TW200815600A - An enzyme for phosphorizing a medicine - Google Patents

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TW200815600A
TW200815600A TW096128340A TW96128340A TW200815600A TW 200815600 A TW200815600 A TW 200815600A TW 096128340 A TW096128340 A TW 096128340A TW 96128340 A TW96128340 A TW 96128340A TW 200815600 A TW200815600 A TW 200815600A
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Futoshi Nara
Kiyoaki Yonesu
Kazuishi Kubota
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Daiichi Sankyo Co Ltd
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Description

200815600 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明爲有關活體内使藥物磷酸化之酵素。更有關使用 上述酵素之化合物之磷酸化方法、由該酵素而磷酸化之化 合物之篩選方法、及判定被驗者之被驗化合物之磷酸化能 力之方法等。 【先前技術】 醫藥品中，有於投與患者之階段與實際有藥效之化合物 構造相異，投與患者則於活體内被代謝而構造變化，發揮 其藥效者。如此於活體内被代謝前之化合物稱前藥，令前 藥代謝成有藥效之化合物之酵素也有種種已知。 胺基醇衍生物中有於活體内被磷酸化而呈免疫抑制活性 者。例如FTY720(2-胺基-2-[2-(4-辛苯基）乙基]丙烷-1，3-二醇鹽酸鹽）認爲於活體内受神經鞘胺醇激酶1及2而被 磷酸化，變成FTY720-磷酸酯[即（：）2-胺基-2磷醯氧甲基-4-(4-辛苯基）丁醇]，而呈免疫抑制作用（The Journal of Biological Chemistry，（2003)，278，ρ·47408-47415) 〇 他方面，式（I)化合物（式中R1及R2爲氫原子，R3爲Cl-C6烷基或羥甲基，R4爲氫原子、鹵原子或C1_C6烷基， R5爲由氫原子、鹵原子、氰基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧 基、C3-C6環烷基、鹵C1-C6烷基、苯基及苄氧基而成之 群選擇之基1至3個取代之苯基、鹵原子或氫原子、X爲 伸乙烯基（CH = CH基）、氧原子、硫原子或甲胺基，Y爲單 鍵、氧原子、硫原子或羰基，Z爲單鍵或C1-C8伸烷基， 200815600 η爲2或3)也於活體内被磷酸化而變成活性體、呈示免疫 抑制活性（日本國專利公開公報：特開2005-46 1 41號公報） ，但於活體内之磷酸化機制不明。 認爲解明這些化合物之磷酸化機制，對探索活體内被磷 酸化而呈示活性之化合物，解明活性表現之機制，更對藥 劑有感受性之患者之選擇等有效。
Rs RV /+(CH2)nXV-Y-Z-R5 (丨)
HO n X R1、R2 人果糖胺-3-激酶關連蛋白質（人 fructosamine-3_kinase-related protein:以下也稱「人FN3KRP」）具有使核酮糖胺 (ribulosamine)或鞘胺醇半乳糖胺（psych〇samine)等酮糖胺 (ketosamine)之3位予以磷酸化之活性之報告（Diabetes， (2003)，52, ρ·2888-2895)，但於活體内之角色不明。 本發明者爲解明於活體内磷酸化機制而致力硏究結果， 發現Μ爲人FN3KRP或果糖胺·3_激酶（人fructosamine-'3-kmase ’以下也稱「人FN3K」）之蛋白質參與上述式（I)化 合物之磷酸化，終於完成本發明。 【發明內容】 發明_欲邂決之課頴 本發明之一課題爲解明令例如（2R)_2_胺基-2_甲基_4_[5_ (5-本戊醢基）噻吩-2-基]丁 -1-醇等上述式（I)化合物於活體 200815600 内予以磷酸化之酵素。本發明之又一課題爲提供使用令上 述化合物磷酸化之酵素之該化合物之磷酸化方法。本發明 之又一課題爲提供篩選由該酵素來憐酸化之化合物之方法 。本發明之又一課題爲提供判定被驗者之被驗化合物之磷 酸化能力之方法等。 解決課穎之丰跺 本發明者爲解決上述課題、致力檢討結果、發現令（2R)-2-胺基-2-甲基-4-[5-(5-苯戊醯基）噻吩-2-基]丁 -1-醇等上述 式I化合物予以磷酸化之酵素爲稱果糖胺激酶關連蛋白 質（fruct〇samine- 3 -kinase-related protein:以下也稱「 FN3KRP」）及 / 或果糖胺-3-激酶（fruct〇samine-3-kinase、以 下也稱「FN3K」）之蛋白質而完成本發明。 即本發明包括： (1)包括下述工程1)至3)之由人FN3KRP及/或人FN3K而 磷酸化之物質之篩選方法， 1)由以下a)至c)而成之群選擇之多肽與被驗物質接觸之工 程； a) 由序列表之序列編號2之胺基酸編號1至3 09所示胺基 酸序列而成之多肽 b) 序列表之序列編號4之胺基酸編號1至309所示胺基酸 序列而成之多肽 c) 由上述a)或b)選擇之多肽之胺基酸序列中丨或數個胺基 酸欠缺、取代或附加之胺基酸序列而成，且具有（2R)-2-胺 基·2-甲基-4-[5·(5-苯戊醯基）噻吩-2-基]丁 -1-醇之磷酸化 200815600 能力之多肽； 2) 測定被驗物質之磷酸酯之生成量之1程； 3) 比較被驗物質不與由上述a)至c)選擇之多肽接觸時測定 之被驗物質之磷酸酯之量與上述2)測定之磷酸酯之生成量 之工程。
(2)含有下述之工程1)至4)之由人FN3KRP及/或人FN3K 而磷酸化之物質之篩選方法， 1) 令由以下a)至〇而成之群選擇之多肽與被驗物質接觸之 工程； a) 由序列表之序列編號2之胺基酸編號1至309所不胺基 酸序列而成之多肽 b) 由序列表之序列編號4之胺基酸編號1至309所示胺基 酸序列而成之多肽 c) 與上述a)或b)選擇之多肽之胺基酸序列中1或數個胺基 酸欠缺、取代或附加之胺基酸序列而成，且具有（2R)_2_胺 基-2-甲基-4-[5-(5-苯戊醯基）噻吩-2-基]丁 -1-醇之磷酸化 能力之多肽； 2) 測定被驗物質之磷酸酯之生成量之工程； 3) 比較被驗物質不與由上述a)至c)選擇之多肽接觸時測定 之被驗物質之磷酸酯之量與上述2)測定之磷酸酯之生成量 之工程； 4) 令被驗物質與由上述a)至c)選擇之多肽不接觸時測定之 磷酸酯量比較’若上述2)測定之磷酸酯之量多時’判定爲 被驗物質被磷酸化之工程。 200815600 (3)包括下述工程1)至3)之具有免疫抑制活性之物質之篩 選方法， 1) 由以下&)至〇而成之群選擇之多肽與被驗物質接觸之工 程； a) 由序列表之序列編號2之胺基酸編號1至309所示胺基 酸序列而成之多肽 b) 序列表之序列編號4之胺基酸編號1至309所示胺基酸 序列而成之多肽 〇由上述a)或b)選擇之多狀之胺基酸序列中1或數個胺基 酸欠缺、取代或附加之胺基酸序列而成’且具有（2R)-2-胺 基-2-甲基-4-[5-(5-苯戊醯基）噻吩-2-基]丁 -1-醇之磷酸化 能力之多肽； 2) 測定被驗物質之磷酸酯之生成量之工程； 3) 令被驗物質與由上述a)至c)選擇之多肽不接觸時測定之 被驗物質之磷酸酯之量與上述2)測定之磷酸酯之生成量比 較之工程。 (4)包括下述工程1)至4)之具有免疫抑制活性之物質之篩 選方法， 1)由以下之a)至c)而成之群選擇之多肽與被驗物質接觸之 工程； a) 由序列表之序列編號2之胺基酸編號1至3 0 9所示胺基 酸序列而成之多肽 b) 由序列表之序列編號4之胺基酸編號1至3 09所示胺基 酸序列而成之多肽 200815600 C)由上述a)或b)選擇之多肽之胺基酸序列中1或數個胺基 酸欠缺、取代或附加之胺基酸序列而成，且具有（2R)-2-胺 基-2-甲基-4-[ 5-(5-苯戊醯基）噻吩-2-基]丁 -1-醇之磷酸化 能力之多肽； 2) 測定被驗物質之磷酸酯生成量之工程； 3) 令被驗物質與由上述a)至c)選擇之多肽不接觸時測定之 被驗物質之磷酸酯之量與上述2)測定之磷酸酯之生成量比 較之工程， φ 4)令被驗物質與由上述a)至c)選擇之多肽不接觸時測定之 磷酸酯量比較，若上述2)測定之磷酸酯量多時，判定爲被 驗物質具有免疫抑制活性之工程。 (5)由（1)至（4)中任一項記載之篩選方法，其中被驗物質爲 下述式（I)化合物 R3 -(CH2)
γ—z—r5 Ο)
