201002333 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 . 本發明屬於一種乳汁萃取物做為免疫調節的新用途。更具體來 說’本發明係關於一種自超高免疫狀態(hyperimmune)產乳動物之 乳汁中萃取而得一乳汁萃取物，其具有能降低過敏反應之難以預 見之新用途。 【先前技術】 發炎一般被定義為「組織受傷或受破壞時，用來摧毁，稀釋或 隔離傷害因子及受傷組織兩者之侷限性保護反應」。蓋一般常見的 過敏反應係為上述發炎反應之一支。目前用來處理過敏反應如消 火鎮痛、解熱’最廣泛被使用為藥物的化合物係類固醇類藥物。 另外’水揚酸類化合物則為另一廣用的非類固醇之消炎劑，參考 j師桌面參考文獻』，198?年(參見第2〇7及2〇8頁之製劑索引)。 用而’勺不然或人工合成之類固醇製劑皆會引發多種嚴重 作用’包括生長遲緩、骨質疏鬆、血料高、水腫、血中離子 》辰度過低。此外，因類因_望I — 等反應，同時也會使類關具有上述消炎、抗過敏 观城本身之先天免疫反應 ί不自知，錄㈣級血歧亡。 適宜孕婦使用。由於胎兒發育階段時母 親會刀泌夕種女性荷爾蒙使 町母 勢必對胎紐育會造成嚴重干擾。月’ &施骑素類藥劑’ 對於非激素嶋__編言，娜嶋，啤吸麻 5 201002333 瘁、體循環_、上㈣迫、如、觉吐、肝損傷、胃出血及凝 血時間過長等問題。在先進國家中如美國，每年可見ι萬例以上 • 之嚴重水揚酸類消炎劑中毒，造成多人死亡且常見於兒童，參考 Goodman及Gilamn之『治療學之藥理基礎』，第七版，μ阳年。 . 近年來，順勢療法盛行，傳統的中草藥被用來改善發炎或過敏 等症狀的趨勢越來越普遍，然、而儘管有—部分人因中草藥而使病 症改善，但絕大部分患者之過敏仍舊無法獲得改善。通常，中草 藥劑製造商將這絕大部分無法獲得改善或沒有明顯改善之原因歸 咎於「不明原因」，然、而當我們細細探究此「不明原因」發現，原 來「不明原因」中草藥的品質管理通常欠缺—套嚴格的^程，例 如不同產地所生產的藥材，其有效性成分會有不同及差異，當一 中草藥劑需要混合數種不同草藥時，其有效性成分排列組合^所 產生之結果複_度想見—斑’是故雜過嚴格的無賴程，但 其根本成分差異性太大，最終品質之隱憂值得深慮。 以美國專利第09/949610號帽案為例，該㈣揭露—種用於 鼻炎的醫藥組合物，其包含：麥冬(Tuber 〇phi〇p〇g〇n)、半夏(Tuba Pinelhae)、甘草（Radix Glycyrrhizae)與西洋篸 Quinquefoli)的水溶液萃取物，以及 HerbaTridadsPr〇_bentis 的 50%乙醇萃取物。雖然上述萃取物有消炎的效果，但對於過敏的 效果仍待進-步研究。然而上述萃取物的消炎效果僅具短期舒緩 症狀之能力，其長期療效容易因為草藥品質差異而不易掌握。是 故對於具有過敏體質者而言，急需一種不具有副作用及不良反應 之安全穩定長期有效的消炎抗過敏產品。 6 201002333 過敏常見的症狀包含哞吸道過敏症，該症是一種免疫球蛋白 E(IgE)所媒介之一種過敏反應，參考Brinker刊登於『自然療術期 刊』（I Naturopathic Medicine，1993 年，4 期，64-68 頁）。呼吸道 過敏反應主要有兩型：立即過敏免疫反應及過敏性支氣管喘息。 立即過敏免疫反應包含過敏性鼻炎，過敏性鼻炎的發生係由抗原 與1班結合於吞嗟細胞(macrophage)及嗜鹼性白血球(Basophils) 上’造成該等細胞内cAMP減少，進而釋出組織胺等傷害因子。 當組織胺結合於受體上時’會引發一連串細胞内訊息傳遞，進而 導致血管擴張、毛細血管通透性上升、平滑肌收縮，進而產生鼻 塞流鼻水，打噴嚏等症狀。 而過敏性氣喘亦為IgE所媒介之免疫反應，在IgE與抗原結合 後’吞嗟細胞(macrophage)會分泌組織胺、花生四烯酸(arachid〇nic acid)之代謝物等’進而使周邊白血球釋出血小板激活因子，此因 子將引發強烈的支氣管氣喘現象發生。因此，對於—種天然不具 田J作用之穩疋長期有效且能抑制賊的抗過敏產品應具有龐大的 市場潛力。 【發明内容】 本發明之目的係提供—種可緩和過敏錄之乳汁萃取物，並藉 由抑制IgE財式提供抑制過敏反應之用途。 為達麟狀目的，本發_來緩㈣敏鎌之毅萃取物係 歹〗各4之方綠生.I先使產乳動物特在超高免疫狀態 (yPe_Une);並·乳動物收集乳七去除乳汁中之脂肪而生 201002333 成脫脂乳；利用巴斯德滅菌法將脫脂乳滅菌後(肋它至7〇它之間， 加熱10至20秒鐘）；透析此脫脂乳除去乳醣而成脫脂乳蛋白；而 後瘵除脫脂乳蛋白之水分；以及利用喷霧乾燥器乾燥脫脂乳蛋 白，而完成乳汁萃取物。此乳汁萃取物由接下來的活體實驗證實， 其^有顯著抑制血液中IgE的濃度之功能，同時令人驚舒的是乳 汁萃取物對於生物體本身先天免疫能力沒有抑制或明顯提升 之能力，因此本發某方面來說，日_具有 藥劑所無之優點卻能達成姻功效。 财類固醇 對於上述齡萃取物之乳汁來_由產鶴物轉在超高免 疫狀態(hyperimmune)，在本發明中，產乳動物可自牛、羊或能提 供類似大量料_帽其—；其巾為了_其超高免疫狀態， 可利用經口射魏動物或注料_方式雜紐抗原導入產 摘物體内。