TW201036625A - Peptide for therapeutic or prophylactic treatment of tumors of the skin at early stages - Google Patents

Description

201036625 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於早期階段皮膚腫瘤之預防性或治療性治 療。更具體而言，本發明係關於TGF-β 1之抑制劑肽之用 途’其較佳藉助局部施加來預防性或治療性治療早期階段 皮膚腫瘤。 【先前技術】 皮膚癌係皮膚上特定細胞類型之惡性生長，其可具有許 多起因，但太陽輻射係最常見原因之一。皮膚癌通常產生 於表皮（皮膚最外層）中，但亦可位於真皮中。最常見種類 之皮膚癌係基底細胞癌（BCC)、鱗狀細胞癌（SCC)及黑素 瘤。基底細胞癌往往生長較慢且很少擴散。鱗狀細胞癌通 常比基底細胞癌更具侵害性且更有可能擴散至身體之其他 部位。最危險種類之皮膚癌係黑素瘤、尤其係惡性黑素 瘤，其若不及早治療可係致命的。皮膚癌係生長最快的癌 症之一且數量上超過了肺癌、乳癌、結腸直腸癌或前列腺 癌的情況。 轉化生長因子βΐ (TGF-βΙ)係調節諸如細胞增殖、細胞 分化、細胞凋亡、組織重塑及血管發生等各種細胞過程之 多功能細胞因子。 經遺傳修飾小鼠之各種實驗模型（w· Cui等人’ 「TGFbetal inhibits the formation of benign skin tumors, but enhances progression to invasive spindle carcinomas in transgenic mice」，Cell 1996，第86卷，第531-542頁）輔之以經培養角 146877.doc 201036625 蛋白細胞之活體外研究（G. Portella等人，「Transforming growth factor beta is essential for spindle cell conversion of mouse skin carcinoma in vivo: implications for tumor invasion」， Cell· Growth. Differ. 1998，第 9卷，第 393-404 頁）提出 TGF-βΐ在皮膚癌症形成中具有雙重功能。其既用作在腫瘤發生 早期階段之良性腫瘤形成之阻抑劑，且亦用作在癌症形成 晚期階段之惡性進展之觸發劑，進而可促進侵入及轉移 (R.J· Akhurst等人，「Genetic events and the role of TGF beta in epithelial tumour progression」，J. Pathol· 1999，第 187卷， 第82-90頁）。因此，預計在癌症形成晚期階段抑制此因子 將會對惡性進展具有阻抑效應，而在腫瘤發生初始階段對 其進行抑制會對良性腫瘤之形成及其進展成惡性癌症具有 刺激效應。 文獻WO 00/31 135首次闡述了 P144肽（其INN係地司特 泰，SEQ ID NO: 1)。其亦闡述該肽可如何用於治療肝 病、更具體而言治療肝纖維化。 文獻WO07048857闡述了地司特泰在作為免疫應答調節 劑及治療癌症中之用途。地司特泰用於治療癌症之用途與 上述研究一致，該等研究提出了此因子在癌症形成晚期階 段對惡性進展具有刺激效應。 然而，當前業内仍需要如下治療替代物：可局部施加以 用於預防性或治療性治療早期階段皮膚腫瘤以避免進展成 癌症，且有效並具有良好耐受性。 