(式中R1及R2爲氫原子，R3爲Cl-C6烷基或羥甲基，R4 爲氫原子、鹵原子或C1-C6烷基，R5爲氫原子、鹵原子、 氰基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C3-C6環烷基、鹵CM-C6烷基、有苯基及苄氧基而成之群選擇之基1至3個取代 之苯基、鹵原子或氫原子、X爲伸乙烯基（CH = CH基）、氧 原子、硫原子或甲胺基，Y爲單鍵、氧原子、硫原子或羰 基，Z爲單鍵或C1-C8伸烷基，η爲2或3)。 -10- 200815600 (6)包括以下工程1)及2)之磷酸酯之製造方法， 1) 令式（I)化合物與由以下a)至c)而成之群選擇之多肽接觸 之工程； a) 由序列表之序列編號2之胺基酸編號1至309所示胺基 酸序列而成之多肽 b) 由序列表之序列編號4之胺基酸編號1至3 0 9所示胺基 酸序列而成之多肽 c) 由上述a)或b)選擇之多肽之胺基酸序列中1或數個胺基 β 酸欠缺、取代或附加之胺基酸序列而成，且具有（2R)-2-胺 基-2-甲基-4-[5-(5-苯戊醯基）噻吩-2-基]丁 -1_醇之磷酸化 能力之多肽； 2) 由1)中反應溶液取得式（I)化合物之磷酸酯之工程。 (7)包括下述之工程1)至3)而判定被驗者之式（I)化合物之 磷酸酯生成能力之方法， 1) 由被驗者採集之檢體萃取全RNA之工程； 2) 測定全RNA中，由下述之a)至〇而成之群選擇之多核 苷酸之表現量之工程； a) 由含有序列表之序列編號1之核苷酸編號6至9 3 5所示 核苷酸序列而成之多核苷酸 b) 由含有序列表之序列編號3之核苷酸編號27至95 6所 示核苷酸序列而成之多核苷酸 〇與上述a)或b)記載之核苷酸序列互補之核苷酸序列而成 之多核苷酸於嚴格條件下雜交，令具有使式（I)化合物於活 體内磷酸化能力之多肽編碼之多核苷酸； -11- 200815600 3)於確認2)測定之多核苷酸之表現量和具有式⑴化合物於 活體内磷酸化能力之檢體中，比較該多核苷酸之表現量， 來檢定被驗者之式（I)化合物之磷酸化能力之工程。 (8) 包括下述工程1)及2)而判定患者生成式（I)化合物之磷 酸酯之能力之方法， 1) 測定被驗者採集之檢體中，由下述之a)至c)而成之群選 擇之多肽之表現量之工程； a) 序列表之序列編號2之胺基酸編號1至309所示胺基酸 序列而成之多肽 b) 序列表之序列編號4之胺基酸編號1至309所示胺基酸 序列而成之多肽 c) 上述a)或b)選擇之多肽之胺基酸序列中1或數個胺基酸 欠缺、取代或附加之胺基酸序列而成，且具有（2义）-2_胺 基-2-甲基-4-[5-(5-苯戊醯基）噻吩-2-基]丁 -1-醇之磷酸化 能力之多肽； 2) 於確認1)測定之多肽之表現量和具有使式（I)化合物於活 體内磷酸化能力之檢體中，比較該多肽之表現量，來檢定 被驗者使式（I)化合物磷酸化能力之工程。 (9) 包括下述之工程1)及2)之判定患者生成式（I)化合物之 磷酸酯之能力之方法， 1)測定被驗者採集之檢體中，由下述之&)至c)而成之群選 擇之多肽之酵素活性之工程； a)序列表之序列編號2之胺基酸編號1至309所示胺基酸 序列而成之多肽、 -12- 200815600 b)序列表之序列編號4之胺基酸編號1至3 09所示胺基酸 序列而成之多肽、 〇由上述a)或b)選擇之多肽之胺基酸序列中1或數個胺基 酸欠缺、取代或附加之胺基酸序列而成，且具有（2R)-2-胺 基-2-甲基-4-[5-(5-苯戊醯基）噻吩-2-基]丁 -1-醇之磷酸化 能力之多肽； 2)於確認1)測定之多肽之酵素活性和具有使式⑴化合物於 活體内憐酸化能力之檢體中，比較該多肽之酵素活性，來 • 檢定被驗者使式（I)化合物磷酸化能力之工程。 (10)包括下述工程1)至3)之判定被驗者生成式（I)化合物之 磷酸酯之能力之方法， 1) 調査被驗者採集之檢體中由以下a)至c)而成之群選擇之 多核苷酸之核苷酸序列之工程； a) 含有由序列表之序列編號1之核苷酸編號1至1 466所示 核苷酸序列而成之多核苷酸、 b) 含有由序列表之序列編號3之核苷酸編號1至1781所 ^ 示核苷酸序列而成之多核苷酸、 c) 與上述a)或b)記載之核苷酸序列互補之核苷酸序列而成 之多核苷酸於嚴格條件下雜交，令具有使式（I)化合物於活 體内磷酸化能力之多肽編碼之多核苷酸； 2) 調査上述多核苷酸中對酵素活性有影響之核苷酸序列有 無變異之工程； 3) 有降低該多核苷酸所編碼之多狀之磷酸化活性之核苷酸 序列之變異之被驗者判定爲式（I)化合物之磷酸化能力低， •13- 200815600 而無降低該多肽之磷酸化活性之核苷酸序列之變異之被驗 者判定爲具有式⑴化合物之磷酸化能力之工程。 (11)包括下述之工程1)至3)而鑑定由以下之a)至C)而成之 群選擇之多核苷酸所編碼之對多肽之磷酸化活性有影響之 核苷酸序列之變異之方法， a) 包括由序列表之序列編號1之核苷酸編號1至1466所示 核苷酸序列而成之多核苷酸、 b) 包括由序列表之序列編號3之核苷酸編號1至178 1所 # 示核苷酸序列而成之多核苷酸、 〇與上述a)或b)記載之核苷酸序列互補之核苷酸序列而成 之多核苷酸於嚴格條件下雜交，令具有使式（I)化合物於活 體内磷酸化能力之多肽編碼之多核苷酸； 1) 調査被驗者採集之檢體中由上述a)至c)而成之群選擇之 * 多核苷酸之核苷酸序列之工程； 2) 調査上述多核苷酸中核苷酸序列之變異之有無之工程； 3) 調査該多核苷酸序列之變異與該多核苷酸所編碼之多肽 • 之磷酸化活性之關連，鑑定對磷酸化活性有影響之多核苷 酸序列之變異之工程。 (12) 檢體爲末梢血之（7)至（1 1)中任一項記載之方法。 (13) 含有由下述1)至5)而成之群選擇之至少1以上之藥物 代謝能力診斷用套組， 1)使由序列表之序列編號1或3記載之核苷酸序列而成之 多核苷酸之一部分至全部專一地增幅之15至30鹼長之連 續寡核苷酸引子； -14- 200815600 2) 由序列表之序列編號1或3記載之核苷酸序列而成之多 核苷酸於嚴格條件下雜交，而用以檢出該多核苷酸之1 5 核苷酸以上之連續多核苷酸探針； 3) 上述1)記載之寡核苷酸引子或上述2)記載之多核苷酸探 針之任一多核苷酸被固定之固相化試料； 4) 於由下述之a)至〇選擇之多肽專一地結合，而用以檢出 該蛋白質之抗體； a) 由序列表之序列編號2之胺基酸編號1至3 0 9所示胺基 _ 酸序列而成之多肽、 b) 由序列表之序列編號4之胺基酸編號1至3 09所示胺基 酸序列而成之多肽、 c) 由上述a)或b)選擇之多肽之胺基酸序列中1或數個胺基 酸欠缺、取代或附加之胺基酸序列而成，且具有（2R)-2-胺 基-2-甲基-4-[5-(5-苯戊醯基）噻吩-2-基]丁 -1-醇之磷酸化 能力之多肽； 5) 於上述4)記載之抗體結合之二次抗體。 ^ 【發明之效果】 依本發明可提供使用人果糖胺-3-激酶關連蛋白質（人 fructosamine-3- kinase-related protein:以下也稱「人 FN3KRP」）及/或人果糖胺-3-激酶（人 fructosamine-3-kinase，以下也稱「人FN3K」）之使該化合物磷酸化之方 法。更依本發明可提供由該酵素篩選可磷酸化之化合物之 方法。更依本發明可提供判定被驗者之被驗化合物之磷酸 化能力之方法等。 -15- 200815600 i.定義 本說明書中，「基因」不只DNA，也包括其mRNA、 cDNA及其cRNA。又本說明書中，「多核苷酸」當作與核 酸同義，也包括DNA、RNA、探針、寡核苷酸、及引子。 本明細中，「多肽」與「蛋白質」不區別使用。又本說明 書中，「RNA劃份」指含有RNA之劃份。又本說明書中 ’ 「細胞」也包括動物個體内之細胞、培養細胞。本說明 書中「全RNA劃份」指含有全RNA之劃份，包括由血液 ® 、各種臓器、各種組織、培養細胞等至RNA之萃取用溶 劑等，依通常方法萃取之全RNA之劃份。本說明書中， 「以嚴格條件雜交」指於市售之雜交溶液 ExpressHyb Hybri dization S olution(克隆科技公司製）中，於 6 8 °C雜 交，或用固定DNA之過濾器於0.7-1.0M氯化鈉存在下於 68°C雜交後，用0.1-2倍濃度之SSC溶液（1倍濃度SSC係 由150mM氯化鈉、15mM檸檬酸鈉而成），於68°C洗淨而 可鑑定之條件或與其同等條件雜交。
® 2. A FN3KRP R X FN3K 本發明所用人果糖胺-3-激酶（人fructosamine-3-kinase:人 FN3K)及人果糖胺-3·激酶關連蛋白質（人fructosamine-3-kinase-related protein:人 FN3KRP)不限於其全長蛋白質， 只要能進行本發明所用化合物之磷酸化反應，也可其一部 分序列而成部分胜肽。又也可人由來細胞取得之天然蛋白 質，也可依PCR法等選植之基因表現該蛋白質地基因重組 之細胞所取得之蛋白質。又這些蛋白質除精製者之外，也 -16 - 200815600 可爲部分精製者。 人FN3K之cDNA之核苷酸序列爲例如序列表之序列編號 1之核苷酸編號1至1466所示。又人FN3K之胺基酸序列 爲例如序列表之序列編號2之胺基酸編號1至309所示。 人FN3K之cDNA之核苷酸序列爲於GenBank以寄存編號 :NM_022 1 5 8 登錄。 又人FN3KRP之cDNA之核苷酸序列爲例如序列表之序 列編號3之核苷酸編號1至1781所示。又人FN3KRP之 Φ 胺基酸序列爲例如序列表之序列編號4之胺基酸編號1至 309所示。人 FN3KRP之 cDNA之核苷酸序列爲於 GenBank以寄存編號：NM，02461 9登錄。 本說明書中，「人FN3K基因」乃指核苷酸序列爲序列表 之序列編號1之核苷酸編號6至93 5而成之基因，或與該 核苷酸序列而成之基因互補之核苷酸序列而成之多核苷酸 於嚴格條件雜交，而具有與人FN3K同一之生物活性之蛋 白質編碼之核苷酸序列而成之基因。 ^ 本說明書中，「人FN3K」乃指胺基酸序列爲序列表之序 列編號2之胺基酸編號1至309所示胺基酸序列而成蛋白 質，或該蛋白質之胺基酸序列中，有1或數個胺基酸欠缺 、取代或附加之胺基酸序列而成，且具有與人FN3K同一 生物活性之蛋白質。 本說明書中，「人FN3KRP基因」乃指核苷酸序列爲序 列表之序列編號3之核苷酸編號27至956而成之基因， 或與該核苷酸序列而成之基因互補之核苷酸序列而成之多 -17- 200815600 核苷酸於嚴格條件雜交，而具有與人FN3KRP同一之生物 活性之蛋白質編碼之核苷酸序列而成之基因。本說明書中 ，「人FN3KRP」乃指胺基酸序列爲序列表之序列編號4 之胺基酸編號1至3 09所示胺基酸序列而成蛋白質，或該 蛋白質之胺基酸序列中，有1或數個胺基酸欠缺、取代或 附加之胺基酸序列而成，且具有與人FN3KRP同一之生物 活性之蛋白質。 人FN3K及人FN3KRP，.並於其部分胜肽附加其他胺基 # 酸序列之融合蛋白質也包括於人FN3K及人FN3KRP，並 包括於其部分胜肽。融合蛋白質可爲組胺酸標幟融合蛋白 質、FLAG融合蛋白質、GFP等之螢光色素融合蛋白質等 ，但不限於這些。 人FN3K及/或人FN3KRP之酵素活性可令人FN3K及/或 人FN3KRP、構成基質之物質以適當緩衝液保溫，而定量 生成物之磷酸化化合物來測定。例如令人FN3K及/或人 FN3KRP與（211)-2-胺基-2-甲基-4-[5-(5-苯戊醯基）噻吩-2_ ® 基]丁 -1-醇保溫，而生成之磷酸酯以HPLC定量來測定酵 素活性。
