TW200935055A - Peptides specific for hepatocellular carcinoma cells and applications thereof - Google Patents

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200935055 六、發明說明： 優先權主張 ，申請案主張臨時申請案_ 申請）之優先權，其全讀林文作為參考。年11月20曰 【發明所屬之技術領域】 應用 本發明係關於断細胞癌細胞具專—性之新穎胜狀及其 【先前技術】 肝細胞癌（HCC)是全世界第十大最致 手二即使在輪、放槪化療之進展及 =佳僅= 於姨管線癌(4, ’全世界共有超過667，_件肝癌之新病例，i中8〇ί =在亞洲及撒哈拉沙漠以南之非洲⑶。隨著分子 0 =中之大幅進展，新穎的治療策略持續研發中，以“疾 之對向療劑之研發是當前抗癌研究之主要目桿 大部分的化療劑不會優先累積於腫瘤位置。 之劑量可能很少，僅僅暑g藉於T 到達腫瘤 二4上作用通常會限制抗癌藥‘之3劑C之因5 出:期種的方Τ復發以及最後導致藥物抗= 忿株?囊於_統中⑸以及使經 早株抗體（6,7)或胜肽配位體（8,9)完成乾向，該等單株 200935055 抗體或胜肽配位體可結合至癌細胞上有過度表現或獨特表現 之抗原或受體。 目前已研究出藥物傳遞系統（DDS)，諸如，基於脂質或 聚合物之抗癌奈米醫藥（10)。DDS通常指具有直徑2〇〇 nm或 以下之奈米顆粒及微米顆粒，包括微脂體及其他基於脂質之載 體，諸如，微胞（micelle)、脂質乳液及脂質藥物複合物；亦 包括聚合物與藥物共輛物及各種配位體靶向產物，諸如，免疫 共輛物（11)。腫瘤脈管之通透性增加是一種重要因素，其決 • 定基於聚合物之癌症療法是否得以成功完成腫瘤之靶向 (12)。在靜脈内之投藥後，血管生成性腫瘤脈管系統（估計 ® 具有100-600η^之平均孔徑大小（13))之「滲漏」，造成共軛 物在腫瘤組織中產生選擇性外滲（extravasation)。此外，腫瘤 組織常缺乏有效的淋巴引流，因此後續會促使聚合物之滯留。 此等因素共同導致共輛物累積在腫瘤組織中，此即被動乾向現 象’由Maeda命名為「增強的通透性及停滯（EPR )效應」（丨4 )。 由微脂體進行、EPR介導之被動腫瘤靶向作用，可在實體腫瘤 中造成數倍的藥物濃度增加，其係相對於以游離藥物所測得之 藥物濃度而言（15)。 DDS之特點在於其改變相關藥物之藥物動力學及生物分 e 布之潛力（5)。聚乙二醇（peg)或是其他鈍性聚合物與各種 治療分子之偶合’可能會降低由腎臟或網狀内皮系統 所造成之藥物清除率（16)。就較大的微粒狀載體而言，諸如， -微脂體及聚合物-藥物共軛物，該等載體之尺寸（一般而言為 • 直徑50至200nm)導致其主要被侷限在血液隔室中，對於正常 器官產生較少的有害作用。 目前大多數核准用於腸外投藥之〇£)8包括連結pEG之微 脂體或基於脂質之調配物及治療性分子，例如，pEG化之微脂 體阿黴素（doxorubicin)，其用於治療高度血管生成性腫瘤， 諸如’ AIDS相關性卡波西肉瘤，其整體反應率為俱及59% 5 200935055 祕在賴、賴及骨趙 妒古直^ = 累積增加’並可能對此等組織造成 再者’隨著微粒狀咖之循環時間及侷限性 招^广2學性之毒性（諸如，嗔中性白血球減少症、血小 ϋΐίϋ血球減少症）亦會變得顯著⑽。現在此一領 (目^之位置專—性作用，方式為使其與配位體 細胞及腫瘤微管系統表面抗原或受體）結合，這 二，為主動乾向或配位體介導杨之方法（8,21)。此外， 研究的是透過親和力無向而將化療藥物傳遞至 腫瘤組織（22, 23)。

單株抗體已顯示具有作為腫瘤輕向劑之臨床潛力，但 f尺寸造_等抗體之_穿透性不仙及料—性之抗體 ，入而造成肝臟/㈣毒性’這些是抗體療法之兩種主要限 胜肽乾向劑可減少抗體癌症療法產生之相關問題（24 )。 顯現於微生物上之組合庫是用以辨麵瘤專—性乾向配位體 之一種可能策略。 噬菌體顯現技術已被應用於辨識B細胞抗原表位 (25-27)、發現腫瘤細胞（8, 28, 29)及腫瘤脈管系統專一性 胜肽（30-33)。DDS與腫瘤專一性胜肽之組合可僅經由少數之 Ο 乾向配位體分子’即可將高達數千種之抗癌藥物分子傳遞至腫 瘤細胞。在腫瘤位置持續釋放抗癌藥物分子亦具治療優勢（8, 34、〇 【發明内容】 本發明特別包含下列内容，單獨或組合： 本發明提供一種聚核苷酸或其變體，其中該聚核苷酸編碼 一種對肝細胞癌細胞具專一性之胜肽，且該聚核苷酸包含選自 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、 SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 1 卜 SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 6 200935055 15 ' SEQ ID NO: 17 ' SEQ ID NO: 19 ' SEQ ID NO: 21 > SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25及SEQ ID NO: 29之序列。

本發明提供一種多胜肽或其變體，其中該多胜肽對肝細胞 癌細胞具專一性，且該多胜肽包含選自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、 SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28及SEQ ID NO: 30之序列。在一具體實例 中，該多胜肽包含SP94 (SEQIDNO:2)或其變體。在另一具 體實例中，該多胜肽包含SP94 (SEQ ID NO: 2)。在另一具體 實例中，該多胜肽包含連續胺基酸PILP。 本發明提供融合蛋白’其包含與第二多胜肽融合之第一多 胜肽（其中該第一多胜肽包含對肝細胞癌細胞具專一性之多胜 肽）’以及第二胜肽。在一具體實例中，第二多胜肽包含一或 多種對肝細胞癌細胞具專一性之多胜肽（如’該多胜肽係同型 二聚體、異型二聚體或其他多聚體）。在另一具體實例中，第 二多胜肽包含麩胺基硫S-轉移酶（GST)蛋白域。在另一具體 實例中，第二多胜肽包含GFP。在另一具體實例中，第二多胜 肽包含免疫學標記。在另一具體實例中’第二多胜肽包含抗體 蛋白域。在另一具體實例中，該抗體蛋白域是抗體之Fc區域。 本發明提供多胜肽或其變體，其中該多胜肽對肝細胞癌细 ，具專一性，且其中該多胜肽或其變體係共軛結合於一或多種 藥物。在厂具體實例中，該藥物係選自阿黴素、長春瑞濱 (vmorelbine)、長春新鹼（vincristine)、太平洋紫杉醇、勒托 j (lurotecan)、寡核苷酸、毒素、抗VEGF適體 及放射性分子。 ) 本發明提供抗體， 胜肽或其變體。 其可結合對肝細胞癌細胞具專一性之多 本發明提供微脂體，其包含對肝細胞癌細胞具專一性之多 200935055 胜肽或其變體。在一具體實例中， no: 2)或其變體。在另一/體==曰體包含sm(SEQID (SEQ ID NO: 2 )。在另一具體實例φ中，士5亥微脂體包含SP94 含至少-種藥物，其選自阿黴素、長春瑞發脂體尚包 洋紫杉醇、勒托替康、寡核苦酸、、長春新驗、太平 射性ί:。ΐ另一具體實例♦，該微脂體:含適體及放 治療之方法，其包含將 ΐ平ΐΐ==係，阿黴素、長春瑞濱、長春新驗、 双十平糸杉醇、勒托替康、寡核苷酸 錄Γ具體實例中，該哺乳動物係人:。本ί明進 含治療有效量之=°多=物中治療疾病之醫藥組合物，其包 提供—種在哺乳動物巾治療疾狀絲，其包含將

_:2) m在1 一種多胜肽（其包含SEQ 多胜肽（其包/含SEQ ID Nr) G 5例中，該微脂體包含一種 體包含」或包 =該微脂 素在2或其變體，以及阿徽 該癌症是肝癌癌f。在另-具體實例中， 於在嗔乳動u f疋人類。本發明進一步提供一種用 、在有摘財轉疾狀㈣組合物 200935055 上述微脂體。 上本發明提供一種在檢體中偵測肝癌之方法，其包含： 使1檢體在一條件下與對肝細胞癌細胞具專一性之多胜肽或 其變體接觸’該條件容許該多胜肽與肝癌細胞結合；及（b) 使用可結合該多胜肽之抗體偵測該多胜肽之結合。在一具體實 例中，該多胜肽或其變體包含融合多胜肽，其包含對肝細胞癌 — 具專一性之多胜肽以及包含抗原表位之另一序列。可使用結合 • 至該抗原表位之抗體偵測該融合多胜肽與肝細胞癌細胞之結 合。本發明進一步提供一種用於在檢體中偵測肝癌之套組，其 Φ 包含上述多胜肽及抗體。 本發明提供一種辨識細胞分子之方法，該分子可結合至對 肝細胞癌細胞具專一性之多胜肽或其變體，其包含：使細 胞萃取物在一條件下與該多胜肽或其變體接觸，該條件容許一 包含該多胜肽或其變體及該分子的複合物之形成；及（b)分 析該複合物，以鑑別該細胞分子。在一具體實例中，該細胞分 子位於肝細胞癌細胞之表面並可結合該多胜肽或其變體。

