TW200950778A - Methods of using Apo2L/TRAIL to treat cancer - Google Patents

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Description

200950778 六、發明說明： 本申請案根據119(e)部分主張2008年5月14日申請之臨時 申請案第61/127,528號及2008年5月28日申請之臨時申請案 • 第61/130,048號的優先權，該等申請案之内容係以引用的 • 方式併入本文中。 【先前技術】 ，在此項技術中已鑑別屬於腫瘤壞死因子（TNF)總科之各 種配體及受體。該等配體中包括腫瘤壞死因子-a(「TNF-® α」）、腫瘤壞死因子-β(「TNF-β」或「淋巴毒素-α」）、淋 巴毒素_β(「LT-β」）、CD30配體、CD27配體、CD40配 體、ΟΧ-40配體、4-1ΒΒ配體、LIGHT、Αρο-1配體（亦稱為 . Fas配體或CD95配體）、Αρο-2配體（亦稱為Apo2L或 TRAIL)、Apo-3 配體（亦稱為 TWEAK)、APRIL、OPG配體 (亦稱為RANK配體、ODF或TRANCE)及TALL-1(亦稱為 BlyS、BAFF 或 THANK)(參見例如，Ashkenazi, Nature Review, 2:420-430 (2002) ; Ashkenazi 及 Dixit，Science, 281:1305-1308 (1998) ; Ashkenazi 及 Dixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000) ； Golstein, Curr. Biol., - 7:750-753 (1997) Wallach, Cytokine Reference, Academic
Press, 2000，第 377-411 頁；Locksley 等人，Cell, 104:487-501 (2001) ; Gruss及 Dower，Blood, 85:3378-3404 (1995); Schmid等人，Proc. Natl. Acad. Sci·, 83:1881 (1986); Dealtry 等人，Eur· J. Immunol.，17:689 (1987) ; Pitti 等 人，J. Biol. Chem·，271:12687-12690 (1996) ; Wiley等人， 140371.doc 200950778
Immunity，3:673-682 (1995) ; Browning等人，Cell, 72:847-856 (1993) ; Armitage 等人 Nature，357:80-82 (1992); 1997年1月16日公開之WO 97/01633 ; 1997年7月17日公開 之 WO 97/25428 ; Marsters 等人，Curr. Biol.，8:525-528 (1998) ; Chicheportiche 等人，Biol. Chem.，272:32401-32410 (1997) ; Hahne等人，J. Exp. Med.，188:1185-1190 (1998) ; 1998 年 7 月 2 日公開之 WO 98/28426 ; 1998 年 10 月 22日公開之WO 98/46751 ; 1998年5月7日公開之WO/98/ 18921 ; Moore等人，Science, 285:260-263 (1999) ; Shu 等 人，J. Leukocyte Biol” 65:680 (1999) ; Schneider等人，】· Exp. Med.，189:1747-1756 (1999) ; Mukhopadhyay等人，J. Biol. Chem.，274:15978-15981 (1999))。 由該等TNF家族配體所介導之各種細胞反應的誘導通常 藉由該等配體與特異性細胞受體結合而起始。一些（但非 全部）TNF家族配體與細胞表面「死亡受體」結合，且經由 該等「死亡受體」來誘導各種生物活性以活化卡斯蛋白酶 (caspase)或進行細胞死亡或細胞凋亡路徑之酶（Salvesen等 人，Cell, 91:443-446 (1997))。迄今為止所鑑別之TNF受 體總科之成員中包括TNFR1、TNFR2、TACI、GITR、 CD27、OX-40、CD30、CD40、HVEM、Fas(亦稱為 Apo-1 或 CD95)、DR4(亦稱為 TRAIL-R1)、DR5(亦稱為 Apo-2 或 TRAIL-R2)、DcRl、DcR2、骨保護素（〇PG)、RANK 及 Αρο·3(亦稱為 DR3 或 TRAMP)(參見例如 Ashkenazi, Nature Reviews, 2:420-430 (2002) ; Ashkenazi 及 Dixit, Science, 14037l.doc 200950778 28.1:1305-1308 (1998) ; Ashkenazi 及 Dixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000) ; Golstein, Curr. Biol” 7:750-753 (1997) Wallach, Cytokine Reference, Academic Press，2000，第 377-411 頁；Locksley等人，Cell，104:487-501 (2001) ; Gruss及 Dower，Blood，85:3378-3404 (1995); Hohman等人，J. Biol. Chem·，264:14927-14934 (1989)； Brockhaus 等人，Proc. Natl· Acad· Sci.，87:3127-3131 (1990) ; 1991 年 3 月 20 曰公開之 EP 417,563 ; Loetscher 等 人，Cell，61:351 (1990) ; Schall 等人，Cell，61:361 (1990) ; Smith 等人，Science，248:1019-1023 (1990); Lewis等人，Proc. Natl. Acad. Sci·，88:2830-2834 (1991); Goodwin等人，Mol. Cell. Biol·，11:3020-3026 (1991); Stamenkovic等人，EMBO J·, 8:1403-1410 (1989) ; Mallett 等人，EMBO J.，9:1063-1068 (1990) ; Anderson等人， Nature, 390:175-179 (1997) ; Chicheportiche 等人，J. Biol· Chem.，272:32401-32410 (1997) ; Pan等人，Science, 276:111-113 (1997) ; Pan等人，Science， 277:815-818 (1997) ; Sheridan等人，Science, 277:818-821 (1997); Degli，Esposti等人，J. Exp. Med.，186:1165-1170 (1997); Marsters等人，Curr. Biol·, 7:.1003-1.006 (1997) ; Tsuda等 人，BBRC, 234:137-142 (1997) ; Nocentini等人，Proc· Natl. Acad. Sci·，94:6216-6221 (1997) ; vonBulow等人， Science, 278:138-141 (1997))。 此等TNF受體家族成員中之大部分共有包括胞外區、跨 140371.doc 200950778 膜區及胞内區之細胞表面受體的典型結構，而發現其他成 員天然地為缺少跨膜域及胞内域之可溶性蛋白。典型 TNFR之胞外部分含有由NH2末端起始之多個半胱胺酸富集 域（CRD)之重複胺基酸序列模式。 多年前，已將稱為Apo-2L或TRAIL之配體鑑別為細胞激 素之TNF家族成員。（參見例如Wiley等人，Immunity, 3:673-682 (1995) ; Pitti 等人，J. Biol. Chem., 271:12697-12690 (1996) ； WO 97/01633 ； WO 97/25428 ； 1998年 6月 9 曰頒布之美國專利5,763,223 ; 2001年9月4曰頒布之美國專 利6,284,236)。全長天然序列人類Apo2L/TRAIL多肽為281 個胺基酸長、II型跨膜蛋白。一些細胞可經由使多肽胞外 區酶促裂解而產生多肽之天然可溶形式（Mariani等人，J. Cell. Biol·, 137:221-229 (1997))。Apo2L/TRAIL之可溶形 式的結晶學研究揭示類似於TNF及其他相關蛋白之結構的 同源三聚結構（Hymowitz 等人，Molec. Cell, 4:563-571 (1999) ; Cha 等人，Immunity, 11:253-261 (1999);
Mongkolsapaya 等人，Nature Structural Biology, 6:1048 (1999) ; Hymowitz 等人，Biochemistry, 39:633-644 (2000) )。然而，發現不同於其他TNF家族成員， Apo2L/TRAIL具有獨特結構特徵，亦即三個半胱胺酸殘基 (處於同源三聚體内之每一次單位之位置230處）一起與鋅原 子配位，且鋅結合對於三聚體穩定性及生物活性為重要 的。（Hymowitz 等人，見上文；Bodmer 等人，J. Biol. Chem., 275:20632-20637 (2000)) » 140371.doc 200950778 文獻中已報導Apo2L/TRAIL可在免疫系統調節（包括諸 如類風濕性關節炎之自體免疫疾病）中起作用[參見例如， Thomas等人，J· Immunol.，161:2195-2200 (1998) ; Johnsen 等人，Cytokine, 11:664-672 (1999); Griffith等人，J. Exp. Med.，189:1343-1353 (1999) ; Song等人，J. Exp. Med.， 191:1095-1103 (2000)] ° 亦已報導Apo2L/TRAIL之可溶形式誘導多種癌細胞之細 胞凋亡，包括結腸、肺、乳房、前列腺、膀胱、腎、卵巢 及腦腫瘤；以及黑色素瘤、白血病及多發性骨髓瘤（參見 例如Wiley等人，見上文；Pitti等人，見上文；2000年2月 29日頒布之美國專利6,030,945 ; 2004年6月8日頒布之美國 專利 6,746,668 ; Rieger 等人，FEBS Letters, 427:124-128 (1998) ; Ashkenazi 等人，J. Clin. Invest·，104:155-162 (1999) ; Walczak等人，Nature Med., 5:157-163 (1999);
Keane 等人，Cancer Research, 59:734-741 (1999);
Mizutani等人，Clin. Cancer Res.，5:2605-2612 (1999); Gazitt, Leukemia，13:1817-1824 (1999); Yu等人，Cancer Res.，60:2384-2389 (2000) ; Chinnaiyan 等人，Proc. Natl. Acad. Sci·，97:1754-1759 (2000))。在鼠類腫瘤模型中之活 體内研究進一步表明單獨Apo2L/TRAIL或其與化學療法或 放射療法之組合可發揮實質抗腫瘤效應（參見例如 Ashkenazi等人，見上文；Walzcak等人，見上文；Gliniak 等人，Cancer Res.，59:6153-6158 (1999) ; Chinnaiyan 等 人，見上文；Roth等人，Biochem. Biophys. Res. Comm·， 140371.doc 200950778 265:1999 (1999) ; PCT 申請案 US/00/15512 ; PCT 申請案 US/01/23691)。與許多類型之癌細胞相反，大部分正常人 類細胞類型對藉由Apo2L/TRAIL之某些重組形式誘導之細 胞〉周亡顯現出抗性（Ashkenazi等人，見上文；Walzcak等 人，見上文）。Jo等人已報導Apo2L/TRAIL之經多聚組胺酸 標記的可溶形式活體外誘導正常經分離之人類（而不為非 人類）肝細胞之細胞〉周亡（Jo等人，Nature Med.，6:564-567 (2000);亦參見Nagata，Nature Med·，6:502-503 (2000))。 咸信某些重組Apo2L/TRAIL製劑對患病細胞與正常細胞之 生物化學特性及生物活性可（例如）視標記分子之存在或不 存在、鋅含量及三聚體含量％而不同（參見Lawrence等人， Nature Med.，Letter to the Editor, 7:383-385 (2001) ; Qin等 人，Nature Med.，Letter to the Editor, 7:385-386 (2001))。 已發現Apo2L/TRAIL結合至少五種不同受體。結合 Apo2L/TRAIL之受體中的至少兩者含有功能性細胞質死亡 域。一種該受體被稱為「DR4」（且或者被稱為TR4或 TRAIL-Rl)(Pan等人，Science, 276:111-113 (1997);亦參 見1998年7月30日公開之WO 98/32856 ; 1999年7月29日公 開之 WO 99/37684 ; 2000年 12 月 7 日公開之 W0 00/73349 ; 2002年8月13日頒布之US 6,433，147 ; 2002年10月8日頒布 之118 6,461，823及2002年1月29曰頒布之118 6,342,383)°
Apo2L/TRAIL之另一該受體被稱為DR5(其亦或者被稱為 Apo-2 ; TRAIL-R或 TRAIL-R2、TR6、Tango-63、hAP08、 TRICK2 或 KILLER)(參見例如 Sheridan 等人，Science, 200950778 277:818-821 (1997) ; Pan 等人，Science, 277:815-818 (1997) ; 1998年 11 月 19 日公開之WO 98/51793 ; 1998年 9月 24 日公開之 WO 98/41629 ; Screaton 等人，Curr. Biol·， 7:693-696 (1997) ; Walczak等人，EMBO J·, 16:5386-5387 • (1997) ; Wu等人，Nature Genetics，17:141-143 (1997); 1998年8月20日公開之WO 98/35986 ; 1998年10月14日公開 之 EP 870,827 ; 1998 年 10 月 22 日公開之 WO 98/46643 ; 1999年1月21日公開之WO 99/02653 ; 1999年2月25日公開 m
之 WO 99/09165 ; 1999 年 3 月 11 日公開之 WO 99/11791 ; 2002 年 8 月 13 日公開之 US 2002/0072091 ; 2001 年 12 月 7 日 公開之US 2002/0098550 ; 2001年12月6日頒布之US • 6,313,269 ; 2001 年 8 月 2 日公開之 US 2001/0010924 ; 2003 年7月3日公開之US 2003/01255540 ; 2002年10月31日公開 之 US 2002/0160446 ; 2002 年 4 月 25 日公開之 US 2002/0048785 ; 2002 年 2 月頒布之 US 6,342,369 ; 2003 年 5 φ 月27日頒布之US 6,569,642 ; 2000年6月6日頒布之US 6,072,047 ; 2003 年 11 月 4 曰頒布之 US 6,642,358 ; 2004年 6 月1日頒布之US 6,743,625)。據報導類似於DR4，DR5含有 • 細胞質死亡域且能夠在配體結合後（或在結合模擬配體活 • 性之分子，諸如促效劑抗體後）發出細胞凋亡信號。Apo-2L/TRAIL與DR5之間所形成之複合物的晶體結構係描述於 Hymowitz 等人，Molecular Cell, 4:563-571(1999)中0 在配體結合後，DR4與DR5皆可經由稱為FADD/Mortl之 含有死亡域的接附分子來募集且活化細胞凋亡引發物卡斯 140371.doc 200950778 蛋白酶-8而獨立地觸發細胞〉周亡[Kischkel等人， Immunity, 12:611-620 (2000) ; Sprick等人，Immunity， 12:599-609 (2000) ; Bodmer 等人，Nature Cell Biol.， 2:241-243 (2000)] 〇 已報導Apo2L/TRAIL亦結合彼等稱為DcRl、DcR2及 OPG之受體，咸信其充當抑制劑而非信號轉導之轉導物 (參見例如，DCR1(亦稱為 TRID、LIT 或 TRAIL-R3)[Pan等 人，Science, 276:111-113 (1997) ; Sheridan等人，Science， 277:818-821 (1997) ; McFarlane 等人，J. Biol. Chem·， 272:25417-25420 (1997) ; Schneider等人，FEBS Letters， 416:329-334 (1997) ； Degli-Esposti 等人，J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997);及 Mongkolsapaya 等人，】·
Immunol·，160:3-6 (1998) ; DCR2(亦稱為 TRUNDD 或 TRAIL-R4)[Marsters 等人，Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997) ; Pan 等人，FEBS Letters，424:41-45 (1998);
Degli-Esposti 等人，Immunity, 7:813-820 (1997)]及 OPG[Simonet等人，見上文]。與DR4及DR5相反，DcRl及 DcR2受體並不發送細胞凋亡信號。 【發明内容】 本發明之實施例包括治療癌症之方法，其包含使癌細胞 暴露於有效量之Apo2L/TRAIL及所選化學治療方案及/或 VEGF抗體。在較佳實施例中，該等癌細胞為非小細胞肺 癌（NSCLC)細胞。亦包括製品及套組，其包含 Apo2L/TRAIL及提供例如關於治療諸如NSCLC之癌症之投 140371.doc -10- 200950778 藥資訊的包裝插頁。 本發明之實施例包括治療癌症之方法，其包含使癌細胞 暴露於有效量之Apo2L/TRAIL及CD20抗體。在較佳實施 例中，該等癌細胞為非霍奇金氏淋巴瘤（NHL)細胞。亦包 括製品及套組，其包含Apo2L/TRAIL及提供例如關於治療 諸如NHL之癌症之投藥資訊的包裝插頁。 本發明之各種實施例係描述於以下說明性及非限制性申 請專利範圍中： 1. 一種用於治療個體之非小細胞肺癌（NSCLC)的方法， 其包含於治療第1天投與（a)有效量之太平洋紫杉醇 (Paclitaxel)、卡翻（Carboplatin)及抗 VEGF 抗體及（b)約 4 mg/kg至20 mg/kg範圍内之量的包含圖1之胺基酸114-281 (SEQ ID ΝΟ:1)的Apo2L/TRAIL多肽，其中於治療第1天投 與該Apo2L/TRAIL多肽後，再向該個體投與約4毫克/公斤/ 天至約20毫克/公斤/天範圍内之量的Apo2L/TRAIL多肽歷 時達至連續5天。 2. 如技術方案1之方法，其中該太平洋紫杉醇係以約200 mg/m2之量投與。 3. 如技術方案1之方法，其中該卡鉑係以每分鐘約6 mg/ml之量投與。 4. 如技術方案1之方法，其中該抗VEGF抗體為以約1 5 mg/kg之量投與的貝伐單抗（Bevacizumab)。 5. 如技術方案1之方法，其中（a)及（b)係經靜脈内向該個 體投與。 140371.doc -11 - 200950778 6·如技術方案1之方法，其中在該（b)治療中，向該個體 杈與約4毫克/公斤/天之量的Apo2L/TRAIL多肽歷時達至連 續5天。 7.如技術方案1之方法，其中在該（b)治療中，向該個體 · 才又與約8毫克/公斤/天之量的Apo2L/TRAIL多肽歷時達至連 ， 續5天。 8·如技術方案1之方法，其中在該（b)治療中，向該個體 投與約15毫克/公斤/天之量的Apo2L/TRAIL·多肽歷時達至 連續2天。 ❹ 9·如技術方案1之方法，其中在該（b)治療中，向該個體 投與約20毫克/公斤/天之量的Apo2L/TRAIL·多肽歷時達至 連續2天。 10.如技術方案1之方法’其中自第1天初始治療起21天 後向該個體投與包含（a)及（b)之後續療法。 · U.—種治療個體之非霍奇金氏淋巴瘤（NHL)的方法，其 包3於治療第1天投與（a)有效量之抗CD20抗體及（b)約4 mg/kg至約8 mg/kg之量的包含圖！之胺基酸j 14_281(SEq ID N0.1)的Apo2L/TRAIL多肽，其中於治療第^投與該 Apo2L/TRAIL多肽後，再向該個體投與約4毫克/公斤/天至 · 約8毫克/公斤/天範圍内之量的Ap〇2L/TRAIL多肽歷時達至 · 連續5天。 12.如技術方案π之方法，其中該抗CD20抗體為以約375 mg/m2之量投與的利妥昔單抗（Rituximab)。 13_如技術方案11之方法，其中（3)及（1?)係經靜脈内向該 140371.doc -12- 200950778 個體投與。 14.如技術方案丨丨之方法，其中該個體係診斷患有復發 性 NHL。 1 5 .如技術方案11之方法，其中在該（a)治療中，每7天向 該個體投與有效劑量之抗CD20抗體。 16.如技術方案1之方法，其中每週向該個體投與包含（a) 之後續療法歷時達至8個治療週期。 17_如技術方案n之方法，其中自第j天初始治療起以天 後向該個體投與包含（b)之後續療法。 18. 如技術方案U之方法，其中在第丨天治療之前，該個 體已預先用抗CD20抗體治療。 19. 一種AP〇2L/TRAIL·多肽用於製造用於治療個體之 NSCLC之藥劑的用途，其中該藥劑包含於治療第丄天投與 (a)有效量之太平洋紫杉醇、卡鉑及抗vegf抗體及（b)約4 mg/kg至20 mg/kg範圍内之量的包含圖1之胺基酸114_ 281(SEQ ID ΝΟ:1)的Ap〇2L/TRAIL多肽，且其中於治療第 1天投與該Apo2L/TRAIL多肽後，再向該個體投與約4毫克/ 公斤/天至約20毫克/公斤/天範圍内之量的Ap〇2L/TRAIL多 肽歷時達至連續5天。 20. —種用於個體NSCLC之醫藥治療方法中的 Apo2L/TRAIL多肽，其中該用途包括於治療第^投與⑷ 有效量之太平洋紫杉醇、卡鉑及抗VEGF抗體及（b)約4 mg/kg至20 mg/kg範圍内之量的包含圖1之胺基酸114_ 281(SEQ ID ΝΟ:1)的Apo2L/TRAIL多狀，且其中於治療第 140371.doc •13· 200950778 1天投與該Apo2L/TRAIL多肽後，再向該個體投與約4毫克/ 公斤/天至約20毫克/公斤/天之量的Apo2L/TRAIL多肽歷時 達至連續5天。 21. —種Apo2L/TRAIL多肽用於製造用於治療個體NHL之 藥劑的用途，其中該藥劑包含於治療第1天投與（a)有效量 之抗CD20抗體及（b)約4 mg/kg至約8 mg/kg之量的包含圖1 之胺基酸 114-281(SEQ ID ΝΟ:1)的 Apo2L/TRAIL多肽，且 其中於治療第1天投與該Apo2L/TRAIL多肽後，再向該個 體投與約4毫克/公斤/天至約8毫克/公斤/天範圍内之量的 Apo2L/TRAIL多肽歷時達至連續5天。 22. —種用於個體NHL之醫學治療方法中的Apo2L/TRAIL 多肽，其中該用途包括於治療第1天投與（a)有效量之抗 CD20抗體及（b)約4 mg/kg至8 mg/kg之量的包含圖1之胺基 酸 114-281(SEQ ID ΝΟ:1)的 Apo2L/TRAIL 多肽，且其中於 治療第1天投與該Apo2L/TRAIL多肽後，再向該個體投與 約4毫克/公斤/天至約8毫克/公斤/天範圍内之量的 Apo2L/TRAIL多肽歷時達至連續5天。 23. —種製品，其包含： 一包括包含圖1之胺基酸114-281(SEQ ID ΝΟ:1)之 Apo2L/TRAIL多肽的容器；及 一具有關於治療個體之NSCLC之說明書的包裝插頁’其 中該說明書指示如請求項1之向個體投與之（a)及（b)的給藥 及量。 24. —種製品，其包含： 140371.doc • 14· 200950778 一包括包含圖1之胺基酸114-2 81 (SEQ ID NO: 1)之 Apo2L/TRAIL多肽的容器；及 一具有關於治療個體之NHL之說明書的包裝插頁，其中 該說明書指示如技術方案11之向個體投與之（a)及（b)的給 藥及量。 【實施方式】