3.人 FN3K cDNA 及人 FN3KRP cDNA 之取得 (1)人 FN3K cDNA 人FN3K cDNA可用市售品，例如可由GeneCopoeia公司 購入者（型錄No. GC-W 1 3 92)。 又人FN3K cDNA也可用含有人FN3K基因之cDNA庫而 取得如下。 -18- 200815600 依表現人FN3K基因之cDNA庫乃至集落雜交法等公知之 方法，取得完全長cDNA。以此完全長cDNA爲模板，用 PCR法取得人FN3K cDNA。cDNA庫可用例如人骨髓由來之 cDNA庫。市售之人cDNA庫可用例如克隆科技公司之 Creator SMART人 cDNA庫，也可自己自調製cDNA庫。 也可不施行集落雜交，以cDNA庫爲模板直接施行PCR而 取得人FN3K cDNA。 PCR引子只要能增幅人FN3K cDNA即可，可依公知之方 Φ 法選擇適當引子。增幅人FN3K cDNA之PCR用引子可選 擇例如具有以下核苷酸序列之寡核苷酸： 5’-atggagcagctgctgcgcgccgagctgcgc -3’（引子 1:序列表之序 列編號：5)及 5’-etacttgagcagccttcgcatggtgcccaa -3’（引子 2:序列表之序 列編號：6)。
(2)人 FN3KRP cDNA 由表現人FN3KRP之cDNA庫依集落雜交法等公知之方 ® 法，取得完全長cDNA。以此完全長cDNA爲模板，用 PCR法取得人FN3KRPcDNA。cDNA庫可用例如人骨髓由 來之cDNA庫。市售之人cDNA庫可用例如克隆科技公司 之Creator SMART人cDNA庫，也可自己自調製cDNA庫 〇 也可以cDNA庫爲模板直接施行PCR而取得人FN3KRP c D N A 〇 PCR引子只要能增幅人FN3KRP cDNA即可，可依公知 -19- 200815600 之方法選擇適當引子。增幅人FN3KRP cDNA之PCR用引 子可選擇例如具有以下核苷酸序列之寡核苷酸： 5，-ataagaatgcggccgccaccatggaggagctgctgaggcg -3,(弓| 子 3 : 序列表之序列編號：7)及 5’-atagtttagcggccgctcacttgaccagattcctcat -3’（引子 4:序列 表之序列編號：8)。 只要爲本發明所屬技術領域中具有通常知識者，則可由 令人FN3K基因及/或人FN3KRP基因之天然型之核苷酸序 Φ 列之一部分取代爲其他核苷酸或欠缺、附加核苷酸等改變 ，而調製具有與天然型之人FN3K基因及/或人FN3KRP基 因同等生物活性之多核苷酸。具有如此天然型之核苷酸序 列中核苷酸取代、欠缺、或附加之核苷酸序列，呈示與天 然型之人FN3K基因及/或人FN3KRP基因同等之生物活性 之多核苷酸也可用於本發明。核苷酸序列之改變可由例如 限制酵素或由DNA核酸外切酶而欠缺導入、由部位特異 的變異誘發法之變異導入、依使用變異引子之PCR法之核 ® 苷酸序列之改變、合成變異DNA之直接導入等方法來施 行。又可使用與人FN3K基因或人FN3KRP基因互補之核 苷酸序列而成之多核苷酸於嚴格條件雜交，具有與人 FN3K或人FN3KRP同樣之生物活性之多核苷酸。 4.人FN3K及人FN3KRP之表現 (1)人FN3K及人FN3KRP表現載體之構築 人FN3K及/或人FN3KRP爲於試管内合成、或由基因操 作而產生於宿主細胞來生產。具體而言，令人FN3K基因 -20- 200815600 及/或人FN3KRP基因植入表現可能之載體後，於含有轉錄 和翻譯必要之酵素、基質及能量物質之溶液中合成，或使 其他原核生物、或真核生物之宿主細胞形質轉換來表現人 FN3K及/或人FN3KRP而得人FN3K及/或人FN3KRP。 原核細胞之宿主可爲例如大腸桿菌（Escherichi a coli)或 枯草桿菌（B acillus subtilis)等。欲令目的之基因於這些宿 主細胞内形質轉換，可以適合爲宿主之種由來之複製子也 即複製起點，與含有調節序列之質粒載體使宿主細胞形質 Φ 轉換。又載體以具有能給形質轉換細胞附與表現形質（表 現型）之選擇性之序列者較佳。 例如大腸桿菌以K12株、DH5a株等較常用，載體一般 使用 pBR322 或 pUC 系、pcDNA3.1( + )(Invitrogen 公司）等 之質粒，並不限於這些，公知之各種菌株、及載體皆可使 用。 枯草桿菌以例如 207-25株較佳，載體可用 pTUB228 (Ohmura. K.et al · (1 9 8 4) J . B io chem · 9 5、8 7 - 9 3 )等，但不限 ^ 於此。令編碼枯草桿菌之α-澱粉酶之信息胜肽序列之DNA 序列連結，則也可於菌體外之分泌表現。 真核細胞之宿主細胞包括脊椎動物、昆蟲、酵母等細胞 、脊椎動物細胞可爲例如屬於猴細胞之 cos細胞 (Gluzman. Y.(1981)Cell 23，1 75- 1 82，AT C C : C RL - 1 6 5 0 )或 中國倉鼠卵巢細胞（CHO細胞，ATCC:CCL-61)之二氫葉酸 還原酵素欠損株（Url aub · G · and Chasin. L.A.(4980) Pr oc .Natl· A cad. Sci. US A 77，4126-4220)等較常用，但不限 -21- 200815600 於這些。 宿主細胞若以使用HEK293細胞時爲例，則可例如載體 使用 pcDNA3.2-DEST(Invitrogen 公司）。 如上述所得形質轉換體可依常法培養，由於該培養而於 細胞内或細胞外產生目的之多肽。該培養所用培養基可依 採用之宿主細胞而適宜選擇各種之慣用者，例如若爲上述 Η E K 2 9 3細胞，貝IJ可使用方令RP Μ11 6 4 0培養基或D u 1 b e c 〇變 法Yeagle培養基等培養基，視必要而添加牛胎兒血清等 • 血清成分者。 由上述培養，於形質轉換體之細胞内或細胞外產生之重 組蛋白質，可利用該蛋白質之物理性質或化學性質等之各 種公知之分離操作法來分離·精製。該方法具體而言可例 示如以通常之蛋白沈澱劑處理、超濾、分子篩層析（凝膠 過濾）、吸附層析、離子交換層析、親和層析、高速液體 層析（HPLC)等各種液體層析、透析法、這些組合等。又於 供表現之重組蛋白質連結由6殘基而成之組胺酸，則可以 ® 鎳親和柱有效地精製。令上述方法組合則可容易以高產率 、高純度大量製造本發明之多肽。又精製之多肽之分子量 可依質量分析器、SDS-PAGE等通常之方法決定。 人FN3K及/或人FN3KRP之精製時，可以酵素活性爲指 標。 5 ·由磷酸化酶而受磷酸化之化合物 本發明中可作爲人FN3K及/或人FN3KRP之基質使用之 化合物，只要由人FN3K及/或人FN3KRP來磷酸化則無特 -22- 200815600 限，可爲如下式（I)化合物。
呈上式（I)之胺基醇衍生物可依例如國際公開第94/0 8 94 3 號小冊（FTY720)，國際公開第96/06068號小冊（FTY類似 化合物）、國際公開第98/45249號小冊（FTY類似化合物） 、國際公開第03/029 1 84號小冊（ROX-2127: KRP-203類似 化合物）、國際公開第03/029205號小冊（KRP-203)、國際 公開第 02/06268號小冊（噻吩衍生物）、國際公開第 03/05 9 8 80號小冊（吡咯衍生物）、國際公開第05/005 383號 小冊（取代吡咯衍生物）、國際公開第05/06367 1號小冊（苯 環之醚衍生物）等記載之方法製造。 本發明中以呈上式（I)胺基醇衍生物爲醫藥組成物之有 效成分使用時之取代基，適宜取代基如下： R1及R2宜氫原子。 R3宜C1-C6烷基或羥甲基，更宜甲基或羥甲基。 R4宜氫原子、鹵原子或C1-C6烷基，更宜氫原子、氯原 子或甲基，特宜氫原子或氯原子。 R5爲例如氫原子、鹵原子、氰基、C1-C6烷基、C1-C6 烷氧基、C3_C6環烷基、鹵C1-C6烷基、有苯基及苄氧基 而成之群選擇之基1至3個取代之苯基、鹵原子或氫原子 ，宜氫原子、氟原子、氯原子、氰基、甲基、甲氧基、環 -23- 200815600 丙基、三氟甲基、有苯基及苄氧基而成之群選擇之基丨至 3個取代之苯基、氟原子或氫原子，更宜氫原子、甲基、 甲氧基、三氟甲基、有苯基及苄氧基而成之群選擇之基1 至3個取代之苯基、氟原子或氫原子，特宜苯基、4-甲苯 基、4 -甲氧苯基、3 -甲氧基-4-甲苯基、3-三氟甲苯基、3-苄氧苯基、氟原子或氫原子。 X宜伸乙烯基（CH = CH基）、氧原子、硫原子或甲胺基， 更宜伸乙烯基（CH = CH基）或甲胺基。 Y宜單鍵、氧原子、硫原子或羰基，更宜單鍵、氧原子 、或羰基。 Z宜單鍵或C1-C8伸烷基，更宜單鍵、三亞甲基、四亞 甲基或八亞甲基。 η宜2或3，更宜爲2。 本發明中可作爲人FN3K及/或人FN3KRP之基質使用 之化合物中，呈式（I)胺基醇衍生物之適宜化合物爲 2-胺基-2-甲基-4-[1-甲基- 5-(5-苯戊醯基）吡咯-2-基]丁-1·醇、 2-胺基-2-甲基-4-{1-甲基-5-[5-(2-甲苯基）戊醯基]吡咯-2-基}丁 -1-醇、 2-胺基-2-甲基甲基- 5-[5-(3-甲苯基）戊醯基]吡咯-2-基}丁 -1-醇、 2-胺基-2-甲基-4-{1_甲基-5-[5-(4-甲苯基）戊醯基]吡咯-2-基}丁 -1-醇、 、 2-胺基-2-甲基甲基- 5-[5-(2,3-二甲苯基）戊醯基] -24- 200815600 吡咯-2-基}丁 -1-醇、 . 