TW201012474A - Treatment of fructose malabsorption - Google Patents

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201012474 六、發明說明：

【明 屬^^^0"々貝 J 本發明係相關於一種治療果糖-吸收不良之組成物。 【先前技術3 果糖（先前亦稱之為左旋糖)屬於碳水化合物中之單糖 (最簡單的醣類）。果糖廣泛應用於人類食品中。 果糖為一種存在於家用糖類（蔗糖與甜菜根糖）之自由 六元醣形式，與葡萄糖結合為雙糖蔗糖，並以聚合形式形 成可食用之果聚糖(fructane)。自由形式之果糖愈來愈常用 於食品業’由於其尚甜度約高出一般醣類約2〇%，以及較 佳之運輸性。 相對於葡萄糖，果糖並不會被小腸吸收，但可藉由特 定蛋白質被動吸收，以實質上相當低之速率。接近有一半 的人口果糖吸收值每日不超過25g。然而，果糖之平均每曰 消耗量為11 g至54 g。應注意到，大部分之果糖使用於不含 酒精飲料中，在一般食物攝取中愈來愈重要。此外，使用 HFCS (南果糖玉米糖漿”)作為甜味劑之機會增加，使得此 問題更加嚴重。 此吸收不良會導致滲透度平衡失常，同時會被大腸内 之細菌快速降解。另一方面，此會導致腹部產生氣體之困 擾，干擾大腸蠕動，中期影響為改變菌叢分佈。結果為臨 床上常見之大腸激躁症。 依據目前技術’果糖-吸收不良係由果糖刺激之後測量 呼出氣體之H2含量。此試驗之特異性低於5〇%。 201012474 至7可獲得之療法只有飲食治療，然而，由於上述提 到果糖之廣泛應用，因此非常_監控。此外，不攝取水 果會導致營養不良症狀，這部分應予以補償。 小腸對於礙水化合物之吸收，係以小腸空腔内之水解 酶進行水解性㈣為基礎，並則、腸㈣吸收六元糖_單 糖、半乳醋與果It，之後由小腸上皮層再吸收 。再吸收過 私主要夂到二種運輸蛋白影響：SGLT卜01^丁5與01^丁2。 SGLT1 (納/葡萄糖共運輸子)作用於小腸上皮細胞之纖 毛邊緣上。SGLT1對抗濃度梯度運輸葡萄糖與半乳醣，尤 其是在小腸之低葡萄糖濃度下。 GLUT5對於果糖有特異性，且為兼性運輸子 (facultative transporter)。因此，GLUT5 強烈依賴小腸空腔 與血液循環中之濃度梯度。GLUT5存在於整個腸壁中。 最後，GLUT2為一葡萄糖、果糖與半乳醣之低親和性 兼性運輸子。GLUT2顯然可快速且可逆性地整合至小腸壁 上之SGLT1-活性中。GLUT2的活性取決於多種因素，因此 通常作為“擴散路徑”。 果糖-吸收不良會有不同結果。 果糖與果聚糖為環繞有大量水分之小分子，並可運送 至小腸遠端’最後到達直腸。此會導致小腸加速運輸，此 種效果使其可作為瀉藥。 果糖傳送至直腸中時’會被宿主細菌快速轉換為短鏈 脂肪酸。在此，會產生大量氫氣、C02，有時會形成曱燒。 短鏈脂肪酸會影響腸道之PH值，亦會產生較高之蠕動性。 201012474 某些細菌會使用果糖產生果聚糖，可作為腸壁之黏附 因子。最終黏附時，這些細菌之影響為多樣化且有爭議的。 在大鼠中觀察到上皮細胞增生增加，以及過量之黏液分 泌，通常與黏膜受到刺激有關。 此外’果糖-吸收不良亦與憂鬱症有關，由於血液循環 中色胺酸，血清素之前驅物，亦受到影響。 果糖-吸收不良對於腸胃疾病發展之影響首見於1978 ❹ 年（Andersson DE，Nygren A: Acta Med Scand 1978; 203:87-92)。然而-以及也許是由於缺乏特定與敏感之診斷 方法-果糖-吸收不良至今仍未被認定為一種疾病。此相當 π楚，由於吸收疾病具有不同之嚴重度，且對於“正常，，至 “病態”之界定，個體差異相當大。 果糖不僅存在有果糖_吸收不良之問題，同時亦有遺傳 I·生果糖不耐症’此二臨床現象有時在文獻中亦會簡稱為果 糖不耐症。果糖不对症出現之頻率約為1:2〇_。此為果糖 Φ _之自體隱性遺傳疾病，其中果糖完全無法被降解或降 解量不夠。此會導致細胞内果糖含量增加，產生毒性影 響葡萄糖之代謝。結果為低血糖症。 " 目前果糖㈣不良僅以絲糖或無果糖限制飲食治 =道任何科衡之飲食，尤其是缺乏水果、果汁等，通常 致營養不良症狀，對於病患之健康狀態有負面影響。 =了預防任何缺失，病患必須使用額外之產品如維他命， =做食結合。因此，所有相關人士與醫療系統都希望 月匕-種治療形式，適用於廣範圍之族群中。 5 201012474 在WO 2007/057749中描述一種製劑，其以使用5-D-果 糖-脫氫酶(EC 1.1.1.124; FDH)為基礎。此酵素會改變果 糖，使其無法成為腸胃道中細菌之受質，因而無法導致任 何疾病。為了改善FDH之作用，建議添加入木糖-異構酶。 在DE 102006013624中描述木糖-異構酶可將果糖轉換 成葡萄糖。 在BHOSALE，S.G. et al. (Microbiol Rev 60(2)，（1996): 280-300)中，討論到鹼土金屬鹽類對於木糖-異構酶之活性 相當重要。 在WO 91/05857 A中，係描述一種酵素結晶法，如葡萄 糖-異構酶結晶法。此外，此文獻顯示在酵素結晶時，可使 用二價鹽類如硫酸鎂。 WO 01/12834 A相關於一種組成物，其包含木糖-異構 酶交聯性結晶’並在受質轉換過程中與硫酸鎂接觸。 US 3,847,740 A係揭示一種組成物，其包含木糖_異構 酶與碳酸鎮。 WO 03/099410 A揭示一種核苷酸分離與純化之方法， 其中使用木糖-異構酶交聯性結晶。 在Carrell H.L. et al·, PNAS，86(12) (1989): 4440-4444 中’揭示木糖-異構酶之X-光結構。此外，作者亦陳述二價 金屬離子，如鎂離子’為木糖-異構酶催化活性所必須。 本發明之一目的為提供一種治療果糖-吸收不良之方 法，其可阻止果糖進入直腸，以抑制或明顯降低任何發展 性疾病症狀。因此，患有此類疾病之病患可持續維持“正常 201012474 的”生活，而不需避免含果糖之食品。 【明内容;3 本發明係相關於一種組成物，包含木糖-異構酶(EC 5.3.1.5)結晶，以及至少一金屬及/或驗土金屬鹽類，用於治 療果糖-吸收不良。 令人驚言牙的，目前已發現木糖-異構酶之結晶形式，在 金屬及/或驗土金屬鹽類存在下，具有高度活性，與傳統方 式製備之木糖-異構酶相較。該結晶形式之木糖_異構酶之優 點為酵素受到保護，若該木糖-異構酶結晶經交聯，則可避 免受到胃酸與胃蛋白酶之影響。交聯化可藉由已建立之方 式達成（如 Vallejo-Becerra et al. (J Agric Food Chem. 2008, Feb. 07; 56(4): 1392 - 1397)或Wenzel et al. (FEBS Lett 1991，March 11; 280(1): 147 _ 151))。因此，木糖·異構酶可 為口服形式，可不具或具有降低量之腸衣包覆。 木糖-異構酶或其組成物較佳為乾燥、微細顆粒粉末形 式，較佳在作為輔助因子之金屬離子存在下結晶，以確保 得到快速生物可獲娜與高㈣性減。木糖異構酶結晶 可經微細研磨。由於在小腸空腔中具有相當良好之溶解 度’此類製劑可在小腸之生理環境下產生最大活性，並且 快速釋放。 令人驚評地’該活性與生物可獲得性可在本發明木糖_ 異構酶製狀幫助下增加數倍。研觸示此高度活性與有 效陡可大量或a全阻止果糖進人直腸。腸道區域的葡萄糖 再吸收變快，可在平衡反應（果糖 糖）中抽出葡萄 7 201012474 因此果糖便會隨著時間降解。此可預防腸道區域中殘 =量之果糖，果糖過量會導致已知與果糖吸收不良有關 之健康問題，之後發展為果糖_吸_良之症狀。

木糖-異構酶大量崎食品錢d从量製造，用 於自葡萄糖製備果糖，以增強甜度。在小腸之環境參數中 (即自平衡反應中抽㈣萄糖），依據本發明製備之木糖_異 構酶會促使反應往另-方向進行：_素使果糖異構化為 勤萄糖。但工業上使用之酵素含有大量之干擾㈣，會決 定性地抑制酵素活性，尤其是山梨糖醇。㈣於工業上使 用之酵素，本發明木糖·異構酶結晶中之山梨㈣含量 <ι%°由於山_醇含量僅有1%，本發明組成物在活性上 可明顯增加。然而，若無山梨糖醇存在，穩定性可能會受 才貝而令人驚對地無法達到本發明希望之功能。 作為木糖-異構酶之支援，甘露醣-異構酶可用於將果糖 轉換為甘露賭。此在小腸亦會被再吸收，如同上述所解釋， 因此可自反應平衡中抽出。