除非另有規定，否則本文中所使用之所有技術術語、註 釋及其他科學術語均意欲具有熟習本發明所屬技術者通常 所瞭解之含義。在一些情況下，為了清楚起見及/或供及 時參考’本文中定義具有通常所瞭解之含義的術語，且本 文中包涵該等定義不一定視為表示相對於此項技術中通常 所瞭解的定義有實質差異。本文中所述或參考之技術及程 序通常為熟習此項技術者充分瞭解及通常由熟習此項技術 者使用習知方法來利用，諸如Sambr〇〇k等人，黯咖心
Cloning: A Laboratory Manual 第 2 版（1989) Cold Spring
Harbor Laboratory Press，c〇ld η_〇γ，Ν γ 中所述之 廣泛使用之分子選財法。除非另有說明，否則適當時通 常根據製造商定義之方茔；A k 我 < 万案及/或參數來進行包括使用市售 套組及試劑之程序。 否則本文中及隨 及該包括複數個 必須注意除非上下文中另外明確指示， 附申請專利範圍中所用之單數形式「一 指示物。 本文中所知·及之所有公安/么 有A開案係以引用的方式併入本 以揭示及描述與所引用公開 Λ開案有關之方法及/或材料。引 140371.doc -15· 200950778 用在本申請案之申請日期之前的本文中所引用之公開案的 揭示内容。此處不應視為承認發明者無權根據發明之較早 優先權日期或先前曰期而提早公開案之日期。此外，實際 公開日期可不同於彼等所示日期且要求獨立核實。 定義 術語「Apo-2 配體」、「Ap〇_2L」、「Apo2L·」、 「Apo2L/TRAIL」、「Ap〇-2 配體/TRAIL」及「TRAIL」在 本文中可互換使用以指包括圖1中所示之胺基酸序列之胺 基酸殘基114-281(包括114及281)、殘基95-281(包括95及 281)、殘基92-281(包括92及281)、殘基91-281(包括91及 281)、殘基41-281(包括41及281)、殘基39-281(包括39及 281)、殘基15-281(包括15及281)或殘基1-281(包括1及281) 的多肽序列，以及上述序列之生物學活性片段、缺失、插 入及/或取代變異體。在一實施例中，該多肽序列包含圖1 之殘基114-281。視情況，多肽序列包含圖1之殘基92_281 或殘基91-281。八？〇-21^多肽可由圖1中所示之天然核苷酸 序列編碼。視情況，編碼殘基卩⑺丨丨^圖丨）之密碼子可為 「CCT」或「CCG」。視情況，該等片段或變異體具有生 物學活性且與上述序列中之任一者具有至少約8〇%胺基酸 序列一致性，更佳為至少約9〇%序列一致性，且甚至更佳 為至少95%、96%、97°/〇、98%或99。/。序列一致性。該定義 涵蓋Αρο·2配體之取代變異體，其中其天然胺基酸中之至 少一者經諸如丙胺酸殘基之另一胺基酸取代。可選取代變 異體包括一或多個殘基取代。可選變異體可包含不同於圖 140371.doc •16- 200950778 1之天然序列Apo-2配體多肽序列且於圖1中之殘基位置處 具有以下胺基酸取代中之一或多者的胺基酸序列：S96C ; S101C ; S111C ; R170C ; K179C。定義亦涵蓋自 ap〇_2 配 體來源分離或藉由重組或合成法製備之天然序列Apo_2配 體。本發明之Apo-2配體包括以下文獻中所揭示之稱為
Apo-2配體或TRAIL之多肽：1997年1月16日公開之w〇 97/01633、1997 年 7 月 17 日公開之 WO 97/25428、1999 年 7 月22日公開之WO 99/36535、2001年1月4日公開之w〇 01/00832、2002 年 2 月 7 日公開之 WO 02/09755 及 2000 年 12 月14日公開之WO 00/75 191。該等術語通常用於指包括單 體、二聚體、三聚體、六聚體或高級寡聚物形式之多肽之 Apo-2配體形式《除非另有特別規定，否則ap〇_2l序列中 所提及之胺基酸殘基的所有編號均使用根據圖1之編號。 舉例而言，「D203」或「Asp203」係指在圖1中所提供之 序列中位置203處之天冬胺酸殘基。 包含圖1之胺基酸114-281的重組人類Apo2L/TRAIL多肽 已指定US AN名稱「杜拉樂明（Dulanermin)」且提及「杜拉 樂明」係指此形式之Apo2L/TRAIL多肽。 如本文中所使用之術語「Apo-2配體選擇性變異體」係 指在天然Apo-2配體序列中包括一或多個胺基酸突變且對 DR4受體或DR5受體具有選擇性結合親和力之Ap〇_2配體多 肽。在一實施例中’該Apo-2配體變異體對DR4受體具有 選擇性結合親和力且於天然Ap〇-2配體序列之位置丨89、 191、193、199、201或209之任一處包括一或多個胺基酸 140371.doc -17- 200950778 取代。在另一實施例中，Apo-2配體變異體對DR5受體具 有選擇性結合親和力且於天然Apo-2配體序列之位置189、 191、193、264、266、267或269之任一處包括一或多個胺 基酸取代。較佳Apo-2配體選擇性變異體包括一或多個胺 基酸突變且展現對DR4受體之結合親和力等於或大於（匕)天 . 然序列Apo-2配體對DR4受體之結合親和力，且甚至更佳 地，Apo-2配體變異體展現對DR5受體之結合親和力小於 (<)由天然序列Apo-2配體對DR5所展現之結合親和力。當 該Apo-2配體變異體對DR4受體之結合親和力與天然序列 © Apo-2配體相比大致相等（不變）或較大（增加），且Ap〇_2配 體變異體對DR5受體之結合親和力與天然序列Ap0-2配體 相比較小或幾乎消除時，出於本文之目的，認為Ap〇_2配 體變異體之結合親和力對DR4受體具「選擇性」。本發明 之較佳DR4選擇性Apo-2配體變異體對DR5受體具有小至少 10倍之結合親和力（與天然序列Ap0-2配體相比），且甚至 更佳地，對DR5受體具有小至少1 〇〇倍之結合親和力（與天 然序列Apo-2配體相比）。可藉由此項技術中已知之 © ELISA、RIA及/或BIAcore檢定來測定Apo_2配體變異體之 各別結合親和力且將其與天然Ap〇_2L(諸如i丨4_2 8丨形式）之 結合特性作比較。本發明之較佳DR4選擇性Ap〇_2配體變 異體將誘冑至少一種類型之哺乳動物細胞（較佳癌細胞）之 細胞獨亡，且該細胞〉周亡活性可藉由諸如阿爾瑪藍（山_ blue)或結晶紫（cryStai violet)檢定之已知技術方法來測 定。DR4選擇性Apo_2配體變異體對Ap〇_2L之誘餌受體中 140371.doc -18· 200950778 任一者可能或可能不具有變化之結合親和力，彼等誘餌受 體在此項技術中被稱為DcRl、DcR2及OPG。 更佳Apo-2配體選擇性變異體包括一或多個胺基酸突變 且展現對DR5受體之結合親和力等於或大於（匕）天然序列 Apo-2配體對DR5受體之結合親和力，且甚至更佳地，該 Apo-2配體變異體展現對DR4受體之結合親和力小於（<)由 天然序列Apo-2配體對DR4所展現之結合親和力。當該 Apo-2配體變異體對DR5受體之結合親和力與天然序列 Apo-2配體相比大致相當（不變）或較大（增加），且ap〇_2配 體變異體對DR4受體之結合親和力與天然序列Apo-2配體 相比較小或幾乎消除時，出於本文之目的，認為Ap0-2配 體變異體之結合親和力對DR5受體具「選擇性」。本發明 之較佳DR5選擇性Apo-2配體變異體對DR4受體具有小至少 10倍之結合親和力（與天然序列Αρ〇·2配體相比），且甚至 更佳地’對DR4受體具有小至少1 〇〇倍之結合親和力（與天 然序列Apo-2配體相比）。可藉由此項技術中已知之 ELIS A、RIA及/或BIAcore檢定來測定Apo-2配體變異體之 各別結合親和力且將其與天然Ap〇2L(諸如114-281形式）之 結合特性作比較。本發明之較佳DR5選擇性Apo-2配體變 異體將誘導至少一種類型哺乳動物細胞（較佳癌細胞）之細 胞凋亡，且該細胞凋亡活性可藉由諸如阿爾瑪藍或結晶紫 檢定之已知技術方法來測定^ DR5選擇性Apo-2配體變異 體對Apo-2L之誘俾受體中任一者可能或可能不具有變化之 結合親和力’彼等誘餌受體在此項技術中被稱為Dcri、 140371,doc -19- 200950778
DcR2及 OPG。 胺基酸鑑別可使用胺基酸中之單字母符號或三字母符 號，亦即
Asp D 天冬胺酸 lie I 異白胺酸 Thr T 蘇胺酸 Leu L 白胺酸 Ser S 絲胺酸 Tyr Y 酪胺酸 Glu E 麩胺酸 Phe F 苯丙胺酸 Pro P 脯胺酸 His H 組胺酸 Gly G 甘胺酸 Lys K 離胺酸 Ala A 丙胺酸 Arg R 精胺酸 Cys C 半胱胺酸 Trp W 色胺酸 Val V 纈胺酸 Gin Q 麩醯胺酸 Met M 甲硫胺酸 Asn N 天冬醢胺酸 術語「Apo2L/TRAIL胞外域」或「Apo2L/TRAIL ECD」 係指基本上無跨膜域及細胞質域之Apo2L/TRAIL形式。通 常ECD具有小於1%之該等跨膜域及細胞質域，且較佳具有 小於0.5%之該等結構域。應瞭解關於本發明之多肽所鑑別 之任何跨膜域係按照通常在此項技術中用於鑑別彼種疏水 性域之標準來鑑別。跨膜域之確切邊界可改變，但最可能 在如最初所鑑別之結構域的任一末端處改變不超過約5個 胺基酸。在較佳實施例中，ECD由無跨膜域及細胞質域或 胞内域的多肽之可溶性、胞外域序列組成（且不為膜結合 型）。Apo-2L/TRAIL之特定胞外域序列係描述於PCT公開 案第WO 97/01633號及第WO 97/25428號中。 140371.doc -20- 200950778 術語「Apo2L/TRAIL單體」或「Apo2L單體」係指 Apo2L之胞外域序列的共價鏈。 術語「Apo2L/TRAIL二聚體」或「Apo2L二聚體」係指 經由二硫鍵以共價鍵接合之兩個Apo-2L單體。如本文中所 • 使用之術語包括獨立式Apo2L二聚體及處於三聚形式之
Apo2L中的Apo2L二聚體（亦即與另一第三個Apo2L單體締 合）。 術語「Apo2L/TRAIL三聚體」或「Apo2L三聚體」係指 非共價締合之三個Apo2L單體。 術語「Apo2L/TRAIL聚集體」用於指自締合之較高級寡 聚形式的Apo2L/TRAIL，諸如Apo2L/TRAIL三聚體，其形 成（例如）六聚及九聚形式之Apo2L/TRAIL。Apo2L/TRAIL . 單體、二聚體或三聚體（或其他聚集體）之存在及數量的測 定可使用此項技術中已知之方法及檢定（及使用市售材料） 來進行，諸如天然尺寸排阻HPLC(「SEC」）' 使用十二烷 φ 基硫酸鈉之變性尺寸排阻（「SDS-SEC」）、逆相HPLC及毛 細管電泳。 「Apo-2配體受體」包括此項技術中稱為「DR4」及 「DR5」之受體。Pan等人已描述稱為「DR4」之TNF受體 -家族成員（Pan等人，Science, 276:111-113 (1997);亦參見 1998年7月30日公開之WO 98/32856 ; 1999年7月29日公開 之 WO 99/37684 ; 2000 年 12 月 7 日公開之 WO 00/73349 ; 2002年8月13日頒布之US 6,433,147 ; 2002年10月8日頒布 之 US 6,461，823 及 2002 年 1 月 29 曰頒布之 US 6,342,383)° 140371.doc •21· 200950778
Sheridan 等人，Science，277:818-821 (1997)及 Pan 等人， Science，277:815-818(1997)描述 Apo2L/TRAIL 之另一受體 (亦參見，1998年11月19日公開之WO 98/51793 ; 1998年9 月24日公開之WO 98/41629)。此受體被稱為DR5(該受體或 者亦稱為 Apo-2 ; TRAIL-R、TR6、Tango-63、hAP08、 - TRICK2 或 KILLER ; Screaton等人，Curr. Biol., 7:693-696 (1997) ; Walczak等人，EMBO J·，16:5386-5387 (1997);
Wu等人，Nature Genetics，17:141-143 (1997) ; 1998年 8 月 f|
20日公開之WO 98/35986 ; 1998年10月14日公開之EP ^ 870,827 ； 1998 年 10 月 22 日公開之 WO 98/46643 ; 1999 年 1 月21日公開之WO 99/02653 ; 1999年2月25日公開之WO 99/09165 ; 1999 年 3 月 11 日公開之 WO 99/11791 ; 2002 年 8 月13日公開之US 2002/0072091 ; 2001年12月7日公開之US 2002/0098550 ; 2001 年 12月 6 曰頒布之US 6,313,269 ； 2001 年8月2日公開之US 2001/0010924 ; 2003年7月3日公開之 US 2003/01255540 ; 2002 年 10 月 31 日公開之 US 2002/0160446 ; 2002年 4 月 25 日公開之 US 2002/0048785 ; 2003年5月27曰頒布之US 6,5 69,642 ; 2000年6月6日頒布之 US 6,072,047 ; 2003年11月 4曰頒布之US 6,642,3 5 8) ° 如上 文所述，Apo-2L之其他受體包括DcRl、DcR2及OPG(參 見，Sheridan等人，見上文；Marsters等人，見上文；及 Simonet等人，見上文）。本文中所使用之術語「Apo-2L受 體」涵蓋天然序列受體及受體變異體。此等術語涵蓋在包 括人類之多種哺乳動物中表現的Apo-2L受體。Apo-2L受 140371.doc -22- 200950778
體可如同在多種人類組織系中天然發生般内源表現，或可 藉由重組或合成方法表現。「天然序列Apo-2L受體」包含 與源自自然界之Apo-2L受體具有相同胺基酸序列的多肽。 因此，天然序列Apo-2L受體可具有來自任何哺乳動物之天 • 然產生之Apo-2L受體的胺基酸序列。該天然序列ap〇-2L 受體可自自然界分離或可藉由重組或合成方式製造。術語 • 「天然序列AP〇-2L受體」特別涵蓋該受體之天然產生的截 斷或分泌形式（例如含有（例如）胞外域序列之可溶形式）、 ❹ 天然產生的變異體形式（例如替代性拼接形式）及天然產生 的對偶基因變異體。受體變異體可包括天然序列Ap〇_2L受 體之片段或缺失突變體。人類DR5之轉錄拼接變異體為此 . 項技術所已知。此DR5拼接變異體編碼人類DR5之440個胺 基酸的序列。 當在本文中使用時術語「多元醇」廣義上係指多元醇化 合物。多元醇可為例如任何水溶性聚（氧化烯）聚合物且可 9 具有直鏈或支鏈。較佳多元醇包括彼等於一或多個羥基位 置處經諸如具有丨與4個碳之烷基的化學基團取代之多元 醇。通常，該多元醇為聚（烷二醇），較佳為聚（乙二 •醇）(PEG)。然而，熟習此項技術者咸了解，諸如聚（丙二 • 醇)及聚乙二醇-聚丙二醇共聚物之其他多元醇可使用本文 關於PEG所述之共輕技術來利用。本發明之多元醇包括此 項技術中熟知之彼等多亓 饥予夕70知及可（諸如自市售來源）公開得 到之彼等多元醇。 術語「共輕」在本文中根據其最廣義定義來使用以意謂 140371.doc -23· 200950778 接合或連接在一起。當分子如 分子係「經共輕」。 經接合般起作用或操作時， 術語「胞外域」或「ECD」係指其太μ么从 J于、夺曰基本上無跨膜域及細胞 質域之配體或受體形式。通常 冷性£CD具有小於1%之該 專跨膜域及細胞質域，且較佳妯 1地具有小於0.5%之該等結構 術- &金屬離子」係指具有兩個正電荷之金屬離 子。用於本發明之二價金屬離子的實例包括（但不限於〕
辞鈷、鎳、錄、鎮及鐘。可使用之該等金屬的特定形式 包括鹽形式（例如醫藥學上可接受之鹽形式），諸如上述二 價金屬離子之氣化物、乙酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽及硫酸 =形式。如本文中所述之二價金屬離子較佳以濃度或 量（例如有效量）使用，該等濃度或量足以（例如）⑴在所需 時段内增強Ap〇_2L三聚體之儲存穩定性，⑺在重組細胞 培養或純化方法中增強ApG_2L三聚體之產生或產率，⑺