本發明提供一種本發明之聚核苷酸之變體，其中該變體聚 核苷酸可雜合至聚核苷酸之互補體，該聚核苷酸係選自SEQ ID NO:卜 SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、SEQ O IDNO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、 SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25及SEQ ID NO: 29。在一具體實例中，該聚 核苷酸可在嚴格條件下雜合。 • 本發明提供一種本發明之多胜肽之變體，其中該變體多胜 肽係由聚核苷酸編碼，該聚核苷酸可雜合至選自以下之聚核普 酸之互補體：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、 SEQ ID NO: 7 ' SEQ ID NO: 9 ' SEQ ID NO: 11 > SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 2 卜 SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25及SEQ ID NO: 29。 9 200935055 在一具體實例中，該聚核苷酸可在嚴格條件下雜合。 本發明提供一種用於在對象中偵測癌症之方法，其包含將 本發明之多胜肽投藥至該對象，其中該多胜肽包含標記，以及 在該對象中偵測該多胜肽與癌症之結合。在一具體實例中，該 標記包含放射性分子。在另一具體實例中，該癌症是肝癌。g 另一具體實例中，該肝癌是肝細胞癌。在另一具體實例中，該 對象是哺乳動物。在另一具體實例中，該哺乳動物是人類。= 發明進一步提供一種用於在對象中偵測癌症之組合物，A 上述多胜肽。 ，、3 【實施方式】 HCC係第五大常見之癌症且排名全世界第四大癌症死亡 原因（1)。手術切除或肝臟移植是目前僅有的治癒性治療方 式，但只有少數病患符合條件而可接受此等治療方式（36、)。 大部分後期發現的HCC都已超出治癒性治療方式之處理 圍。在過去的30年間，已大規模研究對抗後期Hcc之全 Ϊ丄，單一藥劑療法或組合’但一般被視為無效（36)。改 ，王身性治療之有效性以及選擇可受益之病患仍是一重大 ，。我們在此報告以韻體舰篩選而侧的新穎 胞f細胞具專，之多胜肽以及使m鱗胜肽發展對 抗HCC之靶向藥物傳遞。 肷’ 最初，我們使用、經噬菌體顯現胜肽庫鑑別 等胜肽可在活斷—）及在活_ 至HCf細胞。其中一種胜肽是sp94。此外，pc94 (二^口 之噬菌體）在取自HCC病患之手術樣本中可辨鈣賒、’、、 m觸正f對應物。在Hcc類細赋 SP94與含阿歸之赌_共驗合可改^ 肽 SP94胜肽可改良後期HCC之全身性治療。”匕， 200935055 ι·定義 、用於本文中之辭彙具有其一般意義，如下文所示，且可在 說明書之上下文中獲得進一步暸解。 辭彙「聚核苷酸」、「核苷酸」、「核酸」、「核酸分子」、「核 酸序列」、「聚核苷酸序列」及r核苷酸序列」在本文中可互換 使用’以表示任何長度之核苷酸的聚合物形式。聚核苷酸可包 含去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸及/或其類似物或衍生物。本 文所示之核苷酸序列係以5'至3'方向排列。 辭彙「多胜肽」、「胜肽」及「蛋白」在本文中可互換使用， 以表示任何長度之胺基酸的聚合物形式。 辭彙「變體」包括本發明聚核苷酸或多胜肽序列中之插 入、添加、缺失或取代，其中該變體對肝細胞癌細胞具專一性。 辭句「實質上相同」或「實質上相似」意謂與所揭示之序 列相較時’該相關胺基酸或核苷酸序列是相同的或具有非實質 性之差異（經由保守性胺基酸取代）。 就多胜肽而言，在原始多胜肽與變體多胜肽（其與原始多 胜肽實質上相同）間，至少比較了 10、20、30、50、1〇〇個或 以上之胺基酸。就核酸而言，在該原始核酸與變體核酸（其與 原始核酸實質上相同）間，至少比較了 3〇、4〇、5〇、1〇〇、15〇、 300個或以上之核苷酸。因此，變體可在一個區域或多個區域 中只貝上相同，但在其他區域中有歧異，而同時仍符合「實質 亡相同」之定義。兩序列間之相同性百分比係由標準之排比運 算法判定，諸如，舉例而言，Altschul等人，j Μ〇/说〇/ 215:403-410 (1990)所述之基礎局部排比工具（Β_ [⑽; Alignment Tool (BLAST))、Needleman等人，j Mo/ 仿〇/ 48:444-453 (测）之運算法或是Meyers等人，c㈣卿如 所osc/·，4:11-17 (1988)之運算法。 辭菜「Μ月曰體」係指一種組合物，其包含外層之脂質雙層 或多層膜，包圍内部水性空間。該辭彙包括多層微脂體，、其二 200935055 般而言具有約1至約10微米範圍之直徑範圍，且包含2至數百個 不等之同心脂質雙層，其與水相層交替存在。該辭彙包括單層 小泡，其係由單一脂質層構成，且一般而言具有約至約 奈米（nm)、約50至約300nm、約3〇〇至約4〇〇nm或約1〇〇至約 200 nm範圍之直徑。該辭彙亦包括直徑為約& 至約75腿 之微脂體。 二辭彙「抗體」係指免疫球蛋白或其片段，且涵括任何包含 抗原結合片段或抗原結合域之多胜肽。該辭彙包括但不限於 〇 ^單ί、單專一性、多專一性、非專一性、人類化、人類、 =、肷合、合成、重組、融合、賴、接枝及活體外產生之 ^非月J面接有「完整」乙詞，辭彙「抗體」包括抗體片 ’，、F(ab’)2、FV、SCFV、Fd、_及其他保留抗原 、、…抗體片段。一般而言，此等片段可包含抗原、結合域。 -够彙/原結合域」及「抗騎合片段」係指抗體分子之 二ϋ包含負責抗體與抗原性結合之胺基酸。可由 =專-性韻遞合之抗原科稱為「抗絲位」，盆 之胺級絲_糊，域可包含糖 叙分子。抗縣合射包含抗體輕 必)及抗體重鏈可變區域(Vh);然而，不-定 〇 保Fd片段具有兩個Vh區域’且通常 段if二域之部分抗原結合功能。抗體之抗原結合片 雙炉;’⑵F (ab) 2片段’ 一種具有兩個秘片段（以 區^^之雙價片段；⑶柯片段，具^兩 儘，以及⑷分離之互補決定區（咖）。此外， (vlavh) ^ μ由重組方法、經由合成連接子使其結合在 12 200935055

單蛋白鍵之方式製備’其中Vl&Vh區域配對以形成單價分 子（稱為單鏈FV(scFV);參見，例如，Bird等人（1988) 242:423-426 ； Muston^A ( 1988) Proc. Natl. Acad Sci USA 85:5879_5883 )。可使用熟習技藝者已知的習知技術取得此等抗 體片段，且可使用如同完整抗體之方式，篩選該等片段之用途。 ❹ 辭彙「專一性雜合」在聚核苷酸之上下文中係指嚴格條件 下之雜合。增加DNA/DNA及DNA/RNA雜合反應之嚴格度的 條件已廣為知悉並公開於此技藝中。嚴格雜合條件之實例包括 雜合於4X氣化鈉/檸檬酸鈉（SSC)及約65_7(rc，或是雜合於 添加50%曱醯胺之4XSSC中及約42_5(rc，接著以一或多 SSC、在65-70°C下進行清洗。 ^當該胜肽可與肝細胞癌細胞結合或產生交互作用，但未顯 著地與其他細胞結合或產生交互作用時，則胜肽可稱為 田 胞癌細胞「具專一性」。 *' 辭彙「配位體」係指可結合至其他分子（包括受體）之分 子0 、、佰主細胞」係單獨的細胞或細胞培養物，其可為或已經 ，為任何飯載體或分離的聚鮮酸之接受體。宿主細胞包括 宿主細胞之子代’且該子代因天然、意核故意的突變及 ，改變而不一疋與該原始親本細胞完全相同（在形態 正體DNA互補性方面）。宿主細胞包括在活體内或活體外經重 組载體或本發明之聚核紐轉染或感染之細胞。包含本發明重 組載體之宿主細胞可稱為「重組宿主細胞」。 「檢體」係任何衍生自病患之生物檢體。該辭彙包括但不 ，於生物液體，諸如，血液、血清、血漿、尿液、腦脊趙液、 淚液、唾液、淋巴、透析液、灌洗液、精液及其他液體樣本， 以及生物総之細胞及_。該辭彙亦包括_或其衍生之細 f及’包括養物中之細胞、細胞上清液及細胞裂解 ^辭彙亦包括If g或组織培養物衍生的液體、組織生檢樣 13 200935055 本、遁，生檢樣本、糞便樣本、萃取自生理組織之液體以及分 離自固，組織、組織切片及細胞裂解物之細胞。此一定義涵括 在其獲得之後以任何方式操作之樣本，諸如，以試劑處理、溶 解或使其富含某些組成份，諸如，聚核苷酸或多胜肽。該辭彙 =包括病患樣本之衍生物及區份。病患樣本可用於診斷、預後 ίί他監測分析。靖彙亦可應麟來自非人類哺乳動物之生 物檢，。該檢體可來自人類病患或非人類哺乳動物。 而奶療」在本文中涵括針對哺乳動物（包括人類）之疾病 樂ί進行治療’包括抑制疾病、遏止其進展或缓解疾病， 二二復原或重建或修復喪失、遺失或缺陷之功能或激發 率差的作用。該辭彙包括獲取想要的藥理學及/或生理 %涵對哺乳動物（包括人類）之病理狀況或病症之任何 ^^作用可為預防性（就完全地或部分地預防病症或其症 及/或治療性（就部分地或完全地治癒病症及/或由該 ί 面影響而言）。因此，本發明提供治療及預防兩 处古⑴預防該病症在對象體内發生或復發，該對象可 Γ有該雜之傾向但尚未產生症狀，⑵抑繼病症，諸 展Γ i(3)使_症或至少是與其糊之症狀ί 二二斗、=使該伤主不再受該病症或其症狀所苦，諸如，造 奂正或八症狀之復原，例如，藉由重建或修復一喪失、遺 示ί=ίί ί ί ?ί相關之症狀，所稱改善係用以廣義地ί 度(發炎、疼痛及/或腫瘤大小)之降低。 固體或Ιΐΐίΐΐ載f .」係指任何習知類型之無毒固體、半 賦形劑。醫筚可接A之載包膠囊材料、調配物輔助劑或 者叙主w 載體在所用之劑量及濃度下，對接受 者無了性，且可與該調配物之其他成分相容。 按又 諸如，指—種混合物’其通常含有載體’ 如醫樂了接文之載體或賦形劑，其係技藝中所習知且適合 200935055 投樂至對象中，七 可包括細胞培養物，性、診斷性或預防性之目的，其亦 培養基中。乂仞中夕胜肽或聚核苷酸係存在於細胞中或 鍵劑、⑽=5 ’ 口服投狀組合物可為驗、懸浮液、 ' ^、膠囊、持__、口沖m粉末。 介入或希何就、絲、病症或症狀，其需要醫藥 或預防。有醫樂m等醫藥介人可包括治療、診斷及/ 孤或亞ί症;L係任何異常之細胞或組織生長，例如，腫瘤，不 ❹ : 前惡性或非惡性，其特徵在於不受控制的細胞增 合犯會（亦有可能不會）侵襲周圍之組織，並因此可能 了此不會）轉移至新的身體位置。癌症涵括癌瘤，其 係上皮細胞之癌，癌瘤包括鱗狀細胞癌、腺癌、黑素瘤及肝瘤。 癌症亦涵括肉瘤，其係間質來源之腫瘤，肉瘤包括骨原性肉 ，、白血病及淋巴瘤。癌症可涉及一或多種瘤細胞類型。辭彙 癌症包括肺癌、結腸癌、乳癌、前列腺癌、肝癌、胰臟癌及口 腔癌。 II·本發明多胜肽（對肝細胞癌細胞具專一性） 本發明提供一種聚核苷酸或其變體，其中該聚核苷酸編碼 一種對肝細胞癌細胞具專一性之胜肽，且該聚核苷酸包含選自 SEQ ID NO: 1 ^ SEQ ID NO: 3 > SEQ ID NO: 5 > SEQ ID NO: 7 > SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 2卜 SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25及SEQ ID NO: 29之序列。 本發明提供一種多胜肽或其變體，其中該多胜肽對肝細胞 癌細胞具專一性，且該多胜肽包含選自SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 18、 SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 15 200935055 26、SEQ ID NO: 28及SEQ ID NO: 30之序列。在一具體實例 中，該多胜肽包含SP94(SEQIDNO:2)或其變體。在另—具 體實例中，該多胜肽包含SP94 ( SEQ ID NO: 2 )。 、 A.變艟 變體包括該等胜肽之生物活性變體，其包括在結構方面實 質上相似或實質上相同之變體。胜肽序列之變體可包括相對於 該等對象胜肽之插入、添加、缺失或取代。多胜肽序列之變體 包括生物活性之多形性變體。 本發明之核苷酸及多胜肽之變體包括，例如’與所揭示之 核酸分子及多胜肽在序列上有至少約5〇%、至少約55%、至少 約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約8〇%V、 至少約85%、至少約90%、至少約92。/❶、至少約93❹/。、至少0约 94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約9 $二 至少約99°/❶相同者。 本發明之核苷酸及多胜肽之變體包括’例如，與所 核酸分子及多胜肽在序列上有至少約5〇0/。、至少約55%、小 約60%、至少觸％、至少_%、至少約75%、至 1 至少約85%、至少約9G%、至少約92%、至少約93% / ' 94%、至少約95%、至少約96%、至少約97% ^ 至少約99%相似者。 川或 本發明多胜肽之變體包括具有〗、2、3、4、5、6個 之插入#添加、缺失或取代之髓（她 一具體實射，該變體包含卜2、3、4、5、6個或以入在 添加、缺失或取代（相較於表i _所 J g ^、 不之 =胺一;酸雜實例中’該變心 2、3、4、5、6、7、8、 〇 〇 本發明聚核苷酸之變體包括具有j、 16 200935055 :列f，變其體中=二:加、缺失或取代(她於辦所示 =核ΪΣ體包含編碼表1中以粗體字表示之單1列^3 學編碼及非編碼性胺基酸、經化學或生物化