而其中_性抗狀錢混合少部分包含：金 ^色葡萄賴，·表皮鏈_ ;A1麵膿鏈麵；Μ型產膜鍵球 菌^型產膿鏈球菌；A8型產膿鏈球菌；M2型產腹鍵球菌； ^膿鏈球菌，A18型產膿鏈球菌；八22型產腹鍵球菌丨產 桿菌；綠腹桿菌；肺炎桿菌；傷寒捍菌；流行性感 :緩鏈韻；#通變轉菌；;肺炎雙球 刪高__; __繼鍵球菌等 本發明之另一目的係提供一錄 物，i凰协妥缺笠％私 了緩和過敏症狀之乳汁萃取 女之胎兒發育產生干擾且爾蒙因而不會使懷孕婦 又+具有生長遲緩、骨質疏鬆、血壓 201002333 升高、水腫、血中離子濃度過低等 婦女身體急f調養，此時若❹ 胃騎產生。產後 因其，包含呼吸麻痒、體循環衰蝎、上、==、 =蓋=及__，其中凝辦間過長對婦娜 =田，供—種缓和過敏症狀之乳汁萃取物且並無上述 ，用，疋故在某些情況下，本發明的確具有水楊酸類消炎劑所 無法達成的功效。 本發明之齡萃取物製财法巾，透析方式係可保留約 =，〇〇〇至100,000道爾頓分子的分子筛模進行超渗透過滤將乳醋 等小分子去除。然而2000至10,000道爾頓分子亦有少許存在於本 發明之乳汁萃取物中。在本發明之乳汁萃取物亦包含些許碳水化 δ物，這些峡水化合物之幾基官能基係繫於次單位鍵聯上，同時 這些碳水化合物亦含有側鏈氧化成羧酸根離子或碳水化合物並與 鈣離子錯合或是碳水化合物與脂肪族酸錯合，亦發現碳水化合物 與含氮化合物結合或碳水化合物與含填化合物結合或碳水化合物 與複合脂質結合以及這些碳水化合物不含實質硫化合物者。 【實施方式】 本發明提供一種乳汁萃取物，對免疫失調尤其是抑制血液中免 疫球蛋白E(IgE)之產生及降低細胞介白素IL-13、IL-10、IL-Ιβ、 IL-4及其他與過敏發炎相關因子TNFa與干擾素IFNy之分泌等用 途具有顯著效果。 201002333 以下說明僅為本發明實施例，不應作為本發明範圍之限制。 實施例h乳汁萃取物之製備 本發明之產乳動物係自下列動物方仍、.方仍 aeSyptiacus、Bos frontalis、Bos gaurus、Bos grunniens、Bos javcmicus、Bos planifrons、Bos primigenius、Bos sauveli、Bos taurus、
Cows ' Ovis aries ' Ovis canadensis ' Ovis dalli' Ovis musimon ' Ovis orientals、Ovis vignei、Ovis ammon 反 Capra aegagrus hircus 選矣 一。在較佳實施例中係以加wms為較佳實施例之產乳動物(在 http://en.wikipedia.org/wiki/Cow 網站中有詳盡的介紹）。 本發明之在超高免疫狀態(hyperimmune)下的產乳動物所分泌 之乳汁係本發明之乳汁萃取物的主要原料。而使產乳動物處於超 高免疫狀態的步驟如下： 1. 選擇抗原： 超高免疫狀態係經由投予包含至少部分下列各者之細菌性抗原 之多價混合物所誘生者：金黃色葡萄球菌；表皮鏈球菌；A1型產 膿鏈球菌；A3型產腹鏈球菌；A5型產膿鏈球菌；A8型產膿鏈球 菌；A12型產膿鏈球菌；A14型產膿鏈球菌；A18型產膿鏈球菌； A22型產腺鏈球菌；產氣桿菌；大腸桿菌；綠膿桿菌；肺炎桿菌； 傷寒桿菌；流行性感冒嗜血桿菌；和緩鏈球菌；普通變形桿菌； 赤痛i桿菌；肺炎雙球菌；粉刺出油酸菌；放線菌(厭氧菌）；突變練 球菌或無乳鏈球菌。 2. 藉由初始免疫使產乳動物(如加狀⑽)產生致敏化反應： 較佳初始免疫(primary immunization)的方法係藉由肌肉注射 201002333 (intramuscular injection)，然而在不同實施例中，靜脈注射 (intravenous injection)、腹膜内注射(intraperitoneal injection)、口服 法(oral administration)、直腸注射法(rectal suppository)等方法，將 適當劑量之上述細菌性抗原之多價混合物注射入產乳動物中。 3.藉由產乳動物之血清測試而證實致敏反應： 此步驟是為了證實產乳動物(如及^加狀泌)是否產生對於抗原 致敏之反應。有多習知的檢驗方法可以測得是否致敏(如文獻 Methods in Immunology and ImmunoChemistry, William, C. A., Chase, W. M. Academic Press, N.Y·，L〇nd〇n(v〇ls M)(l977))，這些檢驗方法包含皮膚 敏感、血清對致敏原敏感、免疫細胞對致敏原敏感等檢驗。如何 取決使用何種檢驗方法是由所使用之致敏原決定。本發明中，較 佳是使用含多種細菌抗原之多價疫苗去測試產乳動物(如五〇5 towmy)，分別在疫苗注射前與注射後，血清中抗體凝集 (agglutinating)現象。而在致敏後’乳汁抗體表現態可以用來調整 不同致敏原之最小適當劑量並用來致敏。 