木糖-異構酶之結晶係依據技術上已知之方法製備 (Suzuki Y et al., J Phys Chem B. 109(8) 2005: 3222-6; Dunlop KV and Hazes B, Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 2005: 1041-8; Vilonen KM et al., Biotechnol. Prog. 20(5) 2004: 1555-60; Ramagopal UA et al., Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 2003: 868-75。 為了在腸道區域，尤其是小腸，達到高度酵素活性， 該組成物包含至少一生理上可接受之金屬及/或驗土金屬 8 201012474 鹽類，且該金屬較佳為二價。由於木糖_異構酶在金屬及/ 或鹼土金屬離子存在下，會顯示出酵素活性增加，因此本 發明組成物中提供有各鹽類。尤其是，木糖_異構酶較佳與 上述鹽類共結晶。因此，輔助因子可整合至結晶中酵素之 活性位置，因此已存在於晶格中（在結晶水與其他原子附 近）。因此離子與輔助因子不需要額外存在於反應溶液中（= 小腸空腔）。依據本發明，該組成物可包含至少2、至少3、 4、5、6、7、8、9、10或甚至至少15個不同種類之金屬及/ 或鹼土金屬鹽類。 依據本發明之一較佳實施例’該鹼土金屬為鎂。 本發明之組成物包含鹼土金屬鹽類與木糖_異構酶，其 莫耳比例範圍為0.5:1至200:1，較佳5:1至25:1，更佳12:1至 18:卜 依據本發明之另一較佳實施例，該金屬為鈷、錳、鋅、 鐵或銅’在組成物中該鹽類與木糖-異構酶之莫耳比例範圍 為0.1:1至100:1，較佳自0.5:1至20:1，更佳自3:1至7:1。 醫藥上可接受之陰離子係使用作為這些鹽類可使用之 陰離子，較佳選自於由氣、硫酸鹽、碳酸鹽、碳酸氫鹽或 蘋果酸鹽組成之族群。 依據本發明之一較佳實施例而言，該至少一鹽類選自 於由 MgCl2、MgS〇4、MgC03、Mg(HC03)2、Mg(C4H2〇4)、 C0CI2、C0SO4、CoC03、Co(HC〇3)2、Co(C4H2〇4)、MnCl2、 M11SO4、MnC03、Mn(HC〇3)2或Mn(C4H2〇4)組成之族群。 在一更佳實施例中，本發明組成物包含鎂及/或鈷鹽。 201012474 本發明這些組成物最佳為包括Mg以及c〇鹽者。此二鹽類之 組合已顯示特別適用於治療果糖_吸收不良。 依據本發明之一較佳實施例，該木糖-異構酶結晶係以 微細乾燥粉末形式使用。該酵素粉末在對抗細菌降解時更 具穩定性，並在大量技術級製錠時具有優勢，如較佳之投 藥性與可混合性。 木糖-異構酶粉末較佳具有殘留水含量〇1%至3〇%，更 佳0.5%至1〇%，最佳1 %至3%。粉末中之蛋白質含量較佳為 50%至99.9%，更佳為75%至99.9%，最佳為95%至99.9%。 該粉末之顆粒尺寸範圍為〇.〇1 0111至1〇〇〇 μιη，較佳〇 1 μηι 至 100 μπι，最佳為 1 μηι至3〇 μιη。 依據本發明製備並可獲得之木糖-異構酶組成物，較佳 為“尚度活化”。此“高度活化”之木糖-異構酶組成物較佳具 有酵素活性35,000至45,000單位每克(總製劑）。於此，一單 位(11)定義為4111〇1每克每小時，於37。(：：（35,〇〇〇與45,〇〇()11 分別對應於9.72與12.5 1111111-{^及1(01^1;;]<^=111〇1/8))。相對 的，冷凍乾燥物中得到之木糖-異構酶，如直接自管柱純化 出’具有活性約4000至6000 U/g (依據Dische et al., J. Biol. Chem. (1951) 192:583決定）’亦即 i.i至 1.7 mkat。 依據本發明之另一較佳實施例，係使用腸衣形式製 劑，選自於由腸衣藥丸、腸衣藥錠、腸衣膠囊、腸衣顆粒 與腸衣粉末組成之族群’並製備為可投藥至人體之形式。 依據本發明，可使用任何形式之藥劑形式，只要確保 可於目標處快速且有效地釋放活性。在一較佳實施例中， 201012474 本發明之藥劑形式可以外膜包覆提供’較佳為包覆腸衣。 這些外衣較佳含量為1至50 %重，以藥劑形式之總重量為基 礎。較佳為曱基丙烯酸/烷基（甲基）丙烯酸酯-共聚物’更佳 為曱基丙稀酸/甲基甲基丙稀酸酿-共聚物，具有比例1:1至 1:2，如Eudragit L®或Eudragit S®，最佳為甲基丙烯酸/乙 基丙烯酸酯1:1共聚物，如Eudragit L55®、Eudragit