【發明内容】 146877.doc 201036625 令人吃驚的是，已發現，特定TGF__#肽可抑制初始 階段皮膚腫瘤之形成且亦抑制其隨後進展成癌症。特定而 5 ’已發現，i也司特泰在小鼠中可抑制乳頭狀瘤之形成並 延遲其進展成癌症。 儘管已知地㈣泰可用於治療早期階段之癌症，但當前 技術並未提及或提出與使用地司特泰來治療早期階段皮膚 腫瘤相關之任何情況。 ❸ Ο 因此’本發明之—態樣係關於用於預防性或治療性治療 早期階段皮膚腫瘤之TGF，抑制肽，其中該肽係地司特泰 或其衍生物。 本發明之另—態樣係關於用於預防性或治療性治療早期 階段皮膚腫瘤之醫藥組合物’其包括治療有效量之上述 肽、以及至少一種醫藥上可+ 果τ接受之载劑、賦形劑或稀釋 劑0 最後’本發明之另一態樣係關於上述狀在製造用於預防 性或治療性治療哺乳動物(包含人類)之早期階段皮膚腫瘤 之藥劑中的用途。 本發明之此最後態樣係關於預防或治療哺乳動物（包含 人類)之早期階段皮膚腫瘤、尤其乳頭狀瘤或光化性角化 病之方法，其中該方法包括向哺乳動物之皮膚施加包括治 療有效量之上述肽、以及醫藥上 」接受之載劑或稀釋劑的 、、且合物。在一較佳實施例中，哺朝 〇 再礼動物呈現早期階段皮膚 腫瘤且該方法包括向哺乳動物之皮膚 ^ 赝％加組合物以治療腫 瘤且避免其進展成癌症。在另一較 κ貫轭例中，哺乳動物 146877.doc 201036625 並未呈現皮膚腫瘤且該方法包括向哺乳動物之皮膚施加化 合物以預防腫瘤。 【實施方式】 如各實例所示，向用作動物模型之小鼠皮膚局部施加本 發明肽可防止產生由DMBA/TPA誘導之良性乳頭狀瘤及 SCE。因此，該等結果顯示，本發明肽可用於預防性或治 療性治療早期階段皮膚腫瘤，例如乳頭狀瘤或光化性角化 病。本發明中之肽優先施加至人類皮膚上，但若需要通常 其亦可施加至哺乳動物皮膚上。 在本發明中之TGF-βΙ-抑制肽中，包含序列SEq id no: ι(地司特泰）或其衍生物。地司特泰（肽P144之INN)首次闡 述於文獻WO 00/31 135中。如此文獻中所述’地司特泰包 括TGF-βΙ之π〗型受體之胺基酸73〇_743(登錄號q〇3i67 , SwissProt)。 術浯「早期階段腫瘤」係指限定於其產生位置、尚未侵 入周圍組織之腫瘤，且係指已侵入其他組織、但侵入區域 限定於局部區域之腫瘤。此定義適用於絕大部分癌症，包 二皮膚癌。人們認為光化性角化病或曰光性角化病係皮膚 癌發生之最早階段。更具體而言，人們認為光化性角化病 係初』癌且係see之主要前體。人們認為皮膚乳頭狀瘤係 另颏早期階段腫瘤：其係良性非癌性腫瘤。 術°。「地司特泰之衍生物」包含序列SEQ ID NO: 1之哺 礼動物片&、類似物及相似物’前提條件係其能維持其抑 β1之生物活性的能力。可藉助抑制Mv_丨_Lu細胞系 146877.doc 201036625 生長之分析來評價及（若需要）量化本發明肽抑制TGF-βΙ之 生物活性的能力。此細胞系源自野牛肺上皮，其增殖係由 丁(}1?'^1抑制，如贾0 00/31135中所述。 術語「片段」意指比初始SEQ ID NO: 1序列短至少一個 胺基酸之任一胺基酸序列，且包括來自初始序列之一定長 度之連續胺基酸、較佳為至少6個殘基。 術語「類似物」包含其中SEQ ID NO: 1之一或多個胺基 0 酸已由不同胺基酸代替之肽。保守性代替胺基酸較佳。保 寸性代替係彼等其中胺基酸殘基由另一生物相似殘基代替 者。保守性代替之實例包括疏水性殘基（例如異白胺酸、 綠胺酸、白胺酸或甲硫胺酸）由另一殘基代替或極性殘基 由另一殘基代替，例如精胺酸與離胺酸、楚胺酸與天冬胺 酸或麵胺醯胺與天門冬醯胺之間。