4·引發並維持超高免疫狀態(liyperimmune): 一旦產乳動物(如5〇?_雇)已經顯示致敏，產乳動物(如 towms)之咼免疫狀態將反覆於一定適當時間間隔施予上述劑量之 致敏原以維持。通常上述時間間隔是由致敏原之特性來決定。不 過對於多價細g致敏絲說適當之時間間隔為兩個禮拜。此外， 要/思的疋’要盡置避免引發免疫耐受性細皿咖^^肪㈣，因 為對於致敏原之免疫财受性將使產乳動物所分泌之乳汁中不具有 抗過敏效用之特性。 11 201002333 為了避免上述免疫耐受性現象發生，可以採用不同之上述致敏 化方法’例如初始免疫伽肌肉注射方法，但f丨發超高免疫狀態 (hyperimmune)注射時可用靜脈注射、腹膜内注射、口服法或直腸 注射法等其它可提供類似功效之方法來引發超高免疫狀態，藉由 上述方法或其混合方法來致敏或引發超高免疫狀態都可大幅減低 免疫耐受性發生之可能。 5.測試高免疫狀態乳汁對於支氣管及肺部之改善能力： 在較佳實施例中，兔子及大鼠的組織適合來當實驗組織，在實 驗中，使兔子或大鼠食用超高免疫狀態乳汁並當成實驗祖；同時 以只餵食一般乳汁之兔子或大鼠當成控制組，經過數周後犧牲這 些實驗動物後，其肺部及支氣管部分取出以進行下列實驗：用掃 描式電子顯微鏡掃描肺支氣管以觀察是否有内皮細胞損害或有細 胞殘骸；並利用穿透式電子顯微鏡進行血管觀察是否有脂肪堆 積、内皮細胞退化、脂泡細胞油脂堆積及組織切片分析，例如用
Oil Red或Sudan Black當成oil-soluble dye來處理冷凍切片組織， 或是針對細胞色素氧化酶(cytochrome oxidase)免疫染色來證實是 否有吞噬細胞作用發生，並觀察是否有嗜中性白血球或其他白血 球滲透入肺組織中。 6·收集及處理超高免疫狀態(hyperimmune)乳汁： 乳汁藉由傳統方法收集後被分開保存，必須注意乳汁中對於抗 過敏的有效成分的保留而維持溫度5它至2〇。〇，較佳為9。(：至12。〇 保存12至36小時，較佳為20至28小時。一般來說乳汁中有效 成分通常會因熱失去活性(heatsensitive)，因此較佳係採用低溫巴 12 201002333 斯德滅肢溫度㈣在m至机·，持射_2〇秒到10 秒之間、後降溫3 C至15°C之間’較佳為6°C至l〇°c之間。一般 係採用脫脂標準程序(此時約贼至机之間，較佳為坑至航) 將乳汁中的脂肪(cream)移除後，始利用低溫巴斯德滅菌法(如前述） 將脫月曰乳滅菌’才再利用超滲透過濾、方式(ultra他加置⑽將工千至 10萬道爾頓以内的分子保留，較佳係以1千至3萬道爾頓以内的 刀子保留，最佳係保留2千至5千道爾頓以内的分子並將其餘成 分去除，利用噴霧乾燥器乾燥此脫脂乳。並使用習知喷霧乾燥法 利用真空(此時約80°C至5(TC，較佳為70〇C至60。〇將此脫脂乳的 有效成为在低溫中被保存(參考K〇sik〇wski，F，“Cheese — Femented MUkProducts，，，2dEd，而)，最後有效成分能被保存於乳汁萃取物 中’換言之’乳汁萃取物(包含乳脂粉末或奶粉以及進一步萃取的 乳斤菁華)含有對抗過敏具有功效之有效成分。而乳汁菁華之製備 流程如下：得自超高免疫狀態牛之乳汁20公升並將乳汁利用乳酪 分離機(德拉瓦型號102)來去除脂肪(cream)。得到約16公升的脫 脂乳’再使用中空纖維滲透機/濃縮機(阿米康DL_10L)超滲透過濾 來去除高分子量分子(超過丨〇萬道爾頓脫脂乳於儀表上以8〇泵 送速度及分別為30psi及25psi之入口及出口壓力流動。並以每小 時4公升流速從匣中送出2〇公升濾液，濾液經冷凍或凍乾後供儲 存及進一步純化用。利用DEAE_西法雷斯CL6〇B膠(法瑪)用來填 充5X10cm玻璃柱，並以無菌二次蒸餾水pH7 0平衡後，以流速 160 ml/hr的無菌二次蒸餾水當成移動相來分離有效成分後。再利 用西法雷斯G-10樹脂(法瑪)填充入2.5X80公分玻璃柱内，且以無 13 201002333 菌二次蒸顧水ρΗΧΟ平衡。以3〇m/hr流速收集，併用254rnm及 280mm(法瑪都光學單元)監視並連接記錄器來記錄並收集有效成 分。 實施例2乳汁萃取物之品質管理標準 本實驗之乳汁萃取物是藉由ELISA方法決定牛的抗如0郎/仏 ⑼妙脱&抗體之量來進行品質控管。並利用Ra(Jial immunodiffiision(RID)法，定量全部igG抗體含量。 實驗設備及耗材包含：96-well盤；校正後之1管、8管、以及 12管之pipettor ; 96-well盤讀取儀器；96-well盤清洗器； washing/dilution buffer(Tris pH 7.2/0.05 % Tween) ； Blocking reagent(l% heat-treated skim milk) ； Coating reagent(&/wo«e//a emmYzVfc ATCC # 13076); Assay standard(未稀釋之專一性係 2025 單位）；偵測抗體(Peroxidase-labeled goat anti-bovine IgG) ; TMB 受 貝（3,3 -5,5，-tetramethylbenzidine); 2N H2SO4; Coating buffer(borate saline，pH 8.5) ; Humidity chamber ; MicrocentrifUge 離心機；計時 器’離心管。