L30D-55®，皆可於pH值> 5.5時快速溶解。此外，可使用以 纖維素或蟲膠(shellac)為基礎之腸衣，為此領域技術上已 知。該外衣可以溶於有機或水性介質中，較佳為水性介質 之適當溶液或分散液方式施加。該腸衣藥劑形式較佳亦可 抗唾液’適當之外衣係以Eudragit E或Eudragit EPO為基礎。 依據本發明’“胃液”代表胃液之天然組成物，以及類 似於人工胃液之製劑(pH 1-2)，為此技術領域者所熟知。術 語“於小腸中釋放”係包含於天然小腸液中釋放，以及於類 似於小腸液之製劑中，於pH值6_7.5，較佳pH 6 4 6 8釋放。 依據本發明，“腸衣”係指藥劑特徵為保護其内所包含 之活性成分(如木糖-異_)不受胃液或可與胃液相比之溶 液(如酸)作用，於-段特定期間，至少1〇分鐘，較佳至少2〇 分鐘，更佳至少3G分鐘，最佳6〇分鐘，使活性成分損失最 大值為獅活性，較佳最大⑽％活性，更加最大值娜活 性，最佳最大值為20%活性，尤佳最大值_活性。 最佳之藥劑形式係以將起始材料與酵素製劑混合、膠 囊化、擠出、分裝錢雜_，㈣雜化，選擇性分 類，並以腸衣形式提供。 11 201012474 腸衣藥丸為包覆有腸衣外膜之藥丸，其溶解於腸道之 pH值下’即，此外衣較佳溶解於pH值至少4 ’最大10下。 例如，Eudragit為一以甲基丙稀酸與甲基丙烯酸酯之陰離子 性聚合物為基礎之腸衣，含有-COOH作為官能基，並可溶 解於pH5.5至pH7之條件下。除了 Eudragit之外，亦可使用 蟲膠或乙醯化澱粉(如Amprac 01)。由於技術上已知各種腸 衣具有不同之特性（如外衣溶解之pH值，溶解速率），外衣 之材料可組合。例如，蟲膠顯示具有良好之酸抵抗性，但 在腸道中卻溶解地非常緩慢。相反地，Amprac 01可在腸道 β 環境中溶解地相當快速，但酸抵抗性卻不足。為了彌補某 一材料之缺點，上述二材料可混合，如使用重量比為 60-95/40-5，較佳為70-90/30-10之蟲膠/Amprac 01。另一影 響活性成分釋放速率之參數為腸衣藥丸之外層厚度。該外 層厚度，以質量比表示，較佳為5至30%，更佳為1〇至20% 之最終產物總質量。該藥丸具有平均直徑為0.5至5 mm，尤 其是0.7至2mm。此尺寸之優點為該藥丸可快速通過胃。 可使用作為本發明酵素製劑之該藥丸製劑可作為藥 ® 物、食物補給品、飲食療法食品、醫藥產品、飼料、飼料 補給品或飲食療法飼料，較佳使用一擠出機製造，因此需 要組成物中之各成分呈現熱穩定，尤其是酵素，至多至6〇°c (Strieker Arzneiformenentwicklung，Springer Verlag 2003)。 該藥丸除了腸衣與酵素之外，可包含其他醫藥成分。例如， 作為填充劑以及膨潤劑之微結晶纖維素(如Avicel)。纖維素 不溶於水中，並具有此結晶形式與非晶形部分。若施加足 12 201012474 夠之外力，此組合會導致塑性變形，π，形狀上之不可逆 變化產生。此為在擠出機與球化機中顆粒化所必須。在濕 式顆粒化微結晶纖維素吸收Α量水分期間，會形成容易壓 縮、緊緊結合之物質，即使未添加黏著劑。微結晶纖維素 在藥丸中之量介於5至70%，較佳介於1〇至6〇%，更佳介於 15至50%，依據本發明。麥芽糖可使用作為黏著劑與填充 劑。麥芽糖可增強基質之溶解度，因而可幫助酵素之快速 釋放。依據本發明，每一顆粒中較佳加入丨至牝％，更佳5 至35% ’尤佳10至30%之麥芽糖。 與一般使用之蔗糖比較，麥芽糖之優點為其不包含任 何果糖，因而不會於體内製造任何不希望以及有害之果糖。 亦可加入羥基丙基纖維素（加入量較佳為〇5至1〇%)作 為黏者劑’並可預防微細粉塵。此外，經基曱基纖維素可 增加藥丸之強度，因此幫助增進產率。澱粉可加入本發明 藥丸中作為填充劑與分解劑（較佳量為1至30%)。由於為水 不溶物質，澱粉可吸收大量的水，因此為一理想之分解劑。 交联羧曱基纤维素鈉（Crosscarmellose (Na-CMC; Acdisol)) 為一種純分解劑’較佳之加入量為1%至5%。過高比例之 Acdisol會導致球狀化過程中藥丸過早分解，因而使產率降 低。