環(depsicyclic)、縮酚酸雙環二： 架之多胜肽。麵包括單鑛白以及多雜。 月 本發明之胜肽變體可包括天然存 ^ 嫌酸、胺基酸之組合以 :Λ」胺基酸（例如，"基胺基酸、ca-甲基胺基 i 等）’以傳達特別之特性。此外，變體可為 祐田/ f體可匕括非典型胺基酸，以引人制的構形基序。可 ΐΓΓϋί的非典型胺基酸。可將胺基酸類似物及胜肽模擬 /以誘發或有利於特定的二級結構，其包括但不 ^5 ( Ϊ_3_胺基-2·ΡΓ〇Ρ_〇η6·6_紐）、_ 角誘發 f Λ片狀誘發性類似物、p-轉角誘發性類似 α，、疋誘發性類似物、轉角誘發性類似物、Gly-Ala轉角 賴晴賴（i喊心細-以及 山可將去胺基或去羧基殘基納入變體之終端，使其不具有終 Ιΐί或祕’崎婦蛋自酶之敏紐或是關構形。C-端s能基包括醯胺、醯胺低碳烷基、醯胺雙（ 碳炫氧基、減及縣，以及魏碳s|魅物^ 接受之鹽。 17 200935055 此外’如有需要，可在該多胜肽序列中引入非典型胺基酸 或化學胺基酸類似物，作為取代或添加。非典型胺基酸包括， 但不限於，常見胺基酸之0_異構物、2,4二胺基丁酸、a_胺基異 丁酸、4-胺基丁酸、Abu、2_胺基丁酸、g_Abu、e_Ahx、6_胺 基己酸、Aib、2-胺基異丁酸、3-胺基丙酸、鳥胺酸、降白胺 酸、降纈胺酸、羥基脯胺酸、肌胺酸、瓜胺酸、高瓜胺酸、半 胱胺磺酸、t-丁基甘胺酸、t_丁基丙胺酸、苯基甘胺酸、環己 基丙胺酸、b-丙胺酸、氟-胺基酸、設計胺基酸，諸如，b曱基 胺基酸、Ca-曱基胺基酸、Na_甲基胺基酸，以及一般之胺基酸 類似物。再者，該胺基酸可為ϋ (右旋）或L (左旋）。 '變體包括與本發明之胜肽實質上類似之聚核苷酸序列。此 等變體可由雜合至本發明聚核苷酸之互補體之核酸所編碼。 Β.融合蛋白及共輕物 本發明提供融合蛋白，其包含與第二多胜肽融合之第一多 胜肽（其中該第一多胜肽包含對肝細胞癌細胞具專一性之多胜 肽）’以及第一胜肽。該第二胜肽係選自，但不限於，麩胺基 硫呂_轉移酶（GST)、異源胺基酸序列，諸如，生物發光蛋白二 〇 螢光钱水母素（_光蛋白），其具有錢及同源之 别導序列。該等融合蛋白可包含1^_端曱硫胺酸殘基、聚乙二 化之蛋白以及縣疫學標記或HIS標記之蛋自。麟融合蛋白 抗絲蚁融合物。此物合蛋白可包含本發明胜肽之 體如，同型二雜朗型多聚體，以及異型二聚體及異 本發明之胜肽可共軛結合於一標記，諸如，但不 =ITC、生物素以及放射性同位素，包括，但 64 7广

二音、rAmA244cm，具有可偵測性產物之酶（例如Y 勞先細、過氧化物酶、驗性鱗酸酶，半乳糖普酶以及^似 18 200935055 物）’螢光劑及螢光標記，螢光發光金屬，例如，mEu或是鑭 系之其他金屬，電化學發光化合物，化學發光化合物，例如， 發光版（luminol)、異發光胺（isoluminol)或。丫·^鹽（acridinium salts) ’專一^I1 生結合分子，例如，磁性顆粒、微球體、奈米球 體以及類似物。本發明之胜肽可共軛結合於治療劑，諸如，長 春瑞濱、順鉑、吉西他濱（gemcitabine)、太平洋紫杉醇、依 托治，（etoposide )、Novantrone (米托蒽醌（mitoxantrone ))、 放線菌素D、吾樹驗（或其水可溶性衍生物）、胺曱嗓吟、絲 ^黴素（例如’絲裂黴素C)、達卡巴嗪（dacarbazineXDTIC)、 φ 環磷醯胺及抗癌抗生素（諸如，阿黴素及柔紅黴素 ^daimomycin)以及其他物質，例如’ DeVita等人（2〇〇1)所 描述者。胜肽亦可共輛結合於胞毒性藥物、寡核苷酸、毒素及 放射性分子或是化合物，諸如，Ng等人（2〇〇6) -VEGF 適體。 < ^ III·製備對肝細胞癌細胞具專一性之多胜肽之方法 本發明之胜肽可使用技藝中已知之方法製備。基於細胞之 方^及無細胞之方法皆可用_備本發明之胜肽。基於細胞 ❹ =法:般而言涉及在活體外將核酸引人餘細胞，再於適合 件下培養該宿主細胞，接著收取該胜肽，其可由培養 二二1主細胞中（例如，藉由破壞該宿主細胞）或自兩 f中巧。適當的宿主細胞包括原核或真核細胞，其包括，例 :二，、真菌、植物、昆蟲及哺乳動物細胞。 胜壯ΐϋ亦ί供使用無細胞之活體外轉錄/轉譯方法而製備 胜肽之方法，其係技藝帽熟知。 衣角 顼源胜肽（獨係經修飾或未經修飾）可自行表 ϊ Ϊ)或是以融合蛋白形式表現，^其可包括分= 些。本發日狀分泌㈣序列可指引^ 、旧（ER)°ER將膜連蛋白與其他蛋白分開。-旦 19 200935055 疋位至ER’蛋白可進一步被導引至高基氏體，再分配至泡囊， 包括分泌泡、細胞質膜、溶酶體及其他胞器。 二此外，可在該等胜肽上添加胜肽分子部分及/或純化標 記。此等區域可在多胜肽之最終製備前除去。在多胜肽上添加 胜狀分子部分’以引起分泌或排泄、改良安定性及加速純化， 舉例說明’其均為技藝中熟悉及慣常之技術。適當之純化標記 ，括，舉例而言，V5、聚組胺酸、親和素及生物素。胜肽與 諸如生物素之共軛作用可使用技藝中所熟知之技術完成。、 (Hermanson編輯（1996)生物共軛技術；Academic Press)。 . =肽亦可共軛結合於放射性同位素、毒素、酶、螢光標記、膠 態金、核酸、長春瑞濱及阿黴素，可使用技藝中已知之技術^ Ο 成。（Hennanson編輯（1996) ; Academic press ; Stefan〇等人 (=06)。毒素包括免疫毒素。Kreitman及Pastan ,血液學惡性 病治療中之免疫毒素，Curr Drug Targets· 7:1301-11 (2006)。 太適用於本發明之融合配對物包括，例如，胎球蛋白、人類 血清白蛋白、Fc及/或一或多種其片段。本發明亦提供共軛蛋 白，諸如，聚乙二醇共輛物。 一本發明之多胜肽亦可使用技藝中已知之技術，以化學方式 合成（例如，參見，Hunkapiller等人 ’ Nature，310:105 111 (1984) ; Grant編輯（1992)合成胜肽，使用者指南，WH 〇

Freeman and Co·;美國專利第6,州,·號）。舉例而言，對應 於二多胜肽片段之多胜肽可藉由使用胜肽合成儀或經由使^ 技藝中已知之固相方法而合成。 — 本發明之多胜肽可以標準方法，自化學合成及重組細胞培 養，中回收及純化，其包括，但不限於，硫酸銨或乙醇沈澱、 酉文萃取、陰離子或陽離子交換層析、礙酸纖維素層析、疏水交 互作用層析〕親和層析、氫氧磷灰石層析及凝集素層析。最佳 者’本發明係使用高效液相層析（「HPLC」）進行純化。當多 胜肽在分離及/或純化之過程中變性時，可使用既有熟知的再 20 200935055 折疊蛋白技術重建其活性構形。 本發明之胜肽或胜肽模擬物可以一或多個各種親水性 合物予以修飾或與其共價偶合’以增加該胜肽之溶解度及循^裒 半生期。用以偶合至胜肽之適當的非蛋白親水性聚合^包括衣 但不限於’聚烷基醚（如，聚乙二醇及聚丙二醇）、"聚乳酸、 ^^乙醇S欠、XK氧細煙、聚乙稀醇、聚乙稀吼洛。定_、纖維素及 - 纖維素衍生物、葡聚糖及葡聚糖衍生物。一般而言，此等親水 性聚合物具有介於約500至約100,000道耳吞J 2,〇〇〇至^ . 40,000道耳吞或約5,000至約20,000道耳吞範圍之本均分子 φ 量。可使用任何下述方法，使胜肽與此等聚合物形成衍生i或 與其偶合·· Zallipsky, S. ( 1995 )Bioconjugate Chem.，6:150-165 ; Monfardim，C.等人（1995) Bioconjugate Chem. 6:62-69 ;美國 專利第4,640,835 ; 4,496,689 ; 4,301，144 ; 4,670,417 ; 4,79i，192 ; 4，179,337號或WO 95/34326。 ’ ’ ’ IV.抗«之產生 本發明之分離蛋白可用於產生抗體，其可為單株或多株， 可使用技藝中一般已知的抗體生成方法產生。因此，本發明亦 包括抗體，其係對應於對肝細胞癌細胞具專一性之胜肽。該等 © 抗體包括可阻斷活性之抗體以及不阻斷活性之抗體兩者。 舉例而言’可經由傳統的融合瘤技術（Kohler及Milstein，

Nature 256:495-499 (1975))、重組DNA方法（例如，美國專 利第4,816,567號）或使用抗體庫之嗟菌體顯現技術（ciacks〇n 等人，Nature 352: 624-628 ( 1991); Marks等人，J, Mol. Biol. 222:581-597 (1991))而製備抗體。針對各種不同之抗體生成 技術’可參見抗體.實驗室手冊，編輯，Harlow等人，冷泉港 實驗室（1988)。 本發明之抗體可用於治療下述疾病。抗體亦可用於下述分 析及偵測方法。 21 200935055 v.撤鹿*之製備 已知有各種製備微脂體之方法’其中有幾種方法是描述於 Lichtenberg 及 Barenholz，Methods of Bi〇chemical Aj^ysis， Volume 33, 337-462 ( 1988 )。單層小微泡（SUV，大小<i〇〇 而!）