上述所有的coating buffer，blocking reagent及 washing/dilution buffer需經標準程序處理；所有耗材及器材需經認 證之製造商購得。 實驗流程： 1·將溶於 coating buffer 之 10yg/ml 塗佈於 96-well 盤’每 weii 含有 1〇〇μ卜 2·將之置放於Humidity chamber至少18小時5°C±4°C，最長能 存放至7天。 201002333 3. 加入至少 250μ1 之 Blocking reagent 至每個 well，搖晃 20-60 分鐘 23°C±5°C。 4. Vortex後這些樣本於500-1000g離心力離心2-3分鐘後，將上 ' 清液取來當後續實驗樣本。 * 5.稀釋樣本及正控制(p0Sitive control)於 washing/dilution buffer。 6. 加入 200μ1 之 washing/dilution buffer 入 8 個 well 中以標準樣 本做序列稀釋。 7. 用 300μ1 之 washing/dilution buffer 洗 96-well 盤兩次’後加入 50μ1 washing/dilution buffer 到每個 well。 8. 將序列稀釋之標準樣品置入實驗96-well盤，每個well 50μ1。 9. 將此實驗96-well盤置入Humidity chamber 1小時±10分鐘， 溫度約23°C±5°C。 10. 用 300μ1 之 washing/dilution buffer 洗 96-well 盤兩次後，加入 100‘ul detecting antibody，並用 washing/dilution buffer 適當稀釋。 11. 將此實驗96-well盤置入Humidity chamber 1小時±10分 ^ 鐘，溫度約23°C±5°C。 12. 用 300μ1 之 washing/dilution buffer 洗 96-well 盤兩次後，加入 100μ1 detecting antibody ° 13. 加入100μ1之TMB受質於每個weu，將實驗96-well盤置入 96-well盤讀取儀器一直到OD值第一序列稀釋的前兩個稀釋weu 在650nm吸光值超過1.0，後根據經驗，加入2NH2S04溶液以停 止反應，並作用4-10分鐘。 14. 在30分鐘内用96-well盤讀取儀器在吸光值450nm讀取數 15 201002333 值’標準曲線應該是在450nm吸光值有最大〇D值約2〇_2 5，最 後OD值也應在0.01-0.5之間以完成一標準曲線，否則實驗數據將 予以廢棄。 15.藉由標準曲線來計算每個樣本的真實數值。 . 16·並以正控制之數值來當成實驗數值是否接受的一種指標。 最後「品質標準」係以⑴每100公克具有大於600毫克之免疫 球蛋白G及(2)每公克具有大於6〇〇〇抗體力價之專一性抗體(以上 ， 述ELISA實驗過程），而再利用The Binding版Ltd所生產之 實驗kit進行實驗，其方法大致:將本發明之乳汁萃取物放入培養 孔中’靜置24至48小時後，再測量其直徑大小，與標準值對照， 算出IgG免疫球蛋白濃度。 品管標準表： 1.化學試驗 -------- —單位 -----Ί 規格 卡路里 "---- Kcal/100g ------- >330 蛋白質 ----— Lg/100g ---- >80 脂肪 -------- g/100g ----__ <3.0 碳水化合物 . g/100g --- <6.0 鈉 jng/l〇〇g ----- <100 灰質 g/lOOg --- <8.0 濕度 ~~--- g/lOOg ----- <6.0 201002333 2.物理試驗 單位 規格 溶解度 % >94 粗比重 g/ml 0.3-0.4 3.免疫試驗 單位 規格 ELISA 抗體力價/g >6000 全部 IgG(RID) mg/100g >600 4.微生物試驗 單位 規格 嗜氧性細菌數 cfu/g <15,000 黴菌&酵母菌 cfu/g <10 大腸菌群細菌 cfu/g 未偵測到有任一 大腸桿菌 cfu/g 未4貞測到有任一 葡萄球菌凝固酶陽性 /g 未4貞測到有任一 沙門氏桿菌 /750g 未偵測到有任一 單核球增多性李氏菌 /25g 未4貞測到有任一 實施例3實驗設計 a.實驗動物：建議選用小鼠，常用的Balb/c或是B6小鼠皆可， 6-8週大，雄鼠或雌鼠皆可，每組隻數為單一性別至少10隻，並 飼養於無特定病源之環境，每組老鼠均分開飼養。 17 201002333 控制組.银食〇.4mL去離子水(d dH2〇)(有接下來的致敏步驟) 中劑里乳汁萃取物組：餵食2g乳汁萃取物B〇dy Weight(溶於 d.d H20)，餵食 0.4 mL。 