聚乙烯》比洛院酮(Crosspovidon)，一種交聯化pvp，亦 不溶於水中，同時可作為分解劑。以其聚合物性值為基礎， 它可在藥丸製備過程中促進較佳之球狀化（較佳之加入量 為0.5至10%)。聚維酮(Povidon)為水溶性添加物並可作為黏 著劑。這些不同之填充劑、分解劑與黏著劑，會產生藥丸 13 201012474 中木糖-異構酶之分子呈分散分佈，並確保快速之生物可獲 得性。 由甘油及/或滑石組成之分離層，可提供於腸衣與包含 活性成分之藥丸之間。甘油作為濕潤劑’以預防脫水進而 使酵素失活。 由於直徑大於3 mm之顆粒會刺激幽門產生阻塞反射， 因此大部分藥丸腸衣藥劑形式離開胃部時之尺寸較佳小於 3mm，如此該藥丸便可以密閉狀態通過幽門，且可以類似 液體之形式由胃部進人小腸。中性pH值可預防顆粒在約$ φ 至30分鐘，較佳15分鐘内破裂，因而釋放活性物質。因此， 最佳可提供直徑小於5 mm，較佳小於3 腸衣藥劑形式 顆粒。 除了藥丸之外，該木糖-異構酶亦可於膠囊或不同藥劑 形式中傳送，自胃部進入腸道。適當之膠囊為如明膠膠囊 或澱粉膠囊。膠囊内亦含有本發明之藥丸。 依據本發明之一較佳實施例，木糖-異構酶可存在於微 膠囊、奈米顆粒或微脂體中。 依據一較佳實施例，該木糖-異構酶為微生物性、動物 性、植物性或重組性來源。 本發明所使用之酵素可為不同來源。酵素之單離及/或 製備為熟習此技術領域者已知。 ~ 較佳為’使用微生物來源之木糖-異構酶，； w目於微生 物家族鍵黴菌（Streptomycetaceae)家族，尤其县粉+ 、、义罐赤鏈黴菌 (Streptomyces rubiginosus)。此類來源之木糖-異構 14 201012474 萄糖/果糖具有較肖之特H較小之Km值，與其 他來源之異構酶相較。因此，短乳酸菌(Lactobacillu s brevis) 之木糖-異構酶之⑸為92〇 _，鏽赤鏈黴菌之Km為· mM。 j發日胁成物可驗不同產品形式巾。較佳該組成物 為絲組成物、食物補給品、飲食療法食品、醫藥產品、 飼料、飼料補給品或飲食療法飼料。 本發明之另一觀點係相關於一種組成物，包含木糖-異 構酶(EC 5.3.L5)結晶，以及至少一金屬及/或驗土金屬鹽 類’於腸衣藥劑形式中，特別選自於由腸衣藥丸、腸衣藥 錠、腸衣膠囊、腸衣顆粒與腸衣粉末組成之族群。 本發明之另一觀點係相關於一種使用木糖_異構酶(EC 5.3.1.5)以製備治療果糖·吸收不良之用途，其中該木糖-異 構酶以結晶形式存在，如上所述，用於作為藥物。該藥物 可為如腸衣藥劑形式，如本發明申請書所描述。 若為口服投藥，該包含本發明木糖_異構酶之藥物，應 在每餐含果糖飲食之前立即服用，以確保快速異構化進 行。由於直徑大於3 mm之顆粒會刺激幽門產生阻塞反射， 因此較佳該腸衣藥劑形式離開胃部時之尺寸小於3mm，如 此該顆粒便可以密閉狀態通過幽門，且可以類似液體之形 式由胃部進入小腸。中性pH值可預防顆粒在約5至3〇分鐘， 較佳15分鐘内破裂，因而釋放活性物質。 本發明之另一觀點係相關於一種製備本發明組成物之 方法，包含將木糖-異構酶在至少一驗土金屬及/或金屬鹽類 15 201012474 存在下、’°晶，其中該木糖-異構酶結晶係經乾燥，並選擇性 粉末化’製備為藥劑形式’尤其是選自於由腸衣藥丸、腸 衣藥錠、腸衣膠囊、腸衣顆粒與腸衣粉末組成之族群。 乾燥步驟較佳係、於真^下進行，並區分為a)將晶體自 溶液中過㈣，b)將_冷綠燥。該乾燥（殘餘 據餅較佳經，如❹玉米研磨機。 〜 本發明之另-觀點係相關於由使用本發明方法而獲得 之組成物。 & 本發明將以下列圖示與範例進行更詳細之描述，，然 φ 而’這些僅作為範例。 圖式簡單說明 第1圖顯示pH值對於木糖-異構酶活性之影響。 第2圖顯示木糖-異構酶之酸穩定性。在pH< *之條件 下，酵素活性係被不可逆性地破壞。 第3圖顯示本發明高度活化木糖-異構酶活性之溫度穩 定性，於較佳之腸衣藥丸實施例中。 第4圖顯示經結晶過程純化之木糖-異構酶與單離出之 麵 木糖-異構酶之活性比較。 第5圖顯示二價金屬離子對於木糖-異構酶活性之^ 響。 第6圖顯示木糖-異構酶與二價金屬離子共結晶對於木 糖-異構酶活性之影響。 第7圖顯示木糖-異構酶隨著時間在體内之影響，與安 慰劑以及未投藥組相較。 