可依前人所述（Tseng等人’ 1999)，結合薄膜水合及重複擠出 之標準方法而製備。Hug及Sleight等人（1991)敘述了由微脂 體包囊DNA之製備方法以及微脂體介導的轉染作用之直接應 用。製備微脂體之方法亦揭示於美國專利第6,355,267號及美^ 專利第6,663,885號。微脂體可由反相蒸發法，用脂質組合物（包 含磷脂醯膽驗、膽固醇及PEG衍化性鱗脂醯乙醇錢（pEG_pE )) 製得。微脂體可經由具有預定孔洞尺寸之濾器擠出，以產生具 所需直徑之微脂體。 〃 微脂體亦可由市售來源取得，諸如，台灣微脂體公 北，台灣其他市售可得之微脂體包括TLC_D99j；；^

Doxil、DaunoXome、AmBisome、ABELCET、transfectace (舰卿E)、DOTAP/D〇腿ip〇fectin。滅敵 一本發明之微脂體一般由磷脂製備，但亦可使用其他分子， 其^時▲具有疏水性及親水性分子部分且具細似分子形狀及

尺山就本發明之目的而言，所有適當的微脂體形成分子在本 歸。可朗—或多種天然存在及/或合成的脂質 化合物製備微脂體。 祕制疏极細之抑，織射級離子性、 人糊㈣，#制具有猶或硫酸基團之化 二二微脂體為陰離子性。當使用含胺基之脂質 夺斤製付之试月曰體具陽性電荷，為陽離子微脂體。 化入m中二可用於形成初始微脂體之代表性磷脂或脂質 (於’鱗脂相關性物質’諸如，構月旨_驗 (㈣月曰）、溶血㈣月旨、溶血礙脂醯乙_、磷脂醯絲胺酸、 22 200935055 磷脂酸肌醇、神經鞘磷脂、磷脂醯乙醇銨（腦磷脂）、心磷脂、 填脂酸、腦脂糖苦、碟酸聯十六烧基醋、磷脂醯膽鹼及二掠櫚 醯基磷脂醯甘油。其他不含磷的脂質包括，但不限於，十八烷 胺、十二烷胺、十六烷胺、乙醯棕搁酸、甘油蓖麻醇酸酯、硬 脂酸十六烧基酯、肉豆蔻酸異丙酯、兩性丙烯酸聚合物、脂肪 酸、脂肪酸醯胺、膽固醇、膽固醇酯、二醯基甘油、二醯基甘 油琥珀酸酯及其類似物。 土 可用於本發明之微脂體製備物包括陽離子（帶正電荷）、 ' 陰離子（帶負電荷）及中性製備物。 φ 將化合物載入微脂體中之主動載藥是利用穿膜梯度之形 成而達成（Ceh及Lasic, 1995)。此種方法包括使欲載入微脂體 之化合物及硼酸化合物連同懸浮之微脂體一起培育，俾使該化 合物累積於微脂體中（Zalipsky等人，1998 ; Ceh B. and LasL'D. D.，1995 ; Zalipsky等人，1998 ;美國專利第6,〇51251號）。· 可使用磷酸分析以測定微脂體濃度。其中一種鱗酸分析是 基於鉬酸及孔雀綠染劑間之交互作用而進行。主要原理涉及無 機磷酸與鉬酸反應形成無色未還原的磷鉬酸複合物，其在酸性 條件下還原時會轉變成藍色複合物。而在與孔雀綠形成複合物 時’填鉬酸會產生20或30倍較深的顏色。終產物，即，還原的 © 綠色可溶性複合物，可在620 nm測量吸收值，是直接測量溶液 中的無機磷酸。 VI·製備醫藥组合物 本發明之微脂體、胜肽及抗體可包含一或多種廣泛不同的 藥物’其已被用於癌症之治療及血管生成之抑制，包括，但不 限於，長春瑞濱、順鉑、吉西他濱、太平洋紫杉醇、依托泊苷、 Novantrone (米托蒽醌）、放線菌素D、喜樹鹼（或其水可溶性 衍生物）、胺曱喋呤、絲裂黴素（例如，絲裂黴素C)、達卡巴 嗪（DTIC)、環鱗醯胺及抗癌抗生素（諸如，阿黴素及柔紅徽 23 200935055 ，）或是其他藥物，例如，De Vita等人（2001)所述藥物。該 等微脂體、胜肽及抗體亦可包含胞毒性藥物、寡核苷酸、毒素 及放射性分子。該等微脂體、胜肽及抗體亦可包含化合物，諸 如Ng等人（2006)所述之抗VEGF適體。 ，部分具體實例中，該等微脂體、胜肽及抗體是存在於含 有醫藥可接受之載體、贿彡劑及稀釋劑（各種廣泛不同的種類 均為技藝中已知）之調配物。此等醫藥載體、賦形劑及稀釋劑 包括列於usp醫藥賦形劑表中者（usp and Exdpients, ❹

Listed by categories, p. 2404-2406, USP 24 NF 19, United States Pharmacopeial Convention Inc., Rockville, Md. (ISBN 1:889788-03-1))。醫藥可接受之賦形劑，諸如，載劑、佐劑、 載體或稀釋劑，皆可由公眾輕易取得。此外，醫藥可接受之輔 助物質，諸如，pH調節及緩衝劑、滲透壓調節齊j、 溼潤劑及類似物，亦皆可由公眾輕易取得。 ▲適當之包括，但不限於，水、葡雜、甘油、鹽水、 乙醇及其組合。載體可含有渺卜之試劑，諸如 ^

Pf衝劑献_，射增賴植物之有錄。局m 體匕括液體石油、棕搁酸異丙酯、聚乙二醇、乙醇 ％ 溶於水中的聚氧乙烯單月桂酸自旨（5%)或是溶 〇 烷基硫酸鈉（5%)。可視需要加人其他材料，諸n 保濕劑、黏度穩定劑及類似試劑。 彳几虱化劑 在醫藥劑型中’本發明之組合物可以醫藥 式予以投藥，或可㈣朗韻當地賴餘紅 =合物來使用。可根據可能的投賴式來調配本發明=組合 ^本發明之織體、雌及鋪在水性鱗水性之 谷解m❹ut ’關配姐射賴備物 劑劑 =丄蔬菜油或其他類似之油、合雜脂肪酸甘油ί ΐΐ 肪酸或丙二醇之酯，且如需要，尚可結合f知添加物， 24 200935055 助溶劑、特劑、懸浮劑、乳化劑、安定劑及防腐劑。亦可使 用其他口服或腸外投藥用之調配物，如技藝中所習知者。 VII.治療方法 Α.投藥途徑、劑量及頻率 本發明之包含治療性藥物之胜肽或微脂體可藉由注射而 Ο ❹ ΪΐίΪ療之對象進行全雜之投*，諸如，藉祕脈注射， 或疋猎由注射於或施用在相關位置而投藥，諸如，藉由直接注 射進入腫瘤’或是當位置在手術巾絲出來時，直接施用於該 ^置’或是藉由局部施用而投藥，諸如，該病症係位於皮膚上 時:需要、;絲之縣包姉絲如癌症赫（包細cc或肝癌） 之對象。 本發明之胜肽可使抗體以癌症為標把，以進行治療。在一 巾’將本刺之雌減至需要治狀縣，接著再 ί1:ί:ϊ合該胜肽之抗體。靶向抗體可調節抗體依賴性細 2毒性产補_性細胞毒性，歧可修飾目齡子之基 之形式可為抗體共祕’以直接傳騎對目標組 劑、tyEGF舰及抗Μ生雜合物。 衫化療 投藥方式有很多種，包括，口服、經頰鼻 =內腹膜内、皮内、穿皮、皮下、靜脈内、動 氣管内及_投藥，或是藉由植人或吸人之其 、夜1本發明之組合物可調配為固體、半固體、 油膏ίΓΐί製備物’諸如，鍵齊卜膝囊、粉末、顆粒、 形麵為例示射物、吸入物及氣溶膠。下列方法及賦 乙薛形纖劑為，例如，水、鹽水、葡聚糖、甘油、 ίϊίί物及其組合。此外’如有需要’載劑可含有微量之 辅助物f，諸如，溼潤或乳化劑或是ΡΗ緩衝劑。製=等》 25 200935055 型之實際方法是熟習技藝者已知或顯而易知者。在任何情形 下，待投藥之組合物或調配物會含有一定量之試劑，1可^ 治療對象體内達到想要的狀態。 八 、 一般而言’本發明之組合物是以約i gg/kg至約2〇 、 約 1 pg/kg至約 10 mg/kg、約1 pg/kg至約 1 mg/kg、約 1〇 pg/kg 至約1 mg/kg、約1 〇 pg/kg至約1 〇〇咫/峰、約丨〇〇肫至約丨吨知 ，約500 pg/kg至約1 mg/kg範圍之劑量，對病患投藥。抗體以 單次劑量（bolus dose)投藥，俾使抗體在投藥至^患體内後 在病患體喃環之間隔時間制最A。在—開始的單次劑量 後，可使用持續的輸液。劑量投予可用單劑進行或是間隔進 行’諸如’每曰一次、每週一次或每月一次。劑量投予之時程 可$於，例如，該多胜肽對肝細胞癌細胞之親和力、該多胜肽 之半生期及該病患病況之嚴重性而進行調整。 B·组合療法 、本發明之胜肽或微脂體可為單一療法。或者，本 肽或微脂體可結合標準之絲或賴絲伽，以浴療癌症。 〇 癌症療法使用之藥物可能對於癌細胞具有細胞毒性或細 胞抑制作用，或是可降低惡性細胞之增殖。本發明之微脂體、 胜肽或抗體可與放射療法結合。本發明之微、胜肽或 =連，De Vita等人編輯⑵⑷所述之治療方法作為輔助治 f。在本發明之微麟、驗或抗體與第二抗癌劑發揮協同 胞之組合中，第二藥劑之劑量降低（她於單獨^ 樂二第一樂劑之標準劑量而言）。一種用於增加癌細胞敏感性 ，包含將本發明之微脂體、胜肽或抗體與一含量之化療 =藥物（其可有效增強癌細胞敏感性）共同投藥。共同投藥 „時之投藥。在療程中，本發明之微脂體、胜肽 =體可與其他賴制鋪。在—具體實财，本發明之微 曰、胜肽或抗體與其他療劑之投藥係依順序進行。根據各種 26 200935055 因素，例如，病患疾病之性質以及該病患之狀況，醫師可選 適當之時程。 VIII.診斷方法 疾病專一性生物標記之偵測提供一種有效之篩選策略。早 期偵測不僅可提供早期診斷，就癌症而言，亦可提供篩選多带 性及偵測手術後殘餘腫瘤細胞與隱匿性轉移（腫瘤復 = ，標)之能力。因此，疾病專一性生物標記之早期丄 夂治療之同時以及在緩解之同時，於診斷前改善病患之存活。 ❹ 本發明之胜肽可用於疾病之診斷或預後，包括癌症。該 胜肽可作為診_，其方式包括但不·ELISA、西方墨二 法、螢光、免疫螢光、免疫組織化學或自動放射線攝影術二’、 本發明之抗體亦可與本發明之胜肽組合使用， f。在部分具體實财，所使_分析是—種結合分析，U =抗體與本發赚肽之結合，其中本發酿肽已連結於肝= ’肝細胞癌細胞。該多胜肽及/或抗體可予 予以標記，或以經標記之二級抗體予以二:亦C :=體可制性標記包括直接標記（其標 =標科觸崎目標 存在可伽咖含敎，如分_標記之 IX篩選方法 之方蝴明之胜肤） (可結合該分子）之·目彳® 其可作為療劑或診斷劑 之紐士 示。舉例而言，對於該分子且有專-性 生該分子之病患。 了用乂/0療或診斷其細胞產 27 200935055 人、巾—種方法巾，本發明之職可在雙雜合分析或三雜 二刀斤作為「誘_蛋白」（參見，例如，美國專利第5,283,317 等人（1993);胸聰等人（1993) ; Bartel等人 U993) ; lwabuchi等人（1993);及Smer等人（2〇〇6))，以辨 識其他蛋白，該等蛋白可與本發明之胜肽結合或產生交互作 用。 在另一方法中，本發明之胜肽與細胞萃取物一起培育，以 辨識可結合本發明之胜肽之生物分子。在其中一種方法中，將 本發明之胜肽固定於固體支持物上，諸如HPLC管柱，以及將 · 細胞萃取物在一條件下接觸經固定之胜肽，該條件可幫助本發 明之胜肽與目標分子之結合。將結合的分子予以溶析並纟標準 〇 之技術（諸如’質譜分析）進行辨識。 實例 1 =本說明書可參照說明書中所引述之參考文獻之教示而獲 得最完全之理解。下列說明書中之具體實例提供本發明具體實 例之说明，不應被視為限制本發明之範圍。熟習技藝者很容易 瞭解本發明是涵括諸多其他具體實例。 I·實例1·噬菌《顯現之随機胜肽庫及生物淘選（bi0paning) Q Α·細胞系及細胞培養 使用 59Τ、Changliver、ΗΑ22Τ、Hep3B、HepG2、J5、 NTUBL、Mahlavu及SKHepl (均為人類肝細胞癌細胞系）以 — 及NNM (人類初代正常鼻黏膜上皮細胞）細胞承蒙 . 蕭宏昇博士（基因體研究中心，中央研究院，台灣）提供。將 前述人類HCC細胞系及NNM維持在DMEM培養基及10%胎牛 血清（FBS)中’其餘條件為370C、空氣中5%或10%CO2之溼 潤大氣。 其他可用之細胞系包括人類肺鱗狀細胞癌細胞系A549、 28 200935055 高轉移性人類肺腺癌細胞系CLl-5、人類肺腺癌細胞系H23、 人類肺大細胞癌細胞系H460、人類肺癌細胞系PC13、人類鼻 咽癌細胞系NP-TW(H、人類口腔鱗狀細胞癌細胞系SAS、人類 胰臟癌細胞系PaCa、結腸癌（HCT116)、乳癌（BT483)、前 列腺癌（PC3)、NNM (人類正常鼻黏膜上皮細胞）及纖維母 細胞。A549、H23、H460、PC 13、PaCa、HCT116、PC3、Mahlavu 及SAS可自美國典型培養物保藏中心（American Type Culture Collection)取得。CLI-5及NPC-TW01細胞系分別由Chu等人 (1997)及Lin等人（1990)建立。 B·分離可結合HCC細胞之噬菌艟 使用噬菌體顯現之隨機胜肽庫，篩選HCCMahlavu細胞專 一性嗟菌體。我們的實驗是使用噬菌體顯現之隨機胜肽庫 (RPLs) Ph.D.-12套組（New England Biolabs，Ipswich, MA， USA)。根據先前之研究（35)加上部分修飾，進行生物淘選 流程。簡言之’使Mahlavu細胞生長至70-80%聚滿，以磷酸緩 衝鹽水（PBS)清洗，以溶於PBS之5mMEDTA收取細胞，然 後以含有1% BSA之無血清培養基收集細胞。將細胞懸浮液冰 藏在4°C下’接著加入1.5 X 1011溶菌斑形成單位（pfu)之噬菌 體顯現胜肽庫。在4。(：下培育該反應混合物1小時，轉移至不混 溶的有機溶劑之頂端（磷苯二甲酸二丁酯：環己烷為9:1) (Sigma-Aldrich，Saint Louis，MO, USA) ’ 再進行離心。將連結 噬菌體之細胞沈澱物重新懸浮於LB培養基，再以大腸桿^ (及C油·β ⑺/〇 ER2738培養物（New England Biolabs,