增強々〜儿三聚體之溶解度（或減少聚集），或⑷增強Apo_ 2L三聚體形成。 經分離」在用於描述本文所揭示之各種蛋白質時意謂 已、丄鑑別且自其天然環境之組份分離及/或回收之蛋白 質其天然環境之污染組份為⑨常會干擾S白質之診斷或 …療用途之物質，且可包括酶、激素及其他蛋白質或非蛋 白質溶質。在較佳實施例中，蛋白質將被純化：（ι)至足以 藉由使用轉杯式測序儀獲得N末端或内部胺基酸序列之至 乂 15個殘基的程度；或（2)至藉由SDS-PAGE在非還原或還 140371.doc •24· 200950778 原條件下使用庫馬斯藍（Coomassie blue)或較佳為使用銀染 色獲得之均質性。因為蛋白質天然環境之至少一種組份將 不存在’故經分離之蛋白質包括原位處於重組細胞中之蛋 白質。然而，通常經分離之蛋白質係藉由至少一個純化步 • 驟來製備。 「經分離」之核酸分子為經鑑別且與至少一種通常在核 ' 酸之天然來源中與其締合之污染核酸分子分離的核酸分 0 子。經分離之AP〇-2配體核酸分子不同於自然界中可見之 形式或設置。因此，使經分離之Ap〇-2配體核酸分子與存 在於天然細胞中時之Apo_2配體核酸分子相區別。然而， 經分離之AP〇-2配體核酸分子包括通常表現Αρ〇·2配體之細 . 胞中所含之ΑΡ〇_2配體核酸分子，在該等細胞中例如該核 » 酸分子處於與天然細胞之染色體位置不同的染色體位置 處。 關於本文中所鏗別之序列的「胺基酸序列一致性百分數 ❹ （/0)」係疋義為在比對序列且引入間隙（必要時）以達成最大 序列一致性百分數，且不將任何保守性取代視為序列一致 性之部分後’與Αρο-2配體序列中之胺基酸殘基一致的候 選序列中之胺基酸殘基之百分數。用於測定胺基酸序列一 致性百分數之目的之比對可以多種方式來達成，該等方式 在此項技術之技術範圍内，可測定用於量測比對之適當參 數，包括在所比較之全長序列内達成最大比對所需之賦值 演算法。出於本文之目的，胺基酸一致性百分數值可使用 由Genentech，lnc.創造且源編碼已與使用者文件一起保存 140371.doc -25- 200950778 於 US Copyright Office, Washington, DC，205 59 中，以美國 版權登記（US Copyright Registration)第 TXU510087號登記 之序列比較電腦程式ALIGN-2來獲得。該ALIGN-2程式可 經由 Genentech, Inc.，South San Francisco, CA公開獲得。 所有序列比較參數均由ALIGN-2程式設定且不會改變。 術語「控制序列」係指於特定宿主生物體内操作性連接 之編碼序列之表現所需的DNA序列。舉例而言，適合於原 核生物之控制序列包括啟動子、視情況操縱子序列及核糖 體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、聚腺苷酸化信號 及增強子。 當核酸與另一核酸序列呈功能性關係置放時，其為「經 操作性連接」。舉例而言，若前序列或分泌前導序列之 DNA表現為參與多肽分泌之前蛋白，則其與多肽之DNA操 作性連接；若啟動子或增強子影響序列之轉錄’則其與編 碼序列操作性連接；或若核糖體結合位點經定位以便促進 轉譯，則其與編碼序列操作性連接。「操作性連接」通常 意謂所連接之DNA序列係相鄰的且在分泌前導序列之情況 下為相鄰的並處於閱讀階段。然而，增強子不必為相鄰 的。連接係藉由在適宜限制性位點處連接來實現。若該等 位點並不存在，則根據習知慣例使用合成募核苷酸接附子 或連接子。 術語「VEGF」或「VEGF-A」用於指如由Leung等人 Sczewce, 246:1306 (1989)及 Houck 等人 Mo/. 5:1806 (1991)所述之165個胺基酸之人類血管内皮細胞生 140371.doc -26- 200950778 長因子及相關121個、189個及206個胺基酸之人類血管内 皮細胞生長因子，以及其天然產生之對偶基因及加工形 式。VEGF-A為包括 VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F及P1GF之基因家族之部分。VEGF-A主要與兩 種高親和力受體酪胺酸激酶VEGFR-l(Flt-l)及VEGFR-2 (Flk-1/KDR)結合，後者（VEGFR-2)為VEGF-A之血管内皮 細胞有絲分裂信號之主要遞質。另外，神經纖毛蛋白-1已 被鑑別為肝素結合VEGF-A同功異型物之受體，且可在血 管發育方面起作用。術語「VEGF」或「VEGF-A」亦係指 來自諸如小鼠、大鼠或靈長類動物之非人類物種之 VEGF。有時來自特定物種之VEGF由諸如以下之術語表 示：對於人類VEGF而言為hVEGF或對於鼠類VEGF而言為 mVEGF。術語「VEGF」亦用於指包含165個胺基酸之人類 血管内皮細胞生長因子之胺基酸8至109或1至109的多肽之 截短形式或片段。對任何該等形式之VEGF的提及可在本 申請案中例如由「VEGF(8-109)」、「VEGF(1-109)」或 「VEGF165」鑑別。「截短」天然VEGF之胺基酸位置係如 天然VEGF序列中所指示來編號。舉例而言，截短天然 VEGF中之胺基酸位置17(甲硫胺酸）亦為天然VEGF中之位 置17(甲硫胺酸）。截短天然VEGF對KDR及Flt-Ι受體具有 與天然VEGF相當之結合親和力。 如本文中所使用之術語「VEGF變異體」係指在天然 VEGF序列中包括一或多個胺基酸突變之VEGF多肽。視情 況，該一或多個胺基酸突變包括胺基酸取代。出於簡單命 140371.doc -27· 200950778 名本文所述之VEGF變異體之目的，應注意數字係指沿推 定天然VEGF(Leung等人，見上文及Houck等人，見上文中 所提供）之胺基酸序列的胺基酸殘基位置。 本文中之術§#「抗體」係以最廣義意義使用且特別涵蓋 完整單株抗體、多株抗體、由至少兩個完整抗體形成之多 特異性抗體（例如雙特異性抗體）及抗體片段，只要其展現 所需生物活性即可。 「抗體片段」包含完整抗體之一部分，較佳包含其抗原 結合區或可變區。抗體片段之實例包括Fab、Fab，、F(al〇2 及Fv片段；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；及由 抗體片段形成之多特異性抗體。 天然抗體」通常為由兩條相同輕鍵（L)及兩條相同重 鏈（H)組成’約150, 〇〇〇道爾頓（dalton)之異四聚膽蛋白。各 輕鏈藉由一個共價二硫鍵與重鏈連接，而在不同免疫球蛋 白同型之重鏈中二硫鍵之數目不同。各重鏈及輕鏈亦具有 規則間隔之鏈内二硫橋。各重鏈於一末端處具有可變域 (VH)，接著為許多恆定域。各輕鏈於一末端處具有可變域 (VL)且於其另一末端處具有恆定域；輕鏈之恆定域與重鏈 之第一恆定域比對且輕鏈可變域與重鏈可變域比對。咸信 特定胺基酸殘基在輕鏈可變域與重鏈可變域之間形成界 面。 術語「可變」係指如下事實：可變域之某些部分之序列 在抗體之間廣泛不同且用於各特定抗體對其特定抗原之結 合及特異性。然而’可變性在整個抗體可變域中並非均勻 140371.doc -28- 200950778 分布。其集中於輕鏈與重鏈可變域中之三個稱為高變區之 區段中。可變域之較高度保守部分稱為構架區（FR)。天然 重鏈及輕鏈之可變域各自包含四個大體上採用p摺疊構 型、由二個咼變區連接之FR，該等高變區形成連接該β摺 . 疊結構之環且在一些情況下形成β摺疊結構之部分。各鏈 中之咼變區藉由FR極接近地固持在一起且與另一條鏈之高 ' 變區一起促使抗體之抗原結合位點形成（參見Kabat等人， 瘳 Sequences of Proteins of Immunological Interest，％ 5版
Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda，MD. (1991))。恆定域並不直接參與使抗體與抗 原結合，但展現各種效應功能，諸如抗體參與抗體依賴性 • 細胞介導之細胞毒性（ADCC)。 抗體之木瓜蛋白酶消化產生兩個稱為「Fab」片段各 自具有單一抗原結合位點之相同抗原結合片段及殘餘 「Fc」片段，該「Fc」片段之名稱反映其易於結晶之能 Φ 力月蛋白酶處理產生具有兩個抗原結合位點且仍能夠使 抗原乂聯之F(ab')2片段。 「Fv」為含有完整抗原識別及抗原結合位點之最小抗體 片&。此區由緊密、非共價締合之一個重鏈可變域與一個 輕鏈了變域之—聚體組成。在此構型下，各可變域之三個 咼變區相互作用以定義Vh-Vl二聚體表面上之抗原結合位 點°六個高變區共同賦予抗體以抗原結合特異性。然而， 即使早一可變域（或僅包含三個對抗原具特異性之高變區 的半個Fv)亦具有識別及結合抗原之能力，儘管其親和力 140371.doc •29- 200950778 比完整結合位點低。
Fab片段亦含有輕鏈之恆定域及重鏈之第一恆定域 (CH1)。Fab’片段因在重鏈CH1域之羧基末端處添加包括— 或多個來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸的數個殘基而與Fab片 段不同❶Fab'-SH為本文中對恆定域之半胱胺酸殘基具有 至少一個游離硫醇基之Fab'的命名。F(ab')2抗體片段最初 以其間具有鉸鏈半胱胺酸之Fab，片段對產生。亦已知抗體 片段之其他化學偶聯。 來自任何脊椎動物物種之抗體（免疫球蛋白）之r輕鏈」 © 基於其恆定域之胺基酸序列可歸入兩種明顯不同類型（稱 為κ及λ)之*。 視重鏈之恆定域之胺基酸序列而定，抗體可歸入不同類 別。存在五類主要完整抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及 IgM ’且此等抗體中之若干者可進一步分為亞類（同型）， 例如 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA及 IgA2。對應於不同 類別之抗體的重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。熟知 不同類別之免疫球蛋白之次單位結構及三維構型。 「單鏈Fv」或「scFv」抗體片段包含抗體之νΗ及VL域， 其中此等結構域存在於單一多肽鍵中》較佳地，Fv多肽另 外包含VH與VL域之間的多肽連接子，其使得％卜能夠形成 抗原結合所需之結構。關於scFv之評述，參見Pltickthun，
The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第 113 卷， Rosenburg及 Moore編，Springer-Verlag，New York，% 269-315頁（1994)。 140371.doc ·30· 200950778
❷ 術語「雙功能抗體」係指具有兩個抗原結合位點之小抗 體片段，該等片段包含與同一多肽鏈（vH-vL)中之輕鏈可 變域（VL)連接的重鏈可變域（vH)。藉由使用過短而無法使 同一鏈上兩個結構域之間配對的連接子，迫使該等結構域 與另一鏈之互補域配對且產生兩個抗原結合位點。雙功能 抗體係更詳細地描述於（例如）EP 404,097 ; WO 93/11161 ; 及Hollinger等人，Proc. W". Jed. 5W· ^/以，9〇:6444_ 6448 (1993)中。 如本文中所使用之術語「單株抗體」係指自一群大體上 均質之抗體獲得之抗體，亦即，構成該群體之個別抗體除 可以微量存在之可能天然產生的突變外皆相同。單株抗體 具高度特異性，針對單一抗原位點。此外，與通常包括針 對不同決疋子（抗原決定基）之不同抗體的習知（多株）抗體 製劑不同，各單株抗體針對抗原上之單一決定子。除其特 異性外，單株抗體之有利之處在於其係藉由融合瘤培養而 合成，未受其他免疫球蛋白污染。修飾語「單株」表示抗 體自大體上均質抗體群體獲得之特徵，且$應理解為需要 藉由任何特定方法產生該抗體。舉例而言，根據本發明使 用之單株抗體可藉由首先由Kohler等人，256:495 (1975)描$之融合瘤方法來製帛，或可藉由重組dna方法 (參見例如美國專利第4,816,567號）來製備。「單株抗體」 亦可使用例如Clackson等人 及 Marks 等人，乂 , 技術自噬菌體抗體庫分離。
Nature, 352:624-628 (1991) 222:581-597 (1991)中所述之 140371.doc -31 · 200950778 本文中之單株抗體特別包括「嵌合」抗體（免疫球蛋 白），其中重鏈及/或輕鏈之-部分與源自特定物種或屬於 特定抗體類別或亞類之抗體的相應序列一致或同源而鏈 之其餘部分與源自另一物種或屬於另一抗體類別或亞類之 抗體的相應序列一致或同源；以及該等抗體之片段，只要 其展現所需生物學活性即可（美國專利第4,816,567號； Morrison等人，户⑽.細^ ⑸㈣，8i:685i 6855
〇984))。本文中所關注之嵌合抗體包括「靈長類化」抗 體，其包含源自非人類靈長類動物（例如舊大陸猴（〇μ World Monkey)，諸如狒狒、恆河猴或獼猴）之可變域抗原 結合序列及人類恆定區序列（美國專利第5 693,78〇號）。
非人類（例如鼠類）抗體之「人類化」形式為含有源自非 人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合抗體。一般而言，人類 化抗體為人類免疫球蛋白（受體抗體），其中來自受體之高 變區的殘基經來自具有所需特異性、親和力&能力之非人 類物種（供體抗體）(諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動 物）之高變區的殘基置換。在一些情況下，人類免疫球蛋 白之構架區（FR)殘基經相應非人類殘基置換。此外，人類 化抗體可包含受體抗體或供體抗體中未見之殘基。進行此 等修飾以進-步改善抗體效能…般而言，人類化抗體將 包含大體上至少一個且通常兩個可變域之全部，其中所有 或大體上所有南變環對應於非人類免疫球蛋白之高變環， 且所有或大體上所有FR為人類免疫球蛋白序列之fr。人. 類化抗體視情況亦包含免疫球蛋白恆定區之至少一部 140371.doc •32- 200950778 分，通常為人類免疫球蛋白恆定區之至少一部分。關於其 他細節，參見 Jones 等人，iVaiwre 321:522-525 (1986); Riechmann 等人，iVaiwre 332:323-329 (1988);及 Presta, Cwrr. 2:593-596 (1992)。 ' 當在本文中使用時術語「高變區」係指抗體中負責抗原 結合之胺基酸殘基。該高變區包含「互補決定區」或 「CDR」之胺基酸殘基（例如輕鏈可變域中之殘基24-34(L1)、50-56(L2)及 89-97(L3)及重鏈可變域中之 31-35(H1)、50-65(H2)及 95-102(H3) ; Kabat 等人， of Proteins of Immunological Interest，第 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda， MD. - (1991))及/或來自「高變環」之彼等殘基（例如輕鏈可變域 中之殘基26-32(Ll)、50-52(L2)及91-96(L3)及重鏈可變域 中之 26-32(Η1)、53-55(H2)及 96-101(H3) ; Chothia及 Lesk X Mo/·沿〇/. 196:901-917 (1987))。「構架」或「FR」殘基 φ 為除如本文中所定義之高變區殘基外的彼等可變域殘基。 「結合」所關注之抗原（例如VEGF)的抗體為能夠以足夠 親和力及/或親和性結合彼抗原以視情況使得該抗體適用 '作把向表現該抗原之細胞的治療劑之抗體。 「抗VEGF抗體」為以足夠親和力及特異性與VEGF結合 之抗體。所選抗體通常對VEGF具有足夠強之結合親和 力，例如抗體可以100 nM-1 pM之間的Kd值結合hVEGF。 抗體親和力可藉由例如基於表面電漿共振之檢定（諸如如 PCT申請公開案第WO 2005/012359號中所述之BIAcore檢 140371.doc -33- 200950778 定）、酶聯結免疫吸附檢定（ELISA)及競爭檢定（例如RIA) 來測定。較佳地，本發明之抗VEGF抗體可用作靶向及干 擾涉及VEGF活性之疾病或病狀的治療劑。又，可使抗體 經受其他生物活性檢定（例如）以評估其作為治療劑之有效 性。該等檢定為此項技術所已知且視靶抗原及抗體所欲之 用途而定。實例包括HUVEC抑制檢定；腫瘤細胞生長抑 制檢定（如例如WO 89/06692中所述）；抗體依賴性細胞之 細胞毒性（ADCC)及補體介導之細胞毒性（CDC)檢定（美國 專利5,500,362);及促效活性或血細胞生成檢定（參見WO 95/27062)。抗VEGF抗體通常不會結合其他VEGF同系物 (諸如VEGF-B或VEGF-C)，亦不會結合其他生長因子（諸如 P1GF、PDGF或bFGF)。較佳抗VEGF抗體包括結合與由融 合瘤ATCC HB 10709製造之單株抗VEGF抗體A4.6.1相同之 抗原決定基的單株抗體；根據Presta等人 （1997) Cancer Res. 57:4593-4599產生之重組人類化抗VEGF單株抗體， 包括（但不限於）稱為貝伐單抗（BV ; Avastin®)之抗體。貝 伐單抗包括突變型人類IgGl構架區及來自阻斷人類VEGF 與其受體結合之鼠類抗hVEGF單株抗體A.4.6.1的抗原結合 互補決定區。貝伐單抗之胺基酸序列之約93%(包括大部分 構架區）係源自人類IgGl，且序列之約7%係源自鼠類抗體 A4.6.1。貝伐單抗具有約149,000道爾頓之分子質量且經糖 基化。貝伐單抗及其他人類化抗VEGF抗體進一步描述於 2005年2月26日頒布之美國專利第6,884,879號中。其他較 佳抗體包括如PCT申請公開案第WO 2005/0 12359號中所述 140371.doc -34- 200950778 之G6或B20系列抗體（例如G6-31、B20-4.1)。關於其他較 佳抗體，參見美國專利第7,060,269號、第6,582,959號、第 6,703,020 號、第 6,054,297 號；WO 98/45332 ； WO 96/30046 ； WO 94/10202 ; EP 0666868B1 ;美國專利申請 公開案第2006009360號、第20050186208號、第 20030206899號、第 20030190317號、第 20030203409號及 第 20050112126 號；及 Popkov 等人，Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004)。其他較佳抗 體包括與人類VEGF上之功能性抗原決定基結合的彼等抗 體，該功能性抗原決定基包含殘基F17、M18、D19、 Y21、Y25、Q89、191、K101、E103 及 C104，或者包含殘 基 F17、Y21、Q22、Y25、D63、183 及 Q89。 根據本揭示案之「G6系列抗體」為源自根據PCT申請公 開案第WO 2005/012359號之圖7、24-26及34-35中之任一 者的G6抗體或G6衍生抗體之序列之抗VEGF抗體。在一較 佳實施例中，該G6系列抗體與人類VEGF上之功能性抗原 決定基結合，該功能性抗原決定基包含殘基F1 7、Y21、 Q22、Y25、D63、183及 Q89。 根據本揭示案之「B20系列抗體」為源自根據PCT申請 公開案第WO 2005/012359號之圖27-29中之任一者的B20抗 體或B20衍生抗體之序列之抗VEGF抗體。在一實施例中， 該B20系列抗體與人類VEGF上之功能性抗原決定基結合’ 該功能性抗原決定基包含殘基F17、M18、D19、Y21、 Y25、Q89、191、K101、E103 及 C104。 140371.doc -35- 200950778 免疫療法J係指一種用抗體治療哺
(2)至足以藉由使 出於本文之目的，「免疫療 乳動物（較佳人類患者）之方法 或裸」抗體，或該抗體7Γ盘 用轉杯式測序儀獲得]^末端或内部胺基酸序列之至少。個 殘基的程度；或（3)至藉由SDS_PAGE在還原或非還原條件 下使用庫馬斯藍或較佳銀染色獲得之均質性。因為抗體天 然環境之至少一種組份將不存在，故經分離之抗體包括原 位處於重組細胞中之抗體。然而，通常經分離之抗體將藉 由至少一個純化步驟來製備。 「B細胞」為在骨髓中成熟之淋巴細胞，且包括初始B 細胞、記憶B細胞或效應b細胞（漿細胞）。本文中之8細胞 可為正常或非惡性B細胞。 CD20」抗原為90%以上來自外周血液或淋巴器官之b 細胞之表面上所見的約35 kDa、非糖基化磷蛋白。cD2〇存 在於正常B細胞以及惡性b細胞上，但不表現於幹細胞 上。文獻中CD20之其他名稱包括「B -淋巴細胞限制性抗 原」及「Bp35」。CD20抗原係描述於例如Clark等人 140371.doc -36- 200950778 82:1766 (1985)中。 結合CD20抗原之抗體的實例包括：現稱為「利妥昔單 抗」（「RITUXAN®」）之「C2B8」（美國專利第5,736，137 號）；可購自 Idee Pharmaceuticals，Inc·之稱為「Y2B8」或 「伊莫單抗（Ibritumomab Tiuxetan)」ZEVALIN®的釔-[90]-標記之2B8鼠類抗體（美國專利第5,736，137號；於1993年6 月22日由ATCC以寄存編號HB1 1388寄存之2B8);鼠類 IgG2a「B1」，亦稱為「托西莫單抗（Tositumomab)」，其視 情況經1311標記以產生「131I-B1」抗體（碘1131托西莫單抗， BEXXARtm)，可購自C〇rixa(亦參見美國專利第5,595,721 號）；鼠類單株抗體「1F5」（Press等人69(2):584-591 (1987))及其變異體，包括「構架修補」或人類化1F5 (WO 2003/002607，Leung，ATCC 寄存編號 HB-96450);鼠 類2H7及嵌合2H7抗體（美國專利第5,677，180號）；人類化 2H7 ;靶向於B細胞細胞膜中之CD20分子之HUMAX-CD20TM全人類、高親和力抗體（Genmab, Denmark;參見例 如，Glennie 及 van de Winkel, Drug Discovery Today 8: 503-510 (2003)及 Cragg等人，5/ood 101: 1045-1052 (2003)); WO 04/035607中所述之人類單株抗體（Teeling等 人）；ΑΜΕ·133τμ抗體（Applied Molecular Evolution) ; A20 抗體或其變異體，諸如嵌合或人類化A20抗體（分別為 cA20 ' hA20)(US 2003/0219433，Immunomedics);及得自 國際白血球分型工作組（International Leukocyte Typing Workshop)之單株抗體L27、G28-2、93-1B3、B-C1 或NU- 140371.doc -37- 200950778 B2(Valentine等人，Typing III (McMichael編， 第 440 頁，Oxford University Press (1987))。本文中之較佳 CD20抗體為嵌合、人類化或人類CD20抗體，更佳為利妥 昔單抗、人類化2H7、嵌合或人類化A20抗體 (Immunomedics)及 HUMAX-CD20tm 人類 CD20 抗體 (Genmab) ° 本文中之術語「利妥昔單抗」或「RITUXAN®」係指針 對€〇20抗原且美國專利第5,736,137號中稱為「〇268」之 經基因工程化之嵌合鼠類/人類單株抗體，包括其保留結 合CD20之能力的片段。 純粹出於本文之目的且除非另外指示，否則「人類化 2H7」係指人類化CD20抗體，或其抗原結合片段，其中該 抗體有效地活體内消耗靈長類B細胞，該抗體在其Η鏈可 變區（VH)中包含至少一個來自抗人類CD20抗體之CDR Η3 序列及大體上人類重鏈亞群III(VHIII)之人類一致構架（FR) 殘基。 較佳人類化2H7為包含可變輕鏈序列之完整抗體或抗體 片段： DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR (SEQ ID N〇：3); 及可變重鏈序列： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYISIQKFKGRFTISVDKS KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID Ν〇：4)。 當人類化2Η7抗體為完整抗體時，其較佳包含輕鏈胺基 200950778 酸序列： DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:5); 及重鏈胺基酸序列： EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKS KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK (SEQ ID NO:6) 或重鏈胺基酸序列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKS KNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNATYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK (SEQ ID NO:7) ° 「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性」及「ADCC」係指 細胞介導之反應，其中表現Fc受體（FcR)之非特異性細胞 毒性細胞（例如自然殺手（NK)細胞、嗜中性白血球及巨噬 細胞）識別靶細胞上之經結合抗體且隨後引起靶細胞溶 解。