2-胺基-2-甲基-4·{1-甲基- 5-[5-(2,4-二甲苯基）戊醯基] D比略-2 -基} 丁 -1 -醇、 2-胺基-2-甲基-4-{l-甲基- 5-[5-(2,5-二甲苯基）戊醯基] 吡咯-2-基}丁 -1-醇、 2-胺基-2-甲基甲基-5-[5-(3,4_二甲苯基）戊醯基] 吡咯-2-基}丁 -1-醇、 2 -胺基-2 -甲基-4-{l -甲基- 5- [5-(3,5 - _*甲苯基）戊酸基] _ 略-2-基}丁 -1-醇、 ， 2-胺基-2-甲基甲基-5-[5-(3-甲基-4-甲氧苯基）戊 醯基]吡咯-2-基}丁 -1-醇、 2-胺基-2-甲基-4-{l-甲基-5-[5-(3-甲氧基-4-甲苯基）戊 醯基]吡咯-2-基}丁 -1-醇、 2-胺基-2-甲基-4-{l-甲基-5-[5-(4-氰苯基）戊醯基]吡咯· 2-基}丁 -1-醇、 2-胺基-2-甲基-4-{l-甲基-5-[4-(2-甲苯基）丁醯基]吡咯-• 2-基}丁 -1-醇、 2-胺基-2-甲基-4-{l-甲基- 5-[4-(3-甲苯基）丁醯基]吡咯-2-基}丁 -1-醇、 2-胺基-2-甲基-4-{l-甲基-5-[4-(4-甲苯基）丁醯基]吡咯-2-基}丁 -1-醇、 2-胺基-2-甲基甲基-5-[4-(2,3-二甲苯基）丁醯基] 吡咯-2-基}丁 -1-醇、 2-胺基-2-甲基-4-{l-甲基- 5_[4-(2,4-二甲苯基）丁醯基] -25- 200815600 吡咯-2-基}丁 -1-醇、 2-胺基-2-甲基-4-U-甲基- 5-[4-(2,5-二甲苯基）丁醯基] 吡咯-2-基}丁 -1-醇、 2-胺基-2-甲基-4-U-甲基-5-[4-(3,4-二甲苯基）丁醯基] 吡咯_2-基}丁 -1-醇、 2-胺基-2 -甲基甲基- 5-[4-(3,5-二甲苯基）丁醯基] 吡咯-2-基}丁 -1 -醇、 2-胺基-2-甲基甲基- 5-[4-(3-甲基-4-甲氧苯基）丁 _ 醯基]吡咯-2-基}丁 -1-醇、 2-胺基-2·甲基甲基-5-[4-(3-甲氧基-4-甲苯基）丁 醯基]吡咯_2-基}丁-1-醇及 2-胺基-2_甲基_4_ {1-甲基- 5-[4-(4-氰苯基）丁醯基]吡咯-2_基}丁 -1-醇、及 2-胺基-2-[2-(4-辛苯基）乙基]丙-1，3-二醇、 2-胺基-2-[2-(4-庚氧苯基）乙基]丙-1，3-二醇、 2-胺基-2·{2-[4-(5-苯戊醯基）苯基]乙基}丙-1，3-二醇、 2_胺基-2-{2-[4-(5-環己基戊醯基）苯基]乙基}丙-1，3-二 醇、 2·胺基-2-{2-[4-(7-苯基庚醯基）苯基]乙基}丙-1，3-二醇 -26- 200815600 2-胺基-2-(2-{4-[2-(3-氟-4-甲氧苯基）乙氧基]苯基}乙基 )丙-1，3 -二醇、 2-胺基-2 -甲基-4-[4-(4,4,5,5,5-五氟戊氧基）苯基]丁 -1-醇、 2-胺基-2-甲基-4-[4-(3-聯苯基-4-基丙氧基）苯基]丁 -1-醇、 2-胺基-2-甲基-4-[4-(3-聯苯基-4-基丙醯基）苯基]丁 -1-醇、 ® 2-胺基-2-甲基-4-[3-甲氧基_4_ (4-苯基丁氧基）苯基]丁- 1-醇、 2-胺基-2-甲基-4-[4-(5-苯基戊氧基）苯基]丁 -1-醇、 2 -胺基-2-甲基- 4- [ 4-(5-苯戊釀基）苯基]丁 -1-醇、 2-胺基-2-甲基-4-(4-己氧苯基）丁 -1-醇、 2-胺基-2-甲基-4-[4-(3-苯基丙氧基）苯基]丁 -1-醇、 2-胺基-2-甲基-4-[4-(3 _環己基丙氧基）苯基]丁 -1-醇、 2-胺基-2-甲基-4-[4-(5-環己基戊醯基）苯基]丁 -1-醇、 ^ 2-胺基-2-甲基-4-(4-庚氧苯基）丁 -1-醇、 2-胺基-2-[4-(3-苄氧苯氧基）-2-氯苯基]丙基-1，3-丙二醇 2-胺基-2-[4-(3-苄氧苯硫基）-2-氯苯基]丙基-1，3-丙二醇 、 2-胺基-2-甲基-5-[4-(3-苄氧苯氧基）-2-氯苯基]戊-1-醇 、 2-胺基-2-甲基-5-[4_(3_苄氧苯硫基）-2-氯苯基]戊-1-醇 -27 - 200815600 2-胺基-2-甲基-4-[5-(5-苯戊醯基）噻吩-2-基]丁 -1-醇、 2-胺基-2-[4-(3-苄氧苯硫基）-2_氯苯基]丙基-1，3-丙二醇 (ROX-2127)、 2 -胺基-2-[4-(3·节氧苯硫基）-2 -氯苯基]乙基-1，3·丙二醇 (KRP-203)、 2 -胺基-2-甲基- 4- [1-甲基- 5- (5 -苯戊醯基）卩比略-2·基]丁- 1- 醇、 2-胺基-2-甲基-4-{1-甲基-5-[4-(4-甲苯基）丁醯基]吡咯- 2- 基}丁-1-酉学、 2-胺基-2-甲基-4-{3-甲基-5-[4-(3,4-二甲苯基）丁醯基] 噻吩-2-基}丁 -1-醇、 2-胺基-2-甲基-4-{3-甲基-5_ [4-(3,4-二甲氧苯基）丁醯基 ]噻吩-2-基}丁 -1-醇、 2-胺基-2 -甲基-4-{l-甲基- 5-[4-(3,4-二甲苯基）丁醯基] 吡咯-2-基}丁 -1-醇、 2-胺基-2-甲基-4-{3·氯-5-[4-(3,4-二甲苯基）丁醯基]噻 吩-2-基}丁 -1-醇、 2-胺基-2-甲基-4-{1,3-二甲基-5-[4-(3,4-二甲苯基）丁醯 基]吡咯-2-基}丁 -1-醇、 2 -胺基-2-甲基-4-{l -甲基-3-氯- 5- [4-(3,4-二甲氧苯基） 丁醯基]吡咯-2-基}丁-1-醇、 2-胺基-2-甲基-4-{1，3-二甲基-5-[4-(3,4-二甲氧苯基）丁 醯基]吡咯-2-基}丁 -1-醇、 -28- 200815600 2-胺基-2-甲基-3·(4-庚醯苯氧基）丙-1-醇、 2-胺基-2-甲基-5-{1-甲基-5-[4-(4-甲苯基）丁醯基]吡咯-2-基}戊-1-醇、 2-胺基-2-甲基-5-{5-[4-(4-甲苯基）丁醯基]噻吩-2-基} 戊-1-醇、 2-胺基-2-甲基-3-{4-[4-(4-甲苯基）丁醯基]苯基甲氧基} 丙-1-醇、 2-胺基-2-甲基-3-{2-氯-4-[4-(4-甲苯基）丁醯基]苯基甲 # 氧基}丙-1-醇、 2-胺基-2-甲基- 3-{5-[4-(3，4-二甲苯基）丁醯基]噻吩-2- 基甲氧基}丙-1-醇、及 2-胺基-2-[2-(4-辛苯基）乙基]丙-1，3-二醇（卩丁¥72 0)、 更適宜化合物爲 (21〇-2-胺基-2-甲基-4-[1-甲基-5-(5-苯戊醯基）吡咯-2-基]丁 -1-醇、 (2R)-2-胺基-2-甲基-4-{l-甲基- 5-[5-(2-甲苯基）戊醯基] ^ Π比咯-2-基}丁 -1-醇、 (2化）-2-胺基-2-甲基-4-{1-甲基-5-[5-(3-甲苯基）戊醯基] 吡咯-2-基}丁 -1-醇、 (2化）-2-胺基-2-甲基-4-{1-甲基-5-[5-(4-甲苯基）戊醯基] D比咯-2 -基} 丁 -1 -醇、 (2R)-2-胺基-2-甲基-4-{l-甲基- 5-[5-(2,3-二甲苯基）戊 醯基]吡咯-2-基}丁 -1-醇、 (2R)-2-胺基-2-甲基甲基·5-[5-(2,4-二甲苯基）戊 -29- 200815600 醯基]吡咯-2-基}丁 -1-醇、 (2R)-2-胺基-2-甲基-4-{l-甲基- 5-[5-(2,5-二甲苯基）戊 醯基]吡略-2-基}丁 -1-醇、 (2R)-2-胺基-2-甲基-4-{l-甲基- 5-[5-(3,4-二甲苯基）戊 醯基]吡咯-2-基}丁 -1-醇、 (2R)-2-胺基-2-甲基-4· {1·甲基- 5-[5-(3,5-二甲苯基）戊 醯基]吡咯-2-基}丁 -1-醇、 (2R)-2-胺基-2-甲基甲基- 5-[5-(3-甲基-4-甲氧苯 ® 基）戊醯基]吡咯-2-基}丁 -1_醇、 (21〇-2-胺基-2-甲基-4-{1-甲基-5-[5-(3-甲氧基-4-甲苯 基）戊醯基]吡咯-2-基}丁-1-醇、 (2尺）-2-胺基-2-甲基-4-{1-甲基-5-[5-(4-氰苯基）戊醯基] 吡咯-2-基}丁 -1-醇、 (2R)-2-胺基-2-甲基甲基- 5-[4·(2-甲苯基）丁醯基] 吡咯-2-基}丁 -1-’醇、 (2R)-2-胺基-2-甲基-4-{1-甲基-5-[4-(3-甲苯基）丁醯基] _ W _ 略-2-基}丁-1·醇、 (2尺）-2-胺基-2-甲基-4-{1-甲基-5-[4-(4-甲苯基）丁醯基] 吡咯-2-基}丁 -1-醇、 (2R)-2-胺基-2-甲基甲基- 5-[4-(2,3-二甲苯基）丁 醯基]吡咯-2-基}丁-1-醇、 (2R)-2-胺基-2-甲基-4-{l-甲基- 5·[4·(2,4-二甲苯基）丁 醯基]吡咯-2-基}丁-1-醇、 (2R)-2-胺基-2-甲基-4-{1·甲基- 5-[4-(2,5-二甲苯基）丁 -30- 200815600 醯基]吡咯-2-基}丁-1-醇、 (2化）-2-胺基-2-甲基-4-{1-甲基-5-[4-(3,4-二甲苯基）丁 醯基]吡咯-2-基}丁 -1-醇、 (2R)-2-胺基-2-甲基-4-{l-甲基-5-[4-(3,5-二甲苯基）丁 醯基]吡咯-2-基}丁 -1-醇、 (2 R)-2-胺基-2-甲基-4·{1-甲基-5-[4-(3-甲基-4-甲氧苯 基）丁醯基]吡咯-2-基}丁-1-醇、 (2R)-2-胺基-2-甲基-4-{1-甲基-5-[4-(3-甲氧基-4-甲苯 # 基）丁醯基]吡咯-2-基}丁 -1-醇及 (2R)-2-胺基-2-甲基-4-{l-甲基- 5-[4-(4-氰苹基）丁醯基] 吡咯-2-基}丁 -1-醇、及 (2R)-2-胺基-2-[2-(4-辛苯基）乙基]丙-1,3-二醇、 (2R)-2-胺基-2-[2-(4-庚氧苯基）乙基]丙-1，3-二醇、 (2R)-2-胺基-2-{2-[4-(5-苯戊醯基）苯基]乙基}丙-1,3-二 醇、 (2R)-2-胺基-2-{2-[4-(5-環己基戊醯基）苯基]乙基}丙-_ 1，3-二醇、 (2R)-2-胺基-2-{2·[4-(7·苯基庚醯基）苯基]乙基}丙-l，3- 二醇、 (2 R)-2-胺基-2-(2-{4-[2-(4-甲氧苯基）乙氧基]苯基}乙基 )丙-1，3-二醇、 (2R)-2·胺基-2-(2-{4-[2-(4-乙氧苯基）乙氧基]苯基}乙基 )丙-1,3-二醇、 (2R)-2 -胺基-2-(2-{4-[2-(3 -氟-4-甲氧苯基）乙氧基]苯基 -31- 200815600 }乙基）丙-1，3-二醇、 (2R)-2-胺基-2-甲基-4-[4-(4,4,5,5,5-五氟戊氧基）苯基] 丁 -1-醇、 (2R)-2-胺基-2-甲基-4-[4-(3-聯苯基-4-基丙氧基）苯基] 丁 -1-醇、 (2 R)-2-胺基-2-甲基-4-[4-(3-聯苯基-4-基丙醯基）苯基] 丁 -1-醇、 (2R)-2-胺基-2-甲基-4-[3-甲氧基-4-(4-苯基丁氧基）苯基 • ]丁 -1-醇、 (2R)-2-胺基-2-甲基-4-[4-(5-苯基戊氧基）苯基]丁 -1-醇 (2R)-2-胺基-2-甲基-4-[4-(5-苯戊醯基）苯基]丁 -1-醇、 (2R)-2-胺基-2-甲基-4-(4-己氧苯基）丁 -1-醇、 (2R)-2-胺基-2-甲基-4-[4-(3-苯基丙氧基）苯基]丁 -1-醇 (2R)-2-胺基-2-甲基-4-[4-(3-環己基丙氧基）苯基]丁 -1-^ 醇、 (2R)-2-胺基-2-甲基-4-[4-(5-環己基戊醯基）苯基]丁 -1-醇、 (2R)-2-胺基-2-甲基-4-(4-庚氧苯基）丁 -1-醇、 (2R)-2_胺基-2-[4-(3-苄氧苯氧基）-2-氯苯基]丙基-1，3- 丙二醇、 (2R)-2-胺基-2-[4-(3-苄氧苯硫基）-2-氯苯基]丙基-1，3- 丙二醇、 -32- 200815600 (2R)-2-胺基-2-甲基-5-[4-(3-苄氧苯氧基）-2-氯苯基]戊-1-醇、 (2R)-2-胺基-2-甲基- 5_[4-(3-苄氧苯硫基）-2-氯苯基]戊-1-醇、 (2R)-2-胺基-2-甲基-4-[5-(5-苯戊醯基）噻吩-2-基]丁 -1-醇、 (2R)-2-胺基-2-[4-(3-苄氧苯硫基）-2-氯苯基]丙基_1，3-丙二醇（ROX-2127)、 # (211)-2-胺基-2-[4-(3-苄氧苯硫基）-2-氯苯基]乙基-；1，3- 丙二醇（KRP-203)、 (2R)-2-胺基-2-甲基-4-[l-甲基- 5-(5-苯戊醯基）吡咯-2- 基]丁 -1-醇、 (2R)-2-胺基-2-甲基-4-{1-甲基-5-[4-(4-甲苯基）丁醯基] 吡咯-2-基}丁 -1-醇、 (2R)-2-胺基-2-甲基-4-{3-甲基- 5-[4-(3,4-二甲苯基）丁 醯基]噻吩-2-基}丁 -1-醇、 ^ (211)-2-胺基-2-甲基-4-{3-甲基-5-[4-(3,4-二甲氧苯基） 丁醯基]噻吩-2-基}丁 -1-醇、 (2R)-2-胺基-2-甲基-4-{l -甲基- 5-[4·(3,4-二甲苯基）丁 醯基]吡咯-2-基}丁 -1-醇、 (2R)-2-胺基-2 -甲基-4-{3-氯- 5-[4-(3,4-二甲苯基）丁醯 基]噻吩-2-基}丁 -1-醇、 (2R)-2-胺基-2-甲基-4-{1，3-二甲基- 5-[4-(3,4-二甲苯基） 丁醯基]吡咯-2-基}丁 -1-醇、 -33- 200815600 (2R)-2-胺基-2-甲基甲基-3-氯- 5-[4-(3,4-二甲氧苯 基）丁醯基]吡咯-2-基}丁-1-醇、 (2R)-2-胺基-2-甲基-4-{l，3-二甲基- 5-[4-(3,4-二甲氧苯 基）丁醯基]吡咯-2-基}丁-1-醇、 (2 S )-2-胺基-2-甲基-3-(4-庚醯基苯氧基）丙-1-醇、 (2R)-2-胺基-2-甲基- 甲基- 5-[4-(4·甲苯基）丁醯基] 吡咯-2-基}戊-1-醇、 (2R)-2-胺基-2-甲基- 5_{5-[4-(4-甲苯基）丁醯基]噻吩-2- • 基}戊-1-醇、 (2S)-2_胺基-2-甲基-3-{4-[4-(4_甲苯基）丁醯基]苯基甲 氧基}丙-1-醇、 (2S)-2-胺基-2-甲基- 3-{2-氯-4_[4-(4-甲苯基）丁醯基]苯 基甲氧基}丙-1·醇、 (2S)-2-胺基-2-甲基- 3-{5-[4-(3,4-二甲苯基）丁醯基]噻 吩-2-基甲氧基}丙-1-醇、及 (2R)-2-胺基-2-[2-(4-辛苯基）乙基]丙-1，3-二醇（FTY720) 更特適宜化合物爲 (2R)-2-胺基-2-甲基-4-[l-甲基- 5-(5-苯戊醯基）吡咯-2-基]丁 -1-醇、 (21〇-2-胺基-2-甲基-4-{1-甲基-5-[5-(4-甲苯基）戊醯基] 毗咯-2-基}丁 -1-醇、 (2R)-2·胺基-2-甲基-4-{l-甲基- 5-[5-(3,4-二甲苯基）戊 醯基]吡咯-2-基}丁 -1-醇、 -34 - 200815600 (2R)-2-胺基-2-甲基-4-{l-甲基- 5-[5-(3-甲基-4-甲氧苯 基）戊醯基]吡咯-2-基}丁-1-醇、 (211)-2-胺基-2-甲基-4-{1-甲基-5-[5-(3-甲氧基-4-甲苯 基）戊醯基]吡咯-2-基}丁-1-醇、 (2R)-2-胺基-2-甲基-4-{l-甲基- 5-[5·(4-氰苯基）戊醯基] 吡咯-2-基}丁 -1-醇、 (2R)-2-胺基-2-甲基-4-{1-甲基-5-[4-(4_甲苯基）丁醯基] 吡咯-2-基}丁 -1-醇、 ® (2及）-2-胺基-2-甲基-4-{1-甲基-5-[4-(3,4-二甲苯基）丁 醯基]吡咯-2-基}丁-1-醇、 (2R)-2-胺基-2-甲基甲基- 5-[4-(3-甲基-4-甲氧苯 基）丁醯基]吡咯-2-基}丁-1-醇、 (2R)-2-胺基-2-甲基甲基- 5-[4-(3-甲氧基-4·甲苯 基）丁醯基]吡咯-2-基}丁-1-醇、及 (2R)-2-胺基-2-甲基·4-{1-甲基- 5-[4-(4-氰苯基）丁醯基] 啦略-2 -基} 丁 _ 1 -醇、及 ^ (2R)-2-胺基-2-[2-(4-辛苯基）乙基]丙-1，3-二醇、 更宜 (2R)-2-胺基-2-甲基-4-[1-甲基- 5-(5-苯戊醯基）吡咯-2- 基]丁 -1-醇、 (2R)-2-胺基-2-甲基甲基- 5-[4-(4-甲苯基）丁醯基] 吡咯-2-基}丁 -1-醇、 (2R)-2-胺基-2-甲基-4-{1·甲基- 5-[4-(3,4·二甲苯基）丁 醯基]吡咯-2-基}丁 -1-醇、 -35- 200815600 (211)-2-胺基-2-甲基-4-{1-甲基-5-[4-(3-甲基-4-甲氧苯 基）丁醯基]吡咯-2-基}丁-1-醇、 (2R)-2-胺基-2-甲基-4-{1-甲基-5-[4-(3 -甲氧基-4-甲苯 基）丁醯基]吡咯-2-基}丁-1-醇、及 (21〇-2-胺基-2-甲基-4-{1-甲基-5-[4-(4-氰苯基）丁醯基] 吡咯-2-基}丁 -1-醇、及 (2R)-2-胺基-2-[2-(4-辛苯基）乙基]丙·1，3-二醇。 以下列示作爲呈式（I)胺基醇衍生物中適宜化合物之構 造式： 化合物編號 構造式
200815600 化合物編號
15 HO 16 HO 17 18 HO
化合物編號 構造式 Cl、 Me )ί \\
22 HO* 23 24 H0‘ 25 HO 26 HO* 27 HO 28
-37 200815600
化合物編號 構造式
化合物編號 構造式 OMe
νη2 ο
38- 200815600 化合物編號
43 HO 44 HO 45 HO
化合物編號
構造式 50 51 OMe
-39- 200815600 化合物編號 構造式
nh2 化合物編號 64 65 構造式 〇
66 67 68 69 70
-40- 200815600 化合物編號 構造式 化合物編號 構造式
上述R1、R2、R3、R4及r5之定義中，「C1-C6烷基」 可爲例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、2_甲基丙基 、3-甲基丙基、2,2,2_三甲基甲基、戊基或己基，宜甲基 、乙基或丙基，更宜甲基或乙基。 上述R4及R5之定義中「鹵原子」可爲氟原子、氯原子 、溴原子或碘原子，宜氟原子或氯原子。 上述R4及R5之定義中「C1_C6烷氧基」可爲例如甲氧 基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁氧基、2_甲基丙氧基 、3-甲基丙氧基、2,2,2-三甲基甲氧基、戊氧基或己氧基 ，宜甲氧基或乙氧基。 -41- 200815600 上述R5之定義中，「C3-C6環烷基」可爲例如環丙基 、環丁基、環戊基或環己基，宜環丙基或環己基。 上述R5之定義中，「鹵C1-C6烷基」可爲上述C1-C6 院基有鹵原子取代之基，例如氟甲基、二氟甲基、三氟甲 基、氟乙基、二氟乙基、三氟乙基、氟丙基、二氟丙基、 三氟丙基、氟丁基、二氟丁基、三氟丁基、氟戊基、二氟 戊基、二氟戊基、氟己基、二氟己基、三氟己基、五氟乙 基、六氟丙基、九氟丁基、氯甲基、二氯甲基、三氯甲基 、氯乙基、二氯乙基、三氯乙基、氯丙基、二氯丙基、三 氯丙基、氯丁基、二氯丁基、三氯丁基、氯戊基、二氯戊 基、三氯戊基、氯己基、二氯己基、三氯己基、五氯乙基 、六氯丙基、九氯丁基，宜氟甲基、二氟甲基、三氟甲基 、氟乙基、二氟乙基、三氟乙基、氟丙基、二氟丙基或三 氟丙基，更宜三氟甲基或三氟乙基。 上述Z之定義中「C 1-C 8伸烷基」可爲例如亞甲基、伸 乙基、伸丙基、四亞甲基、五亞甲基、六亞甲基、七亞甲 基或八亞甲基，宜碳數2至8之伸烷基，更宜伸乙基、伸 丙基、四亞甲基、七亞甲基或八亞甲基。 上述Z之定義中「有氟原子2至8個取代之C1-C8伸 烷基」可爲例如二氟亞甲基、1，1-二氟伸乙基、1，1，2,2_四 氟伸乙基、1，1-二氟伸丙基、1，1，2,2·四氟伸丙基、1，1-二 氟四亞甲基、1,1，2,2-四氟四亞甲基、1，1-二氟五亞甲基或 1，1，2,2-四氟五亞甲基，宜1，1-二氟伸丙基、1，1，2,2-四氟 伸丙基、1，1·二氟四亞甲基、1，1，2,2-四氟四亞甲基、1，1- -42- 200815600 二氟五亞甲基或1，1，2,2-四氟五亞甲基。 上述中鹽可爲呈上式（I)胺基醇衍生物因具有胺基作爲 鹼性基，故與酸反應所得鹽，例如氫氟酸鹽、鹽酸鹽、氫 溴酸鹽、氫碘酸鹽等氫鹵酸鹽、硝酸鹽、過氯酸鹽、硫酸 鹽、磷酸鹽等無機酸鹽；甲磺酸鹽、三氟甲磺酸鹽、乙磺 酸鹽等低烷磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽等芳磺酸鹽 、乙酸鹽、蘋果酸鹽、富馬酸鹽、丁二酸鹽、檸檬酸鹽、 抗壞血酸鹽、酒石酸鹽、草酸鹽、馬來酸鹽等有機酸鹽； 及甘胺酸鹽、離胺酸鹽、精胺酸鹽、鳥胺酸鹽、麩胺酸鹽 、天冬胺酸鹽等胺基酸鹽、宜鹽酸鹽、乙酸鹽、富馬酸鹽 、丁二酸鹽或馬來酸鹽。 本發明中呈式（I)胺基醇衍生物及其藥理容許鹽於其分 子内有不對稱碳原子時，有光學異性體存在。呈式（I)胺基 醇衍生物中具有不對稱碳原子之化合物以單一式，即以R 體表示’依製造方法等之狀況，可能有S體以副生成物混 合。故此等時呈式（I)胺基醇衍生物作爲光學異性體，主要 以R體含有，但一部分也含有S體之混合物。 呈式（I)胺基醇衍生物及其藥理容許鹽放置於大氣中， 或再結晶而吸收水分，附著吸附水而成爲水合物之狀況， 此等水合物也包括於本發明之呈式（I)胺基醇衍生物之藥理 容許鹽。 6·使用人FN3KRP及/或人FN3K之化合物（I)之磷酸酯之製 造方法 由上述式（I)化合物可用人FN3KRP及/或人FN3K製造下述 -43- 200815600 式（Π)化合物。 〇II Η〇一Ρ-