16 201012474 【實施方式3 範例： 範例1 : 為了確保在個體或動物中腸道區域之生理學有效生物 可獲得性，木糖-異構酶較佳經保護’不受胃液侵蝕而傳送 至小腸。酵素活性對於pH值之依賴性（第1圖）與在該pH值下 酵素之穩定性（第2圖）之測量，可作為發展適當製劑之基 礎。葡萄糖異構酶活性之pH值依賴性係於50 mM蘋果酸 醋、hepes或Tris-緩衝液，pH 5至pH 9，具有5 mM MgS〇4、 1 mM CoCl2與100 mM葡萄糖中，於37°C測量。所獲得之 果糖係以經修飾之硫酸/味u坐-測試測量，如Dische and Bohrenfreud (Dische, Z et al.: J Biol Chem.(1951) 192 : 583) 所述。特定量酵素之穩定性係以靜置於5〇 mM甘胺酸、蘋 果酸酯或hepes-緩衝液中，於pH為2至7，37°C下進行30分 鐘。緩衝液以過量之100 mM hepes緩衝液，pH 7.4中和，活 性係於5 mM MgS04, 1 mM CoCl2 and 100 mM葡萄糖存在 下，於37°C測量。所得之果糖係以經修飾之硫酸/咔唑測試 測量’依據Dische et al.之方法。 範例2 .本發明冋度活化木糖異構酶活性之溫度穩定性， 於較佳之腸衣藥丸實施例中。 酵素藥丸之穩定性對於儲存與量產相#重要。必須達 以提供可接受之市場穩定性。經包

到足夠之活性穩定性， 覆藥丸分別儲存於4°C 17 201012474 後，50 C組之活性降低77% (第3圖）。 範例3 :經結晶過程純化與單離出之木糖異構酶之活性比 較。 ^糖-異構酶得自鏽赤鏈黴菌（Streptomyces rubiginosus) 之大量工業級製造。此可取得之木糖異構酶係經山梨糖醇 與其他添加物之結晶過程純化。因此，可達到活性增加川 %由範例1獲得之晶體懸浮液活性，與起始溶液之活性係 於標準條件下測量。於錢㈣平騎性增加量為70% (第 4圖)。 φ 範例4 :二價金屬離子對於木糖異構酶活性之影響。 在未添加任何二價金屬離子而純化出之木糖異構酶 中，加入不同濃度之Mg2，c〇2+，並測量在5〇福_緩 - 衝液’ pH 7.4與1〇〇福葡萄糖溶液中，37。〇時之活性。於 、 此觀察到平均活性增加量為3〇〇% (第5圖）。 範例5 :木糖-異構酶與二價金屬離子共結晶對於木糖_ 異構酶活性之影響。 含有或未含有Mg2+與之木糖異構酶類似於範 參 例1，活性係於50mM磷酸緩衝液，pH7 4，不含二價金屬 離子，具有100 mM葡萄糖之溶液中，於3rt測量。結果 顯示’具有二價金屬離子之晶體與不含金屬離子者相較， 特異性活性為300% (第6圖）。 範例6:木糖-異構酶在輔助因子存在下之結晶。 在5公升之4 w/v %木糖-異構酶溶液中，加入735 8硫 酸銨、72 g硫酸鎂-六水合物，與19 4 g氣化鈷(π)六水合物， 18 201012474 並緩慢冷卻至2°C，並攪拌20小時。為了加速結晶過程，加 入50 ml之4%木糖-異構酶晶體懸浮液。所得之晶體具有最 佳尺寸介於50μιη至ΙΟΟμιη間。 此過程接近於US 4,699,822中所述之結晶法，但其中加 入CoCl2與起始晶體。 範例7 :乾燥木糖-異構酶結晶

由範例1所得之木糖-異構酶晶體懸浮液經摺過之3 h w 濾紙(Sartorius，Germany)過濾、冷束與冷凍乾燥。就最佳化 可加工性而言，該固體酵素餅經微細研磨。所獲得之木糖_ 異構酶粉末通常具有活性45000單位每克。一單位之木糖-異構酶係定義為可將丨μΠ1〇1 (18〇 gg)之葡萄糖轉換為果糖 之酵素活性，於5〇 mM磷酸緩衝液，ρΗ7·4，具有5 mM MgS04、1 mM c〇cl2與1〇〇 mM葡萄糖之溶液中，37°C (標 準條件)每小時。 範例8 :木糖-異構酶顆粒之製備 a) 顆粒化： 31.4 g羥基丙基纖維素、408.7 g微結晶纖維素、169.5 g 米殿粉、15.6 g交聯羧甲基纖維素鈉、62.2 g交聯聚維酮、 145.3 g麥芽糖，係與1671g木糖異構酶粉末混合(7 5〇〇 〇〇〇 單位）。固體混合物係以377 g二次蒸餾水處理成濕狀、柔軟 團塊。此團塊經由孔徑1 mm之篩網擠成條狀（Caleva