介導ADCC之初級細胞（NK細胞）僅表現FcyRIII，而單 核細胞表現FcyRI、FcyRII及FcyRIII FcR於造金細胞上之 -39- 140371.doc 200950778 表現概括於 Ravetch 及 Kinet, /mmwwo/ 9:457-92 (1991)之第464頁上的表3中。為評定所關注分子之ADCC 活性，可進行諸如美國專利第5,500,362號或第5,821，337號 中所述之活體外ADCC檢定。適用於該等檢定之效應細胞 包括外周血液單核細胞（PBMC)及自然殺手（NK)細胞。或 者或另外，可活體内（例如在諸如Clynes等人尸又4) 95:652-656 (1998)中所揭示之動物模型中）評定所關注分子 之ADCC活性。 「人類效應細胞」為表現一或多種FcR且執行效應功能 之白血球。較佳地，該等細胞至少表現FcyRIII且執行 ADCC效應功能。介導ADCC之人類白血球之實例包括外 周血液單核細胞（PBMC)、自然殺手（NK)細胞、單核細 胞、細胞毒性T細胞及嗜中性白血球，其中PBMC及NK細 胞較佳。 術語「Fc受體」或「FcR」用於描述與抗體之Fc區結合 的受體。較佳FcR為天然序列人類FcR。此外，較佳FcR為 結合IgG抗體（γ受體）且包括FcYRI、FcyRII及FcyRIII亞類之 受體（包括此等受體之對偶基因變異體及替代性拼接形式） 的FcR。FcyRII受體包括FcyRIIA(「活化受體」）及 FcYRIIB(「抑制受體」），其具有主要在其細胞質域方面不 同之類似胺基酸序列。活化受體FcyRIIA在其細胞質域中 含有免疫受體酪胺酸基活化基元（ITAM)。抑制受體 FcyRIIB在其細胞質域中含有免疫受體酪胺酸基抑制基元 (ITIM)。(參見 Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 140371.doc -40- 200950778 (1997))。FcR係評述於 Ravetch及 Kinet，J⑽w. /mmwwo/ 9:45 7-92 (1991) ; Capel 等人，Immunomethods 4:25-34 (1994);及 de Haas 等人，*/· C/k. Med. 126:330-41 ' (1995)中。包括以後鑑別之彼等者的其他FcR係由本文中 • 之術語「FcR」涵蓋。該術語亦包括新生兒受體FcRn，其 負責將母體IgG轉移至胎兒（Guyer等人，《/· Immunol. 117:587 (1976)及 Kim等人，J· 24:249 (1994))。 本文中之FcR包括多態現象，諸如編碼FcyRIIIa之基因之 遺傳二態現象，其在位於結合IgGl之受體的區域中之胺基 酸位置158處產生苯丙胺酸（F)或纈胺酸（V)。已顯示純合纈 胺酸FcYRIIla(FcYRIIIa-158V)對人類IgGl具有較高親和力 且介導相對於純合苯丙胺酸FCYRnIa(FcYRIIIa_158F)或雜 • 合（FcyRina-1 58F/V)受體增加之活體外ADCC。 「補體依賴性細胞毒性」或「CDC」係指分子在補體存 在下溶解乾之能力。補體活化路徑係藉由使補體系統之第 φ 一組份（C 1 q)與同源抗原複合之分子（例如抗體）結合來起 始 為°平疋補體活化’可進行例如如Gazzano-Santoro等 人，办 202:163 (1996)中所述iCDC檢 定。 術語「治療有效量」係指治療或預防哺乳動物之疾病或 2症之治療劑的量。在癌症之情況下，治療有效量之治療 劑可減少癌細胞之數目；減小原發腫瘤尺寸；抑制（亦 P 在疋程度上減慢且較佳停止）癌細胞浸潤至外周器 ^中，抑制（亦即，在一定程度上減慢且較佳停止）癌轉 140371.doc -41 - 200950778 移在定程度上抑制腫瘤生長；及/或在一定程度上緩 解與病症相關之_或多種症狀。就藥物可阻止現有癌細胞 生長及/或將其殺死而言，其可具細胞抑制性及/或細胞毒 陡對於癌症治療而言，活體内功效可（例如）藉由評定存 活之持續時間、疾病進展之時間（TTP)、反應速率（RR)、 反應之持續時間及/或生活品質來量測。 如本文中用於辅助療法之術語「免疫抑制劑」係指用於 抑制或遮蔽本文中所治療之哺乳動物之免疫系統的物質。 此物質可包括抑制細胞激素產生、下調或抑制自體抗原表 現或遮蔽MHC抗原之物質。該等藥劑之實例包括2_胺基_6_ 芳基-5-取代之嘧啶（參見美國專利第4,665,〇77號，其揭示 内容以引用的方式併入本文中）；非類固醇消炎藥 (NSAID) ’硫唾嘌吟（azathi〇prine);環填醯胺 (cyclophosphamide);漠隱定（bromocryptine);達那嗤 (danazol);胺苯礙（dapsone);戊二醛（glutaraldehyde)(其如 美國專利第4，120,649號中所述遮蔽河11(：抗原）；1^(：抗原 及MHC片段之抗遺傳型抗體；環抱素A(CyCi〇Sp〇rin a); 類固醇，諸如糖皮質類固醇，例如潑尼松（prednisone)、曱 潑尼龍（methylprednisolone)、地塞米松（dexamethasone)及 氫化可的松（hydrocortisone);甲胺喋呤（methotrexate)(口 服或皮下）；羥基氣喹（hydroxycl〇roquine);柳氮續胺》比咬 (sulfasalazine);來氟米特（leflunomide);細胞激素或細胞 激素受體拮抗劑，包括抗干擾素-γ、抗干擾素-β或抗干擾 素-α抗體、抗腫瘤壞死因子_α抗體（英利昔單抗（infliximab) 140371.doc -42- 200950778 或阿達木單抗（adalimumab))、抗TNFa免疫黏附素（依那西 普（etanercept))、抗腫瘤壞死因子-β抗體、抗介白素-2抗體 及抗IL-2受體抗體；抗LFA-1抗體，包括抗CDlla及抗 ‘ CD18抗體；抗L3T4抗體；異源性抗淋巴細胞球蛋白； . pan-T抗體，較佳為抗CD3或抗CD4/CD4a抗體；含有LFA-3 結合域之可溶性肽（7/26/90公開之WO 90/08187);鏈激 酶；TGF-β ;鏈球菌DNA酶；來自宿主之RNA或DNA ; FK506 ; RS-61443 ;去氧史帕胍淋（deoxyspergualin);雷 Φ 帕黴素（rapamycin) ; T細胞受體（Cohen等人，美國專利第 5，114,721號）；T細胞受體片段（Offner 等人，251: 430-432 (1991) ； WO 90/11294 ； Ianeway, Nature, 341: 482 (1989);及WO 91/01133);及T細胞受體抗體（EP 340,109) ’ 諸如 T10B9。 如本文中所使用之術語「細胞毒性劑」係指抑制或妨礙 細胞功能及/或引起細胞被破壞之物質。該術語意欲包括 參 放射性同位素（例如 At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、 Sm153、Bi212、P32及Lu之放射性同位素）、化學治療劑及毒 素（諸如細菌、真菌、植物或動物源之小分子毒素或酶活 性毒素或其片段）。 出於本文之目的，「協同活性」或「協同」或「協同效 應」或「協同有效量」意謂當使用Apo2L/TRAIL、化學療 法及/或VEGF抗體之組合時所觀察到之效應（1)大於當彼 Apo2L/TRAIL、化學療法或VEGF抗體單獨（或個別）使用時 所達成之效應且（2)大於彼Apo2L/TRAIL、化學療法或 140371.doc -43· 200950778 VEGF抗體之總累加（相加）效應。該協同或協同效應可經由 熟習此項技術者所已知之多種方式來測定。舉例而言， Apo2L/TRAIL、化學療法及/或VEGF抗體之協同效應可在 檢查腫瘤細胞數目或腫瘤質量之減少的活體外或活體内檢 定形式中觀察到。出於本文之目的，「協同活性」或「協 同」或「協同效應」或「協同有效量」亦係指當使用 Apo2L/TRAIL與CD20抗體之組合時所觀察到之效應（1)大 於當彼Apo2L/TRAIL或CD20抗體單獨（或個別）使用時所達 成之效應且（2)大於彼Apo2L/TRAIL與CD20抗體之總累加 (相加）效應。該協同或協同效應可經由熟習此項技術者所 已知之多種方式來測定。舉例而言，Apo2L/TRAIL與 CD20抗體之協同效應可在檢查腫瘤細胞數目或腫瘤質量 之減少的活體外或活體内檢定形式中觀察到。 術語「細胞凋亡」及「細胞凋亡活性」係以廣義使用並 指通常伴隨一或多種特徵性細胞變化之哺乳動物細胞死亡 之有序或受控形式，該等特徵性細胞變化包括細胞質濃 縮、質膜微絨毛喪失、核分裂、染色體DNA降解或粒線體 功能喪失。此活性可使用熟知技術方法，例如藉由細胞生 存力檢定、FACS分析或DNA電泳、膜聯蛋白V之結合、 DNA之斷裂、細胞萎縮、内質網之擴張、細胞分裂及/或 膜囊（稱為細胞凋亡體）之形成來測定及量測。測定抗體（例 如利妥昔單抗）誘導細胞凋亡之能力的檢定已描述於（例 如）Shan 等人 Cancer Immunol Immunther 4达'.6Ί3-名3 (2000) ; Pedersen等人 5/oo<i 99:1314-9 (2002) ; Demidem 140371.doc -44- 200950778 # A Cancer Chemotherapy & Radiopharmaceuticals 12(3):177_186 (1997)中。 術語「癌症」、「癌性」及「惡性」係指或描述通常特徵 為不受調控之細胞生長的哺乳動物之生理病狀。癌症之實 例包括（但不限於）癌瘤，包括腺癌、淋巴瘤.、母細胞瘤、 黑色素瘤、肉瘤及白血病。該等癌症之更特定實例包括鱗 狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、腸胃癌、霍奇金 氏淋巴瘤（Hodgkin's lymphoma)及非霍奇金氏淋巴瘤、胰 腺癌、神經膠母細胞瘤、神經膠質瘤、子宮頸癌、印巢 癌、肝癌（諸如肝癌瘤及肝細胞瘤）、膀胱癌、乳癌、結腸 癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、骨髓瘤（諸如多發性骨趙 瘤）、唾液腺癌、腎癌（諸如腎細胞癌及威爾斯氏腫瘤 (Wilms' tumor))、基底細胞癌、黑色素瘤、前列腺癌、陰 門癌、甲狀腺癌、睾丸癌、食道癌及各種類型之頭頸部 癌。 術語「癌前」係指通常在癌症之前或發展成癌症之病狀 或生長。「癌前」生長具有特徵為異常細胞週期調控、增 殖或分化之細胞，其可藉由細胞週期調控、細胞增殖或分 化之標諸、來確定。 「結構不良」意謂組織、器官或細胞之任何異常生長咬 發育。較佳地，該結構不良為高度結構不良或為癌前的。 「癌轉移」意謂癌症自其原發性部位擴散至體内其他位 置。癌細胞可脫離原發性腫瘤，滲透至淋巴管及血管中， 經由血流循環，且在體内其他地方之正常組織中於遠病灶 140371.doc -45- 200950778 處生長(癌轉移)。癌轉移可為局部或遠處癌轉移。癌轉移 隨腫瘤細胞脫離原發性腫瘤、經^流行進且於遠部位處 停止而發生之連續過程。細胞在新部位處建技液供應且 可生長形成危急生命之腫塊。 腫瘤細胞調控中之刺激與抑制分子路徑調控此作用，且 腫瘤細胞與遠部位虑;夕p Λ & Q , 伯主、，、田胞之間的相互作用亦為明顯 的。 非轉移I·生」忍謂為良性或保持於原發性部位處且未渗 透至淋巴管或血管系統或除原發性部位外之組織中的癌 症通系非轉移性癌症為呈〇、I或II期癌症且偶爾in期 癌症之任何癌症。 「原發性腫瘤」或「原發性癌症」意謂初始癌症且並非 位於個體體内之另一組織、器官或位置中的轉移性病灶。 「良性腫瘤」或「良性癌症」意謂保持位於源部位處且 不具有浸潤、侵襲或轉移至遠部位之能力的腫瘤。 「腫瘤負荷」意謂癌細胞數目、腫瘤尺寸或體内癌症 量。腫瘤負荷亦稱為腫瘤負載。 「腫瘤數目」意謂腫瘤之數目。 Β細胞贅瘤包括霍奇金氏病，包括淋巴細胞為主型霍奇 金氏病（LPHD);非霍奇金氏淋巴瘤（NHL);濾泡性令心細 胞（FCC)淋巴瘤；急性淋巴細胞性白血病（ALL);慢性淋巴 細胞性白血病（CLL);及毛細胞白血病。非霍奇金氏淋巴 瘤包括低度/濾泡性非霍奇金氏淋巴瘤（NHL)、小淋巴細胞 (SL)NHL、中度/濾泡性NHL、中度彌漫性NHL·、高度免疫 140371.doc •46· 200950778 母細胞NHL、高度淋巴母細胞NHL、高度小無裂細胞 NHL、巨大腫塊NHL、類漿細胞型淋巴細胞性淋巴瘤、套 細胞淋巴瘤、AIDS相關淋巴瘤及瓦爾登斯特倫巨球蛋白 血症（Waldenstrom's macroglobulinemia)。亦涵蓋對此等癌 • 症之復發的治療。LPHD為一種霍奇金氏病，即使採用放 射或化學療法治療，其亦易於頻繁復發。CLL為4種主要 白血病之一。稱為淋巴細胞之成熟B細胞之癌症，CLL係 藉由細胞進行性累積於血液、骨髓及淋巴組織中來表現。 Ο 惰性淋巴瘤為生長緩慢的不治之症，其中普通患者在許多 緩解及復發時期後存活6年與10年之間之時間。 如本文中所使用之術語「非霍奇金氏淋巴瘤」或 • 「NHL」係指除霍奇金氏淋巴瘤外之淋巴系統的癌症。通 常因霍奇金氏淋巴瘤中存在里-斯二氏細胞（Reed-Sternberg cells)且非霍奇金氏淋巴瘤中不存在該等細胞可將霍奇金 氏淋巴瘤與非霍奇金氏淋巴瘤加以區分。由如本文中所使 φ 用之術語涵蓋之非霍奇金氏淋巴瘤的實例包括將照此由熟 習此項技術者（例如腫瘤學家或病理學家）根據此項技術中 已知之分類方案來鑑別之任何非霍奇金氏淋巴瘤，該等分 類方案諸如如 Color Atlas of Clinical Hematology，第 3 版；A. Victor Hoffbrand 及 John E. Pettit(編）（Harcourt Publishers Limited 2000)(尤其參見圖 11.57、11.58 及/或 11.59)中戶斤述之歐美淋巴瘤修訂版（Revised European-American Lymphoma，REAL)方案。更特定實例包括（但不 限於）復發性或難治性NHL、一線低度NHL、III/IV期 140371.doc -47- 200950778 NHL、對化學療法有抗性之NHL、前軀體B淋巴母細胞白 血病及/或淋巴瘤、小淋巴細胞淋巴瘤、B細胞慢性淋巴細 胞性白血病及/或幼淋巴細胞白金病及/或小淋巴細胞淋巴 瘤、B細胞幼淋巴細胞淋巴瘤、免疫細胞瘤及/或淋巴漿細 胞淋巴瘤、邊緣區B細胞淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤、淋巴 結外邊緣區-MALT淋巴瘤、淋巴結性邊緣區淋巴瘤、毛細 胞白血病、漿細胞瘤及/或漿細胞骨髓瘤、低度/濾泡性淋 巴瘤、中度/渡泡性NHL、套細胞淋巴瘤、渡泡中心淋巴 瘤（;慮泡性）、中度彌漫性NHL、彌漫性大b細胞淋巴瘤、 侵襲性NHL(包括侵襲性一線NHL及侵襲性復發性NHL)、 自體性幹細胞移植後NHL復發或自體性幹細胞移植難治性 NHL、原發性縱隔大B細胞淋巴瘤、原發性滲出性淋巴 瘤、咼度免疫母細胞NHL、高度淋巴母細胞性NHL、高度 小無裂細胞NHL、巨大腫塊NHL、伯基特氏淋巴瘤 (Burkitfs lymphoma)、前軀體（外周）T細胞淋巴母細胞白血 病及/或淋巴瘤、成年Τ細胞淋巴瘤及/或白血病、τ細胞慢 性淋巴細胞淋巴瘤及/或幼淋巴細胞白血病、大顆粒淋巴 細胞白企病、蕈樣肉芽腫病及/或赛謝症候群（Sezary syndrome)、淋巴結外自然殺手/τ細胞（鼻型）淋巴瘤、腸病 型τ細胞淋巴瘤、肝脾τ細胞淋巴瘤、皮下脂膜炎樣τ細胞 淋巴瘤、皮膚淋巴瘤、多形性大細胞淋巴瘤、血管中心性 淋巴瘤、腸道Τ細胞淋巴瘤、外周Τ細胞（未另外指出）淋巴 瘤及血管免疫母細胞Τ細胞淋巴瘤。 本文中之「自體免疫疾病」為由個體自身組織產生且針 140371.doc 48· 200950778 對個體自身組織之疾病或病症，或其共分離疾病（co_ segregate)或表現或由其產生之病狀。自體免疫疾病或病 症之實例包括（但不限於）關節炎（類風濕性關節炎、青年類 風濕性關節炎、骨關節炎、牛皮癬性關節炎及強直性脊椎 . 炎）、牛皮癬、皮膚炎（包括異位性皮膚炎）；慢性特發性蓴 麻疹，包括慢性自體免疫蓴麻疹；多發性肌炎/皮肌炎、 中毒性表皮壞死溶解、系統性硬皮病及硬化、與發炎性腸 病（IBD)(克羅恩氏病（Crohn's disease)、潰瘍性結腸炎及伴 有壞疽性膿皮病、結節性紅斑、原發性硬化性膽管炎及/ 或鞏膜表層炎共分離之IBD)相關之反應；呼吸窘迫症候 群’包括成人呼吸窘迫症候群（ARDS);腦膜炎、lgE介導 ' 之疾病（諸如過敏及過敏性鼻炎）、腦炎（諸如拉斯穆森氏腦 炎（Rasmussen’s encephalitis))、葡萄膜炎、結腸炎（諸如顯 微鏡結腸炎及膠原性結腸炎）、絲球體腎炎（GN)(諸如膜 GN、特發性膜GN、包括I型及Π型之膜增生性gn(MPGN) ❹ 及快速進行性GN)、過敏病狀、濕疹、哮喘、涉及τ細胞 浸潤及慢性發炎性反應之病狀、動脈粥樣硬化、自體免疫 心肌炎、白血球黏著缺乏、全身性紅斑狼瘡（sle)(諸如皮 膚SLE)、狼瘡（包括腎炎性、腦炎性、兒科性、非腎性、 盤狀性 '脫髮性）、青少年發病型糖尿病、多發性硬化症 (MS)(諸如視神經脊髓炎MS(spino-optical MS)、過敏性腦 脊髓炎）、與由細胞激素及τ_淋巴細胞介導之急性及遲發過 敏反應相關之免疫反應、結核病、肉狀瘤病、肉芽腫病 (包括韋格納氏肉芽腫病（Wegener's granui〇niatosis))、顆粒 140371.doc •49· 200950778 球缺乏症、血管炎（包括大血管炎（包括風濕性多肌痛及巨 細胞（高安氏（Takayasu’s))動脈炎）、中等血管炎（包括川崎 氏病（Kawasaki's Disease)及結節性多動脈炎）、CNS血管炎 及ANCA相關血管炎（諸如徹奇-斯全司血管炎或症候群 (Churg-Strauss vasculitis or syndrome(CSS)D、再生障礙性 貧血、庫姆陽性貧血（Coombs positive anemia)、先天性純 紅血球再生障礙性貧血、免疫溶血性貧血（包括自體免疫 溶血性貧血（AIHA))、惡性貧血、純紅血球再生障礙性貧 血（PRCA)、因子VIII缺乏症、A型血友病、自體免疫嗜中 性白血球減少症、全部血球減少症、白血球減少症、涉及 白血球血球滲出之疾病、CNS發炎性病症、多種器官損傷 症候群、重症肌無力、抗原-抗體複合物介導之疾病、抗 腎小球基底膜疾病、抗磷脂抗體症候群、過敏性神經炎、 白塞病（Bechet disease)、卡斯曼氏症候群（Castleman’s syndrome)、古德帕斯徹氏症候群（Goodpasture's Syndrome)、蘭伯特-伊頓重症肌無力症候群（Lambert-Eaton Myasthenic Syndrome)、雷諾氏症候群（Reynaud’s syndrome)、休格連氏症候群（Sjorgen's syndrome)、史蒂 芬·違森症候群（Stevens-Johnson syndrome)、實體器官移植 排斥反應（包括對高群體反應性抗體力價之預治療、IgA沈 積於組織中及由腎移植、肝移植、腸道移植、心臟移植引 起之排斥反應等）、移植物抗宿主疾病（GVHD)、大皰性類 天疱瘡、天疱瘡（包括尋常、落葉狀及天疱瘡性黏膜類天 疮瘡）、自體免疫多内分泌病變、萊特爾氏病（Reiter's 140371.doc -50- 200950778 disease)、僵人症候群、免疫複合物性腎炎、IgM多發性神 經病或IgM介導之神經病、特發性血小板減少性紫廢 (ITP)、血栓性血小板減少性紫癜（TTP)、血小板減少症（如 例如由心肌梗塞患者所產生）（包括自體免疫血小板減少 症）、睾丸及即巢之自體免疫疾病（包括自體免疫睾丸炎及 印巢炎）、原發性甲狀腺功能低下；自體免疫内分泌疾病 • (包括自體免疫甲狀腺炎）、慢性甲狀腺炎（橋本氏甲狀腺炎 參 （Hashimoto’s Thyroiditis))、亞急性曱狀腺炎、特發性曱狀 腺功此低下、阿狄森氏病（Addison’s disease)、格雷氏病 (Grave’s disease)、自體免疫多腺症候群（或多腺内分泌病 症候群）、亦稱為胰島素依賴性糖尿病（ZDdm)之I型糖尿病 (包括兒童IDDM)及席漢氏症候群（Sheehan's syndrome：); • 自體免疫肝炎、淋巴間質性肺炎（HIV)、閉塞性細支氣管 炎（非移植）伴NSIP、古立安-白瑞（GuUlain_Barr0
Syndrome)、伯格氏病（Berger's Disease)(IgA 腎病）、原發 φ 性膽汁性肝硬化、乳糜瀉（麩質腸病變）、難治性口瘡伴有 共分離疱疹樣皮炎、冷球蛋白血症、肌萎縮側索硬化 (ALS，葛雷克氏病（Lou Gehrig's disease))、冠狀動脈病、
自體免疫内耳病（AIED)、自體免疫聽力喪失、眼陣攣-肌 陣攣症候群（OMS)、多軟骨炎（諸如難治性多軟骨炎）、肺 泡蛋白沈積症、殿粉樣變性病、巨細胞性肝炎、鞏膜炎、 未確定/未知意義之單株免疫球蛋白症（MGUS)、外周神經 病、副腫瘤症候群、離子通道病（諸如癲癇症、偏頭痛、 心律不整、肌肉性病症、耳聾、失明、週期性麻痹及CNS 140371.doc 51 200950778 之離子通道病）；自閉症、發炎性肌病及局灶節段性腎小 球硬化（FSGS)。 如本申請案中所使用之術語「前藥」係指醫藥活性物質 之前驅體或衍生形式，其與母體藥物相比對癌細胞之細胞 毒性較小且能夠經酶促活化或轉化為更具活性之母體形 式。參見例如，Wilman， 「"Prodrugs in Cancer