冋劑量乳汁萃取物組：餵食4g乳汁萃取物B〇办 Weight(溶於 d.d 氏0)，餵食 0.4 mL。 未致敏對馳：絲a4mL去料水(d d邮)(無接下來的致 敏步驟） b. 致敏小鼠.本動物實驗之過敏免疫反應是⑽腔注射過敏原 的模式進行’採用過敏原作為抗原，可以氫氧化銘作為佐劑 (adjuvant)，在注射抗原前及注射抗原一週後以眼寓採血，取得血 清進行抗原特異性抗體濃度之分析，確定動物過敏模式之建立， 必要時須致敏二至四次。對於呼吸道過敏之動物模式，宜另以喷 霧致敏法使從呼吸道接觸過敏原，鼻腔過敏之動物模式宜以鼻腔 接觸過敏原等各種不同過敏動物模式。 本發明之致敏過程如下： 第一次腹腔注射(周齡 8)〇VA(10ug OVA+2 mg Α1(〇Η)3/ 0.2 mL PBS)入老鼠； 第二次腹腔注射(周齡 l〇)〇VA(30ug OVA+2 mg Α1(〇Η)3/ 0.2 mL PBS)入老鼠； 第三次腹腔注射(周齡 12)OVA(30ug OVA+2 mg Α1(ΟΗ)3/ 0.2 mL PBS)入老鼠；並於周齡約η、14及16分別眼窩採血。 c. 測定血液抗體濃度 (1)可利用sandwich-ELISA免疫呈色反應法，定量血清中免疫 201002333 球蛋白IgE、IgG、IgM、IgA和總抗體含量。 利用免虹色反麟啦免疫轉自濃度：將喊加入表面已 覆盍免疫球蛋自抗獅％孔财，靜歧應後，再加人標有呈色 酵素的抗體作用’最後加人呈色劑並與標準值對照，經由可見光 吸光測定分析計算便可以算出免疫球蛋白濃度。 (2)過敏原誘發的特異性抗體產生。 利用免疫呈色反應法測定抗原特異性免疫球蛋白濃度：將血清 加入表面已覆蓋過敏抗原的96孔盤中，靜置反應後，再加入標有 ^色酵素的抗老鼠IgE、IgGi或等抗體作用，最後加入呈色劑並與 標準值對照，可見光吸細定分析計算便可轉出免疫球蛋 白濃度。 脾臟或是淋巴結細胞增生反應 細胞增生能力即指免疫細胞受到刺激時，能夠增生的能力。故 增生能力之表示，以添加裂殖素後，細胞增生的數值為未添加裂 殖·素時數值的倍數’稱為增生指數(Stimuiati〇n index)，簡稱s. I.。 本實驗的細胞增生的刺激物須包括過敏原和裂殖素，T細胞須 以過敏原刺激培養，另可使用如ConA、PHA等裂殖素或抗CD3 抗體的刺激劑，以分析T細胞的增生反應。B細胞須以過敏原刺 激培養，另可使用如LPS來刺激，分析B細胞的增生反應。 進行步驟有以下三種方法： 3 (1) H-thymidine 嵌入法 本方法較靈敏，將脾臟細胞2x 106/ml置於96孔盤，再加入RPMI 培養基或分別添加有LPS、Con A、PHA等細胞裂殖素的培養基。 201002333 於37 c二氧化碳無菌培養箱培養兩天後，加入1 y Ci/Well H-thynudine ’繼續培養2〇小時後’以細胞收集儀收集細胞於濾 紙上，濾紙風乾後以閃爍計數儀測3H_thymidine含量，計算細胞 增生能力。 (2) MTT 法 MT丁的測定方法，是利用細胞本身的酵素對受質的作用，產生 顏色的變化，再進一步測定其吸光值。如果細胞受到細胞裂殖素 的刺激，增生越多，則活的細胞愈多，酵素的活性就會較高，可 以測到較高的吸光值。糊此―原理，也可以來測定細胞的增殖 反應，但是此種測定方法通常對附著性細胞的準確度較高，對懸 浮性細胞則較不理想’細胞數與吸光值的直線相關有飽和現象， 吸光值無法代表細胞數值，以致較不靈敏，進行本實驗時應特別 注意。 e.細胞激素分泌實驗 將分離出的淋巴球以5xl〇6/ml的濃度置於24-孔盤中，利用已 經定量過的過敏原、Con A或抗CD3抗體來刺激這些淋巴球。經 過24到48小時的培養後，將上層液離心下來，以測定其細胞激 素製造的量。在取得足夠檢體以前，可將其它檢體先保存在_7(rc， 等到檢體足夠時再一起測試。細胞激素的測定是利用 sandwich-ELISA法。先將抗細胞激素的抗體先覆蓋在24_孔盤上， 在4°C靜置一晚，在進行實驗前先以1% PBS_BSA處理清洗去多 餘抗體。再加入測定的樣品至24-孔盤，於室溫2小時後加入biotin 聯結的抗細胞激素抗體》兩小時的室溫靜置後，加入avidin聯結 20 201002333 過氧化酵素（avidin-linked peroxidase )，再靜置二個小時後加入受 質以呈色。上述的裂殖素的濃度及刺激時間在實驗進行之前都應 先測定其最適當的濃度，並以已知濃度的細胞激素作為對照。 f.呼吸道肺沖洗液之分析 1·發炎細胞數量及種類分析，如：嗜伊紅性白血球、中性白血 球、單核球及淋巴球等 犧牲氣隻後’剪開氣管露出小洞，以靜脈置留管插入氣管，軟 管綁緊後，以生理食鹽水沖洗肺部5次，回收肺沖洗液放入離心 管離心，取上清液保存待分析。下層細胞以含BSA生理食鹽水溶 開，經trypan blue dye exclusion法染色’以細胞計數器計算所有存 活白血球數目。裴置好玻片後，取細胞液置於cyt〇spin離心管， cytospin後取下载玻片風乾，取Liu A染劑染色3〇秒，從背面以 水龍頭沖去多餘染劑，風乾，取LiuB染劑染色6〇秒，再沖去多 餘染劑’風乾，觀察染色成果。