保守性代替亦包括使用 經取代之胺基酸代替未經取代之胺基酸，前提條件係維持 肽可抑制TGF-β 1之生物活性之能力。類似物亦包括插入或 〇 缺失SEQ ID NO: 1中一或多個胺基酸之肽。該等修飾（代 替、缺失或插入）可由特定肽與SEq ID NO: 1相關之同源 性程度來表示。因此，在本發明之TGF-β 1-抑制肽中，亦 尤其包含與地司特泰之胺基酸序列具有至少75〇/〇同源性、 較佳至少85%同源性及、甚至更佳與此肽具有至少9〇%同 源性之肽’只要維持其有抑制TGF-β 1之生物活性之能力即 可。此外，本發明肽可在其胺基酸中顯示化學修飾。亦包 含含有序列SEQ ID NO: 1之雜合或二聚體融合肽或其片段 作為類似物。 W6877.doc 201036625 術語「哺乳動物相似物」包含來自除人類外之物種之具 有相同生物功能的狀。因此，地司特泰之哺乳動物相似物 肽係具有序列SEQ ID NO: 2之肽P54，其包括TGF-βΙ之大鼠 III型受體之胺基酸731-742(登錄號P26342，Swisspr0t)。 根據文獻WO 00/31 135 ’地司特泰等效於P54肽。前文已展 示地司特泰及肽P54二者用作TGF-βΙ抑制劑之能力，如文 獻WO 00/31 135中所述。 在一較佳實施例中，用於預防性或治療性治療早期階段 皮膚腫瘤之肽係地司特泰（SEQ ID NO: 1)。 較佳地，本發明肽適用作皮膚乳頭狀瘤產生及其進展成 癌症的抑制劑。仍更佳地，本發明肽適用於預防性或治療 性治療光化性角化病。 本發明肽可藉由習用方法（例如，經由固相化學合成技 術）獲得且經由高效液相層析（HPLC)進行純化，例如在 00/3U35中所述。$需要，其可藉助諸如測序及質碰、胺 基酸分析、㈣共振^技術進行分析。或者，Μ明 肽可經由重組DNA技術獲得。 發現本發明肽之醫藥上可接受之鹽在本發明範圍内。術 語「醫藥上可接受之鹽」包含通常用於形成金屬鹽或酸加 成鹽之鹽。鹽之性質並不重要，只要其在醫 受。本發明肽之醫藥上可接受之鹽可自 ^ 接 獲得。該等鹽可藉由彼等熟f此項 機酸或驗 法獲得。 香所熟知之習用方 可藉由任一投與路徑來投與肽。較 ’局部投與本發 146877.doc 〇 201036625 明肽。 因此’在另m本發㈣關於料預防性或治療 性治療早期階段皮膚遽瘤之醫藥組合物，其包括治療有效 *之本發明肽以及至少一種醫藥上可接受之賦形劑、稀釋 * 劑或載劑。本發明之醫藥組合物可含有-或多種本發明 肽、以及（視需要）一或多種替代性Τ(}Ι7_β1抑制化合物。此 醫餘合物可用於投與至哺乳動物體、較佳人體。本發明 ❹之醫樂組合物較佳係局部組合物且可採用（例如）洗劑、潤 髮油、凝膠、乳霜、貼片或嘴霧劑之形式。 狀或肽之醫藥上可接受之鹽在本發明醫藥組合物中之存 在量可在寬範圍内有所變化。用於預防性或治療性治療初 始階段皮膚腫瘤之本發明之肽及/或醫藥組合物的劑量取 決於包含以下之諸多因素：患者年齡、患者狀態、疾病或 病理障礙之嚴重程度、投與途徑及頻率、以及欲投與之本 發明肽。 〇 本發明之又-態樣係本發明肽在製備此醫藥組合物十之 用途。 在-較佳實施例中，本發明係關於本發明肽在製造可抑 制乳頭狀瘤產生及其進展成癌症之藥劑中的用途。在另— 較佳實施例巾，本發㈣關於本發明肽在製造用於預防性 或治療性治療光化性角化病之藥劑中之用途。 在整個說明書及巾請專利範圍中，詞語「包括」及其變 化形式並；I；主張排除其他技術特性、添加物、組份或步 146877.doc 201036625 對於彼等熟習此項技術者，本發明之其他目標、益處及 特性將部分地自說明書且部分地自本發明之實踐得出。 實例 提供下列實例以進行闡釋且並不表示其限制本發明範 圍。 