Chemotherapy」Bioc/zewiica/ 14，第 375-382 頁，第 615次會議 Belfast(1986)及 Stella等人， 「Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery」Dzreciet/ De/zvery，Borchardt 等人（編），第 247-267頁，Humana Press (1985)。本發明之前藥包括（但 不限於）可轉化成更具活性之細胞毒性游離藥物之含有填 酸鹽之前藥、含有硫代磷酸鹽之前藥、含有硫酸鹽之前 藥、含有肽之前藥、經D-胺基酸修飾之前藥、糖基化前 藥、含有β-内醯胺之前藥、含有視情況經取代之苯氧基乙 醯胺之前藥或含有視情況經取代之笨乙醯胺之前藥、5_敦 胞，咬及其他5-氟尿苷前藥。可衍生為前藥形式以供本發 明使用之細胞毒性藥物的實例包括（但不限於）下文所述之 彼等化學治療劑。 如本文中所使用之術語「細胞毒性劑」係指抑制或妨礙 細胞功能及/或引起細胞破壞之物質。該術語意欲包括放 射性同位素（例如 At211、I131、I丨25、γ90、Rei86、Rel88、
Sm 、Βι 、P及Lu之放射性同位素）、化學治療劑及毒 素（諸如細菌、真菌、植物或動物源之小分子毒素或酶活 140371.doc -52- 200950778 性毒素’包括其片段及/或變異體）。 「化學治療劑」為適用於治療癌症之化合物。化學治療 劑之實例包括：烷化劑，諸如塞替派（thiotepa)及 CYTOXAN®環麟醢胺；烧基石黃酸鹽，諸如白消安 (busulfan)、英丙舒凡（impr〇sulfan)及哌泊舒凡 (piposulfan);氮丙啶，諸如苯唑多巴（benz0(j0pa)、卡巴醌 (carboquone)、米特多巴（metured〇pa)及尤利多巴 (uredopa);伸乙基亞胺及曱基三聚氰胺，包括六曱蜜胺 (altretamine)、三伸乙基三聚氰胺、三伸乙基磷醯胺、三 伸乙基硫代碟酿胺及三經甲基三聚氰胺；多聚乙醯 (acetogenin)(尤其布拉他辛（bullatacin)及布拉他辛酮 (bullatacinone));喜樹鹼（campt〇thecin)(包括合成類似物 拓朴替康（topotecan);苔蘚蟲素（bryostatin);卡利斯塔叮 (callystatin) ; CC-l〇65(包括其阿多來新（adozelesin)、卡折 來新（carzelesin)及比折來新（bizeiesin)合成類似物）；自念 珠藻環肽（cryptophycin)(尤其自念珠藻環肽1及自念珠藻環 狀8);海兔毒素（dolastatin);多卡米辛（duocarmycin)(包括 合成類似物，KW-2189及CB1-TM1);艾榴塞洛素 (eleutherobin);水鬼蕉鹼（pancratistatin);沙考的汀 (sarcodictyin);海綿他汀（Sp〇ngistatin);氮芥類（nitrogen mustard) ’諸如苯丁酸氮芥、萘氮芬（chlornaphazine)、環 填酿胺、雌莫司丁（estramustine)、異環填醯胺 (ifosfamide)、氮芬（mechlorethamine)、氮芥氧化物鹽酸 鹽、美法命（melphalan)、新氮芥（novembichin)、膽留醇苯 140371.doc -53- 200950778 乙酸氮芬（phenesterine)、潑尼莫司汀（prednimustine)、曲 洛填胺（trofosfamide)、尿'•密咬氮芬（uracil mustard);亞石肖 基腺（nitrosurea)，諸如卡莫司汀（carmustine)、氣腺黴素 (chlorozotocin)、福莫司汀（fotemustine)、洛莫司；丁 (lomustine)、 尼莫司汀（nimustine)及雷莫司汀 (ranimnustine);抗生素，諸如稀二炔抗生素（例如卡奇黴 素（calicheamicin)，尤其卡奇黴素γΐΐ及卡奇黴素ωΐΐ(參見 例如，Agnew, Chem Inti.編 Engl·，33: 183-186 (1994)); 達内黴素（dynemicin)，包括達内黴素A;雙膦酸鹽，諸如 氣屈膦酸鹽（clodronate);埃斯培拉黴素（esperamicin);以 及新製癌菌素（neocarzinostatin)發色團及相關色蛋白稀二 快抗生素發色團）、阿克拉黴素（aclacinomysins)、放線菌 素（actinomycin)、奥斯拉米辛（authramycin)、偶氮絲胺酸 (azaserine)、 博萊黴素（bleomycin)、 放線菌素 C(cactinomycin)、卡拉比辛（carabicin)、洋紅黴素 (carminomycin)、嗜癌黴素（carzinophilin)、色黴素 (chromomycinis)、放線菌素 D(dactinomycin)、道諾黴素 (daunorubicin)、地托比星（detorubicin)、6-重氮基-5-側氧 基-L-正白胺酸、ADRIAMYCIN®阿黴素（doxorubicin)(包括 嗎琳基-阿黴素（morpho lino-doxorubicin)、氰基嗎淋基-阿 黴素（cyanomorpholino-doxorubicin)、2- D比 B各你基-阿黴素 及脫氧阿黴素（deoxydoxorubicin))、 表柔比星 (epirubicin)、依索比星（esorubicin)、黃膽素（idarubicin)、 麻西羅徽素（marcellomycin)、絲裂黴素（mitomycin)(諸如 140371.doc -54- 200950778
絲裂黴素C)、黴酌·酸（mycophenolic acid)、諾拉黴素 (nogalamycin)、撖欖黴素（olivomycin)、培洛黴素 (peplomycin)、泊非黴素（potfiromycin)、嗓吟黴素 (puromycin)、三鐵阿黴素（quelamycin)、羅多比星 (rodorubicin) ' 鏈黑菌素（streptonigrin)、鏈佐星 (streptozocin)、殺結核菌素（tubercidin)、烏苯美司 (ubenimex)、淨司他丁（zinostatin)、佐柔比星（zorubicin); 抗代謝物，諸如曱胺喋呤及5-氟尿嘧啶（5-FU);葉酸類似 物，諸如迪諾特寧（denopterin)、甲胺°禁吟、蝶羅吟 (pteropterin)、三曱曲沙（trimetrexate) ; 0票0令類似物，諸如 氟達拉濱（fludarabine)、6-疏基嘌呤、"塞咪嘌吟 (thiamiprine)、硫鳥嗓呤（thioguanine) ; 〇密咬類似物，諸如 安西他濱（ancitabine)、阿紮胞普（azacitidine)、6-氮尿普 (6-azauridine)、卡莫氟（carmofur)、阿糖胞苷 (cytarabine)、雙去氧尿普（dideoxyuridine)、去氧氟尿苷 (doxifluridine)、依諾他濱（enocitabine)、氟尿苷 (floxuridine);雄激素，諸如卡普睾酮（calusterone)、屈他 雄酮丙酸醋（dromostanolone propionate)、環硫雄醇 (epitiostanol)、美雄烧(mepitiostane)、睾内醋 (testolactone)； 抗腎上腺類，諸如胺魯米特 (aminoglutethimide)、米托坦（mitotane)、曲洛司坦 (trilostane);葉酸補充劑，諸如夫羅林酸（frolinic acid); 醋葡链内酯（aceglatone)； 越碌醯胺葡糖苷 (aldophosphamide glycoside)；胺基.乙 醯丙酸 140371.doc -55- 200950778
(aminolevulinic acid);恩尿0^ °定（eniluracil);安 °丫。定 (amsacrine);貝司他布（bestrabucil);比生群（bisantrene); 艾達曲卡（edatraxate);得弗伐胺（defofamine);秋水仙胺 (demecolcine);地 π丫酿（diaziquone);艾弗尼辛 (elfornithine);依利醋錄（elliptinium acetate);埃坡黴素 (epothilone);依託格魯（etoglucid);硝酸鎵（gallium nitrate);經基脲（hydroxyurea);磨兹多糖（lentinan);羅尼 代寧（lonidainine);美登素類（maytansinoids)，諸如美登素 (maytansine)及美登木素（ansamitocin)； 米托胍腙 (mitoguazone);米托蒽酿（mitoxantrone);莫比旦莫耳 (mopidanmol);石肖爾靈（nitraerine);喷司他丁 (pentostatin)；蛋胺氮芥（phenamet);"比柔比星 (pirarubicin);洛索蒽酿（losoxantrone);足葉草酸 (podophyllinic acid) ; 2-乙基酿肼；丙卡巴肼
(procarbazine) ; PSK® 多酷複合物（JHS Natural Products， Eugene, OR);雷佐生（razoxane);根黴菌素（rhizoxin);西 佐喃（sizofiran);鍺螺胺（spirogermanium);細交鏈孢菌酮 酸（tenuazonic acid);三亞胺酿（triaziquone) ; 2,2’，2"-三氣 三乙胺；單端抱黴烯族毒素（trichothecene)(尤其T-2毒素、 韋拉庫林A(verracurin A)、桿抱菌素A(roridin A)及安奎定 (anguidine));烏拉坦（urethan);長春地辛（vindesine);達 卡巴嗪（dacarbazine);甘露莫司汀（mannomustine);二漠 甘露醇（mitobronitol);二漠衛矛醇（mitolactol) ; °辰泊漠院 (pipobroman);伽托辛（gacytosine);阿拉伯糖皆 I40371.doc -56- 200950778 (arabinoside)(「Ara-C」）；環構醯胺；塞替派；紫杉醇 (taxoid)，例如 TAXOL® 太平洋紫杉醇（Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)、ABRAXANETM(不含克 列莫佛（Cremophor))(太平洋紫杉醇之白蛋白工程化奈米粒 子調西己物）（American Pharmaceutical Partners, Schaumberg,
Illinois)及 TAXOTERE® 多西他赛（doxetaxel)(Rh6ne-Poulenc Rorer, Antony，France);苯丁 酸氮芥（chloranbucil); GEMZAR®吉西他濱（g emcitabine) ; 6-硫鳥嗓吟；疏嗓吟； ❹ 曱胺°禁吟；翻類似物，諸如順始（cisplatin)及卡始；長春 花驗（vinblastine);翻；依託泊苦（etoposide)(VP-16);異 環填醯胺；米托蒽S昆；長春新驗（vincristine); NAVELBINE®長春瑞賓（vinorelbine); 諾凡特龍 (novantrone);替尼泊苷（teniposide);依達曲沙 (edatrexate);道諾徽素；胺基°票吟（aminopterin);希羅達 (xeloda);伊班膦酸鹽（ibandronate) ; CPT-11 ;拓撲異構酶 0 抑制劑RFS 2000;二I 曱基鳥胺酸（difluorometlhylornithine) (DMFO);類視色素，諸如視黃酸（retinoic acid);卡培他 濱（capecitabine);及以上任一者之醫藥學上可接受之鹽、 酸或衍生物。 此定義中亦包括用於調控或抑制激素對腫瘤之作用的抗 激素劑，諸如抗雌激素及選擇性雌激素受體調節劑 (SERM)，包括（例如）他莫昔芬（tamoxifen)(包括 NOLVADEX®他莫昔芬）、雷洛昔芬（raloxifene)、屈洛昔芬 (droloxifene)、4-經基他莫昔芬、曲沃昔芬（trioxifene)、雷 140371.doc -57- 200950778 洛昔芬（keoxifene)、LY117018、奥那司酮（onapristone)及 FARESTON托瑞米芬（FARESTON· toremifene);抑制芳香 酶之芳香酶抑制劑，其調控腎上腺中之雌激素產生，諸如 4(5)-σ米0坐、胺魯米特（aminoglutethimide)、MEGASE® 乙酸 甲地孕酮（megestrol acetate)、AROMASIN® 依西美坦 (exemestane)、弗米斯坦（formestanie)、法屈 0坐 (fadrozole)、RIVISOR® 伏羅唑（vorozole)、FEMARA® (letrozole)來曲 °坐及 ARIMIDEX®安美達錠（anastrozole);及 抗雄激素，諸如氟他胺（flutamide)、尼魯米特 (nilutamide)、比卡魯胺（bicalutamide)、亮丙瑞林 (leuprolide)及戈舍瑞林（goserelin);以及曲沙他濱 (troxacitabine)(l,3-二氧戊環核苷胞嘧咬類似物）；反義寡 核苷酸’尤其抑制異常細胞增殖中所涉及之信號轉導途徑 中之基因表現的反義寡核苷酸，諸如PKC-α、Ralf及H-Ras ;核糖核酸酶，諸如VEGF表現抑制劑（例如 ANGIOZYME®核糖核酸酶）及HER2表現抑制劑；疫苗，諸 如基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN®疫苗、 LEUVECTIN®疫苗及 VAXID®疫苗；prolEUKIN® rIL-2 ; LURTOTECAN®拓撲異構酶丨抑制劑；ABARELIX® rmRH ;及以上任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生 物。 「生長抑制劑」在用於本文中時係指活體外或活體内抑 制細胞生長之化合物或組合物。因此，該生長抑制劑為顯 著降低處於S期之過度表現該等基因之細胞的百分數之生 140371.doc -58- 200950778 二抑制劑。生長抑制劑之實例包括阻斷細胞週期進程(在 轉核…段）之卿及關H =劑。典型_阻斷劑包括長春花屬（長春新驗及長春 ，）、1杉及_。„抑制劑，諸如阿黴素、表柔比 .生、道諾黴素、依託泊普及博萊黴素。彼等使⑴停滯之藥 :咖益為能使s期停滞’例如dna烧基化劑，諸如他莫 …潑尼松、達卡巴嗪、氮芥(_h1〇rethamine)、順 φ始、甲胺嗓呤、5_氟尿喷啶及.C。其他資訊可見於 Murakami 等人之 77^ A/f , , 哥尺 t The Molecular BasU 〇f c_er, Mendelsohu1隨1編，第 1 章，標題為「Cell cycle
〒㈣。11，。腸gens，and anW〇plastic drugs」（WB
Saunders: Philadelphia，1995)，尤其第 i3 頁中。 • 射吾「細胞激素」&由一個細胞群體釋放之作為胞内介 體作用於另一細胞的蛋白質之通用術語。該等細胞激素之 實例為淋巴因子、單核球激素及傳統多狀激素。細胞激素 〇 中包括生長激素，諸如人類生長激素、N-甲硫胺醯基人類 生長激素及牛生長激素；副Μ腺激素；甲狀腺素；膜島 素；胰島素原；鬆弛素；鬆弛素原；醣蛋白激素，諸如促 濾泡素（FSH)、促甲狀腺激素（TSH)及促黃體素（LH);肝生 •長因子；纖維母細胞生長因子；泌乳素；胎盤生乳素；腫 瘤壞死因子-α及腫瘤壞死因子_β ;苗勒氏抑制物質 (mullerian-inhibiting substance) ·，小鼠促性腺激素相關 肽，抑制素；活化素；血管内皮生長因子；整合素；血小 板生成素（TPO);神經生長因子；血小板生長因子；轉化 140371.doc -59- 200950778 生長因子（TGF)，諸如丁册…及TGF_p ;類胰島素生長因 子-I及類胰島素生長因子_π ;紅血球生成素（Ep〇);骨誘 導因子；干擾素，諸如干擾素_α、干擾素邛及干擾素_γ; 群落刺激因子（CSF)，諸如巨噬細胞_csf(m_csF);粒細 胞-巨嗤細胞-CSF(GM-CSF);及粒細胞-CSF(G-CSF);介 白素（IL)，諸如1[-1、1[-2、1[-3、1[-4、11^5、11^-6、11^-7、IL-8、IL-9、IL-11、il-12 ;及包括 LIF 及套組配體 (KL)之其他多肽因子。如本文中所使用，術語細胞激素包 括來自天然來源或來自重組細胞培養物之蛋白質及天然序 列細胞激素之生物學活性等效物。 「包裝插頁」係用於指通常包括於治療產品之商業包裝 中之說明書，其含有關於適應症、用法、劑量、投藥、禁 忌症、待與包裝產品組合之其他治療產品及/或關於使用 該等治療產品之警告等的資訊。 如本文中所使用之術語「治療」及「療法」係指治療性 療法及預防性療法。 如本文中所使用之術語「哺乳動物」係指歸類為哺乳動 物之任何哺乳動物’包括人類、牛、馬、狗及貓。在本發 明之一較佳實施例中，該哺乳動物為人類。 本文中之「個體」為人類個體。通常，該個體（諸如）根 據實例及圖中所示之標準適合於治療。 II·本發明之組合物及方法 已描述與TNF配體家族有關之細胞激素，本文中鑑別為 「Apo-2配體」或r TRAIL」之細胞激素。所預測之天然 140371.doc -60· 200950778 人類Apo-2配體之成熟胺基酸序列含有281個胺基酸且具有 約32.5 kDa之計算出的分子量。不存在信號序列且存在内 部疏水性區顯示Apo-2配體為II型跨膜蛋白。亦已描述可 溶性胞外域Apo-2配體多肽。參見例如，1997年7月1 7日公 開之WO 97/25428。已進一步描述Apo-2L取代性變異體。 已將丙胺酸掃描技術用於鑑別具有生物活性之各種取代性 變異體分子。Apo-2配體之特定取代性變異體包括彼等其 中至少一個胺基酸經另一個胺基酸（諸如丙胺酸殘基）取代 之變異體。此等取代性變異體經鑑別為（例如）「D203 A」、 「D218A」及「D269A」。此命名法用於鑑別位置2〇3、218 及/或269(使用圖1中所不之編號）處之天冬胺酸殘基經丙胺 酸殘基取代之Apo-2配體變異體。視情況，本發明之ap〇_ 2L變異體可包含一或多個胺基酸取代。視情況，該等Apo_ 2L變異體為DR4或DR5受體選擇性變異體。 以下描述係關於製造Apo-2配體（包括Apo-2配體變異體） 之方法，其係藉由培養用含有Apo-2配體編碼核酸之載體 轉化或轉染之宿主細胞且自細胞培養物回收多肽來達成。 編碼Apo-2配體之DNA可自由咸信具有Apo-2配體mRN A 且其表現可達可偵測程度之組織製備之任何cDNA庫獲 得。因此’人類Apo-2配體DNA宜由自人類組織製備之 cDNA庫獲得，諸如如W〇 97/25428中所述之人類胎盤 cDNA之噬菌體庫。Apo-2配體編碼基因亦可自基因組庫獲 得或藉由寡核苷酸合成來獲得。 可用經設計以鑑別所關注基因或由其編碼之蛋白質的探 U0371.doc -61 · 200950778 針（諸如Apo-2配體之抗體或具有至少約20-80個鹼基之寡 核苷酸）來筛檢庫。可使用所選探針篩檢cDNA或基因組 庫，依標準程序，諸如Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述之程序進行。分離編碼Apo-2配體之基因的替代方法為使用PCR方法[Sambrook等人， 見上文；Dieffenbach 等人，PCR Primer:A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995)]。