以阿拉伯膠封片，以油鏡判讀至 少五個視野之細胞或總數2〇〇個以上之細胞組成，計算判讀細胞 所佔總細胞之數目。 2.發炎相關介質分析，如：組織胺、細胞激素及趨化激素 組織胺可以HPLC方法分析，唯樣品中組織胺回收率較低，目 前組織蚊量多以市售的組織胺測定試劑組分析。細胞激素與趨 化激素分析方法如前所述。 實施例4對生長狀況的影響 21 201002333 如表卜表2所示給予卵蛋白致敏的BALB/c雌鼠餵食乳汁萃 取物兩周_，觀察小鼠生長狀況，巾、高缝乳料取物組對 終體重、飼料攝取、攝食效應和器官重量均細著差異。 實施例5對吞嗟細胞能力的影響 給予印蛋白致敏❺BALB/c雌鼠假食乳汁萃取物兩週後，進行吞 嗤細胞活性測試’此測試中吞嗤細胞可以分別測定單核球 (monocyte)或疋中性白血球的吞嗤能力，目前可以分別利用吞嗟細 菌如尺d戈酵母菌等方法來加以測定，也可以利用已標記好的 五·—（如f光）’在細胞吞微利用螢光流體計數儀來加以分析。 以上述方法測試小鼠血液中呑噬細胞能力。結果如圖1所示，活 化則的底值各組無顯著差異。活化後，中劑量乳汁萃取物組小鼠 的血中顆粒性白血球佔血球總數比例雖然顯著低於控制組，但吞 噬活性各組之間並無顯著影響。 因此，雖然可能因其他血球數增加的關係使顆粒性白血球相對 上所佔的百分比較低，以及未致敏組無致敏處理下顆粒性白血球 的比率較高的現象，但各組間對吞噬活性無顯著差異，顯示餵食 乳汁萃取物並未顯著影響先天自然免疫力的吞嗟活性。 實施例6具有對抗過敏原顯著抑制免疫球蛋白e的功能 給予卵蛋白致敏的BALB/c雌鼠餵食乳汁萃取物兩週後，免疫 球蛋白之定量方法如實施例3所述，如圖2所示對血清中的總抗體 濃度的影響方面’餵食乳汁萃取物組之抗體濃度與控制組雖無顯 22 201002333 者差異’但在餵食前後抗體濃度增加倍數，中劑量組有顯著抑 A液中總IgE增加的效果，如圖3所示。 在圖4中，對血清中的卵蛋白(OVA)特異性抗體濃度的影響方 .面i如實施例3所述之致敏反應後，中、高劑量乳汁萃取物組均 顯著降低血清中抗印蛋白IgG〗的含量，也都有降低抗印蛋白城 含量的趨勢。管餵後如圖5所示，代表第二型τ輔助細胞抗印蛋 白IgG，IgE的增加倍數，在中、高劑量乳汁萃取物組也都顯著 較低’代表第-型T輔助細胞的抗印蛋白每士的增加倍數在中劑 量乳汁萃取物組也有較高的趨勢。因此，本趨勢顯示致敏過程中， 各類抗體的分泌趨勢，可受到餵食乳汁萃取物的影響，使第二型 的過敏抗體分泌能力較低，第一型的防禦性抗體分泌能力略增， 對免疫平衡發展應具有正面的調節作用。 實施例7乳汁萃取物對呼吸道阻力的影響 本發明之實驗步驟如實施例3致敏後，約在周齡15時給予吸 入性刺激’每隻小鼠在最後一次吸入式致敏的隔天進行肺功能測 定，使用whole body plethysmography (Buxco)，以噴霧的方式依序 吸入 3 分鐘的 〇、3.125、6.25、12.5、25 mg/mL methacholine，再 分別測定3分鐘，記錄肺功能指標Penh (Enhanced Pause)值。因 此給予卵蛋白致敏的BALB/c雌鼠餵食乳汁萃取物兩週後，吸入 平滑肌收縮劑methacholine (Mch)測試小鼠的呼吸道阻力。結果 顯示於圖6，在濃度漸增的Mch刺激下所造成的呼吸阻力，餵食 乳汁萃取物組有較低的現象，在12.5 mg/mL Mch時刺激時更達顯 23 201002333 著差異性。因此’财萃取物應有助於賊過敏⑽造成的呼吸 阻力現象(例如氣喘或支氣管炎）。 實施例8乳汁萃取物對肺沖洗液中細胞激素與細胞種類的影響 本發明之實驗步驟如實施例3進行呼吸道肺沖洗液之分析。給予 卵蛋白致敏的BALB/e雖驗食乳汁萃取物兩週後，犧牲氣隻， 測定肺沖級巾各細驗素含量與計算各種齡祕目。中、高 劑量乳汁萃取物組均可_降低肺沖洗液巾絲促發炎細胞激素 的IFNy含量’南劑魏汁萃取物可麟降低造成呼吸道氣喘的主 要、細胞激姐·13的含量如表3所:顯轉汁萃取物可抑制氣管與 肺内發炎性_激素含量，有祕親發炎性峨雜的正面效 果。同4可由表3觀察到不只il-13連IL-10、IL-Ιβ、IL-4及其他與 過敏發炎相關因子TNFct與干擾素正脚都有下降的趨勢，因此可推 斷乳汁萃取物對於該些過敏發炎因子具有抑制的功能。 肺沖洗液中各種類細胞數目結果可由圖7所顯示，高劑量乳汁 萃取物具有減少嗜伊紅性白血球聚集到肺部的效果。因此，有助 於減緩肺部過敏性發炎反應。 實施例9乳汁萃取物對脾臟細胞分泌細胞激素的影響 本發明之實驗步驟如實施例3之脾臟或是淋巴結細胞增生反應 所述。給予卵蛋白致敏的BALB/c雌鼠餵食乳汁萃取物兩週後犧 牲，將取得之脾臟細胞進行體外培養，測定脾臟細胞在不同裂殖 24 201002333 素刺激之下分_細胞激素含量。第一型τ _細胞細胞激素結 果如表4，此時il_2並無明顯抑制或明顯增加的現象發生。中、 =劑量乳汁萃取物均可顯著降低卵蛋白刺激下脾臟分泌麵丫的 能力，進一步確認本發明在肺沖洗液中的趨勢， ㈣沖洗射—分抑。