Extruder 10/25, Caleva Process Solutions Ltd.)。 b) 球狀化： 該濕狀條狀物於球化機中滾動成顆粒(Spheronizer 250, 19 201012474

Caleva Process Solutions Ltd.)，於400 rpm下滾動5分鐘。之 後該顆粒於35°C架上乾燥，直至重量恆定。 c) 分類： 乾燥之顆粒經篩管分類’尺寸範圍介於〇 4至〇 8者適合 進行下一步驟。 d) 藥丸之鑑定： 總產率為70%。 在落解測試儀中之釋放測試發現，可產生85.8%活性之 釋放，在5分鐘内，以及97.5%之周圍環境輸入活性，於15 Φ 分鐘内。藉由在短時間内快速釋放酵素，可達成在口服投 藥後’腸胃道中之快速作用。 e) 藥丸包覆： - 基於其蛋白質結構，木糖-異構酶對於胃中大部分之胃 - 蛋白酶與酸性pH值不具活性。因此，酵素經腸衣或腸衣陰 離子基質保護，為維持酵素活性所必須。 塗佈溶液：1.9 kg乙酿化澱粉係溶解於152岵純水中並 攪拌（懸浮液1)。使用Ultraturrax，10.9 kg蟲膠SSB 63 參 Hydram溶解於另外100 kg純水中，以獲得一溶液（懸浮液 2)。懸浮液1與2係混合，並加入〇 6 kg之85%甘油與2 6 kg 微顆粒化石。在喷;麗過程中，塗佈溶液係以Uitraturrax 攪拌。 塗佈.1 kg藥丸係以1.5 kg塗佈溶液於流體床中塗佈。 薛選之裝置參數如下：喷漏力16巴，喷麗速率18〇 2/分 鐘，入口氣體溫度55°C，產物溫度：3yc ;入口氣體量14〇〇 20 201012474 m3/h 〇 待喷濃溶液完全施加後，藥丸於入口氣體溫度贼進 行再乾燥60分鐘。 g)產物鑑定： 經塗佈之藥丸符合歐洲藥典(pharmac〇p〇ea Europe) 對於胃抵抗性之測試。在分解機中，於37〇c之〇1 N氫氣酸 中靜置2小時，藥丸未產生變化，將介質更換為磷酸緩衝 液，pH 6.8，會使腸衣藥丸分解。外衣之量為約16%原始重 量。此藥丸亦可使用作為藥錠與膠囊之初步產品。 範例9 :喷霧乾燥木糖-異構酶 a) 製備該喷灑溶液： 5 g醋酸鄰苯二曱酸纖維素加至80 g水中，醋酸鄰苯二 甲酸纖維素溶解於25%氨水中，pH調整至7.5。5 g之1〇〇 mM MgS〇4水溶液加至該溶液與木糖-異構酶晶體懸浮液中，加 入對應量之1.25 g乾燥質量酵素。 b) 噴霧乾燥： 係使用下列設定：入口溫度130°C，出口溫度90°C，幫 浦速率1.5 ml/min，800 Ι/h加壓空氣，以及-40 mbar抽出壓 力。 c) 產物之鑑定： 產物產率為50%。維持90%之活性。木糖-異構酶粉末 符合歐洲藥典（Pharmacopoea Europaea)對於胃抵抗性之測 試。在分解機中，於37°C之0.1 N氫氣酸中靜置2小時，粉末 未產生變化，將介質更換為磷酸缓衝液，PH 6.8 ’會使粉末 21 201012474 於1小時内元全溶解。然而，在此溶液中僅測量到5%之原 始酵素活14因此結論為當粉末之巨觀結構維持時(如同 Εΐ1Γ所要求）’酵素活性便會喪失(其並非為Pharm Eur 之要求）。 範例10 :症狀藥效 在臨床武驗中，診斷有果糖-吸收不良之病患被遨求記 錄問卷上之個別症狀’在某些含果糖飲食之後。約2天之間 隔’在相同飲食巾加人含木糖-異構酶之㈣，並記錄症狀 進行之狀況。 魯 令人驚訝地，每餐服用一顆膠囊(=920單位之木糖_異 構酶）’會使症狀明顯改善，而服用二顆，則有75%之病患 症狀完全消失。而另外13%之病患症狀減輕。 - 在臨床試驗中，每餐攝入之果糖約7 g。一單位之木糖 . -異構酶係定義為每小時可將i μιη〇1 (18〇㈣葡萄糖轉換為 果糖(反之亦然）’於ρΗ 7.4,之酵素量。此代表在腸道平均 傳輸時間之1小時内，2顆膠囊可降解總量〇.33 g之果糖，在 實驗室標準條件下。此由實驗室獲得之值，遠低於臨床試 參 驗中攝入之7 g量。 因此，具高度活性木糖-異構酶之特定藥劑形式可大幅 改善果糖之耐受性，以及短腸症與相關臨床症狀皆可被成 功治療。 範例11 :臨床藥效 5位病患’經25克之100毫升果糖溶液刺激，呼出氣體 中氫氣量明顯增加，係在刺激後馬上投以3顆本發明製備之 22 201012474 膠囊。