Apo-2配體之胺基酸序列片段或變異體可藉由將適當核 苷酸變化引入Apo-2配體DNA中或藉由合成所需Apo-2配體 多肽來製備。該等片段或變異體表示胞内區、跨膜區或胞 外區中或其一個或兩個末端處之殘基插入、取代及/或缺 失，或圖1中對於全長Apo-2配體所示之胺基酸序列之插 入、取代及/或缺失。可進行插入、取代及/或缺失之任何 組合以得到最終構築體，其限制條件為最終構築體具有 (例如）如本文所定義之所需生物活性，諸如細胞凋亡活 性。在較佳實施例中，片段或變異體與本文對於Apo-2配 體之胞内域、跨膜域或胞外域所鑑別之序列或Apo-2配體 之全長序列具有至少約80°/。胺基酸序列一致性、更佳至少 約90%序列一致性且甚至更佳至少95%、96%、97%、98% 或99%序列一致性。胺基酸變化亦可改變Apo-2配體之轉 譯後加工，諸如改變糖基化位點之數目或位置或改變膜錨 定特徵。 如上文所述之Apo-2配體序列的變化可使用美國專利第 140371.doc -62- 200950778 5,3 64,934號中所述之保守性及非保守性突變之技術及準則 中之任一者來進行。此等技術及準則包括寡核苷酸介導 (定點）突變、丙胺酸掃描及PCR突變誘發。 可採用掃描胺基酸分析來鑑別沿鄰近序列之一或多個胺 基酸。較佳掃描胺基酸為相對小的中性胺基酸。該等胺基 酸包括丙胺酸、甘胺酸、絲胺酸及半胱胺酸。在此組中丙 胺酸通常為較佳掃描胺基酸，此係由於其消除超出β碳之 側鏈且不太可能改變變異體之主鏈構型。[Cunningham等 人，Science, 244:1081 (1989)]。丙胺酸通常亦由於其為最 常見胺基酸而為較佳。此外，其頻繁地見於隱藏與暴露位 置[Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co·, NY); Chothia，J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]。 胺基酸可根據其側鏈特性之相似性來分組（A. L. Lehninger, Biochemistry，第 2 版，第 73-75 頁，Worth Publishers, New York (1975)) · (1) 非極性：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、 Phe(F)、Trp(W)、Met(M); (2) 不帶電極性：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、 Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q); (3) 酸性：Asp(D)、Glu(E); (4) 鹼性：Lys(K)、Arg(R)、His(H)。 或者，天然存在之殘基可根據常見側鏈特性來分組： (1) 疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、lie ; (2) 中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gin ; 140371.doc -63- 200950778 (3) 酸性：Asp、Glu ; (4) 驗性：His、Lys、Arg ; (5) 影響鏈取向之殘基：Gly、Pro ; (6) 芳族：Trp、Tyr、Phe。 表1 初始 殘基 例示性 取代 較佳 取代 Ala(A) Val ; Leu ; lie Val Arg(R) Lys ； Gin ； Asn Lys Asn(N) Gin ； His ； Asp ； Lys ； Arg Gin Asp(D) Glu ； Asn Glu Cys(C) Ser ； Ala Ser Gln(Q) Asn ； Glu Asn Glu(E) Asp ； Gin Asp Gly(G) Ala Ala His(H) Asn ; Gin ; Lys ; Arg Arg Ile(I) Leu ； Val ； Met ； Ala ； Phe ;正白胺酸 Leu Leu(L) 正白胺酸；lie ; Val ; Met ; Ala ; Phe lie Lys(K) Arg ; Gin ; Asn Arg Met(M) Leu ; Phe ; lie Leu Phe(F) Trp ; Leu ; Val ; lie ; Ala ; Tyr Tyr Pro(P) Ala Ala Ser(S) Thr Thr Thr(T) Val ; Ser Ser Trp(W) Tyr ； Phe Tyr Tyr(Y) Trp ； Phe ； Thr ； Ser Phe Val(V) lie ; Leu ; Met ; Phe ; Ala ;正白胺酸 Leu 亦包括在本發明之範疇内之Apo-2配體序列的變化係關 於胺基末端衍生物或經修飾形式。該等Apo-2配體序列包 括本文所述之於多肽序列之N-末端處具有曱硫胺酸或經修 飾之曱硫胺酸（諸如甲醯基甲硫胺醯基或其他封端曱硫胺 醯基物質）的Apo-2配體多肽中之任一者。 140371.doc -64- 200950778 可將編碼天然或變異AP〇-2配體之核酸（例如cDNA或基 因組DNA)插入可複製載體中以進行進一步選殖（擴增DNA) 或表現。可公開獲得各種載體。載體組份通常包括（但不 限於）以下一或多者：信號序列、複製起點、一或多個標 • 誌基因、增強子元件、啟動子及轉錄終止序列，其中每一 者均在下文中描述。可使用之可選信號序列、複製起點、 • 標誌基因、增強子元件及轉錄終止序列為此項技術所已知 且更詳細地描述於WO 97/25428中。 表現及選殖載體通常含有由宿主生物體所識別且操作性 連接於AP〇-2配體核酸序列之啟動子。啟動子為位於結構 基因之起始密碼子上游（5，）的非轉譯序列（通常在約1〇〇汁 • 至1000 #内），其控制其操作性連接之特定核酸序列（諸如 • Ap〇-2配體核酸序列）之轉錄及轉譯。該等啟動子通常分為 兩類：誘導型及組成型。誘導型啟動子為在其控制下響應 於培養條件之一些變化（例如存在或不存在營養素或溫度 參 變化）而起始增加程度之DNA轉錄的啟動子。目前，大量 由各種潛在宿主細胞所識別之啟動子為眾所周知。藉由經 由限制酶消化自源DNA移除啟動子且將經分離之啟動子序 列插入載體中而使此等啟動子操作性連接於八？〇_2配體編 碼DNA。天然Apo_2配體啟動子序列與多種異源啟動子皆 可用於引導Apo-2配體DNA之擴增及/或表現。 適合用於原核及真核宿主之啟動子為此項技術所已知且 更詳細地描述於WO 97/25428中。 於大腸桿菌（五.co/z’）中產生可溶性Apo_2L之較佳方法使 140371.doc -65· 200950778 用調控產物表現之誘導型啟動子。可控制、誘導型啟動子 之使用使得培養物在誘導產物表現及累積宿主無法良好耐 受之大量產物前生長至合乎需要之細胞密度。 申請者已評估若干種誘導型啟動子系統（T7聚合酶、trp 及驗性填酸酶（AP))之Ap〇_2L⑴4_281形式）表現。使用此-三種啟動子中之每—者均致使大量可溶性、生物學活性 Apo-2L三聚體自收穫之細胞糊狀物回收。Ap啟動子在此 二種誘導型啟動子系統中為較佳的，因為其具有較嚴格啟 動子控制且在收穫之細胞糊狀物中達成較高細胞密度及力〇 價。 使用標準連接技術建構含有上文所列組份中之一或多者 的合適載體。將經分離之質體片段裂解，修整且以 產生所需質體所需之形式再連接。 對於證實所建構之質體中之正確序列的分析而言，可使 用連接混合物來轉化大腸桿菌K12菌株294(ATCc 31，446) 及適當時由安比西林（ampicillin)或四環素（tetracycline)抗 ❹ 性所選之成功轉化子。製備來自轉化子之質體，且將其藉 由限制性核酸内切酶消化來分析，且/或使用此項技術中 已知之標準技術來測序。[參見例如，Messing等人， ·
Nucleic Acids Res” 9:309 (1981) ; Maxam等人，Methods in Enzymology, 65:499 (1980)] 〇 了使用為編碼Ap0-2配體之DNA在哺乳動物細胞_之瞬 時表現所提供的表現載體。一般而言，瞬時表現包括使用 能夠有效地在宿主細胞中複製之表現載體，從而使得宿主 140371.doc -66 - 200950778 細胞累積表現载體之許多複本且又合成高含量之由表現載 體所編碼之所需多肽[Sambr〇〇k等人，見上文]。包含合適 #見載體及#主細胞之瞬時表現系統使得便利地對由經 選殖DNA編碼之乡肽作出陽性鑑別以及針對所需生物學 &生理學特性對該等多肽進行快速篩檢。因此，瞬時表現 系統特別適用於本發明中鐘別Ap〇_2配體之類似物及變異 * 體（為生物學活性AP〇-2配體）之目的。 0 —適合於使適應在重組脊椎動物細胞培養中合成AP〇-2配 體之其他方法、載體及宿主細胞係描述於等人，
Nature，293:620-625 (1981) ; Mantei 等人，Nature， 281:40-46 (1979) ; EP 117,060 ;及 EP 117,058 中。 ' 適合於在本文中之載體中選殖或表現DNA的宿主細胞包 • 括原核生物、酵母或高級真核生物細胞。出於此目的之合 適原核生物包括（但不限於）真細菌，諸如革蘭氏陰性 (Gram-negative)或革蘭氏陽性（Gram_p〇sitjve)生物體，例 ❹ 如腸内菌科（五”⑽，諸如埃希氏菌 (心，例如大腸桿菌；腸桿菌屬（心; 伊文氏桿菌屬;克雷伯氏菌（尤心心化仏）；變形桿 囷屬（/Voiewj)，沙門氏菌屬，例如，鼠傷寒沙 門菌（*Sa/mo«e//a 〇;ρ；π·卿rz·㈣）；沙雷氏菌屬，例 如黏質沙雷氏痛（iSerraiia marceica«i);及志賀桿菌屬 ，以及芽孢桿菌屬（^αί7ζ·//ζ_)，諸如枯草桿菌（万 及地衣芽抱桿囷（_g. (例如1989年4月 12日公開之DD 266，7 10中所揭示之地衣芽抱桿菌41 p);假 14037I.doc -67- 200950778 單胞菌屬，諸如綠膿桿菌（戶此rwp·⑽μ); 及鏈黴菌屬（Sirepiomyce·?)。較佳地，宿主細胞應分泌最少 量之蛋白水解酶。 除原核生物外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物為編 碼AP〇-2配體之載體之合適選殖或表現宿主。適合於表現 糖基化Ap〇-2配體之宿主細胞係源自多細胞生物體。所有 »亥等佰主細胞之實例（包括CH〇細胞）係進一步描述於w〇 97/25428中。 將伯主細胞用上述表現或選殖載體轉染且較佳轉化以產 生AP〇-2配體且在適當時經改質之營養培養基中培養以誘 導啟動子、選擇轉化子或擴增編碼所需序列之基因。 轉染係指宿主細胞吸收表現載體，無論實際表現抑或不 表現任何編碼序列。多種轉染方法為一般熟習此項技術者 所已知，例如CaP〇4及電穿孔。通常當此載體操作之任何 指示出現於宿主細胞内時認可轉染成功。 轉化意謂將DNA引入生物體中使得DNA可作為染色體外 元件複製或由染色體成份複製。視所用宿主細胞而定，使 用適合於該等細胞之標準技術進行轉化。採用氣化鈣之鈣 處理（如Sambrook等人，見上文中所述）或電穿孔通常用於 原核生物或含有實質細胞壁障壁之其他細胞。如81^评等 人，Gene，23:315(1983)及 1989 年 6 月 29 日公開之 w〇 89/05859所述，使用以根癌土壤桿菌（人以吡如⑼謂 tumefaciens)感染來轉化某些植物細胞。此外，可使用如 1991年1月1〇日公開之w〇 91/〇〇358中所述之超音波處理來 140371.doc • 68 * 200950778 轉染植物。 對於無該等細胞壁之哺乳動物細胞而言，可使用Graham 及 van der Eb，Virology, 52:456-457(1978)之磷酸鈣沈澱 法。哺乳動物細胞宿主系統轉化之通用態樣已描述於美國 • 專利第4,399,216號中。轉化至酵母中通常根據van
Solingen 等人，J. Bact·，130:946 (1977)及 Hsiao 等人， Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979)之方法來進 ©行。然而，亦可使用將DNA引入細胞中之其他方法，諸如 藉由細胞核顯微注射、電穿孔、與完整細胞或聚陽離子 (例如聚凝胺（polybrene)、聚鳥胺酸（p〇ly〇mithine))之細菌 原生質體融合。關於轉化哺乳動物細胞之各種技術，參見
Keown等人，Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) 及Mansour等人，Nature, 336:348-352 (1988)。 可將用於產生Apo-2配體之原核細胞於如通常Sarnbrook 等人（見上文）中所述之合適培養基中培養。可用於培養大 _ 腸杯菌之特定形式之培養基係進一步描述於以下實例中。 可將用於產生Apo-2配體之哺乳動物宿主細胞於多種培養 基中培養。 市售培養基之實例包括漢姆氏（Ham's)Fi〇(sigrna)、最低 必需培養基（「MEM」，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)及杜爾 貝科氏改質伊格爾氏培養基（Dulbecc〇，s Modified EagleS Medium)(「DMEM」’ Sigma)。任何該種培養基可按需要 補充有激素及/或其他生長因子（諸如胰島素、轉鐵蛋白或 表皮生長因子）、鹽（諸如氯化鈉、鈣、鎂及磷酸鹽）、緩衝 140371.doc -69- 200950778 液（諸如HEPES)、核芽（諸如腺皆及胸苷）、抗生素（諸如 Gentamycin™藥物）、微量元素（定義為通常以微莫耳範圍 内之最終濃度存在的無機化合物）及葡萄糖或等效能量 源。亦可包括熟習此項技術者已知之適當濃度之任何其他 必需補充劑。諸如溫度、pH值及其類似條件之培養條件為 先前用於為表現所選之宿主細胞的彼等條件，且將為一般 熟習此項技術者顯而易見。 一般而έ ’使哺乳動物細胞培養物之生產率最大的原 理、方案及實踐技術可見於Mammaiian cell
Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler編（IRL
Press, 1991)。 根據本發明之一態樣，通常培養基中會添加有或包括一 或多個二價金屬離子來培養或醱酵宿主細胞。該等二價金 屬離子較佳以足以增強儲存穩定性、增強溶解性或輔助形 成由一或多個鋅離子配位之穩定Apo_2L三聚體的濃度含量 存在於培養基中或添加至培養基中。可添加之二價金屬離 子的量將部分視培養物中之宿主細胞密度或對該等二價金 屬離子之潛在宿主細胞敏感性而定。在培養物中之較高宿 主細胞密度下，增加二價金屬離子之濃度可為有益的。若 在宿主細胞表現產物期間或之後添加二價金屬離子，則因 為宿主細胞表現產物增加，可能需要調節或増加二價金屬 離子濃度。通常咸信可存在於典型常用細胞培養基中的痕 量二價金屬離子可能不足以用於穩定三聚體形成。因此， 如本文中所述，較佳添加額外量之二價金屬離子。 140371.doc -70- 200950778 若在培養物中之宿主細胞的生長期内添加二價金屬離 子則較it將一價金屬離子以不會不利地或負面地影響宿 主細胞生長之濃度添加至培養基中。在搖瓶培養物中，觀 察到以大於1 mM之濃度添加之ZnS〇4可導致較低宿主細胞 • 密度。熟習此項技術者瞭解細菌細胞可藉由與細胞基質形 成金屬離子錯合物而有效地螯合金屬離子。因此，在細胞 • 培養物中，較佳在生長期後（達成所需宿主細胞密度後）或 φ 恰在宿主細胞表現產物之前將所選二價金屬離子添加至培 養基中。為確保存在足量之二價金屬離子，可在產物表現 期内將其他一價金屬離子添加或饋送至細胞培養基中。 培養基中之二價金屬離子濃度應不超過可能對宿主細胞 有害或有毒之濃度。在使用宿主細胞大腸桿菌之本發明方 • 法中，培養基中二價金屬離子濃度較佳不超過約丨mM(較 佳£1 mM)。甚至更佳地，培養基中之二價金屬離子濃度 為約50微莫耳至約250微莫耳。最佳地，該等方法中所用 # 之二價金屬離子為硫酸鋅。將二價金屬離子以金屬離子與 AP〇-2配體三聚體可以1:1莫耳比存在之量添加至細胞培養 物中較為合乎需要。 可將二價金屬離子以任何可接受之形式添加至細胞培養 物中。舉例而言，可使用水來製備金屬離子溶液，且接著 可將二價金屬離子溶液添加或饋送至培養基中。 AP〇-2L之表現可例如藉由習知南方墨點法（s〇uthern Motting)、北方墨點法（Northern⑽麻g)(用以定量mRNA 轉錄）[Thomas，Proc· Natl. Acad. Sei. USA，77:52〇152()5 140371.doc •71 · 200950778 (1980)]、點潰墨法（DNA分析）或基於本文所提供之序列使 用適當經標記之探針的原位雜交而直接在樣品中量測。可 使用各種標記，最常見為放射性同位素且尤其為Up。然 而，亦可使用其他技術，諸如使用經生物素修飾之核苷酸 以引入聚核苷酸中。接著生物素充當與抗生物素蛋白或抗 體結合之位點，其可經各種標記（諸如放射性核苷酸、螢 光增白劑或酶）標記。或者，可使用可識別包括DNa雙鏈 體、RNA雙鏈體及DNA-RNA雜交雙鏈體或DNA_蛋白質雙 鏈體之特定雙鏈體之抗體。又可對抗體作標記且可在雙鏈 © 體結合於表面時進行檢定，以便在表面上形成雙鏈體後， 能偵測到與雙鏈體結合之抗體的存在。或者，可藉由諸如 細胞或組織切片之免疫組織化學染色及對於細胞培養物或 體液之檢定的免疫學方法量測基因表現以直接定量基因產 物之表現。在免疫組織化學染色技術下，細胞樣品通常藉 . 由脫水及固定，隨後與對所偶合之基因產物具特異性之經 標記抗體反應來製備，其中該等標記通常肉眼可偵測，諸 如酶標記、螢光標記、發光標記及其類似物。 © 適用於樣品流體之免疫組織化學染色及/或檢定之抗體 可為單株或多株抗體，且可在任何哺乳動物體内製備。適 宜地，可製備針對天然Ap〇-2配體多肽或針對基於本文中 所提供之DNA序列的合成肽或針對與Ap〇_2配體DNA融合 且編碼特異性抗體抗原決定基之外源序列的抗體。 AP〇-2配體較佳以分泌性多肽形式自培養基回收，儘管 當在無分泌化號下直接產生時其亦可自宿主細胞溶解物回 140371.doc -72· 200950778 收。若Apo-2配體為膜結合型， 則其可使用合適之清潔剤 溶液（例如Triton-X 1〇〇)自腹經姑々计九 )目膜釋放或其胞外區可藉由酶裂解 而釋放。 鮮 當Apo-2配體在除人類來源之重組細胞外之重組細胞中 產生時配體不含人類來源之蛋白質或多肽。缺 而，通常有必要自重組細胞蛋白質或多肽回收或純化八， 2配體以獲得大體上與一_2配體同源之製劑。作為第—步 驟，可將培養基或溶解物離d移除微粒細胞碎片。之 後，自污染物可溶性蛋白質及多肽純化知。_2配體，以下 程序為例示合適之純化程序：藉由離子交換柱分館；乙醇 沈殺；逆才目肌C;〔氧化石夕層析法或陽離子交換樹脂（諸 如DEAE或CM)層析法；層析聚焦；SDS_pAGE;硫酸錢沈 澱；使用例如Sephadex G-75之凝膠過濾；透濾及蛋白八瓊 脂糖管柱用以移除諸如IgG之污染物。
在一較佳貫施例中，Αρο·2配體可藉由親和層析法分 離。考慮由變異引起之特性之任何實質變化，以與天然 ΑΡ〇-2配體相同之方式回收已有殘基缺失、插入或取代之 Apo-2配體片段或變異體。舉例而言，製備入沖^配體與另 一種蛋白質或多肽（例如細菌或病毒抗原）之融合物有助於 純化，含有抗原之抗體的免疫親和管柱可用於吸附融合多 肽0 諸如苯基曱基磺醯基氟化物（PMSF)之蛋白酶抑制劑亦可 適用於抑制純化期間之蛋白水解降解，且可包括抗生素以 防止外來污染物之生長。熟習此項技術者應瞭解適合於天 140371.doc •73- 200950778 然Apo-2配體之純化方法可能需要改良以解決Αρ〜2配體或 其變異體在表現於重組細胞培養物中後之特徵變化。 在任何該等純化步驟期間，可能需要使回收之八口〇_儿暴 露於含有二價金屬離子之溶液或含有一或多個二價金屬離 子之純化物質（諸如層析介f或支律物）。在—較佳實施例 中，在回收或純化Apo_2L期間使用二價金屬離子及/或還 原劑。視情況，可在回收或純化Ap〇_2L期間使用二價金屬 離子及還原劑（諸如DTT或BME)。咸信在回收或純化期間 使用二價金屬離子將提供ApG_2L三聚體之穩定性或保持在 細胞培養步驟期間形成之Ap〇_2L三聚體。 以下描述亦係關於產生共價連接（下文為「共軛」）於一 或多個化學基團之Apo.2配體之方法。適合用於本發明之
Apo-2L共輛物的化學基團較佳不具明顯毒性或免疫原性。 視情況選擇化學基團以產生可在適合於儲存之條件下儲存 及使用的AP〇-2L共軛物。可共軛於多肽之多種例示性化學 基團為此項技術所已知且包括（例如）碳水化合物，諸如天 然存在於醣蛋白上之彼等碳水化合物；聚麩胺酸鹽；及非 蛋白質聚合物，諸如多元醇（參見例如，美國專利第 6,245,901號）。 舉例而言，如WO 93/00109(見上文）中所揭示，多元醇 可共輛於多肽（諸如AP〇-2L)之一或多個胺基酸殘基（包括離 胺酸殘基）處。所用之多元醇可為任何水溶性聚（氧化烯）聚 合物且可具有直鏈或支鏈。合適之多元醇包括於一或多個 羥基位置處經諸如具有1與4個之間的碳之烷基的化學基團 140371.doc •74- 200950778 取代之多元醇。通常，多元醇為聚（烷二醇），諸如聚（乙二 醇）(PEG)，且因此為便於描述，論述之其餘部分係關於所 用多元醇為PEG且將多元醇共軛於多肽之方法稱為「聚乙 二醇化」的例示性實施例。然而，熟習此項技術者應瞭解 • 諸如聚（丙二醇）及聚乙二醇-聚丙二醇共聚物之其他多元醇 可使用本文中對於PEG所述之共軛技術來利用。 用於使Apo-2L聚乙二醇化之PEG的平均分子量可變化， 且通常可在約500道爾頓（D)至約30,000道爾頓之範圍内。 Φ 較佳地，PEG之平均分子量為約1,000 D至約25，000 D，且 更佳為約1，000 D至約5,000 D。在一實施例中，用平均分 子量為約1,000 D之PEG來進行聚乙二醇化。視情況，PEG 均聚物未經取代，但其亦可於一末端處經烷基取代。較佳 地，該烷基為C1-C4烷基且最佳為甲基。PEG製劑為市售 的，且通常適合用於本發明之彼等PEG製劑為根據平均分 子量出售之非均質製劑。舉例而言，市售PEG(5000)製劑 @ 通常含有分子量略有不同（通常±500 D)之分子。 本發明之Apo-2配體可呈多種形式，諸如呈單體形式或 三聚體形式（包含三個單體）。視情況，Apo-2L三聚體將以 使得PEG分子連接或共軛於構成三聚Apo-2L之三個單體中 之一者、兩者或每一者的方式經聚乙二醇化。在該實施例 中，所用之PEG較佳具有約1,000 D至約5,000 D之平均分 子量。亦涵蓋Apo-2L三聚體可「部分」經聚乙二醇化，亦 即其中構成三聚體之三個單體中僅一或兩者連接或共軛於 PEG。 140371.doc -75- 200950778 使蛋白質聚乙二醇化之各種方法為此項技術所已知。產 生與PEG共軛之蛋白質的特定方法包括美國專利第 4，179,337號、美國專利第4,935,465號及美國專利第 5,849,535號中所述之方法。通常，主要視反應條件、聚合 物之分子量等而定’蛋白質經由蛋白質之胺基酸殘基中之 一或多者與聚合物上之末端反應性基團共價鍵結。具有反 應性基團之聚合物在本文中稱為經活化聚合物。該反應性 基團選擇性地與蛋白質上之游離胺基或其他反應性基團反 應。PEG聚合物可以無規或位點特異性方式與蛋白質上之 胺基或其他反應性基團偶合。然而，應瞭解為獲得最佳結 果，所選反應性基團之類型及量以及所用聚合物之類型將 視所用特定蛋白質或蛋白質變異體而定以避免反應性基團 與蛋白質上過多特別活性基團反應。因為此或許不可能完 王避免，故推薦通常使用視蛋白質濃度而定每莫耳蛋白質 約0· 1莫耳至1 〇〇〇莫耳、較佳2莫耳至2〇〇莫耳經活化聚合 物。每莫耳蛋白質之經活化聚合物之最終量為使維持最佳 活性’同時若可能則使蛋白質之循環半衰期最佳化達到平 衡之量。 另外涵蓋亦可使用此項技術中已知之技術將本文所述之 Ap〇2L與白胺酸拉鏈序列連接或融合。 產生血管内皮生長因子（VEGF)抗體之方法已描述於此項 技術中（抗VEGF抗體包括人類化及/或親和力成熟抗VEGF 抗體，諸如人類化抗VEGF抗體huA4.6.1 AVASTIN)(Kim等 人 ’ Oowi/? Faciei, 7:53-64 (1992)，1998 年 10 月 15 日公 14037l.doc -76- 200950778 開之國際公開案第WO 96/30046號及第WO 98/45331號）。 較佳地，根據本發明所用之VEGF抗體為可購自Genentech， Inc之「貝伐單抗」或Avastin®。 血管内皮生長因子（VEGF)已鑑別為刺激血管生成及誘導 . 血管渗透性所涉及之關鍵因子。Ferrara等人，Endocr.