聊可 與單核球等促發炎性細胞，齡乳汁萃取物可使小鼠受到特定抗 原（卵蛋白）刺激時有顯著較低的正外分泌能力，顯示乳汁萃取 物具有降低呼吸道與全身性發炎反應的功效。同時也代表餵食乳 汁萃取物對另一種代表第_型τ輔助細胞的細胞激素，IL_2，並 無顯著影響。 第二型T輔助細胞細胞激素結果如表5，中、高劑量乳汁萃取 物均可顯著降低IL-4的含量，il-4會促使naifve T輔助細胞傾向分 化成&成過敏的弟二型T輔助細胞，也會使b細胞同型轉換成jgp 與IgG〗生成細胞，促使過敏反應的形成。因此，乳汁萃取物可能 透過降低特定抗原卵蛋白刺激下的IL_4分泌量，間接減少抗卵蛋 白IgE與IgG】的生成。此外本發明證實餵食乳汁萃取物對其他第 二型T輔助細胞細胞激素IL_5，無顯著影響。 實施例10乳汁萃取物對免疫細胞生長的影響 本發明之實驗步驟如實施例3之脾臟或是淋巴結細胞增生反應 所述。給予卵蛋白致敏的BALB/c雌鼠餵食乳汁萃取物兩週後， 以培養，利用3H-thymidine嵌入法測定脾臟細胞增生能力，結果 如圖8。在特異性抗原卵蛋白的刺激下，餵食乳汁萃取物組對脾臟 25 201002333 的增生能力無顯著差異，顯示餵食乳汁萃取物對致敏的特異性抗 原無顯著影響。在B細胞裂殖素LPS刺激下’乳汁萃取物具有增 加脾臟細胞增生的效果，在T細胞裂殖素PHA刺激下脾臟細胞增 生能力無顯著差異。顯示餵食乳汁萃取物可以增加B細胞的增生 能力，但不會影響T細胞的增生能力’對致敏抗原刺激下脾臟細 胞的增生能力亦無顯著影響。 本發明已由上述相關實施例加以描述’然而上述實施例僅為實 施本發明之範例。必需指出的是，已揭露之實施例並未限制本發 明之範圍。相反地’包含於申請專利範圍之精神及範圍之修改及 均等設置均包含於本發明之範圍内。 【圖式簡單說明】 圖1顯示以乳汁萃取物對吞噬細胞能力的影響，發現吞噬活性 各、'且之間並無顯著影響並顯示餵食乳汁萃取物並未顯著影響先天 自然免疫力的吞嗟活性。。 圖2顯示乳汁萃取物對抗體生成的影響，發現假食乳汁萃取物 組=抗體濃度與控制組雖無顯著差異，因此顯示乳汁萃取物並未 顯著影響後天自然免疫力。 前德圖博取物對抗體生響㈣—實施例中，在餵食 绝數’中紐乳汁萃取物纟轉顯著抑制血液中 ===顯術萃取物對於丨發之過敏 圖4顯示乳汁萃取物對特異性抗體生成影響的實施例中，中及 26 201002333 ^劑量乳汁萃取物組均顯_低血射抗即蛋自挪的入 都有降低抗印蛋自IgE含量 頻 丄3也 所引發之過敏性症狀具有舒緩的=果因此顯不封卒取物對於賊 .代表圖第5r=孔辅trr對抗體生成影響的另一實施例中，管餵後 -、、’田匕抗印蛋白IgG!和1班的增加倍數，在中、 軸著較低，代表第-型τ獅細胞的抗 勢，因此H 在中劑量乳汁萃取物組也有較高的趨 示致敏過程中，各類抗體的分泌趨勢可受到 射卒取物的鱗，使第二咖職抗體分祕力較低，第 調性抗體分泌能力略增，對免疫平衡發展應具有正面的 ^ 6顯不乳汁萃取物對呼吸道阻力影響的實施例中，發現在濃 二刺激下所造成的呼吸阻力，餵食乳汁萃取物組有較 ，在12.5mg/mLMCh時刺激時更達顯著差異性。因此， 物應有助於減緩過敏性所造成的呼吸阻力現象(例如氣喘 敦又氣管炎）。 β圖7顯不乳汁萃取物對免疫細胞生長影響的實施例中，發現高 劑罝礼汁萃取物具有減少嗜伊紅性白血球聚集到肺部的效果。因 此’有助於減緩肺部過敏性發炎反應。 卜"具示乳/十萃取物對肺沖洗液中細胞激素與細胞種類影響的 實蝴中’發現在18細胞裂殖素LPS刺激下，乳汁萃取物具有增 生At臟2胞^生的效果’在Τ細胞裂瘦素ΡΗΑ刺激下脾臟細胞增 生此力無顯著差異。顯示餵食乳汁萃取物可以增加Β細胞的增生 27 201002333 能力，但不會影響τ細胞的增生能力，並對致敏抗原刺激下脾臟 細胞的增生能力亦無顯著影響。 28 201002333 表1 .餵食乳汁萃取物對BALB/C小鼠生長情形與攝食的影響 組別 η 初體重 (g) 終體重 (g) 飼料攝取 (g/day) 攝食效應 (%) 控制組 10 22.4 ± 1.55 21.4 ± 1.54 3.41 ±0.27 1.42 ±0.98 中劑量奶粉組 10 21.5 ±2.49 22.3± 1_55 3.51 ±0_11 2.00 ±0.89 高劑量奶粉組 10 22.1 ± 1.09 21.3 ± 1.25 3.47 ± 0.34 1.86±0_92 致敏控制組 4 21.4 ± 1.07 20.1 ± 173 3.73 ± 0_47 1_53±1_59 表2 .