令人驚訝地，在接下來的4小時内’呼出氣體中並未 觀察到H2-濃度增加。投以安慰劑膠囊者對於呼出氣體中之 氫氣量並未有作用。這些資料確認了本發明具高度活性之 木糖-異構酶製劑，與正餐一同服用，可將果糖轉換為葡萄 糖’可以此有效方式通過小腸，如此便無生理相關量之果 糖會進入直腸區域。每日食物中約攝入25 g之果糖。因此， 可投予3顆本發明膠囊製劑。 【圈式簡單說明3 第1圖顯示pH值對於木糖-異構酶活性之影響。 第2圖顯示木糖-異構酶之酸穩定性。在pH<4之條件 下，酵素活性係被不可逆性地破壞。 第3圖顯示本發明高度活化木糖_異構酶活性之溫度穩 定性，於較佳之腸衣顆粒實施例中。 第4圖顯示經結晶過程純化之木糖_異構酶與單離出之 木糖-異構酶之活性比較。 第5圖顯示二價金屬離子對於木糖-異構酶活性之影 響。 第6圖顯示木糖-異構酶與二價金屬離子共結晶對於木 糖-異構酶活性之影響。 第7圖顯示木糖-異構酶隨著時間在體内之影響，與安 慰劑以及未投藥組相較。 【主要元件符號說明】 (無） 23

Claims (1)

1. 201012474 七、申請專利範圍： 1· 一種組成物，包含結晶木糖_異構酶(EC 5 3丨5)，以及 至少一金屬-及/或鹼土金屬鹽類，用於治療果糖吸收不 良。 2·如申請專利範圍第1項之組成物，其特徵為該金屬為二 價金屬。 …一 3,如申請專利範圍第丨或2項之組成物，特徵在於該鹼土金 属為鎂。 4·如申請專利範圍第丨至3項任一項之組成物，特徵在於該 組成物中之鹼土金屬鹽類與木糖-異構酶之莫耳比例範 圍為0.5:1至200:1，較佳自5:1至25:1，更佳自12:1至18:1。 5. 如申請專利範圍第1至4項任一項之組成物，特徵在於該 金屬為鈷、猛、辞、鐵或銅。 6. 如申請專利範圍第1至5項任一項之組成物，特徵在於該 組成物中之金屬鹽類與木糖-異構酶之莫耳比例範圍為 0_1:1 至 100:1，較佳自 0.5:1 至20:1，更佳自 3:1 至7:1。 7·如申請專利範圍第1至6項任一項之組成物，特徵在於該 至少一鹽類選自於由MgCl2、MgS〇4、MgC〇3、 Mg(HC03)2、Mg(C4H2〇4)、C〇Cl2、C0SO4、CoC03、 Co(HC〇3)2、Co(C4H2〇4)、MnCl2、MnS〇4、MnC03、 Mn(HC〇3)2 與 Mn(C4H2〇4)組成之族群。 8.如申請專利範圍第1至7項任一項之組成物，特徵在於其 存在於腸衣藥劑形式中，尤其是選自於由腸衣藥丸、腸 衣藥錠、腸衣膠囊、腸衣顆粒與腸衣粉末組成之族群。 201012474 9如申明專利範圍第1至8項任一項之組成物，特徵在於該 木糖-異構酶存在於微膠囊、奈米顆粒或微脂體中。 10. 如申咐專利範圍第丨至9項任一項之組成物，特徵在於該 木糖異構SI為微生物性、動物性、植物性或重組性來 源。 11. 如申凊專利範圍第10項之組成物，特徵在於該微生物來 源之木糖-異構酶源自於鏈黴菌（Streptomycetaceae)家 族尤其疋鏽赤鏈黴菌（Streptomyces rubiginosus)。 12. 如申請專利範圍第丨至丨丨項任—項之組成物，特徵在於 該組成物為醫藥組成物、食物補給品、飲食療法食品、 醫藥產品、飼料、飼料補給品或飲食療法飼料。 13. —種包含結晶木糖_異構酶(EC 5 3」y與至少一金屬及/ 或鹼土金屬鹽類之腸衣藥劑形式組成物，該腸衣藥劑形 式係尤其是選自於由腸衣藥丸、腸衣藥錠、腸衣膠囊、 腸衣顆粒與腸衣粉末組成之族群。 14. 一種使用木糖-異構酶(EC5.3.L5)以製備治療果糖吸收 不良之藥物之用途，其中該木糖_異構酶以結晶形式存 在於如申請專利範圍第1至^項任一項與第13項之組成 物中。 15. —種製備如申請專利範圍第1至13項任一項之組成物之 方法，包含使木糖-異構酶在至少一驗土金屬及/或金屬 鹽類存在下結晶化之步驟’其中將該結晶木糖_異構酶 乾燥，並選擇性地粉末化，並配製為藥學劑型形式，尤 其是選自於由腸衣藥丸、腸衣藥錠、腸衣膠囊、腸衣顆 25 201012474 粒與腸衣粉末組成之族群。 16.—種組成物，係由申請專利範圍第15項所述之方法獲 得。

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