Rev. 18:4-25 (1997)。有關即使單一 VEGF對偶基因損失亦 •導致胚胎死亡之發現指出此因子在血管系統之發育及分化 中所發揮之不可替代的作用。此外，已顯示VEGF為與腫 瘤及眼内病症相關之新血管生成之關鍵介體。Ferrara等 人，Endocr. Rev.見上文。VEGF mRNA為絕大部分所檢 查之人類腫瘤所過度表現。Berkman等人，J. Clin. Invest. 9 1:1 53-1 59 (1 993) ; Brown等人，Human Pathol. 26:86-91 (1995) ; Brown等人，Cancer Res. 53:4727-4735 (1993); Mattern等人，Brit. J. Cancer 73:931-934 (1996); Dvorak 等人，Am, J. Pathol. 146:1029-1039 (1995)。 φ 抗VEGF中和抗體抑制裸鼠體内各種人類腫瘤細胞株之 生長（Kim 等人，362:841-844 (1993) ; Warren 等 人，·/· C/，《. hvew. 95:1789-1797 (1995) ; B〇rgStr0m 等 . 人，Cancer Res. 56:4032-4039 (1996) ; Melnyk 等人， ‘ 56:921-924 (1996))且亦在缺血性視網膜病症 之模型中抑制眼内血管生成。Adamis等人，Ad 114:66-71 (1996)。因此，抗VEGF單株抗體或 VEGF作用之其他抑制劑為治療腫瘤及各種眼内新生血管 病症之有前途的候選物❶該等抗體係（例如）描述於丨998年丄 140371.doc •77· 200950778 月14日公開之EP 817,648 ;及1998年10月15日公開之WO 98/45331 與 WO 98/45332 中。 抗VEGF抗體「貝伐單抗」（亦稱為「rhuMAb VEGF」或 「Avastin®」）為根據 Presta 等人 57:4593- 4599(1997)所產生之重組人類化抗VEGF單株抗體。其包含 突變型人類IgGl構架區及來自阻斷人類VEGF與其受體結 合之鼠類抗hVEGF單株抗體A.4.6.1的抗原結合互補決定 區。約93%之貝伐單抗胺基酸序列（包括大部分構架區）係 源自人類IgGl，且約7%之該序列係源自鼠類抗體A4.6.1。 貝伐單抗具有約149,000道爾頓之分子質量且經糖基化。 貝伐單抗已由FDA批准與化學治療方案組合用於治療轉移 性結腸直腸癌（CRC)及非小細胞肺癌（NSCLC)。Hurwitz等 人，N. Engl. J. Med. 350:2335-42 (2004) ; Sandler等人， N. Engl. J. Med. 355:2542-50 (2006)。目前，貝伐單抗正 在進行中之治療多種癌症病症的臨床試驗中加以研究。 Kerbel，·/· C/k, 0«co/. 19:45S-51S (2001) ; De Vore等人， Proc. dm. Cm 0加〇/· 19:485a. (2000) ; Hurwitz 等 人，Clin. Colorectal Cancer 6:66-69 (2006) ; Johnson 等 人，Proc. Jm. iSoe. C7i«. 20:315a (2001);
Kabbinavar等人 J. 21:60-65 (2003) ; Miller等 K » Breast Can. Res. Treat. 94:^^] 1:S6 (2005) ° 產生CD20抗體之方法已描述於此項技術中。較佳地， 根據本發明所用之CD20抗體為可購自Genentech，Inc之 「利妥昔單抗」或Rituxan®。 140371.doc -78- 200950778 CD20抗原（亦稱為人類B淋巴細胞限制性分化抗原， Bp35)為位於前B及成熟B淋巴細胞上之分子量為約35 kD的 疏水性跨膜蛋白（Valentine 等人 J. Biol. Chem. 264(19): 1 1282-11287 (1989);及 Einfeld 等人 ·/· 7(3):711- • 717 (1988))。該抗原亦表現於超過90%之Β細胞非霍奇金 氏淋巴瘤（NHL)上（Anderson 等人 63(6):1424-1433 (1984))，但並不見於造血幹細胞、祖B細胞、正常漿細胞 或其他正常組織上（Tedder等人《/. /wwwnoL 135(2):973-979 (1985))。CD20調控細胞週期起始及分化之活化過程中 的早期步驟（Tedder等人，見上文）且可能起鈣離子通道之 作用（Tedder等人J. Ce//_ 14D:195 (1990))。假設 . CD20表現於B細胞淋巴瘤中，此抗原可充當「靶向」該等 淋巴瘤之候選物。 利妥昔單抗（RITUXAN®)抗體為針對CD20抗原之基因工 程化嵌合鼠類/人類單株抗體。利妥昔單抗為1998年4月7 φ 曰頒布之美國專利第5,736，137號（Anderson等人）中稱為 「C2B8」之抗體。指示RITUXAN®用於治療患有復發性或 難治性低度或濾泡性、CD20陽性、B細胞非霍奇金氏淋巴 瘤之患者。活體外作用機制研究已證明RITUXAN®結合人 類補體且經由補體依賴性細胞毒性（CDC)溶解淋巴B細胞 株（Reff 等人 83(2):435-445 (1994); Cragg及 Marlin,
Blood，103: 2738-2743 (2004))。另外，在針對抗體依賴性 細胞介導之細胞毒性（ADCC)之檢定中其具有顯著活性。 最近，已顯示RITUXAN®在氚化胸苷併入檢定中具有抗增 140371.doc •79- 200950778 生效應且直接誘導細胞凋亡，而其他抗CD19及CD20抗體 並不如此（Maloney 等人5/ood 88(1 0):637a (1996))。亦以實 驗方式觀察到RITUXAN®與某些化學療法及毒素之間的協 同作用。詳言之，RITUXAN®使抗藥性人類B細胞淋巴瘤 細胞株對阿黴素、CDDP、VP-16、白喉毒素及蓖麻毒素之 · 細胞毒性作用敏感（Demidem等人Career c& iiaAo/i/zarmacewiz'Cii/s 12(3):177-186 (1997))。活體内臨床 前研究已展示RITUXAN®可能經由補體及細胞介導之方法 來消耗來自獼猴之外周血液、淋巴結及骨髓的B細胞（Reff ® 等人5/ood 83(2):435-445 (1994))。
本發明亦提供包含Apo2L/TRAIL、化學療法及/或VEGF 抗體之調配物。咸信該等調配物將尤其適合於儲存以及治 . 療性投藥。調配物可藉由已知技術來製備。舉例而言，調 配物可藉由於凝膠過濾管柱上進行緩衝液交換來製備。 本發明亦提供包含Apo2L/TRAIL及/或CD20抗體之調配 物。咸信該等調配物將尤其適合於儲存以及治療性投藥。 ^ 0 調配物可藉由已知技術來製備。 通常將適當量之可接受之鹽或載劑用於調配物中以使調 配物等張。醫藥學上可接受之載劑的實例包括生理食鹽 水、林格氏溶液（Ringer's solution)及右旋糖溶液。溶液之 pH值較佳為約6至約9，且更佳為約7至約7.5。對於熟習此 項技術者將顯而易見，視（例如）投藥途徑及藥劑濃度而 定，某些載劑可為更佳的。 治療性組合物可藉由將具有適當純度之所需分子與可選 140371.doc -80- 200950778 載知彳賦形劑或穩定劑混合（Remington’s Pharmaceutical
Sciences ’第16版，〇s〇i, a.編（1980))而以凍乾調配物、水 性溶液或水性懸浮液之形式來製備。可接受之載劑、賦形 劑或穩定劑較佳在所用劑量及濃度下對受體無毒，且包括 緩衝液，諸如Tris、HEPES、PIPES、磷酸鹽、檸檬酸鹽及 其他有機酸，抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐 劑（諸如氣化十八烷基二曱基苄基銨；氣化六羥季銨；氯 e ❹ 化苯甲烴銨、苄索氣銨；苯酚、丁醇或苄醇；對羥基苯曱 酸院基S旨，諸如對經基苯甲酸甲g旨或賴基苯甲酸丙醋； 兒茶酚’間苯一酚；環己醇；3·戊醇；及間甲酚)；低分子 量（少於約1〇個殘基）多肽；蛋白質’諸如血清白蛋白、明 /或免疫球蛋自，親水性聚合物，諸如聚乙烯❸各咬嗣； 胺基酸，諸如甘胺酸、麵㈣酸、天冬醯㈣、組胺酸、 精胺酸或離胺酸；物、雙骑及其他碳水化合物，包括葡 萄糖、甘露糖或糊精；糖類，諸如嚴糖、甘露糖醇、海藻 糖或山梨糖醇；成鹽平衡離子，諸如納；及/或非離子界 面活性劑，諸如TWEPN1^、έ»τ τ WEEN pluronicstm 或聚乙二醇 (PEG)。 該等載劑之其他實例句括雜 • 子交換劑；氧化銘；硬脂酸 紹；卵磷脂；血清蛋白，談知 諸如人類血清白蛋白；緩衝物 質，諸如甘胺酸、山梨酸、山 ^ 4酸鉀、飽和植物脂肪酸之 偏甘油酯混合物；水；豳哎 . “一戈電解質，諸如硫酸魚精蛋白、 %酸虱二鈉、磷酸氫鈿、氣 餻n ㈣线鈉；膠狀二氧化⑦；三矽酸 、，5^乙烯'•比洛咬嗣；及纖维 汉纖、，隹素基物質。用於局部或凝膠 140371.doc -81 - 200950778 ir、式聚之乙:劑包括多糖(諸如羧甲基纖維素鈉或曱基纖維 ”）聚乙烯吡咯啶_、聚丙烯酸酿、聚 嵌段聚合物、平下乳丙細 聚乙一醇及木蠟醇。對於所有投藥而古， ▲地使用習知儲槽式形式。該等形式包括（例如）微囊、= 未膠囊、月旨質體、硬膏劑、吸入形式、鼻噴霧 : 及持續釋放性製劑。 卜錠剤 欲用於活體内投藥之調配物應為無菌的。此易於藉由在 凍乾及復水之前或之後經由無菌過濾膜過濾來實現。若全 身投與’則編己物彳以床乾形式或以溶液形式儲存。若呈 凍乾形式，則其通常與其他成份組合調配以在使用之時用 適當稀釋劑復纟。液體調配物之一實例為用⑨皮下注射之 裝填於單劑#小瓶中之無g、透明、&色未經防腐處理的 溶液。 通常將治療性調配物置於具有無菌出入孔之容器中，例 如靜脈内注射溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿之塞子的 小瓶。調配物較佳地以重複靜脈内（i v)、皮下（s c)、肌 肉内（i.m.)注射液或輸注液形式或以適合於鼻内或肺内傳 遞（關於肺内傳遞參見例如EP 257,956)之氣溶膠調配物形 式投與。 持續釋放性製劑之合適實例包括含有蛋白質之固體疏水 性聚合物的半透性基質，該等基質呈成型物品之形式，例 如膜或微囊。持續釋放性基質之實例包括聚酯、水凝膠 (例如’如 Langer等人 ’ J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981)及 Langer，Chem. Tech·，12: 98-105 (1982)所述 i40371.d〇) -82- 200950778 之聚（2-羥基乙基-曱基丙烯酸酯）或聚（乙烯醇））、聚丙交醋 (美國專利第3,773,919號、EP 58,481)、L-麩胺酸與γ乙基_ L-麵胺酸醋之共聚物（Sidman等人，Biopolymers, 22· 547 556 (1983))、不可降解之乙烯-乙酸乙烯酯（Langer等人， 見上文）、可降解之乳酸_乙醇酸共聚物（諸如Lupr〇n Depot(由乳酸-乙醇酸共聚物及亮丙立德乙酸鹽組成之可注 射微球體））及聚-D-(-)-3-羥基丁酸（EP 133,988)。
熟習此項技術者可對哺乳動物進行對本文中所述之各種 病理學病狀的診斷。在此項技術中可利用允許（例如）診斷 或偵測哺乳動物之癌症之診斷技術。舉例而言，癌症可經 由包括（但不限於）觸診、血液分析、χ光、nmr及其類似 技術之技術來鏗別。癌症分期系統描述在解剖學上癌症已 擴政到何種程度且試圖將具有類似預後及治療之患者歸入 才同刀期Ί可進行若干種測試以幫助對癌症分期，該等 測試包括活組織檢查及某些成像測試，諸如胸部χ光、乳 房X光照片、骨掃描、CT掃描及MRI掃描。亦使用血液檢 查及臨床㈣來評估患者之總體健康情m㈣癌症是否 已擴散至某些器官。 為對癌症刀期’美國癌症聯合委員會（American Joint tee on Cancer)最先使用TNM^類系統將癌症（尤其 實 瘤）以子母類別歸類。將癌症命名為字母T(腫瘤尺 寸）、Ν(可觸知淋巴結）及/或Μ(癌轉移）。T1、Τ2、Τ3及丁 4 #述遞曰之原發性病灶尺寸；⑽、Μ、Ν2、犯表示逐漸 推進之淋巴結累及；且_及如反映遠處癌轉移之不存在 140371.doc • 83 - 200950778 或存在。 在亦稱為全病期分類或羅馬數字分期之第二種分期方法 合原發性病灶之尺寸以及淋巴結擴散及遠處癌轉移 ^在，將癌症分為〇至_。在此系統中，將病例分為 羅馬數字I至IV表示之4個病期或歸類為「復發性的」。 對於一些癌症而言，G_為「原位」或「Tis」，諸如對 於乳癌而言之乳腺管原位癌或小葉原位癌。高度腺瘤亦可
歸；為d 般而s，1期癌症為通常可治癒之小搜局部 性癌症，而IV期诵赍本-π A < 期通㊉表不不宜手術性或轉移性癌症。„及 U癌症通常為局部晚期癌症且/或展現累及局部淋巴 結。-般而言’愈高階段數指示愈廣泛疾冑，包括愈大腫 2寸及/或癌症擴散至與原發性腫瘤相鄰之淋巴結及/或 器官附近。此等病魅準確定義，但衫義因各類型癌症 而不同且為熟習此項技術者所已知。 諸如NCI之監測、流行病學及最終結果程序
(Surveillance，Epidemiology, an(j End Results Program， SEER)之許多癌症登記使用簡略分期。此系統用於各種癌 症。其將癌症病例分為5個主要類別： 及位為僅存在於開始之細胞層中之早期癌症。 Θ部餒為侷限於開始之器官而無擴散跡象之癌症。 遲與尨為已擴散超出初始（原發性）部位至淋巴結或器官 及組織附近之癌症。 禮豸為已自原發性部位擴散至遠處器官或遠處淋巴結之 癌症。 140371.doc -84 - 200950778 茗知係用於描述無足夠資訊來指示病期之病例。 在已清除所有可見腫瘤後復發之癌症稱為復發性疾病。 在原發性腫瘤區域内復發之疾病為局部復發，且以癌轉移 形式復發之疾病稱為遠處復發。 腫瘤可為實體腫瘤或非實體或軟組織腫瘤。軟組織腫瘤 之實例包括白血病（例如慢性骨髓性白血病、急性骨髓性 白血病、成年急性淋巴母細胞白血病、急性骨髓性白血 Φ 病、成熟B細胞急性淋巴母細胞白血病、慢性淋巴細胞性 白血病、幼淋巴細胞白血病或毛細胞白血病）或淋巴瘤（例 如非霍奇金氏淋巴瘤、皮膚τ細胞淋巴瘤或霍奇金氏病）。 實體Μ瘤包括除血液、骨髓或淋巴系統外之身體組織之任 ’ 何癌症。實體腫瘤可進一步分為上皮細胞來源之彼等實體 • 腫瘤及非上皮細胞來源之彼等實體腫瘤。上皮細胞實體腫 瘤之實例包括胃腸道、結腸、乳房、前列腺、肺、腎、 肝、胰腺、卵巢、頭頸部、口腔、胃、十二指腸、小腸、 Φ 大腸、肛門、膽囊、陰唇、鼻咽、皮膚、子宮、男性生殖 窃、泌尿器官、膀胱及皮膚之腫瘤。非上皮來源之實體腫 瘤包括肉瘤、腦腫瘤及骨腫瘤。 AP〇2L/TRAIL、化學療法及/或VEGF抗體或CD2〇抗體可 根據已知方法來投與，諸如以大丸劑形式或藉由經一段時 間連續輸液來靜脈内投與，藉由肌肉内、腹膜内、腦脊髓 内、皮下、關節内、滑膜内、鞘内、經口、局部或吸入途 位來投與。視情況，投藥可使用多種市售裝置經由微型泵 輸注來進行。 140371.doc •85- 200950778 投與Apo2L/TRAIL、所選化學療法及VEGF抗體或CD20 抗體之有效劑量及時程係描述於以下實例及附圖中。 預期該方法中可使用其他療法。一或多種其他療法可能 包括（但不限於）投與放射療法、細胞激素、生長抑制劑、 化學治療劑、細胞毒性劑、酷·胺酸激酶抑制劑、ras法尼基 轉移酶抑制劑、企管生成抑制劑及細胞週期蛋白依賴性激 酶抑制劑，其為此項技術所已知且另外特別在以上部分I 中定義。 例示性治療性抗體包括：抗HER2抗體，包括rhuMAb 4D5(HERCEPTIN)(Carter等人，/Voc. #<2". *SW. t/SJ，
89:4285-4289 (1992)，美國專利第 5,725,856號）；抗IL-8(St John等人，CTieW，103:932 (1993)，及國際公開案第WO 95/23865 號）；抗 PSCA 抗體（WO 01/40309);抗 CD40 抗 體，包括S2C6及其人類化變異體（WO 00/75348);抗 CDlla抗體，包括RaptivaTM(美國專利第5,622,700號，WO 98/23761 5 Steppe^ A » Transplant Inti. 4:3-7 (1991)，及 Hourmant 等人，Transplantation 58:377-380 (1994))；抗 IgE 抗體（Presta等人，*/· //wmwwo/. 151:2623-2632 (1993)， 及國際公開案第WO 95/19181號；1998年2月3日頒布之美 國專利第5,714,338號或1992年2月25曰頒布之美國專利第 5,091,313 號，1993 年 3 月 4 日公開之 WO 93/04173，或 1998 年6月30曰申請之國際申請案第PCT/US98/13410號，美國 專利第5,714,338號）；抗CD 18抗體（1997年4月22日頒布之 美國專利第5,622,700號或1997年7月31日公開之WO 140371.doc • 86 - 200950778 97/26912);抗Apo-2受體抗體（1998年11月19日公開之WO 98/51793);抗 TNF-α 抗體，包括 cA2(REMICADE)、 CDP571及MAK-195(參見1997年9月30日頒布之美國專利 ^ 5,672,347¾¾ > Lorenz^ A J. Immunol. 156(4):1646-1653 (1996)，及 Dhainaut等人 Ο"· Care Me汰 23(9):1461-1469 (1995));抗組織因子（TF)抗體（1994年11月9日授予之歐洲 專利第0 420 937 B1號）；抗人類α4·β7整合素抗體（1998年2 月19日公開之WO 98/06248);抗EGFR抗體（如1996年12月 19日公開之WO 96/40210中之嵌合或人類化225抗體）；抗 CD3抗體，諸如ΟΚΤ3(1985年5月7日頒布之美國專利第 4,515,893號）；抗CD25或抗Tac抗體，諸如CHI-621(SIMULECT)及 ZENAPAX(參見 1997 年 12 月 2 曰頒布之 美國專利第5,693,762號）；抗0〇4抗體，諸如^^-7412抗體 (Choy 等人 Jri/zrz·"’·？ Λ/zeww 39(1):52-56 (1996));抗 CD52 抗體，諸如CAMPATH-lH(Riechmann 等人 332:323- 337 (1988));抗Fc受體抗體，諸如針對FcyRI之M22抗體 (如 Graziano 等人 J. Immunol. 155(10):4996-5002 (1995) 中）；抗癌胚抗原（CEA)抗體，諸如hMN-14(Sharkey等人 Career 55(23增刊）：5935s-5945s (1995));針對乳房上 皮細胞之抗體，包括huBrE-3、hu-Mc 3及CHL6(Ceriani等 人 55(23): 5852s-5856s (1995);及 Richman等 人 Cawer Λα. 55(23 增刊）：5916s-5920s (1995));與結腸癌 細胞結合之抗體，諸如C242(Litton等人«/. /wwwwo/. 26(1):1-9 (1996));抗 CD38 抗體，例如 AT 13/5(Ellis 等人 Λ 140371.doc -87- 200950778 /mmw 仙/. 155(2):925-937 (1995));抗 CD33 抗體，諸如 Hu M195(Jurcic 等人 Cawcer Λα 55(23 增刊）:5908s-5910s (1995))及 CMA-676 或 CDP771 ;抗 CD22 抗體，諸如 LL2 或 LymphoCide(Juweid ^ A Cancer Res 55(23 增刊）：5899s-5907s (1995));抗 EpCAM 抗體，諸如 17_1A(PAN0REX); 抗GpIIb/IIIa抗體，諸如阿昔單抗（abciximab)或c7E3 Fab(REOPRO);抗 RSV抗體，諸如 MEDI-493(SYNAGIS); 抗CMV抗體，諸如PROTOVIR ;抗HIV抗體，諸如 PR0542 ;抗肝炎抗體，諸如抗Hep B抗體OSTAVIR ;抗CA 125抗體OvaRex ;抗獨特型GD3抗原決定基抗體BEC2 ;抗 v3抗體VITAXIN ;抗人類腎細胞癌抗體，諸如ch-G250 ; ING-1 ;抗人類17-1A抗體（3622W94);抗人類結腸直腸瘤 抗體（A33);針對GD3神經節苷脂之抗人類黑色素瘤抗體 R24 ;抗人類鱗狀細胞癌（SF-25);及抗人類白血球抗原 (HLA)抗體，諸如Smart ID10及抗HLA DR抗體 Oncolym(Lym-l)。 化學治療劑之製備可根據製造商之說明書或如由熟習此 項技術者憑經驗確定來使用。該化學治療劑之製備亦描述 於 Chemotherapy Service 編，M.C. Perry, Williams & Wilkins，. Baltimore, MD (1992)中。 在本發明之另一實施例中，提供含有上述適用於治療癌 症（諸如NSCLC)之物質的製品。在一態樣中，該製品包 含：（a)包含VEGF抗體之容器（較佳地該容器包含該抗體及 醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑於容器中）；（b)包含 140371.doc -88 - 200950778 AP〇2L/TRAIL之纟器（較佳地該容器包含—2⑽饥及 醫樂學上可接受之载劑或稀釋劑於容器中），·及⑷具有關 於治療癌症之說明書的包裝插w，甘；_ 的匕衮插1，其中該等說明書提供諸 如附圖中所述之資訊。視情況 兄度况該包裝插頁包含關於由適 當管理機構（諸如FDA)所述之投筚、S|丨你 仅樂田彳作用及/或建議提醒 等之資訊。
在本發明之另-實施例中，提供含有上述適用於治療癌 症(諸如NHL)之物質的製品。在一態樣中，該製品包含： ⑷包含CD20抗體之容器(較佳地該容器包含該抗體及醫藥 學上可接丈之載劑或稀釋劑於容器中0)包含 AP〇2L/TRAIL之容器（較佳地該容器包含Ap〇2L/TRAiL& 醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑於容器中）；及⑷具有關 於治療癌症之說明書的包裝插頁，其中該等說明書提供諸 如隨附實例及圖中所述之資訊。視情況，該包裝插頁包含 關於由適當管理機構（諸如FDA)所述之投藥、副作用及/或 建議提醒等之資訊。 在所有此等態樣中，該包裴插頁位於容器上或與容器相 聯合。合適之谷器包括（例如）瓶子、小瓶、注射器等。該 等容器可由諸如玻璃或塑膠之各種材料形成。容器容納或 含有有效治療癌症之組合物且可具有無菌出入孔（例如容 器可為靜脈内溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿之塞子的 小瓶）。該製品可另外包含另一包含醫藥學上可接受之稀 釋緩衝液之容器，該緩衝液諸如注射用抑菌水（BWFI)、磷 酸鹽缓衝生理食鹽水、林格氏溶液及/或右旋糖溶液。製 140371.doc -89- 200950778 可另外包括由商業及使用者觀點來看合乎需要的其他物 質，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針及注射器。 本說明書中所引用之所有專利及參考文獻之全文係以引 用的方式併入本文中。 實例 除非另有指示’否則實例中所提及之市售試劑係根據製 造商之說明書來使用。 實例1 對人類患者之臨床試驗係如本文中及附圖中所述來進❹ 灯。在試驗中關於人類個體之入選及排除標準如下所述。 入選標準： -經組織學或細胞學證實之非小細胞肺癌（NSCLC)。除非 存在小細胞要素（在該情況下患者為不適合），否則混合性 腫瘤將依據主要細胞類型來分類。細胞學或組織學要素可 · 根據轉移性腫瘤抽出或活組織檢查來確立。 _個體必須患有定義為具有惡性胸膜滲出之IIIb期或以期 的晚期NSCLC或復發性疾病。患有不可量測但可評估之疾 © 病的個體可包括於lb期研究中，但包括於2期研究中之疾 病必須為可量測的。 •計劃接受達至6個化學治療週期。 -ECOG功能狀態為〇或1。 -預期壽命大於3個月。 418 歲。 -個體必須簽署書面獨立倫理委員會（Independent Ethies 140371.doc ·90· 200950778