Y—z—R5 (II)
OH R1 、R2 (式中Rl、R2、R3、R4、R5、χ、γ及z與前述化合物⑴ 相同。以下呈式（II)化合物也稱「化合物（II)」） 令化合物（I)與人FN3KRP及/或人FN3K接觸則可製造 上述化合物之磷酸酯即化合物（II)。 化合物（II)之製造方法具體而言可爲如下方法，但只要 能製造化合物（II)則不限於這些。 (1) 人 FN3KRP 及 / 或人 FN3K. 可用於製造化合物（II)之人FN3KRP及/或人FN3K可用 依上述「4」之項目記載之方法由紅血球取得者，也可用 由表現人FN3KRP及/或人FN3K之細胞取得者。人FN3K 及/或人FN3KRP可用精製者，也可令粗精製者、細胞萃取 液就此使用。也可令表現人FN3KRP及/或人FN3K之細胞 就此使用。 (2) 酵素反應 本發明之製造方法可以種種態樣實施。例如（a)令表現 人FN3K及/或人FN3KRP之細胞與化合物（I)接觸、（b)由 表現人FN3K及/或人FN3KRP之細胞之萃取物與化合物（I) -44- 200815600 接觸、（c)令精製或粗精製人FN3K及/或人FN3KRP與化 合物⑴接觸等方法。 又用人FN3K及人FN3KRP由化合物（I) 製造化合物 (II)時，以作成引起該酵素反應之條件較佳。 酵素反應產物爲可於酵素反應後，測定酵素反應產物即 化合物（II)之生成量來分析。化合物（II)之生成量只要能測 定化合物（II)之生成，則無特限，例如令反應產物供HPLC ，測定化合物（II)之峰來測定。 ® 又酵素反應產物即化合物（Π)可由反應系精製。 7.篩選依人FN3KRP及/或人FN3K而憐酸化之物質之方法 依以下之方法鑑定由人FN3KRP或人FN3K而磷酸化之 物質。本方法包括以下之工程。 1) i)人FN3KRP或人FN3K與被驗物質接觸之工程； Π)測定被驗物質之磷酸酯之生成量之工程； iii)比較被驗物質不與人FN3KRP或人FN3K接觸時測定之 被驗物質之磷酸酯之量，與上述ii)測定之磷酸酯之生成量 之工程。 2) i) 人FN3KRP或人FN3K與被驗物質接觸之工程； ii) 測定被驗物質之磷酸酯之生成量之工程·’ iii) 比較被驗物質不與人FN3KRP或人FN3K接觸時測定之 被驗物質之磷酸酯之量，與上述ii)測定之磷酸酯之生成量 之工程。 -45- 200815600 iv)與被驗物質不與人FN3KRP或人FN3K接觸時測定之磷 酸酯之量相較，若上述Π)測定之磷酸酯之量多時，判定爲 被驗物質被磷酸化之工程。 以下說明各工程： 1) l)-i) 本工程所用人FN3KRP或人FN3K無特限，可令表現人 FN3KRP或人FN3K之細胞就此使用，也可用這些細胞之 ^ 破碎液，由這些細胞粗精製之人FN3KRP或人FN3K、精 製之人FN3KRP或人FN3K。又可用依上述「4.人FN3K及 人FN3KRP之表現」之項記載之方法取得者。 被驗物質可用上述「5 ·由磷酸化酶而受磷酸化之化合物 」之項記載之物質，也可用其他化合物。其他化合物之例 可爲式（I)化合物以外之化合物、微生物之代謝產物、植物 或動物組織之萃取物、這些之衍生物或這些之混合物等。 被驗物質之投與量或濃度可適宜設定，或可例如作成稀釋 I 系列等而設定複數種之投與量，可以個體、液體等適當狀 態投與，溶解於適當緩衝液，也可加安定化劑等。用培養 細胞篩選方法之時，可於培養基添加來培養。於培養基添 加時，也可由培養開始時添加，也可於培養途中添加，又 添加之回數也不限於1回。於被驗物質存在下培養之期間 也可適宜設定，宜3 0分至48小時。於哺乳動物個體投與 被驗物質時，依被驗物質之物性等而分別採用經口投與、 靜脈注射、腹腔内注射、經皮投與、皮下注射等之投與形 -46- 200815600 態。由投與至得檢體之時間可適當選擇。 其他可於反應液視必要而添加pH調整之緩衝液。 混合這些材料而如下施行反應。 溫度條件：〇°C〜45°C，宜37°C 反應液之pH:6〜9，宜7.4 反應時間：3 0秒〜2 4小時，宜3小時 反應可用例如3 84穴分析板來施行。 1)-ϋ) ® 測定被驗物質之磷酸酯之量之方法可爲例如用HPLC分 離定量生成物之方法。這些方法可爲如下方法，但不限於 此方法。 柱：YMC-Pack ODS-A A-312(直徑 6.0mmx長 150mm、粒子 徑5μηι、YMC公司） 移動相：40%乙腈/0.1 %三氟乙酸 流速：lmL/分
溶出方法：同溶劑（i s 〇 c r a t i c)溶出 # 柱溫度:40°C 檢出波長：295 nm l)-iii) 被驗物質不與人FN3KRP或人FN3K接觸時，測定之被 驗物質之磷酸酯之量可仿上述1)-Π)之方法測定。而可比 較接觸人FN3KRP或人FN3K時，與不接觸時之被驗物質 之磷酸酯之生成量。 -47 - 2) 200815600 2)-i)至 iii) 這些工程可仿上述l)-i)至iii)之方法來施行。 2)-iv) 由上述2)-iii)之比較結果，若上述ii)中被驗物質之磷酸酯 之生成量比iii)多時，可判定被驗物質被磷酸化。 8.利用磷酸化能力調査患者之藥物代謝能力之方法 人FN3KRP ·及/或人FN3K具有使式⑴化合物於活體内 磷酸化而變換爲呈式（Π)磷酸酯之機能。 依以下之方法，可調査呈式（I)藥劑之患者中代謝能力 〇 1)以人FN3KRP及/或人FN3K基因之表現量爲指標之方法 包括以下之工程i)至iii): 1) 由被驗者採集之檢體萃取全RNA之工程； ii) 測定全RNA中人FN3KRP及/或人FN3fc基因之表現量 之工程； iii) 於ii)測定之人FN3KRP及/或人FN3K基因之表現量和 具有使式（I)化合物於活體内磷酸化能力皆確認之檢體中， 比較人FN3KRP及/或人FN3K基因之表現量，來檢定被驗 者之式（I)化合物之磷酸化能力之工程。 2) 以人FN3KRP及/或人FN3K蛋白質之表現量爲指標之方 法 包括以下之工程i)至ii): i)令由被驗者採集之檢體中人FN3KRP及/或人FN3K蛋白 質之表現量，使用與該蛋白質專一地結合之抗體或配體來 -48- 200815600 測定之工程； ii)於i)測定之蛋白質之表現量，和具有使式（I)化合物於活 體内磷酸化能力皆確認之檢體中，比較人FN 3 KRP及/或人 FN3K蛋白質之表現量，來檢定被驗者之式⑴化合物之磷 酸化能力之工程。 3) 以人FN3KRP及/或人FN3K蛋白質之酵素活性爲指標之 方法 .i)測定被驗者採集之檢體中人FN3KRP及/或人FN3K蛋白 φ 質之酵素活性之工程； Π)於i)測定之蛋白質之酵素活性，和具有使式（I)化合物於 活體内磷酸化能力皆確認之檢體中，比較人FN3KRP及/或 人FN3K蛋白質之酵素活性，來檢定被驗者之式（I)化合物 之磷酸化能力之工程。 4) 利用基因變異之方法 i)調査由被驗者採集之檢體中人FN3KRP及/或人FN3K基 因内人FN3KRP及/或人FN3K之核苷酸序列之工程； ^ Π)調査i)人FN3KRP及/或人FN3K基因中對酵素活性有影 響之核苷酸序列有無變異之工程； iii)使人FN3KRP及/或人FN3K基因之活性降低之核苷酸 序列有變異之被驗者判定爲式（I)化合物之磷酸化能力低， 使人FN3KRP及/或人FN3K基因之活性降低之核苷酸序列 無變異之被驗者判定爲具有式（I)化合物之磷酸化能力之工 程。 9.診斷用套組 由於人FN3K及/或人FN3KRP爲於活體内被磷酸化而具有 -49- 200815600 活性之化合物之磷酸化能力。故用如下套組，則可調査被 驗者之藥物代謝能力。該套組具體而言爲如下者。 含有由下述1)至5)而成之群選擇之至少1以上之藥物代謝 能力診斷用套組 1) 用以使序列表之序列編號1或3記載之核苷酸序列而成 之多核苷酸之一部分至全部專一地增幅之15至30鹼長之 連續寡核苷酸引子； 2) 用以使序列表之序列編號1或3記載之核苷酸序列而成 φ 之多核苷酸於嚴格條件下雜交來檢出該多核苷酸之1 5 ·核 苷酸以上之連續多核苷酸探針； 3) 上述1)記載之寡核苷酸引子或上述2)記載之多核苷酸探 針之任一多核苷酸被固定之固相化試料； 4) 用以使由下述a)至c)選擇之多肽專一地結合來檢出該蛋 白質之抗體； a)由序列表之序列編號2之胺基酸編號1至3 09所示胺基 酸序列而成之多肽 φ b)由序列表之序列編號4之胺基酸編號1至309所示胺基 酸序列而成之多肽 c)由上述a)或b)選擇之多肽之胺基酸序列中1或數個胺基 酸欠缺、取代或附加之胺基酸序列而成，且具有（2R)-2-胺 基-2-甲基-4-[5-(5-苯戊醯基）噻吩-2-基]丁 -1-醇之磷酸化 能力之多肽； 5) 結合於上述4)記載之抗體之二次抗體。 【實施方式】 實施例 -50- 200815600 以下由實施例說明本發明，但本發明不限於實施例。又 下述實施例中，有關基因操作之各操作若無特示，依「分 子選植（Molecular Cloning)」（Sambrook，J.，Fritsch，E.F·及 Maniatis，T.著，Cold Spring Harbor Lab oratory Press， 1 9 89年），其他實驗書記載之方法，及業者熟知之方法施 行。若用市售之試藥或套組時，依市售品之指示書實施。 (參考例） (2R)-2-胺基-2-甲基-4-[5-(5-苯戊醯基）噻吩-2-基]丁 -1- 醇之取得 以下之實驗所用呈式⑴之（2R)-2-胺基-2-甲基-4-[5-(5_ 苯戊醯基）噻吩-2-基]丁 -1-醇（以下也稱「化合物1」）可依 例如國際公開第94/08943號小冊、國際公開第96/06068 號小冊、國際公開第98/45249號小冊、國際公開第 03/029 1 84號小冊、國際公開第03/029205號小冊、國際 公開第 02/06268號小冊（實施例 19)、國際公開第 03/0598 80號小冊、國際公開第05/0053 83號小冊、國際 公開第05/06 3 67 1號小冊等記載之方法製造。