Ipswich, MA，USA )針對噬菌體進行擴增及效價測定 (titration)。以Mahlavu細胞對回收之噬菌體再進行額外的生 物淘選循環。在LB/IPTG/X-Gal盤上，對第五輪之噬菌體溶析 物進行效價測定，以進行噬菌體純系鑑別。在第五輪之親和 選（生物淘選）後，第五輪之回收率已增加為第一輪中所觀察 29 200935055 到者之3.5倍（圖1)。 C·以ELISA鑣別噬菌艟纯系 隨機分離出96株噬菌體純系，與HCC細胞及正常上皮細胞 (NNM)進行反應’以ELISA進行分析。將約丨X 1〇4個Mahlayu 及NNM細胞分別播種於96孔之ELISA盤中，並培養生長至隔 仗。以無血清DMEM清洗試驗盤，並在4°C下以含有i%BSA之 無血清DMEM進行阻斷。接著加入1 〇9 pftj之個別嗟菌體純系， 在下培育1小時。以pBS清洗該等試驗盤，加入辣根過氧化 物i# (HRP)共輛結合的抗Ml3抗體（Amersham Biosciences， Piscataway，紐澤西州，美國）’並在4°c下培育1小時。以pBs ❹ /月洗试驗盤，接著加入過氧化物酶受質鄰苯二胺二鹽酸鹽 (〇PD; Sigma-Aldrich ’聖路易市’密蘇里州，美國）一起培 育。以3N HC1終止反應，使用微盤分析儀在49〇⑽測定光學 密度。 II·實例2.流式細胞計數及生檢分析 A.鐘別可專一結合HCC細胞之噬菌髏純系 上為分析可專一結合HCC細胞之噬菌體純系，進行流式細胞 計數分析。使HCC細胞生長至70-80%聚滿，再以溶於PBS中之 〇 5 mM EDTA收取細胞。使HCC細胞重新懸浮於FACS緩衝液 (具1% FBS之PBS)中’並分別與PC94或控制組（不編碼蛋 白）嗤菌體在40C下培育1小時。以FACS緩衝液清洗後，使HCC 細^胞與單株抗M13抗體在4°C下培育1小時，接著再與共軛結合 R萬紅素之抗小鼠抗體（SouthernBiotech，伯明罕市，阿拉巴 馬州’美國）培育30分鐘。在FACS-Calibur上使用CellQuest軟 體進行分析（BDBioscience，聖荷西市，加州，美國）。 結果顯示，噬菌體純系94 (PC94)對於HCC細胞具有最 佳反應性，而其他的噬菌體純系顯示對於HCC細胞具有中度結 30 200935055 ο活|·生（圖2A)。（A)以流式細胞計數測定各個所選嗟菌體對 HCC細胞之表面結合活性（2nd ··細胞經共軛結合尺藻紅素的 抗小鼠IgG染色；C :細胞與控制組嗟菌體一起培育）。 使不同劑量之噬菌體與HCC細胞進行培育，以進一步驗證

PC94之結合活性，並以faCS進行分析。結果顯示，pC94與HCC 細胞之結合有劑量依賴性（圖2B)。此外，PC94與控制i且噬菌 體，未發現有反應，PC94與NNM培育時亦無反應（圖2B)。 此等結果顯示，HCC (Mahlavu細胞）表現一種未知的分子， 其可由顯現於PC94上之該胜肽辨識。

❹ 為棟究其他HCC細胞是否可由PC94辨識，我們將9種HCC 細胞系與PC94進行培育，並以FACS分析。結果顯示，9種HCC 細胞系中有6種（Mahlavu、59T、Hep3B、HepG2、NTUBL及 SKHepl)與PC94有強烈反應性（47〜81.2%)，其他HCC細胞 系（Changliver及J5)具有中度反應性（25·7〜31 9〇/〇)，而必之奵 細胞系僅有微弱之反應性（19,1〇/〇)(圖2C)。分析PC94對各個 HCC細胞系之表面結合活性（黃色：以共軛結合R藻紅素之抗 小鼠IgG染色；橘色：與控制組噬菌體培育之細胞）。結果顯示， 此處所有細胞系皆表現一種目標分子，其可由卩匸舛顯現之胜 肽辨識（圖2C)。 ’ ❿ 使用取自HCC病患之手術樣本’以免疫組織化學進一步試 驗PC94對HCC細胞之結合專一，!·生。結果顯示，PC9何辨識HCC 之手術檢體中的腫瘤細胞（圖2D，a及b)，但不會辨識其正常 之對應物（圖2D ’ d)。控制組噬菌體則對HCC手術樣本之腫 • 瘤組織，未產生免疫反應性（圖2D，c)。使用HRP共輛結合的 抗M13抗體偵測取自HCC病患之生檢樣本（與pC94或控制組 噬菌體培育）。在腫瘤組織中，發現有PC94免疫反應性（D，a 及b) ’但在正常之對應物則無（d，d)。控制組嗟菌體無法結 合至此等生檢檢體（B ’ c)(比例尺為5〇 μπι)。 為找出胜肽在肝癌組織上之結合能力的位置，使用例行的 31 200935055 免疫組織化學流程’使人類肝細胞癌之石墩切片與嗟菌體顯現 胜肽（具生物素標記）一起培育。手術檢體係取自國立台灣大 學醫院（NTUH)之組織庫，由NTUH之人體試驗委員會 (Institutional Review Board)核准（IRB9461702021)。 Β· DNA定序及電播分析