Committee，IEC)批准之知情同意書且註明日期。 -在登記前1週内INRS1.2且PTTSULN。 排除標準： 相關疾病- _ -患除NSCLC外之先前惡性疾病（除原位基底細胞癌或原 位子宮頸癌以外），除非已經治癒性治療而無疾病跡象超 過3年。 -患未經治療或不穩定之中樞神經系統（CNS)癌轉移。具 有經治療及穩定受控之CNS癌轉移的個體若已經投與確定 療法（手術及/或放射療法），不計劃治療腦癌轉移，且在登 記之前至少2週該個體在臨床上穩定並停止使用皮質類固 • 醇或使用穩定劑量之皮質類固醇，則適合於研究之2期部 分之組A及B。 -在登記1年内出現心肌梗塞，或不穩定或不受控之與心 臟功能有關或影響心臟功能的疾病或病狀（例如不穩定心 ❹ 絞痛、充也性心臟衰竭[紐約心臟協會（New York Heart
Association)>II級])。 -患如下定義之不受控的高血壓：收縮壓>150 mm Hg或 舒張壓>100 mm Hg(可允許使用抗高血壓治療達到此等參 數）。 -在登記1年内有動脈血栓形成、肺栓塞、深靜脈血栓形 成或出血性病症之病史。 -在登記28天内有最近重大手術程序。 -在登記前2 1天内個體不能具有嚴重未癒合的創傷潰瘍 140371.doc -91 - 200950778 或骨折。 -具有與個體NSCLC有關之嚴重咳血（定義為1/2湯匙或更 多之鮮紅血液）的持續性病史。 -已知（病歷中有記錄）HIV感染。 -於登記當日活動性感染。 · -已知為C型肝炎陽性或B型肝炎表面抗原陽性。 -患有吉爾伯特氏症候群（Gilbert’s syndrome)之個體。 對於試驗而言，如2001年1月4日公開之WO 〇1/00832及 2003年5月22日公開之WO 03/042344中所述’由 Genentech，Inc.(South San Francisco, CA)製造及調配由圖 1 之胺基酸114-281(SEQ ID ΝΟ:1)組成的重組人類Apo2L/ TRAIL(「rhApo2L/TRAIL」）。所選化學療法太平洋紫杉 醇（Taxol®)及卡始（Paraplatin®)係購自公開"得之市售來 源。抗VEGF抗體貝伐單抗（Avastin®)係購自Genentech，
Inc。在附圖，圖2-1 4中，太平洋紫杉醇被稱為「P」，卡鉑 被稱為「C」，貝伐單抗被稱為「B」，且此三種藥劑之組 ❹ 合使用被稱為「PCB」。 臨床試驗設計如下： -在患有先前未經治療之IIIb/IV期NSCLC之患者中對 rhApo2L/TRAIL與PCB之組合之lb期多中心、開放標記研 究。 -計劃樣本規模為約24位患者（每組6位） -研究治療包括每21天遇期之第1天P(200 mg/m2)、 C(AUC = 6 mg/mL*min)、B(15 mg/kg)(PCB)IV，隨後為達 140371.doc -92- 200950778 至8毫克/公斤/天（歷時5天）及20毫克/公斤/天（歷時2天）之靶 劑量的rhApo2L/TRAIL ;投與達至6個治療週期。 -主要終點：劑量限制性毒性（DLT)之發生率；不良事件 之發生率及嚴重度。 -次要終點：PK參數，包括藥物濃度-時間曲線下面積 (AUC)、最大濃度（Cmax)、半衰期（tl/2)、清除率、分布體 積（Vd)。 -探查：rhApo2L/TRAIL、貝伐單抗及化學療法之生物標 誌的發生率、特異性及敏感性（適當時）。 關鍵適合標準： -NSCLC，具有胸膜滲出之Illb期、IV期或復發性 •經組織學或細胞學證實 •非鱗狀組織學 •無中樞神經系統（CNS)癌轉移 -218 歲 -ECOG功能狀態為0或1 -預期壽命>3個月 -充分血液學、腎、肝及凝血功能 -無不受控之高血壓 -無對NSCLC之先前治療 -計劃接受達至6個化學治療週期。 關於此等臨床試驗之其他態樣的其他資訊係描述於由美 國國家健康研究所（US National Institutes of Health)主辦之 網際網路網站clinicaltrials.gov上。 140371.doc -93- 200950778 rhApo2L/TRAIL(靶劑量）加PCB似乎耐受性良好且在患有 NSCLC之患者體内具有抗腫瘤活性。rhApo2L/TRAIL PK 值（Cmax、AUC、tl/2)與 FIH研究類似。 實例2 對人類患者之臨床試驗係如下文及附圖中所述來進行。 在試驗中人類個體之入選及排除標準描述如下。 入選標準：
-簽署知情同意書 -年齡218歲 -經組織學證實之1、2或3a級CD20 +濾泡性NHL的病史 -最近用含有利妥昔單抗之療法治療後疾病之進展導致 持續26個月之穩定疾病或部分或完全反應 -可量測之疾病 -東部腫瘤協作組（Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG)功能狀態為0或1 -對於生殖潛能之個體（男性及女性）而言，在整個試驗期 間及其最終暴露於研究治療後1年中，使用可靠避孕方法 (例如避孕丸、子宮内避孕器[IUD]、物理障壁）。 -預期壽命>3個月 排除標準： -對欲用於量測反應之可量測之轉移性病灶應用先前放 射療法，除非該病灶於基線處顯示明確進展 -在第1天前14天内對周邊病灶應用放射療法；在第1天 前28天内對胸部、腹部或骨盆區域應用放射療法 140371.doc -95- 200950778 -在第1天前4週内應用化學療法、激素療法、放射療法 或免疫療法 -已接受用於復發性或難治性、濾泡性NHL之放射免疫 療法的患者’右其係在第1天前至少1年接受此療法，其呈 -有充分骨髓功能’且根據骨髓抽出/活組織檢查無患有骨 聽發β不良症候群的跡象，則適合於該研究 -用Apo2L/TRAIL或DR4或DR5之促效抗體預先治療 -同時使用全身皮質類固醇療法 -第1天有跡象顯示臨床上可彳貞測之腹水 ® _在第1天别5年内患有其他侵襲性惡性疾病 -在進入研究前1年内體檢中有CNS疾病之病史或跡象 -第1天需要非經腸抗生素之活動性感染 -第1天前28天内有重大手術程序、開放式活組織檢查或 明顯外傷或在研究過程中預計需要重大手術程序及在第丨. 天前7天内用細針抽吸 -懷孕或哺乳 -嚴重未癒合之創傷、潰瘍或骨折 ❹ -當前或最近參與另一實驗性藥物研究 -臨床上明顯之心血管疾病 已知HIV、B型肝炎表面抗原（sAg)、B型肝炎或 核心抗體或C型肝炎抗體為陽性測試結果 -已知對鼠類或人類抗體具敏感性 •其他疾病病史、代謝功能障礙、體檢結果或臨床實驗 結果產生合理懷疑具有禁止使用研究藥物或可能影響對研 140371.doc -96- 200950778 究結果之解釋或使得個體具有來自治療併發症之高風險的 疾病或病狀。 關於此等臨床試驗之其他態樣的其他資訊係描述於由美 國國家健康研究所主辦之網際網路網站clinicaltrials.gov 上。 對於試驗而言，如2001年1月4日公開之WO 01/00832及 2003年5月22日公開之WO 03/042344中所述，由 Genentech，Inc. (South San Francisco, CA)製造及調配由圖 1之胺基酸114-281 (SEQ ID ΝΟ:1)組成的重組人類 Apo2L/TRAIL (「rhApo2L/TRAIL」）。抗CD20抗體利妥昔 單抗（Rituxan®)係購自 Genentech, Inc。 研究藥物給藥及評定之臨床試驗設計及時程之示意圖分 別於圖1 5 A及圖1 5B中呈現，且研究設計細節於下文中列 出： -利妥昔單抗及rhApo2L/TRAIL之開放標記安全性、PK 及功效評定；具有復發性、低度NHL及在最後之含有利妥 昔單抗之方案後持續>6個月之先前反應或穩定疾病的病史 之患者為合適的；所有患者接受8個週劑量之利妥昔單抗 (375 mg/m2)與4個 21天週期之rhApo2L/TRAIL的組合；lb 期部分係於5個美國研究點進行。 在根據所述方案治療罹患NHL之人類患者中所達成之各 種效應係報導於附圖16-19中。 【圖式簡單說明】 圖1展示人類Apo-2配體或TRAIL(「Apo2L/TRAIL」）多 I40371.doc •97- 200950778 肽之編碼DNA(SEQ ID ΝΟ··2)及胺基酸序列（SEQ ID ΝΟ:1)； 圖2說明用於組1、2、3及4之研究簡圖及給藥方案； 圖3鑑別在試驗中接受21劑量之rhApo2L/TRAIL加PCB之 . 人類患者（24位）的基線人口分布及疾病特徵； . 圖4描述組1、2、3及4中所治療之患者的安排； 圖5提供在研究中治療中出現的不良事件之發生率； 圖6提供rhApo2L/TRAIL相關不良事件之發生率； 圖7提供關於研究中於週期1及3之第1天rhApo2L/TRAIL ❹ 之血清濃度-時間圖的藥物動力學資料； 圖8提供對人類患者輸注1小時後rhApo2L/TRAIL之平均 藥物動力學參數； . 圖9提供研究中之24個人類患者之腫瘤反應評定； 圖10展示6個週期irhAp〇2L/TRAIL 4 mg/kg歷時5天加 PCB治療後患有IV期NSCLC之男性患者腫瘤負荷的降低； 圖11展示4個週期irhAp〇2L/TRAIL 20 mg/kg歷時2天加 Λ PCB治療後患有IV期NSCLC之男性患者腫瘤負荷的降低； 圖12為說明在治療期間組1之代表性丙胺酸胺基轉移酶 (ALT)變化的曲線； 圖13為說明在治療期間組4之代表性天冬胺酸胺基轉移 酶（AST)變化的曲線； 圖14為說明在治療期間組1之代表性總膽紅素變化的曲 線； 圖15A-B分別展示用於投與利妥昔單抗及rhAp〇2L/ 140371.doc •98、 200950778 TRAIL之臨床研究設計、劑量選擇及給藥時程（研究在圖中 被稱為「AP03585」）； 圖16為展示參與臨床試驗之患者之患者特徵的表格； ' 圖17A-B為提供不良事件之發生率之表格； 圖18提供接受指定劑量之利妥昔單抗及Apo2L/TRAIL之 患者的功效評定；及 圖19展示平均藥物動力學參數。
140371.doc •99· 200950778 序列表 <110> 1.美商建南德克公司 2.美商安美基公司 3.美商艾蒙尼克公司 <120>使用Apo2L/TRAIL治療癌症的方法 <130> P4207R1 <140> 098116058 <141> 2009-05-14 <150> US 61/127,528 <151> 2008-05-14 <150> US 61/130,048 <151> 2008-05-28 <160〉 7 <210〉 1 <211> 281 <212> PRT <213>智人
<400〉 1
Met Ala Met Met Glu Val Gin Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gin Thr 15 10 15
Cys Val Leu lie Val He Phe Thr Val Leu Leu Gin Ser Leu Cys 20 25 30
Val Ala Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gin Met 35 40 45
Gin Asp Lys Tyr Ser Lys Ser Gly lie Ala Cys Phe Leu Lys Glu 50 55 60
Asp Asp Ser Tyr Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser 65 70 75
Pro Cys Trp Gin Val Lys Trp Gin Leu Arg Gin Leu Val Arg Lys 80 85 90
Met lie Leu Arg Thr Ser Glu Glu Thr lie Ser Thr Val Gin Glu 95 100 105
Lys Gin Gin Asn lie Ser Pro Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gin 110 115 120
Arg Val Ala Ala His lie Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr 125 130 135
Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys 140 145 150 lie Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser 155 160 165
Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val lie His Glu Lys Gly 170 175 180
Phe Tyr Tyr lie Tyr Ser Gin Thr Tyr Phe Arg Phe Gin Glu Glu 185 190 195 lie Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gin Met Val Gin Tyr lie 200 205 210
Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro lie Leu Leu Met Lys Ser 215 220 225
Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr 230 235 240
Ser lie Tyr Gin Gly Gly lie Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg 245 250 255 140371-序列表.d〇c 200950778 lie Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu lie Asp Met Asp His 260 265 270
Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly 275 280 <210> 2 <211> 1042 <212> DNA <213>智人 <220>
<221>變異 <222〉 447 <223〉N可為T或G <400> 2 tttcctcact gactataaaa gaatagagaa ggaagggctt cagtgaccgg 50 ctgcctggct gacttacagc agtcagactc tgacaggatc atggctatga 100 tggaggtcca ggggggaccc agcctgggac agacctgcgt gctgatcgtg 150 atcttcacag tgctcctgca gtctctctgt gtggctgtaa cttacgtgta 200 ctttaccaac gagctgaagc agatgcagga caagtactcc aaaagtggca 250 ttgcttgttt cttaaaagaa gatgacagtt attgggaccc caatgacgaa 300 gagagtatga acagcccctg ctggcaagtc aagtggcaac tccgtcagct 350 cgttagaaag atgattttga gaacctctga ggaaaccatt tciacagttc 400 aagaaaagca acaaaatatt tctcccctag tgagagaaag aggtccncag 450 agagtagcag ctcacataac tgggaccaga ggaagaagca acacattgtc 500 ttctccaaac tccaagaatg aaaaggctct gggccgcaaa ataaactcct 550 gggaatcatc aaggagtggg cattcattcc tgagcaactt gcacttgagg 600 aatggtgaac tggtcatcca tgaaaaaggg ttttactaca tctattccca 650 aacatacttt cgatttcagg aggaaataaa agaaaacaca aagaacgaca 700 aacaaatggt ccaatatatt tacaaataca caagttatcc tgaccctata 750 ttgttgatga aaagtgctag aaatagttgt tggtctaaag atgcagaata 800 tggactctat tccatctatc aagggggaat atttgagctt aaggaaaatg 850 acagaatttt tgtttctgta acaaatgagc acttgataga catggaccat 900 gaagccagtt ttttcggggc ctttttagtt ggctaactga cctggaaaga 950 aaaagcaata acctcaaagt gactattcag ttttcaggat gatacactat 1000 gaagatgttt caaaaaatct gaccaaaaca aacaaacaga aa 1042 <210> 3 <211> 107 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223>序列係經合成 <400> 3
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 15 10 15
Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser 20 25 30
Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro 35 40 45 -2- 140371-序列表.doc 200950778
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Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser 20 25 30
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Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 440 445 450
Gly Lys
14037卜序列表.doc

Claims (1)

  1. 200950778 七、申請專利範圍： 1. 一種Apo2L/TRAIL多肽之用途，其係用於製造治療個體 之非小細胞肺癌（NSCLC)之藥劑，其中於治療第1天向該 個體投與（a)有效量之太平洋紫杉醇（Paclitaxel)、卡始 (Carboplatin)及抗VEGF抗體及（b)用量在約4 mg/kg至20 mg/kg範圍内的包含圖1之胺基酸114-281(SEQ ID N0:1) 的Apo2L/TRAIL多肽，且其中於治療第1天投與該 Apo2L/TRAIL多肽後，再向該個體投與在約4毫克/公斤/ 天至約20毫克/公斤/天範圍内之量的Apo2L/TRAIL多 肽，歷時達至連續5天。 2. 如請求項1之用途，其中該太平洋紫杉醇係以約200 mg/m2之量投與。 3. 如請求項1之用途，其中該卡始係以每分鐘約6 mg/ml之 量投與。 4. 如請求項1之用途，其中該抗VEGF抗體為以約15 mg/kg 之量投與的貝伐單抗（Bevacizumab)。 5. 如請求項1之用途，其中（a)及（b)係經靜脈内向該個體投 與。 6. 如請求項1之用途，其中在該（b)治療中，向該個體投與 約4毫克/公斤/天之量的Apo2L/TRAIL多肽歷時達至連續 5天。 7. 如請求項1之用途，其中在該（b)治療中，向該個體投與 約8毫克/公斤/天之量的Apo2L/TRAIL多肽歷時達至連續 5天。 140371.doc 200950778 8. 如請求項1之用途，其中在該（b)治療中，向該個體投與 約15毫克/公斤/天之量的Apo2L/TRAIL多肽歷時達至連 續2天。 9. 如請求項1之用途，其中在該（b)治療中，向該個體投與 約20毫克/公斤/天之量的Apo2L/TRAIL多肽歷時達至連 續2天。 10·如請求項1之用途，其中自第1天初始治療起21天後向該 個體投與包含（a)及（b)之後續療法。 11· 一種Apo2L/TRAIL多肽，其係用於醫學治療個體之 NSCLC之方法中，其中該用途包括於治療第1天投與⑷ 有效量之太平洋紫杉醇、卡鉑及抗VEGF抗體及（b)用量 為約4 mg/kg至20 mg/kg範圍内之包含圖1之胺基酸114-281(SEQ ID ΝΟ:1)的Apo2L/TRAIL多肽，且其中於治療 第1天投與該Apo2L/TRAIL多肽後，再向該個體投與在 約4毫克/公斤/天至約20毫克/公斤/天範圍内之量的 Apo2L/TRAIL多肽歷時達至連續5天。 12. —種Apo2L/TRAIL多肽之用途，其係用於製造用於治療 個體之非霍奇金氏淋巴瘤（NHL)之藥劑，其中於治療第1 天向該個體投與（a)有效量之抗CD20抗體及（b)用量為約4 mg/kg至約8 mg/kg之包含圖1之胺基酸114-281(SEQ ID ΝΟ:1)的Apo2L/TRAIL多肽，且其中於治療第1天投與該 Apo2L/TRAIL多肽後，再向該個體投與在約4毫克/公斤/ 天至約8毫克/公斤/天範圍内之量的Apo2L/TRAIL多肽歷 時達至連續5天。 140371.doc 200950778 13. 如請求項12之用途，其中該抗CD20抗體為以約375 mg/m2之量投與的利妥昔單抗（Rituximab)。 14. 如請求項12之用途，其中（a)及（b)係經靜脈内向該個體投 與。 15. 如請求項12之用途，其中該個體經診斷患有復發性 NHL。 16_如請求項12之用途，其中在該（a)治療中，每7天向該個 體投與有效劑量之抗CD20抗體。 17. 如請求項12之用途，其中每週向該個體投與包含（a)之後 續療法歷時達至8個治療週期。 18. 如請求項12之用途，其中自第1天初始治療起21天後向 該個體投與包含（b)之後續療法。 19. 如請求項12之用途，其中在第1天治療之前，該個體已 預先經抗CD20抗體治療。 20. —種Apo2L/TRAIL多肽，其係用於醫學治療個體之NHL 之方法中，其中該用途包括於治療第1天投與（a)有效量 之抗CD20抗體及（b)約4 mg/kg至約8 mg/kg之量的包含圖 1之胺基酸 114-281(SEQ ID ΝΟ:1)的 Apo2L/TRAIL多肽， 且其中於治療第1天投與該Apo2L/TRAIL多肽後，再向 該個體投與約4毫克/公斤/天至約8毫克/公斤/天範圍内之 量的Apo2L/TRAIL多肽歷時達至連續5天。 21. —種製品，其包含： 包括包含圖1之胺基酸114-281(SEQ ID ΝΟ:1)之 Apo2L/TRAIL多肽的容器；及 140371.doc 200950778 具有關於治療個體之NSCLC之說明書的包裝插頁，其 中該說明書指示如請求項1之向個體投與之（a)及（b)的給 藥及用量。 22. —種製品，其包含： 包括包含圖1之胺基酸114-281(SEQ ID ΝΟ:1)之 Apo2L/TRAIL多肽的容器；及 具有關於治療個體之NHL之說明書的包裝插頁，其中 該說明書指示如請求項12之向個體投與之（a)及（b)的給藥 及用量。 23. —種用於治療NSCLC之藥物組合，其包含（a)第一劑量之 有效量之太平洋紫杉醇、卡鉑及抗VEGF抗體及（b)第二 劑量之約4 mg/kg至20 mg/kg範圍内之量的包含圖1之胺 基酸 114-281(SEQ ID ΝΟ:1)的 Apo2L/TRAIL 多肽。 24. 如請求項23之藥物組合，其另外包含第三劑量之約4毫 克/公斤/天至約20毫克/公斤/天範圍内之量的Apo2L/ TRAIL多肽。 25. —種用於治療NHL之藥物組合，其包含（a)第一劑量之有 效量之抗CD20抗體及（b)第二劑量之約4 mg/kg至20 mg/kg範圍内之量的包含圖1之胺基酸114-28 1(SEQ ID ΝΟ:1)的 Apo2L/TRAIL 多肽。 26. 如請求項25之藥物組合，其另外包含第三劑量之約4毫 克/公斤/天至約20毫克/公斤/天範圍内之量的Apo2L/ TRAIL多肽。 140371.doc
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