餵食乳汁萃取物對BALB/c小鼠器官重量的影響 組別 肺臟 脾臟 肝臟 心臟 腎臟 η 絕對重量（g) 碑制組 10 0.41±0.07 0.08+0.01 1_15±0.14 0.12±0.01 0.27±0.02 ，劑量奶粉組 10 0.43±0.05 0.08±0.02 1.13±0_12 0.12±0.01 0.27±0.03 高劑量奶粉組 10 0.42±0.05 0.07±0.01 1_02士0_21 0.12±0.02 0.27±0.02 致敏控制組 4 0.32±0.09 * 0.07±0.01 1.08±0.14 0.12±0.03 0.27±0.03 η 相對重量（％) 控制組 10 1.91±0.31 0.36±0.06 5.36±0.39 0.57+0.05 1.26±0.09 中劑量奶粉組 10 1.95±0.20 0.35±0.06 5.06±0.33 # 0.54±0.05 1.22±0.01 高劑量奶粉組 10 1.99±0.28 0.32±0.06 4.89 士 0.83 0.57±0.05 1.26±0.09 致敏控制組 4 1_57±0_18 * 0.35±0.05 5.35±0.26 0.59±0.08 1.32±0.08 *與控制組進行统計分析有顯著差異(*/?<0.05, Student's 〖test) #與控制組進行統計分析有顯著差異(#0.05<p<0.1, Student's itest) 29 201002333 表3_餵食乳汁萃取物對BALB/c小鼠肺沖洗液中細胞激冬卑 組別 η IL-5 (ng/mL) IL-4 (pg/mL) IL-11 (pg/mU ίπη/ml \ 控制組 10 1.93±1.69 54.3±62.8 302±133 45_1土31.9 中劑量奶粉 10 組 1.4110.71 34.9±39.0 268±141 34.8±21.7 高劑量奶粉 10 組 2.09±1.18 73.2±68.6 188±90.1 * 39.4±29.5 致敏控制組 4 .. *--- 0·01±0·01 * 16.4±17.1 29±19.9* 43_6±44.8 IFNy TNFa IL-Ιβ Eotaxin η (pg/mL) (pg/mL) (pg/mL) (ng/mL) 控制組 10 557±168 125±46_1 43.6±18.1 8.40±6.68 中劑量奶粉 10 組 301 ±235* 100±59.2 38.7±15.7 6_10 土 3_16 高劑量奶粉 10 經 210±80.6 * 95.1 ±60.6 32.7±15.4 9.57±6.88 致敏控制組 3 —— 813±572 88.0±58.3 24.8±14.4 3.62±3.06 與控制組進行統計分析有顯著差異(* p<〇 〇5, Student_s f test) 與控制組進行統計分析有顯著差異广〇 〇5<p<〇彳，Student,s ftest) i- ί 控制組 中劑量奶粉組 致敏控制組 控制組 中劑量奶粉組 丨量奶粉組 組
0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 〇 上ό ± ό.όο η ------ 10 10 _ 自發性 非特異性 特異性 ConA OVA 一 IL-2 (ng/mL) 0.00 ± 0.00 1.93 ± 1.07 0.07 ± 0-04 0.00 ± 0.00 1.65 ±0.50 0.05 ± 0.03 0.00 ± 0.00 1.70 ±0.55 0.04 ±0.03 _ 0.00 ± 0.00 3.09 ± 1.69 0.00 ± 0_00 * IFNy (ng/mL) 2.64 ± 3.04 2·42 ± 2_97 1.37 士 1.78 Ζ84Ϊ2.Ϊ2 0.29 ±0.13 0.09 ± 0.07 * 0.09±0.10*__ 0.00 ± 0.00 * 30 201002333 表5.餵食乳汁萃取物對BALB/c小鼠脾臟細胞Th2細胞激素分泌量的影響
自發性 非特異性 特異性 __ ConA OVA η IL-4 (pg/mL) 控制組 10 0.00 ±0.00 56.4 ± 44.8 17.2 ±6.69 中劑量奶粉組 10 0.00 ±0.00 73.9 ±85.4 11.8 ± 6.53 # 高劑量奶粉組 10 0.00 ±0.00 42.6 ±45.2 10.1 ±4_98* 致敏控制組 4 0.00 ± 0.00 29.1 ± 19.2 0.0 ± 0.00 * 门 U (ng/mL) 控制組 10 0.00 ± 0.00 1.07 ±0.42 1.94 ± 1.00 中劑量奶粉組 9 0.00 ± 0.00 1.39 ±0.60 2.04 ± 0.67 高劑量奶粉組 10 0.00 ± 0.00 1.15 ±0.69 1.99 ± 1.00 致敏控制組 4 0.00 ±0.00 0.91 ±0.85 0.00 ±0.00* η IL-13 (pg/mL) 控制組 10 0.00 ± 0.00 285 ±197 417±210 中劑量奶粉組 10 0.00±0.00 303±188 330±118 高劑量奶粉組_ 10 0.00 ± 0.00 210±149 300 ±148 致敏控制組 4 0.00 ± 0.00 373 ± 279 0·0±0·0* *與控制組進行統計分析有顯著差異(*p<0.05, Student's itest) #與控制組進行統計分析有顯著差異(#0.05<p<0.1, Student's ί test) 31