實例1.局部調配物之製備 製備一種媒劑局部調配物及含有地司特泰（3〇〇 gg/g)之 一種調配物。藉由混合下列組份來製備媒劑調配物· 1〇% 二曱矽油、43.5%液體石蠟、〇·〇2%對羥基苯曱酸甲g旨、 0.01°/。對羥基苯曱酸丙酯、0.5%十六烷基三甲基漠化録及 1.5%十八醇十六醇混合物。將此混合物加熱至5〇<^至6〇它 且使用100%純化水進行乳化（亦至50充至6〇。〇）。以相同方 式製備地司特泰調配物，只是水由水加上預先溶於〇 2 ml 二曱基亞颯㈧二之^^“中之心们^乂地司特泰之混合物來代 替。 實例2.地司特泰對乳頭狀瘤形成及已確定乳頭狀瘤之發 生及進展之影響 材料及方法 動物 使用自Harlan S.L.(巴塞羅那，西班牙）獲得之雌性瑞士 白化小鼠（4-6週齡在處理前，使動物在習用溫度及濕度 條件下適應1-2週時間。該等動物隨意地提供有無菌水及 標準膳食。所有動物實驗皆係根據實驗動物之管理及使用 之機構導則來批准及實施。 146877.doc 201036625 化學癌症形成 應用小鼠皮膚中之兩階段化學癌症形成方案。小鼠皮膚 係作為用於研究與腫瘤發生相關之變化之實驗模型具有某 些益處之上皮組織。此方案涉及使用單一劑量之致癌引發 ,劑、具體而言7，12-二甲基苯并（〇1)蒽（][)]^6入)處理小鼠、隨 後重複施加腫瘤促進劑12-0-十四烷醯佛波醇（ph〇rb〇1)_ j 3_ 乙酸酯（TPA)。此處理導致出現良性腫瘤（乳頭狀瘤）。大 〇 部分良性乳頭狀瘤會消失或恢復，但小部分（5-1〇〇/0)進展 成惡性鱗狀細胞癌（SCC)，scc跨越基底膜並不斷侵入下 真皮、皮下組織及肌肉。 在6-8週齡小鼠之經剃毛背部皮膚上，經由單次局部施 加DMBA(32 μ§，存於200 μΐ丙酮中）、隨後使用存於2〇〇 μ1 丙酮中之12.5 ΤΡΑ(10-4 Μ)每週處理兩次並持續12週來 誘導腫瘤。此外，使用呈乳霜形式且含有地司特泰或不含 地司特泰之局部調配物來處理小鼠組，如下文所指定。每 Ο 週報告每一小鼠中直徑大於2 mm之腫瘤數量。在實驗結束 時，將動物麻醉並處死（在使用DMBA引發後32週時），且將 腫瘤固疋於1 〇〇/0甲醛中並包埋入石蠟中以進行組織學研究。 使用地司特泰治療之實驗設計 ‘為測試地司特泰之可能的腫瘤促進效應，藉由在化學促 進癌症形成期間使用含有地司特泰之局部調配物乳霜（第2 組，由5隻動物組成）或僅使用媒劑（第1組，由5隻小鼠組 成）進行處理來代替TPA。同樣，藉由在一組5隻小鼠中每2 天重複轭加地司特泰並持續23週，來分析地司特泰之可能 146877.doc 201036625 的致癌活性。自引發後約7_8週時出現乳頭狀瘤之後，將 經DMBA引發且經TPA促進之錢進—步每2天用地司特泰 進行治療’並持續4週及12週（分別為第5組及第6組，每虹 1〇隻動物）’以測試地司特泰是否可預防皮膚癌症形成。 在使用DMBA引發小鼠的同一週（第〇週）開始使用地司特泰 進仃治療，且此地司特泰施藥法係與τρΑ的施藥法交替隔 ^進行。作為對照，僅使用媒劑（對肖乳霜）治療一組小鼠 (第4、’且由5隻動物組成）12週。最後，自使用dmb a引發後 第12週至第32週，每2天使用地司特泰治療—組患有腫瘤之 動物（第7組，由10隻動物組成）並持續2〇週。包含此小鼠組 以測試肽之可能的抗腫瘤效應。地司特泰係以6〇 p以存於 2〇〇 μΐ乳霜局部調配物中）之劑量施加，但是在第人组小鼠中 地司特泰之劑量則增加至高達丨2〇 (存於4〇〇 μ1乳霜中）。 結果 藉由使用單一劑量DMBA進行引發 '隨後每週兩次使用 TP A進行促進並持續1 2週，來使小鼠組接受化學皮膚痒症 形成。