選出由ELISA及流式細胞儀分析顯示具有較高HCC細胞 反應性之 15株純系（PC 1、2、9、12、15、26、42、47、62、 72、84、85、86、88及94)(圖2A) ’並進行定序。根據製造 商之用法說明萃取噬菌體DNA。使用自動DNA定序儀（ABI PRISM 377; Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA) ’ 以雙去氧核苷 酸鏈停止法測定經純化的噬菌體DNA序列。以一％ gm定序引 子5’-CCCTCATAGTTAGCGTAACG -3,（ SEQ ID NO: 33 )進 行定序。使用Genetic Computer Group (GCG)程式，對該等 經噬菌體顯現之胜肽序列進行轉譯及排比。該等噬菌體顯現的 胜肽序列經GCG軟體排比，顯示出獨特的一致性基序（表i)， 其對應的DNA序列顯示於表2。 根據GCG排比（表1)，選出具有基序Pr〇_Ile/Leu_Leu_pr〇 (P-I/L-L-P)之PC94及PC88。 HI·實例3. 模式 用以進行活«内靶向分析及胜肽競爭分析之動物 Ο μ ί實例針對幾個部份，評估SP94 (由PC94編碼之多胜肽） ^樂物傳遞引導者（供對抗HCC之械藥物傳遞）之潛力。 們探究Sm是否可在活體内以腦細胞為目標。我 體移植模式中檢驗pc94之腫瘤歸向能力及其與 组输夕制。活體内之歸向實驗顯示pc94具有針對腫瘤 二。，，能力’其結合活性高出控制組嗔菌體8倍以上（圖 夕，在胜肽競爭抑制實驗中，SP94可抑制PC94與腫瘤 32 200935055 之結合，而相同濃度之控做胜肽财具有此種抑制作用⑽ 3B ) 〇 A·用以進行PC94靶向實驗之動物祺式 為驗證PC94在活體内之靶向能力，將pc94或控制組 體以尾靜脈注射至帶有Mahlavu衍生性HCC異體移植物（500 - mm )之小鼠。使噬菌體在體内循環，接著進行灌流。回收連 結腫瘤組織及正常臟器之噬菌體顆粒。結果證實，從腫 . 回收到的PC94噬菌體顆粒（依每克組織正常化）顯著較多、， ❹ 相較於正常器官之倍數為：例如，腦（220倍）、心臟（32倍） 及肺（23倍）。然而，控制組噬菌體則未顯示歸向現象， 瘤組織或正常器官中亦無（圖3A)。 、將5xl〇6個Mahlavu細胞由皮下（s.c.)注射至SCID小鼠（4_6 ^齡）之背側。將2xl〇9 _之pC94或控制組嗟菌體由靜脈内 Uv·)注射至帶有Mahlavu衍生性Hcc異體移植物（5〇〇_3) 之小鼠。在灌流後，切除器官（腦、心臟及肺）及腫瘤組織， 以冰PB^洗並秤重。以大腸桿菌ER2738培養物拯救連結腫瘤 組織及态g之噬菌體。在LB/IPTG/X-Gal盤上對溶析的嗟菌體 顆粒進行效價測定。在胜肽競爭抑制實驗中，將2xl〇9 pfU之 ❹ PC：94__1()() W之SP94雜或控制組雌—粒射。以免 f組織化學染色檢驗靶向噬菌體在帶有腫瘤之小鼠體内之組 織刀布。使組織切片與小鼠抗％^抗體一起培育，接著與生物 ，化的馬抗小鼠抗體—起培育（ABC套組；VeetwLabGratories， urlmga^ie，加州，美國），再以pBS清洗，接著以試劑浸 泡。將該等切片浸泡於添加0.01%雙氧水之DAB溶液中，以PBS 清洗，再以溶於|>38之5〇%甘油封固。 B·胜肽競爭分析 胜狀競爭抑制分析確認’ PC94對HCC細胞之結合活性是 33 200935055 取決於PC94顯現之胜肽而非該噬菌體顆粒之其他部分 3)。此等結果強烈證實，HCC細胞之細胞膜表現二種°未^的目 標分子，諸如，一種蛋白質，其可由合成性胜肽81>94及1>(：94 顯現之胜肽兩者辨識’但不被該噬菌體之其他部分辨識。 1.胜肽合成及標記 由胜狀合成核心實驗室（生物化學所，中央研究产）人成 靶向 SP94 ( SFSIIHTPILPL > ( SEQ ID N0:、2 )及^ ^ 組 _ (FPWFPLPSPYGN) (SEQ ID NO: 32)胜肽，並以反&高效. 液相層析純化至>95%純度。將生物素分子共輛結合至胜肽之 胺端，以合成經生物素標記之胜肽（生物素_证94及生物素-控 ❹ 制組胜肽）。質譜確認了預測之質量。 、卫 將PC94及同源合成的胜肽SP94—起注射至帶有Hcc異體 移植物之小鼠。結果顯示，SP94顯著抑制來自腫瘤組織之&菌 體回收率。100微克之SP94可抑制88%之PC94對腫瘤組織:結 合，但相同濃度之控制組胜肽（con_P)並無此種抑制作用（圖 3B )。 為確認PC94之組織分布，以抗噬菌體抗體針對衍生自歸 向及競爭實驗之腫瘤及正常器官的組織切片進行免疫染色。結 ，發現，僅有腫瘤細胞顯示免疫反應性（圖3C，d*。，但正 常器官則否，諸如’腦（圖3C，a)、心臟（圖3c，b)及肺（圖 ^ 3C ’ c)。然而，當pC94與同源合成的胜肽SP94—起注射時， 在腫瘤組織中並未發現免疫反應性（圖3c，j)。以控制組噬菌 _ 體進行的實驗亦未發現腫瘤細胞或正常器官具有免疫反庳 (圖3C，f至i)(比例尺，5〇μιη)。 J - 為檢驗SP94是否可增加靶向藥物之治療指數，我們研究了 =94對腫瘤組織（而非正常細胞）之結合專一，f生。在歸向能力 分析及胜肽競爭抑制實驗兩者中，發現PC94可專一結合至腫 瘤組織但不結合至正常臟器，諸如，腦、心臟及肺（圖3A及B)。 34 200935055 免疫組織化學染色證明，PC94顆粒僅出現在腫瘤組織，但不 $現在腦、心臟及肺組織（圖3C)。最後，我們檢驗sp94胜肽 是否可辨識由HCC病患之腫瘤組織所產生之目標分子。pc94 (圖2D)及經生物素標記之SP94兩者皆可辨識表現於取自 HCC病患手術檢體上之目標蛋白，其陽性率為613% (19/31)。綜言之，我們的結論是，sp94可專一辨識一種由Hcc 細胞產生（但非正常組織產生）之未知目標分子。因此，此種 刀子對於進4亍HCC之把向藥物傳遞是有用的，而SP94可提供 一種用於鏗別此種分子之試劑。 ^ IV·實例4.活艟内踵痼靶向治療實驗 、藉由使用SP94&^^乙一醇化微脂體阿徽素之組合，一種稱 為主動或配位體介導的靶向作用，此種靶向DDS之位置專一性 作用進一步增強了抗腫瘤作用（圖4及6)，並伴隨增強的腫瘤 凋亡現象（圖5A、5B及6E)及降低的腫瘤血管生成作用（圖 5C 及 6D)。 在聚乙二醇化微脂體阿黴素（Lip〇_D〇x)調配物之臨床試 驗中，先前已觀察到會增進藥物動力學特性及降低全身性毒性 (40)。於此，我們的結果顯示，憑藉此種靶向藥物傳遞系統 之位置專一性作用，SP94-Lip〇-Dox可藉由避免總白血球計數 (WBC)之降低而進一步降低血液學毒性（圖4(：及6(：)。以非 靶向聚乙二醇化微脂體阿黴素（c〇n_p_Lip〇_D〇x&Lip〇_D〇x ) 進行之實驗所觀察到的總WBC計數之降低，可能是因為循環 時間增加7侷限在血管内以及有較大機會由單核吞噬細胞系統 之細胞進行非專一性攝入所致。一項以聚乙二醇化微脂體阿黴 素治療後期HCC病患之Π期臨床試驗已報導此種白血球減少 症（4卜42)。 先前^關聚乙二醇化微脂體阿黴素H期臨床試驗之部分 研究已顯示，該藥物在後期Hcc中幾乎沒有活性，其反應率充 35 200935055 ^量僅有0至14% (41-43)。因此，本文所述SP94_Up〇_D〇x之 增強治療功效顯示，此種靶向藥物傳遞系統在後期HCC病患治 療具有顯著的臨床潛力。此外，鑑別與8?94產生交互作用之目 標分子可用以驗證其在HCC腫瘤組織上之專一性表現，並證實 其可作為HCC療法之目標。 靶向藥物傳遞系統包含：一種抗癌藥物、一種靶向配位

且可進-步包含顏。由於已魏導指出隨素可在配匸 中提供最為一致的整體反應率（18%)(36)’而微脂體阿黴素 亦已經顯示在頑固性乳癌及卵巢癌中具有顯著活性（37,38)， 因此選擇此種藥物作為該抗癌劑，以及選擇經聚乙二醇包覆之 微脂體（聚乙二醇化微脂體）作為載體。使聚乙二醇化微脂體 阿黴素與SP94偶合（SP94-LiP〇-Dox)，以評估無向藥物傳遞系 統對抗HCC之功效。在人類Hcc異體移植模式中， SP94-LiP〇-D〇X顯示治療功效有增進效果’其係於妓 =LiP〇-D〇X之控制組胜肽（Con_p_Up()_D())〇 / 治療組別而言（圖4及6)。 .在不受任何特定機制限制之下，經c〇n_p_Up〇_D〇x及 Lipo-Dox治療的組別，其腫瘤生長有部分受到抑制情形，可能 因素如下H血管生雜輔脈料、紅相可料藥物 共輛物在腫瘤組織中進行選擇性外渗。此外，由於缺效 淋巴引^，因此’藥物餘物可滯留在義_中。此等因素 可造成藥物純物產生被純向仙並f、積於軸組織中 紅二醇化微脂體阿徽 素會在腫針產生摘性騎定位，且在腫射產生數 物濃度增加’其係相對於以游離__得之藥物濃^而^ (15 39)。 Α·胜肽-微脂«阿擻素之製備及投藥 用以製備胜肽_微脂體阿黴素之流程為已知者⑻。簡言 36 200935055 之’以1:1.5之莫耳濃度比，使胜肽與NHS_pEG_DSpEp^_羥基 琥轴酿胺基-羧基-PEG (Mw，3400)衍化性二硬脂醯磷脂醯乙 醇胺（NOF Corporation ’東京’曰本）]偶合。以該胜肽胺端 之自由胺基完成偶合反應，俾產生胜肽基·pEG_DSPE，並以三 硝基本續酸試劑（Sigma-Aldrich ’聖路易市，密蘇里州，美國） 對剩餘胺基進行定量，確認偶合反應。在高於脂質雙層之轉移 溫度之溫度下一起培育後’將胜肽基_PEG_DSPE轉移至預先形 成的聚乙二醇化微脂體阿黴素。

❹ 將5χ106個Mahlavu細胞皮下注射至SCID小鼠（4_6週齡） 之背側。將帶有腫瘤（1〇〇 mm3)之小鼠隨機分成四組（每組6 隻小鼠），以進行不同處理’ A : SP94-Lipo-Dox ( SP94-LD); B ： Con-P-Lipo-Dox ( CP-LD ) ； C ： Lipo-Dox ( LD ) ； D ： PBS ° f種處理是經由尾靜脈注射而投藥，丨mg/kg，一週兩次，連 續四週，總劑量為8 mg/kg。在另一實驗中，將帶有較大的 Mahlayu.亍生性HCC異體移植物（5〇〇 mm3)之小鼠分成四組 (與前述相同）。各種處理是經由尾靜脈注射而投藥，5 mg/kg 週次，連續二週，總劑量為1〇 mg/kg。以電子秤 及"^測量體重及腫瘤大小。使用方程式計算腫瘤體積：長度 XJ^見度）2 X 〇.52。在實驗結束時，切除各小鼠之腫瘤組織及 臟器’以3%甲經固定，並以〇CT包埋，以作進一步的組織病 理學檢驗。動物照護係根據中央研究院（台灣）之準則進行。 在處理結束時（第28天），Con-P-Lipo-Dox及Lipo-Dox組 之腫瘤大小是SP94-Lipo-Dox組之1.5倍大。控制組PBS組之腫 瘤大小是SP94-Lip〇-Dox組之3.3倍大（p<0.01)(圖4A)。此外， 3^^SP94-LiP〇-D〇x之帶膜瘤小鼠之組別，具有較低的 相較於Con-P-Lipo-Dox及Lip〇-Dox之處理組別而 ί押ΐϋΐ4()%抑制圖4b)。圖表中之誤差條代 表才示準誤差，户值是以學生纟檢驗計算。 37 200935055 1·總WBC計數 自頜下靜脈抽血，並與15% EDTA溶液溫和混合，以避免 凝血。接著加入含有2%乙酸及1%龍膽紫（Sigma-Aldrich，聖 路易市，密蘇里州，美國）之RBC裂解緩衝液，並在室溫下進 行培育。使用血細胞計數器計算總WBC。