(I)(2R)-2-胺基- 2-.甲基- 4-[5-(5-苯戊醯基）噻吩基]丁_ 1-醇（化合物1) (實施例1)人全血之調製 -51- 200815600 由隱名之2名供血者各採血約10 OmL末梢血，作爲抗 凝固劑令3.2%(w/v)檸檬酸3鈉2水合物溶液對人末梢血 每lOOmL添加約1 lmL作成人全血，由全血依常法劃分爲 . 紅血球、血漿、血小板、淋巴球之各劃份。 (實施例2)磷酸化活性之確認及磷酸化活性之存在 就實施例1所得各種構成成分測定對化合物1之磷酸化 活性。於反應基質使用化合物1，令反應產物化合物1之 磷酸酯，也即磷酸單（2R)-2-胺基-2-甲基-4-[5-(5-苯戊醯基 Φ )噻吩-2-基]丁酯（化合物1之磷酸酯）之生成量予以定量來 測定磷酸化活性。
νη2 ο 磷酸單（2R)-2-胺基-2-甲基-4-[5-(5-苯戊醯基）噻吩-2-基]丁 酯 準備1.5mL容量聚丙烯管13支，各令實施例1所得全 血、血漿、紅血球、血小板、或淋巴球，以全血、血漿、 紅血球、血小板、淋巴球、紅血球+血漿、血小板+血漿、 淋巴球+血漿、紅血球+血小板+淋巴球+血漿、紅血球+血 小板+淋巴球、紅血球+血小板+血漿、紅血球+淋巴球+血 漿、血小板+淋巴球+血漿之組合分注而冰冷。所有管之分 注量皆爲500 pL、混合2種類以上之構成成分時，各等量 -52- 200815600 混合作成500μί。即2種類混合時爲各25 0μί、3種類混 合時爲各166·7μί、四種類混合時爲各125pL分注，而使 總分注量爲500pL。於各管加100mg/mL化合物1/二甲亞 颯溶液0.5pL來混合（終濃度lOOpg/mL)，以冰冷却而於37 °C之湯浴中保溫30分後，移至冰上。於各管加lmL甲醇 而混合後，於-20°C保存至HPLC測定時。 反應產物即磷酸單（2R)-2-胺基-2-甲基-4-[5-(5-苯戊醯 基）噻吩-2-基]丁酯（化合物1之磷酸酯）之生成量以如下裝 置及條件下測定。 HPLC:LC-10AVP系統（島津製作所公司製） 柱：YMC-Pack ODS-A A-312(直徑 6.0mmx 長 150mm、粒子 徑5μιη、YMC公司） 移動相：40%乙腈/0.1 %三氟乙酸 流速：lmL/分 溶出方法：同溶劑溶出 柱溫度：40°C 檢出波長：295nm 保持時間：6.7分（化合物1之磷酸酯）、11· 1分（化合物1)、 14·2分（1-萘酚，内部標準物質） 於反應終了後之管添加lORg/mL之1-萘酚/甲醇溶液使 終濃度2.5pg/mL後混合，以21，60〇xg、3分、4°C離心。 其上清30μ[載入上述HPLC裝置，測定各保持時間出現 峰之AUC値。令化合物之AUC値以内部標準物質即卜萘 酚之AUC値補正後，於別途作成之檢量線外揷而得化合 -53· 200815600 物之濃度。 測定之結果，如第1圖所示，於反應系有紅血球存在時 化合物1之磷酸酯之生成量多，判明化合物1被磷酸化， 得知全血中之構成成分之内，紅血球爲使化合物1進行磷 酸化之主要存在。 (實施例3)人紅血球中使化合物1進行磷酸化之酵素之存 在 由紅血球依常法劃分爲可溶性劃份與膜劃份。仿實施例 • 2之方法調査化合物1之磷酸化反應，如第2圖所示，確 認於紅血球之可溶性劃份有強力磷酸化活性存在，得知使 化合物1進行磷酸化之酵素主要於紅血球之可溶性劃份存 在。 (實施例4)由人紅血球可溶性劃份精製使化合物1進行磷 酸化之酵素之（1) 依以下之方法，由人紅血球之可溶性劃份精製使化合物 1進行磷酸化之酵素。 ® ⑴酵素活性測定方法 對酵素活性測定用之檢體45pL，添加使終濃度各爲 100pg/mL 化合物 1、ImM ATP、0.5%CHAPS 及 100mM HEPES，pH7.0，總量7 5 μΕ。若添加1 -去氧-1 -嗎啉果糖（1-deoxy_l-morpholinofructose; DMF，細馬公司）時，於反應 液添加使終濃度成ImM。於37°C保溫1小時使化合物1 進行磷酸化後，添加15(^L甲醇，以孔徑〇·45μιη之過濾 器過濾使反應停止及去除蛋白質。1〇 pL濾液於逆相層析柱 -54- 200815600 (TSK-gel ODS-100S，直徑 4.6mmx長 150mm，東曹公司） ，以流速ImL/分、柱溫度4〇°C中由含有0· 1%三氟乙酸之 4 0 %乙腈施行同溶劑溶出。化合物1及化合物1之磷酸 酯之檢出以295nm施行，由峰面積測定化合物1之磷酸酯 之生成量。以上述條件生成bg/mL化合物1之磷酸酯之 活性定義爲1 U / m L。以後之精製過程中，使化合物1進ί了 磷酸化之酵素之活性之測定使用本測定法。 (2)由人紅血球可溶性劃份使化合物1進行磷酸化之酵素之 精製 由隱名之志願者5名各採血lOOmL，共計500mL，由依 常法調製之紅血球可溶性劃份，以化合物1之磷酸化活性 爲指標，以硫酸銨鹽析，疏水性相互作用柱（HiTrap Phenyl HP 5mL，GE保健生命科學公司）、色素結合親和柱 (HiTrap Blue HP ImL、GE保健生命科學公司）、陰離子交 換柱（Resource Q ImL、GE保健生命科學公司）、陽離子交 換柱（Resource S ImL、GE保健生命科學公司）、陽離子交 換柱（Mono S PC 1.6/5、GE保健生命科學公司）、及凝膠過 濾柱（Superdex 75 PC 3.2/30、GE保健生命科學公司）來精 製。其結果，人紅血球可溶性劃份中之化合物1之磷酸化 活性爲如表1所示濃縮至約1 0,000倍。 -55- 200815600 (表1) 精製工程 蛋白質濃度 [Mg/mL〕 活性 [U/mL] 容量 [mL] 總蛋白質量 [mg] 總活性 [U] 比活性 [U/mg] 精製效率 活髓率 [%) 可溶性劃份 83000 3.2 50 4100 160 0.039 1.0 100 1)硫酸銨沈澱 9000 7.3 50 450 367 0.81 21 230 2)疏水性相互作用柱 170 1.7 60 10 100 10 260 63 3)色素結合親和柱 870 5.1 4.0 3.5 20 5.9 150 13 4)陰離子交雛 210 2.1 10 2.1 21 10 260 13 5)陽離子交換柱 87 2.8 4.0 035 11 32 820 6.9 6)陽離子交雛 10 7.1 0.20 0.0020 1.4 710 18000 0.88 7)凝膠過雛 4.0 1.6 0.10 0.00040 0.16 410 10000 0.10 表1人FN3K之精製表
(實施例5)依質量分析鑑定使化合物1進行磷酸化之酵素 (1) 令實施例4所得活性劃份供SDS-PAGE，由凝膠切出 SDS-PAGE凝膠上之各帶，依常法力Π胰蛋白酶（改質胰蛋白 酶，普露美加公司），於37°C消化反應12小時。生成之消 化胜肽供液體層析（LC)/丹得母質量分析裝置（MS/MS)。所 得質量譜數據由資料庫檢索軟體（Mascot，矩陣科學公司） 解析。資料庫使用由國家生技資訊中心編纂之GenBank nr資料庫。 ’ 結果得知令化合物1進行磷酸化之酵素爲人序列 fructosamine-3—kinase(FN3K » GenBank 編號 NP_071441 ) ο (實施例6)由人紅血球可溶性劃份之使化合物1進行磷酸 化之酵素之精製（2) 爲確認人FN3K爲使化合物1進行磷酸化之酵素，使用 -56- 200815600 作爲人 FN3K 之競爭抑制劑熟知之 DMF(Biochem. J.(2000)vol. 352，p.83 5-839)施行抑制實驗。實施例4中第 2精製階段之疏水性相互作用柱之活性劃分被DMF顯著地 抑制，其IC5G値爲約ΙμΜ。由此確認人FN3K爲使化合物 1進行磷酸化之酵素。 另一方面，於可溶性劃份及第1精製階段即使硫酸銨沈 澱再可溶化之樣品殆無觀察到由DMF之抑制，又強力暗 示與人FN3K不同之使化合物1磷酸化之酵素之存在。由 # DMF之抑制程度考量，此與人FN3K不同之酵素推定爲使 化合物1磷酸化之主要酵素。於是施行此酵素之精製。 精製時，常於ImM DMF之存在下或非存在下施行酵素 活性測定，以不被DMF抑制之活性爲指標施行精製。 令實施例4所得硫酸銨沈澱由陰離子交換柱（HiPrep Q 16/10 XL、GE保健生命科學公司）、色素結合親和柱 (HiTrap Blue HP lmL)、陽離子交換柱（Mono S PC 1.6/5) 、凝膠過濾柱（81^6以6\75?〇3.2/30)來劃分。 ® 經以上5階段之精製過程之結果，如表2所示，第2精 製階段以後之酵素活性不被DMF抑制，最終由此精製法 使化合物1進行磷酸化之酵素之比活性上昇約1 6,000倍。 -57- 200815600