此處理導致使用DMBA引發8週後出現多發性乳頭 狀瘤。此外，每2天使用含有地司特泰之皮膚乳霜來處理 兩個動物組並持續4週及12週，此係在開始DMBA之同— 天開始（分別為第5組及第6組）。在兩種情形下，出現比未 經處理小鼠（第3組）或僅經媒劑處理之小鼠（第4組）少3 〇 _ 60%之良性乳頭狀瘤，如在引發後1〇週及14週時所見（表 1 ，圖 1)。 有趣的是，使用地司特泰在較短時間内處理（4週）在抑 146877.doc •12· 201036625 制札頭狀瘤之數量及尺寸中具有更明顯之效應。

❹ 吾人亦測試地司特泰是否可代替TPA作為癌症形成之促 進劑。為此，使用含有地司特泰之乳霜或僅使用媒劑將經 DMBA引發之小鼠促進12週（分別為第2組及第1組）。正如 所預計，在該等組中並未誘導腫瘤，第〖組中僅經媒劑促 進之兩又小乳除外，該兩隻小鼠在引發後週時自發產生 較小腫瘤（直fe<5叫（表〇。地司特泰顯示在每2天重複 她加20週以上後在正常皮膚上沒有有害效應（數據未顯 示）。該等結果表明，以局部乳霜調配物形式向皮膚施加 司4寸水不會引發或促進癌症形成。與之相反，局部施加 地司特泰對化學皮膚癌症形成具有保護效應。 為分析地司特泰對已確定乳頭狀瘤之發生及進展的影 響’引入小鼠纽（第7组），其中在使用咖㈣發後第_ (此時每-小鼠平肖具有約7_8個乳頭狀瘤（表1)}開始施加 並持續2〇週。觀察到此組中乳頭狀瘤之數量或尺寸並 未明顯減小。實際上’引發14週後，每—小鼠中直徑>2咖 之腫瘤的平均數量在所有組中往往趨於敎（表υ。直徑 5 mm之腫瘤的平均數量亦出現相同情形（表2)'然而，引 發32^後，在使用地司特泰處理之組中，直徑麵之腫 瘤數量及直徑>5 _之腫瘤數量通f較低。同樣，在引發 後處理4週之組巾觀察到減小最明顯（表1及2)。 早期乳頭狀瘤通常較小（參見圓υ，但隨著其變n =具有窄或寬基底之菜花樣結構。另-方面，scc通常 系王現具有潰癌表面之片材形式之内生性腫瘤。基於該等 I46877.doc 201036625 特性，每週檢驗每一小鼠是否存在癌症。如表3中所示， 對照小鼠（第3組及第4組）及經地司特泰處理4週之小鼠（第$ 組）在引發後第丨7-18週出現第一可觀察癌症。顯而易見， 在第12週至第32週期間使用地司特泰處理之小鼠（第7 組）（其在處理開始時具有乳頭狀瘤）顯示在首次出現癌症時 延遲約14週。在引發後使用地司特泰處理12週之小鼠（第6 組）具有約6週之較短延遲。該等結果顯示，向皮膚局部施 加地司特泰不僅可預防腫瘤形成且亦推遲惡性轉化。

組 Ί 小鼠 數量 C 癌症形成 (引發劑DMBA) 處 -j-〜収言 理 在引發後户 每一小鼠之J ^示週數時 促進劑 乳霜 時間段 (週數） 10 14 25 32 1 對照乳霜 - - 0.0 0.0 0.0 0.4 2 5 地司特泰乳霜 - - 0.0 0.0 0.0 0.0 3 10 ΤΡΛ 4 5 t Λ 1 Jr/\ - - 6.4 11.9 9.4 10J TPA 對照 0-12 8.4 11.8 12.6 13.5 D 1U TPA 渑司特泰 0-4 2.3 7.0 10.3 7.8 6 10 TPA 地司特泰 0-12 4.7 8.1 8.1 8.7 7 10 ΓΡΑ 地司特泰 12-32 6.8 「12.6 10.2 8.8 "---- 表1.在兩個階段的癌症形成後地司特泰對小鼠中 皮膚腫瘤發生的影響