為評估由化療藥物之全身性傳遞所造成之副作用，本實例 測定總WBC計數。結果顯示’ SP94-Lipo-Dox處理組的總WBC 計數（1.9xl03/mm3)高於Con-P-Lipo-Dox (1.6xl03/mm3)及 Lipo_Dox( 1.6xl03/mm3)處理組，但低於PBS組（2.6 X l〇3/mm3) (圖4C)。在各處理組中，體重並未顯著改變（圖4D)。圖表 中之誤差條代表標準誤差，而P值係以學生丨檢驗計算。 V.實例5.组織病理檢驗，在胜肽-微鹿髏阿擻素療法中，膣瘤 血管及凋亡細胞之免疫螢光偵測 A· TUNEL 染色 在37°C下’使冷凍的腫瘤組織切片與末端去氧核苷轉移酶 介導的dUTP缺口末端標記（TUNEL)反應混合物（R〇che

Diagnostic，Grenzacherstrasse，Basel，CHE) — 起培育1小時。以 Hoechst 33258 (Molecular Probes，Eugene，奥利岡州，美國） ❹ 在玻片上進行對比染色，接著以封固劑（Vect〇r Lab〇ratories Burlingame，CA，USA)進行封固。接著在螢光顯微鏡下 ’ 玻片進行顯像。 . B.CD31染色 以甲醇-丙酮（1:1)固定冷凍腫瘤組織切片，以PBS、主 再浸泡於阻斷緩衝液中（1〇/0 BSA，溶於PBS中），接^大色 抗小鼠CD31 (BDPharmingen ’聖地牙哥市，加州，美^二 起培育。以PBSTo ! (0.1%Tween-20inPBS)清洗切片、°，接著 38 200935055 與兔抗大鼠抗體（Stressgen，AnnArbor，密西根州，美國）一 起培育’再浸泡於經玫紅標記之山羊抗兔抗體（Jackson

ImmunoResearch，West Grove，賓州，美國）中。以H〇echst 33258 在玻片上進行對比染色，接著以封固劑進行封固，並在螢光顯 微鏡下顯像。 在以H&E染色後’檢驗各處理組的腫瘤組織之組織病理。 在SP94-Lipo-Dox處理之異體移植物之全部切片中，有顯著的 溺改性壞死/凋亡區域’而在Lip0_Dox及Con-P-Lipo-Dox處理之 異體移植物中’則發現有中度的壞死/凋亡區域。PBS處理組顯 ❹ 示正常的HCC細胞（圖5A)。在SP94-Lipo-Dox ( SP94-LD )處 理之異體移植物之全部切片中，有顯著的瀰漫性壞死/凋亡區 域’在Con-P-Lipo-Dox (CP-LD)及Lipo-Dox (LD)異體移 植物中，則顯示中度的壞死/凋亡區域，而PBS組則顯示正常的 HCC細胞（比例尺：上半部，5〇〇 ;下半部，5〇 μιη)。 在切片上進行TUNEL標記，以使凋亡性腫瘤細胞顯像（綠 色）。相較於Con-P-Lipo-Dox及Lipo-Dox組，TUNEL陽性腫瘤 細胞在SP94-Lip〇-Dox處理組中分布較均勻。在pBS處理組 中’則未發現调亡性腫瘤細胞（比例尺，1〇〇 μιη)(圖5 B)。 使用TUNEL以鑑別凋亡性腫瘤細胞，並施用抗_€1)31抗體以偵 ® 測腫瘤血管。取自腫瘤之代表性顯微視野顯示，相較於

Con-P-Lipo-Dox及Lipo-Dox處理組而言，SP94_Lip〇_D〇x處理 .組具有較多的凋亡性腫瘤細胞（圖5 B)及較低密度的血管（圖 5C)。 以抗CD31抗體在該等切片進行染色，俾使腫瘤血管顯像 (紅色）’並以Hoechst33258 (藍色）進行對比染色（比例尺， ) (^®5 C)。在低放大倍率下，對CD31陽性内皮細胞之 區域進行定量（《=6)，亦在低放大倍率下，對€1)31陽性内皮 細胞之區域進行定量（π6)。相較於pBS組，在Up〇_D〇x& C〇n-P-LiP〇-D〇x處理組中，CD31陽性内皮細胞之區域顯著減 39 200935055 少（n=6，P<〇.〇5)。相較於Con_P-LipoDox及Lipo-Dox經， SP94-Lipo-Dox處理組中，CD31陽性内皮細胞之區域又更為減 少（n=6，P0.001)(圖5D)。在PBS處理組中，發現腫瘤血管 密度高’但無凋亡性細胞（圖5B及C)。圖表中之誤差條代表 標準誤差，而户值係以學生ί檢驗計算。 VI·實例6·用以治療大型HCC異艎移植腫痼之胜肽·微脂遁 阿黴素療法 為驗證大型異體移植物是否亦對SP94-Lipo-Dox處理有反 · 應，將帶有大型HCC異體移植物（550 mm3)之小鼠分為四組， 以進行不同之處理：A : SP94-Lipo-Dox (SP94-LD) ; B : ®

Con_P-Lipo-Dox ( CP-LD ) ; C : Lipo-Dox (LD );及D : PBS。 在處理結束時（第14天），Con-P-Lipo-Dox及Lipo-Dox組之腫 瘤大小逐漸增加’是SP94-Lipo-Dox組之1.3及1.2倍大（分別為 P=0.089，P<〇.〇5 )。控制組PBS組之腫瘤大小則是 SP94-Lipo-Dox組之1·9倍大（P<〇.〇5)(圖6A)。此外，相較於 Con-P-Lipo_Dox、Lipo-Dox及PBS組，發現接受SP94-Lip〇-Dox 之帶腫瘤小鼠之組別，其腫瘤重量較低。C〇n-P-Lip〇-Dox、 Lipo-Dox及PBS組之腫瘤重量則分別增加為SP94-Lip〇-D〇x組 之1.3、1.2及2.1倍大（ρ<〇·〇5 )(圖6B)。在第10天亦分析總 〇 WBC計數，顯示SP94-Lipo-Dox處理組之總WBC計數（11.8 X 10 /mm )南於Con-P-Lipo-Dox( 8·8X1 〇3/mm3)及Lipo-Dox ( 8.2 χ 103/mm3)處理組（圖6C)。

以H&E染色檢驗各處理組中腫瘤組織之組織病理。在 SP94-Lip〇-D〇x處理之異體移植物之全部切片中，有顯著的壞 死/凋亡區域’在Lipo-Dox及Con-P-Lipo-Dox處理之異體移植物 中’發現有中度的壞死/凋亡區域，而PBS組則顯示正常的Hcc 細胞（圖6E)。在低放大倍率下，在取自各處理組之腫瘤組織 中，對CD31陽性内皮細胞之區域進行定量（f2=6)。相較於pBS 40 200935055 組，在Lip〇-D〇x及Con-P-Lipo-Dox處理組中，CD31陽性内皮 細胞之區域稍微減少。然而，相較於c〇n_p_Lip〇_D〇x及

Lipo-Dox組，在SP94-Lipo-Dox處理組中，CD31陽性内皮細胞 之區域則顯著減少（η==6，Ρ<〇.〇〇1)(圖6D)。（比例尺：上半 部’500 μιη;下半部，5〇 μιη)。圖表中之誤差條代表標準誤差， 而Ρ值係以學生ί檢驗計算（Student’s itest)。 、 本文所討論的出版品僅係因其在本申請案之申請日前之 揭示内谷而提供。本文中並無任何事物係被視為承認本發明不 符合以較早之發明而優先於此等公開。本文中對於任何出版品 之引用並非承認此等參考文獻為本發明之先前技藝。再者，本 文所提供之公開日期可能與實際之公開日期不同Γ可能必須個 別確認。 X.實例7·比較PC88及PC94之結合 進行FACS分析’以比較PC88及PC94之結合活性。使 Mahlavu 細胞分別與 ΐχΐ〇9、5χΐ〇9、7.5χ1〇9及 ΐχ109 τυ 一起 培育，然候以FACS分析個別噬菌體純系之表面結合活性，步 驟說明於實例2°PC94之Mahlavu細胞結合活性優於pC88(圖 7)。Con-phage代表控制組噬菌體。

XI.實例8·比較PC88及PC94在活If内之艘瘤歸向 在SCID小鼠中，比較PC88及PC94之腫瘤歸向能力。 將PC88、PC94及控制組輔助噬菌體以靜脈内注射至帶有hcc 異體移植物之SCID小鼠，在灌流後回收噬菌體，方法如 3所述。在LB/IPTG/X_Gal盤上，測定從腫瘤、控制組器官（諸 如，腦、心臟及肺）回收之噬菌體的效價。PC94之^ 能力優於PC88 (圖8)。 ^ 口 VII.出版品 41 200935055 1. Thomas, Μ. B., and Zhu, A. X. ( 2005 ) Hepatocellular carcinoma: the need for progress. J C//« Oncol 23, 2892-2899. 2. Farazi, P. A., and DePinho, R. A. (2006) Hepatocellular carcinoma pathogenesis: from genes to environment. Nat Rev Cancer 6, 674-687. 3. Jemal，A” Murray，T.，Ward, E” Samuels，A., Tiwari, R· C” Ghafoor, A·, Feuer, E. J., and Thun, M. J. ( 2005 ) Cancer statistics, 2005. CA Cancer J Clin 55, 10-30.

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ELMNPLLPFIQP HLPSTGNQYLSL ETNWTHRPPLRV EYRMAHLTPSLL YHLQDSETLSLL SPWYMTPSPNTA SVSVGMKPSPRP DPMTWTPSSVMR TPHRLDWSPHLV GSNPWNTWLTTL NPFNQHLHAQHP SESKDPTLWYPA SFRLATPESSRV SNNEPMLRYTGQ

(SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ (SEQ ID NO: ID NO: ID N〇: ID N〇: 工D N〇: ID NO: ID N〇: 工D N〇: ID N〇: 工D N〇: 工D N〇: ID NO： ID NO: ID NO: \Jy \ly Nly \)/ \ly xly N)/ xly N)/ )))02468024680 46811111222223 噬菌體顯現之一致胺基酸序列係以粗體字表示。 ο ο 48 200935055 表2 :由Mahlavu細胞選擇之噬菌體顯現的核苷酸序列 SEQ ID NO: (SEQ ID NO： (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO： (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO： (SEQ ID NO： (SEQ ID NO: 噬菌體純系_經展示核苷酸序列 94 88 84 01 15 86 42 72 47 26 02 62 09 85 12

1) 3) 5) 7) 9) 11) 13) 15) 17) 19) 21) 23) 25) 27) 29)

AGTTTTTCGATTATTCATACGCCTATTCTGCCGCTG

GAGTTGATGAATCCTCTTTTGCCGTTTATTCAGCCG

TCGTTTCGGCTTGCGACTCCTGAGTCTTCGCGTGTT

GAGACTAATTGGACTCATAGGCCTCCGCTGCGGGTG

GAGTATCGTATGGCGCATCTGACTCCGTCTTTGCTG

TATCATCTGCAGGATTCTTAGACTCTGTCTCTGCTT

TCTCCTTGGTATATGACTCCTAGTCCTAATACGGCG

TCTGTTTCTGTGGGTATGAAGCCGAGTCCTAGGCCT

GATCCTATGACTTGGACGCCTAGTAGTGTTATGCGT ACTCCTCATCGTCTGGATTGGTCTCCGCATCTGGTG (SEQ ID NO: GGGTCGAATCCTTGGAATACTTGGCTGACTACGCTT (SEQ ID NO: AATCCGTTTAATCAGCATCTGCATGCTCAGCATCCT (SEQ ID NO: AGTGAGAGTAAGGATCCTACTCTTTGGTATCCTGCG (SEQ ID NO： TCGTTTCGGCTTGCGACTCCTGAGTCTTCGCGTGTT (SEQ ID NO: CTGCCCAGTATAACGCAGCATCGGCTCATTATTCGA (SEQ ID NO: ❹ 【圖式簡單說明】 、本專利或專利申請標案含有至少一張以彩色製成之圖 式。本專利或專利申請公開案（含彩色圖式）之影本將依請求 ' 及繳付必要費用後由智財局提供。 . 圖1 :使用活體外噬菌體顯現法分離HCC細胞專一性噬菌 體。 圖2A_D : PC94對於HCC細胞系及人類HCC生檢檢體之垆 合活性。 圖3A-C : PC94在活體内之腫瘤歸向能力之驗證。 圖4A-D :在HCC異體移植模式中，靶向胜肽sp94之共軛 結合可增強治療功效並降低微脂體阿黴素之血液學毒性。、 49 200935055 圖5A-D :經SP94-Lipo-Dox處理之HCC異體移植物之組織 病理學檢驗。 圖6A-E :以SP94-Lipo-Dox處理帶有大HCC異體移植物之 SCID小鼠。 圖7 :以FACS進行所選嗟菌體純系之結合活性的劑量相關 分析。 圖8 . PC88及94在活體内之腫瘤歸向能力之驗證。

〇 50 200935055 序列表

<110> WU, HAN-CHUNG

LIN, CHIN-TARNG L〇，ALBERT <12Q>對肝細胞癌細胞具專一性之肽及其應用 <130> 09934.0007-00000 <140> <141>

<150> 60/996,488 <151> 2007-11-20 <160> 32 <170> Patentln 3.5版 <210> 1 <211〉 36 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：合成募核苷酸 <400> 1 agtttttcga ttattcatac gcctattctg ccgctg <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之敘述：合成肽 <40〇> 2 200935055

Ser Phe Ser lie lie His Thr Pro lie Leu Pro Leu 1 5 10 <21〇> 3 <211> 36 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之敘述：合成寡核苷酸 <400> 3 gagttgatga atcctctttt gccgtttatt cagccg 36 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213〉人工序列 <22〇> <223>人工序列之敘述：合成肽 <400> 4

Glu Leu Met Asn Pro Leu Leu Pro Phe lie Gin Pro 15 10 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223〉人工序列之敘述：合成寡核苷酸 <400> 5 tcgtttcggc ttgcgactcc tgagtcttcg cgtgtt 36 <210> 6 <211> 12 2 200935055 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：合成肽 <400> 6

His Leu Pro Ser Thr Gly Asn Gin Tyr Leu Ser Leu 15 10

<21〇> 7 <211> 36 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之敘述：合成寡核苷酸 <400> 7 36 gagactaatt ggactcatag gcctccgctg cgggtg <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：合成肽 <400> 8

Glu Thr Asn Trp Thr His Arg Pro Pro Leu Arg Val 15 10 <210> 9 <211> 36 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：合成寡核苷酸 3 200935055 <4〇〇> 9 gagtatcgta tggcgcatct gactccgtct ttgctg 36 <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213>人工序列 <22〇> <223〉人工序列之敘述：合成肽 <4〇〇> 10

Glu Tyr Arg Met Ala His Leu Thr Pro Ser Leu Leu 15 10 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223〉人工序列之敘述：合成寡核苷酸 <4〇0> 11 tatcatctgc aggattctta gactctgtct ctgctt 36 <21〇> 12 <211> 12 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223〉人工序列之敘述：合成肽 <400> 12

Tyr His Leu Gin Asp Ser Glu Thr Leu Ser Leu Leu 15 10 4 200935055 <210> 13 <211> 36 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：合成寡核苷酸 <4〇0> 13 tctccttggt atatgactcc tagtcctaat acggcg 36

<210> 14 <211> 12 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：合成肽 <400> 14

Ser Pro Trp Tyr Met Thr Pro Ser Pro Asn Thr Ala 15 10 <21〇> 15 <211> 36 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：合成寡核苷酸 <400> 15 tctgtttctg tgggtatgaa gccgagtcct aggcct 36 <210> 16 <211> 12 <212> PRT <213〉人工序列 200935055 <220> <223〉人工序列之敘述：合成肽 <400> 16

Ser Val Ser Val Gly Met Lys Pro Ser Pro Arg Pro 15 10 <210> 17 <211〉 36 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：合成募核苷酸 <40〇> 17 gatcctatga cttggacgcc tagtagtgtt atgcgt 36 <210> 18 <211> 12 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：合成肽 <400> 18

Asp Pro Met Thr Trp Thr Pro Ser Ser Val Met Arg 15 10 <21〇> 19 <211> 36 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：合成募核苷酸 <400> 19 6 200935055 36 actcctcatc gtctggattg gtctccgcat ctggtg <21〇> 20 <211> 12 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之敘述：合成肽 <400> 20 " Thr Pro His Arg Leu Asp Trp Ser Pro His Leu Val 15 10 <210> 21 <211> 36 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之敘述：合成寡核苷酸 <400〉 21 gggtcgaatc cttggaatac ttggctgact acgctt 36

<210> 22 <211> 12 <212> PRT <213>人工序列 <22〇> <223>人工序列之敘述：合成肽 <40〇> 22

Gly Ser Asn Pro Trp Asn Thr Trp Leu Thr Thr Leu 15 10 <210> 23 <211> 36 7 200935055 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之敘述：合成寡核苷酸 <4〇〇> 23 aatccgttta atcagcatct gcatgctcag catcct 36 <210> 24 <211> 12 <212> PRT <213〉人工序列 <22〇> <223〉人工序列之敘述：合成肽 <4〇〇> 24

Asn Pro Phe Asn Gin His Leu His Ala Gin His Pro 15 10 <21〇> 25 <211> 36 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之敘述：合成寡核苷酸 <400> 25 agtgagagta aggatcctac tctttggtat cctgcg 36 <210> 26 <211> 12 <212> PRT <213〉人工序列 <22〇> <223>人工序列之敘述：合成肽 8 200935055 <4〇0> 26

Ser Glu Ser Lys Asp Pro Thr Leu Trp Tyr Pro Ala 15 10 <210> 27 <211> 36 <212> DNA <213〉人工序列 <22〇> <223>人工序列之敘述：合成寡核苷酸

<400> 27 tcgtttcggc ttgcgactcc tgagtcttcg cgtgtt 36 <210> 28 <211> 12 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：合成肽 <400> 28

Ser Phe Arg Leu Ala Thr Pro Glu Ser Ser Arg Val 15 10

<210> 29 <211> 36 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223>人工序列之敘述：合成寡核苷酸 <4〇0> 29 ctgcccagta taacgcagca tcggctcatt attcga 36 <210> 30 9 200935055 <211> 12 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之敘述：合成肽 <40〇> 3〇

Ser Asn Asn Glu Pro Met Leu Arg Tyr Thr Gly Gin 15 10 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉人工序列之敘述：合成引子 <400> 31 ccctcatagt tagcgtaacg 20 <210> 32 <211> 12 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223〉人工序列之敘述：合成肽 <400> 32

Phe Pro Trp Phe Pro Leu Pro Ser Pro Tyr Gly Asn 15 10 10

Claims (1)

1. 200935055 七、申請專利範圍： 1. 一種聚核苷酸或其變體，其中該聚核苷酸包含選自SEQ ID NO:卜 SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: n、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、 SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 25 及 SEQ ID NO: 29 之序列。 2. —種多胜肽或其變體，其中該多胜肽包含選自SEQ ID * NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID * NO: 10 > SEQ ID NO: 12 ' SEQ ID NO: 14 ' SEQ ID NO: 16 ' SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 24、 €> SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 28 及 SEQ ID NO: 30 之序列。 3. 如請求項2之多胜肽，其中該多胜肽包含SEQ ID NO: 2 或其變體。 4·如請求項3之多胜肽，其中該多胜肽包含SEqID no: 2。 5. —種融合蛋白，其包含與第二多胜肽融合之第一多胜 肽’其中第一多胜肽包含請求項2之多胜肽。 6. 如請求項2之多胜肽，其中該多胜肽係共輛結合於一或 多種藥物。 7. 如請求項6之多胜肽’其中所述一或多種藥物係選自阿 Θ 黴素（doxorubicin )、長春瑞濱（vinorelbine )、長春新鹼 (vincristine)、太平洋紫杉醇、勒托替康〇ur〇tecan)、寡核苷 酸、毒素、抗-VEGF適體（aptamer)及放射性分子。 — 8. 一種抗體，其可結合請求項2之多胜肽。 * 9. 一種微脂體，其包含至少一種請求項2之多胜肽。 1〇.如請求項9之微脂體，其中該多胜肽包含SEQ ID NO: 2 或其變體。 11.如请求項1〇之微脂體，其中該多胜肽包含SEqID N〇: 2 〇 如請；^項11之微脂體，其中該微脂體進 一步包含至少 一種樂物，該藥物係選自阿黴素、長春瑞濱、長春新鹼、太平 1 200935055 洋紫杉醇、勒托替康、宴^ 性分子。 Λ苷酉文、毋素、抗-VEGF適體及放射 輯’其中該祕係阿徽素。 治療有效量之請求項疾病之醫藥組合物，其包含 治療有效量之微物中治療疾病之醫藥組合物，其包含 肽，^體或;=項=^ 胜肽^巾織麟包含一種多 白PTmi^求項丨6之醫藥組合物，其巾該—或多種華物传選 i==瑞濱、長春新驗、太平洋紫杉醇、3: 券乂苷欠〕毋素、抗_ VEGF適體及放射性分子。 二.如，求項19之醫藥組合物，其中該藥物係阿徵素。 .如，求項16之醫藥組合物，其中該疾病係癌症。 22‘如f求項21之醫藥組合物，其中該癌症係肝癌。 =如，求項22之醫藥組合物，其中該肝癌係肝細胞癌。 .如請求項16之醫藥組合物，其中該哺乳動物係人 25. —種用於在檢體中偵測肝癌之方法，其包含：、。 a) 使該樣本在一條件下與請求項2之多肽接觸， 容許該多肽與肝癌細胞結合；及 條件 b) 使用請求項8之抗體偵測該多胜肽之結合。 26. —種用於在檢體中偵測肝癌之套組，其包含請 多胜肽及請求項8之抗體。 貝2 < 27. —種用於在檢體中偵測肝癌之方法，其包含： a)使該檢體在一條件下與請求項5之融合多肽接觸， 件容許該融合多肽與肝癌細胞結合；及 ^條 200935055 該抗體係對該融合多胜肽之 b)使用抗體偵測該融合蛋白 抗原表位具專一性。 28. -種用於在檢體中_肝癌之 融合多雌及職齡乡職之抗絲之 29. -種辨識分子之方法，該分子可結合 肽，該方法包含： 夕 a)使細胞萃取物在-條件下與請求項2之多肽接觸，該條 件谷卉一包含該多胜肽及該分子之複合物之形成；及b)分 該複合物，以辨識該分子。 ❹ 30.—種聚核苷酸，其可在嚴格條件下雜合至請求項丨之 核苷酸之互補體。 31. —種多胜肽，其係由請求項30之聚核苷酸所編碼。 32. —種用於在對象中偵測癌症之組合物，其包含請求項2 之多胜肽’其中該多胜肽包含一標記。 33. 如請求項32之組合物，其中該標記包含放射性分子。 34. 如請求項32之組合物，其中該對象係人類。