表2.在^用DMBA/TPA經受癌症形成且經地司特泰或以 ，、他方式治療之小鼠中腫瘤尺寸的發展 組 小鼠 數量 乳霜 10 4 5 10 To' 10 一對照— ^特泰 特泰 處理 在引發後所示週數時每一小鼠中 直徑>5 mm之腫瘤的平均數量 時間段 (週數） 14 25 32 - 1.6 4.2 3.9 0-12 0.0 3.8 5.0 0-4 0.1 3.3 2.3 0-12 0.2 3.3 3.7 12-32 0.7 3.1 3.8 146877.doc •14· 201036625 表3.藉由DMBA/TPA經受癌症形成且經地司特表式 其他方式治療之小鼠申第一癌症之出現、3^ 組 小鼠 數量 處 乳霜 i理 1時严日拓 (週數） ---—~~_ 引發後之週數* Ϊ7~~~~-- -- 3 - 釋--- 4 5 對照 0-12 5 Ιό 地司特泰 0-4 1 〇 10 —- 6 10 地司特泰 0-12~~ 10 7 10 地司特泰 12-32 24 *藉由目測觀察來計算癌症之出現時間 32 ❾ 〇 小鼠中之上述結果顯示，地司拉矣7 ^ i m J特泰可防止化學皮膚癌症 形成。在使用TPA促進腫瘤期間向皮膚局部施加地司特泰 可減小良性乳頭狀瘤之早期出現。此外，在向腫瘤表面直 接施加包括地司特泰之局部調配物時’可延遲其自乳頭狀 瘤至惡性癌症之轉化。該等社罢, 寻'、〇果顯不地司特泰對皮膚癌之 出現具有保護效應。 【圖式簡單說明】 圖1顯示如各實例中所述代* \衣不同組之經處理小鼠之 側皮膚的圖像。 146877.doc 201036625 序列表 <110>西班牙商艾斯汀公司 <120>用於治療或預防早期階段皮膚腫瘤之肽 <130> P1353TW00 <140 099106502 <141> 2010-03-05 <160> 2 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 14 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223> 地司特泰(disitertide)肽 <400> 1

Thr Ser Leu Asp Ala Ser lie lie Trp Ala Met Met Gin Asn 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223> P54 肽 <400> 2 146877-seq.doc 201036625

Thr Ser Leu Asp Ala Thr Met lie Trp Thr Met Met1 5 10 146877-seq.doc

Claims (1)

1. 201036625 七、申請專利範園·· 1. 一種TGF-βι抑制劑肽，| m ^ 0 m ^ ’、:預防性或治療性治療早期 ί白奴皮膚腫瘤，1中嗜肸 生物。 、"狀係地司特泰（disitertide)或其衍 2. 如請求項1之肽，其係地司特泰。 3. 如凊求項1或2之肽，其 、⑺并反贗礼碩狀瘤之產生及立谁 展成癌症之抑制劑。 王及/、進 Ο 4 ·如請求項1或2之肽，1係用 ^ 肢，、係用於預防性或治療性治療光化 性角化病。 5. 6. 一種醫藥組合物’其包括治療有效量之如請求項_之 肽、以及至少-種醫藥上可接受之賦形劑、稀釋劑或載 劑，其係用於預防性或治療性治療早期階段皮膚腫瘤。 -種如請求項丨或2之肽之㈣，其係用於製造供預防性 或治療性治療包含人類在内之哺乳動物之早期階段皮膚 腫瘤用之藥劑。 7. —種如請求項丨或2之肽之用途，其係用於製造可抑制皮 膚乳頭狀瘤之產生及其進展成癌症之藥劑。 8· 一種如請求項1或2之肽之用途’其係用於製造供預防性 或治療性治療光化性角化病用之藥劑。 146B77.doc