表2人FN3KRP之精製表 精製工程 蛋白質濃度 [//g/mL] 活性 [U/mL] 容量 [mL] 總蛋白質量 [mg] 總活性 [U] 比活性 [U/mg] 精製效率 活性產率殘存活性 [%] [%] 可溶性劃份 100000 3.0 50 5200 150 0.029 L0 100 81 1)硫酸銨沈澱 9100 5.0 50 460 250 0.55 19 170 89 2)陰離子交雖 640 5.5 10 6.4 55 8.7 300 36 98 3)色素結合親和柱 310 10 1.0 0.31 10 32 1100 6.6 110 4)陽離子交換柱 5.0 8.5 0.20 0.00010 1.7 1700 58000 1.1 98 5)凝膠過濾柱 3.0 1.4 0.10 0.00030 0.14 450 16000 0.090 未測定
殘存活性：（ImMDMF存在下之酵素活性)+(DMF非存在下之酵素活性)χ100(%) -58- 200815600 (實施例7)由質量分析之使化合物1進行磷酸化之酵素之 鑑定（2) 令精製之活性劃份供SDS-PAGE，所得33kDa附近之帶 予以質量分析，來鑑定此帶之蛋白質。結果，確認所有之 帶皆與人序列假定果糖胺激酶-樣蛋白質（FN3KRP、於 GenBank之蛋白質資料庫以編號Q9HA64登錄）相同。 由人FN3KRP之序列預想之分子量與由35kDa和SDS-PAGE推定分子量（33kDa)及由凝膠過濾推定分子量（24-38kDa)—致。 故得知由本實施例精製之使化合物1進行磷酸化之酵素 爲人 FN3KRP。 (實施例8)人FN3KRP表現載體之構築 令由Invitrogen公司購入之人FN3KRP之cDNA克隆（ 克隆ID:3 3 5 1 60 1 )以限制酵素Xhol及EcoRI處理而取出 cDNA，與以Xhol及EcoRI處理之質粒載體、PcDNA3.1 ( + )neo (Invitrogen公司）結合。結合反應產物之質粒使大 腸桿菌DH5 α形質轉換。大量培養所得形質轉換體，得含 有人 FN3KRP之 cDNA之表現質粒載體、hFN 3 KRP/p c DNA3.1( + )neoo (實施例9)人FN3K表現載體之構築 用 Gateway 技術（Invitrogen 公司），由 GeneCopoeia 公 司購入之人FN3K之cDNA克隆（型錄No. GC-W1 3 92)，於 哺乳類細胞用之表現質粒載體、pcDNA3.2-DEST移換 cDNA。用反應後之DNA溶液使大腸桿菌DH5a形質轉換 •59- 200815600 。所得形質轉換體大量培養，而得含有人FN3K之cDNA 之表現質粒載體、hFN3K/pcDNA3.2-DEST。 (實施例10)人FN3KRP/FN3K表現載體之基因導入及由暫 時性表現細胞之細胞質劃份之調製 爲確認人FN3KRP及人FN3K是否實際具有化合物1之 磷酸化活性，令兩基因之表現載體導入培養細胞而使暫時 性表現，來調製其細胞質劃份。 於75cm2培養燒瓶3支播種HEK293細胞，培養至80% ® 融合。用脂轉染胺plus試藥（Invitrogen公司），每燒瓶予 以質粒 DNA，或以 4gg 之 hFN3KRP/pcDNA3.1( + )neo，或 4pg之hFN3K/pcDNA3.2-DEST來基因導入，培養約27小 時。細胞以 PBS洗淨後，添加 2.5mL之細胞溶解液 (lOOmM HEPES，ρΗ7·4、80%(v/v) CelLytic-M(細馬公司） 、ImM二硫蘇糖醇，每50mL有1個蛋白酶抑制劑混合 物（完全無EDTA，羅氏公司）），於4°C強烈振盪至細胞全 部剝離。回收剝離之細胞及上清，於4°C以20,000xg、超 m — 離心15分。回收上清，小分爲各200μΕ，於液體氮中凍結 ，於-8 0 °C保存至使用時。取一部分上清，測定蛋白質濃 度。 (實施例11)測定細胞質劃份之使化合物1進行磷酸化之活 性
於1 ·5πι1容量聚丙烯管添加各成分使呈如下終濃度， 使總量爲 250μί而靜置於冰上（lOOmM HEPES，pH 7.4、 5mM 氯化鎂、ImM ATP、ImM 二硫蘇糖醇、0 · 5 % C Η AP S -60- 200815600 、lOOpg/mL化合物1、實施例10所得各細胞質劃份：18.2 、54.6、163.8pg相當量或無添加）。於37°C湯浴中保溫3 小時後，移至冰上。各管添加〇.5 mL甲醇而混合後，於 -20°C保存至HPLC測定時。 依實施例2測定化合物1之磷酸酯之生成量之結果，如 第3圖所示，只於使用表現人FN3KRP或人FN3K之細胞 質劃份時，見到化合物1之磷酸酯之生成。由以上之結果 ，得知人FN3KRP及人FN3K實際具有使化合物1磷酸化 • 之活性。 (實施例12)確認對FTY720及神經鞘胺醇之磷酸化能力 神經鞘胺醇激酶1及2爲活體内中使神經鞘胺醇變換爲 神經鞘胺醇-1-磷酸（S1P)之酵素，但令FTY720磷酸化而 生成FTY720磷酸酯爲熟知
-61- 200815600 (J Biol Chem. (2003) vol.278, p.47408-4741 5)(FEBS Lett. (2003) νο1·554，ρ·1 89-1 93)。於是反過來檢討人 FN3Krp 及人FN3K是否使FTY720或神經鞘胺醇進行磷酸化。
準備1.5 mL容量聚丙烯管18支，各添加各成分使呈如 下終濃度，使總量爲250μί而靜置於冰上（loomM HEPES，pH 7.4、5mM 氯化鎂、5mM ATP、ImM 二硫蘇 糖醇、0·5% CHAPS、1 ΟμΜ FTY720或神經鞘胺醇、實施 例1 〇所得各細胞質劃份：9 1 pg相當量）。於3 7 °C湯浴中保 _ 溫3小時後，移至冰上。各管添加〇 · 5 mL甲醇而混合後， 於-20°C保存至LC/MS/MS測定時。 令FTY720磷酸酯或S1P之生成量以如下LC/MS/MS系 統分析。 LC系統： HPLC裝置名：Agilent 1100系統（Agilent科技公司） 自動取樣機名：HTC PAL(CTC Analytics公司） MS/MS系統： 裝置名：ΑΡΊ4000(應用生命系統/MDS Sciex公司） 其結果，得知人FN3KRP及人FN3K之兩者皆僅使FTY720 進行磷酸化，但不具有對神經鞘胺醇之磷酸化能力（第4 圖）。故人FN3KRP及人FN3K爲使化合物1及FTY720磷 酸化之酵素。 (實施例13)由人FN3KRP表現細胞質劃份之化合物1及化 合物1之同類體之磷酸化反應 用實施例10調製用之人FN3KRP表現細胞質劃份施行 -62- 200815600 如下化合物之磷酸化反應。 (211)-2-胺基-2-甲基-4-[5-(5-苯戊醯基）噻吩-2-基]丁-1-醇（化合物1)、 2-胺基-2_[4-(3-苄氧苯硫基）_2_氯苯基]丙基-1，3-丙二醇 (ROX-2127)、 (2R)-2-胺基_2 -甲基-4-[l -甲基- 5-(5-苯戊醯基）吡略-2-基]丁 -1-醇（化合物2)、 (2R)-2-胺基-2-甲基-4-{1-甲基-5-[4-(4-甲苯基）丁醯基] φ 吡咯_2-基}丁-1-醇（化合物3)、 (2R)-2 -胺基-2 -甲基-4-{3 -甲基- 5- [4-(3,4-二甲苯基）丁 醯基]噻吩-2-基}丁-1-醇（化合物4)、 (2R)-2 -胺基-2·甲基-4-{3 -甲基- 5- [4-(3,4-二甲氧苯基） 丁醯基]噻吩-2-基}丁-1-醇（化合物5)、 (2R)-2·胺基-2 -甲基-4-{l -甲基- 5- [4-(3,4-二甲苯基）丁 醯基]吡咯-2-基}丁-1-醇（化合物6)、 (2 R)-2-胺基-2 -甲基-4-{3-氯-5-[4-(3,4-二甲苯基）丁酿 ® 基]噻吩_2_基}丁 -1-醇（化合物7)、 (2R)-2-胺基-2-甲基-4-{l，3-二甲基- 5-[4-(3,4-二甲苯基） 丁醯基]吡咯-2-基}丁-1-醇（化合物8)、 (2R)-2-胺基-2-甲基-4-{l-甲基-3-氯-5-[4-(3,4-二甲氧苯 基）丁醯基]吡咯-2-基}丁-1-醇（化合物9)、 (2R)-2-胺基-2-甲基-4-{l，3-二甲基- 5-[4-(3,4-二甲氧苯 基）丁醯基]吡咯-2-基}丁-1_醇（化合物10)、 2-胺基-2-甲基-3-(4-庚醯基苯氧基）丙-1-醇（化合物11) -63- 200815600 (211)-2-胺基-2-甲基-5-{1-甲基-5-[4-(4-甲苯基）丁醯基] 卩比咯-2-基}戊-1-醇（化合物12)、 (2R)-2-胺基-2-甲基_5-{5-[4-(4-甲苯基）丁醯基]噻吩-2-基}戊-1-醇（化合物13)、 2-胺基-2-甲基- 3-{4-[4-(4-甲苯基）丁醯基]苯基甲氧基} 丙-1-醇（化合物14)、 2-胺基-2-甲基-3-{2-氯-4-[4-(4-甲苯基）丁醯基]苯基甲 氧基}丙-1-醇（化合物15)、 2-胺基-2-甲基-3-{5-[4-(3,4-二甲苯基）丁醯基]噻吩- 2-基甲氧基}丙-1·醇（化合物16) 反應溶液：l〇〇mM HEPES，pH 7.4、5mM 氯化鎂、5mM ATP、ImM 二硫蘇糖醇、0.5% CHAPS、0.328mg/mL 人 FN3KRP表現細胞質劃份 反應容量：1〇〇μΕ 反應基質：1〇〇μΜ 反應條件：37°C、3小時 反應終了後，加甲醇200μΙ^而攪拌、離心（1 6,000xg、10 分、4°C )，上清20μΕ供HPLC而在如下條件分析。 HPLC 裝置：HP 1 100 (Agilent 科技公司） 柱：YMC-pack ODS A-312 柱溫度：4〇°C 流速：1 m L /分 移動相：30%乙腈（〇」％三氟乙酸）— 90%乙腈（〇·1%三氟乙酸） -64 - 200815600 溶出方法：實施梯度溶出。初期乙腈濃度及梯度依化合 物變更。典型方法爲30%乙腈（0.1%三氟乙酸）->90%乙腈 (〇·ι°/。三氟乙酸） 梯度：2%乙腈/分 檢出搜長：295nm或254nm或230nm 各化合物之磷酸化效率爲用如下式所示磷酸酯及未反 應基質之峰面積來算出。 磷酸化效率（％) =磷酸酯之峰面積/(磷酸酯之峰面積+未 反應基質之峰面積）χ100 φ 以上測定之結果確認，人FN3KRP爲使種種化合物磷酸 化之酵素（表3)。 表3由人FN3KRP之磷酸化效率 化合物 磷酸化效率 (%) 化合物1 97.6 ROX-2127 37.5 化合物2 95.6 化合物3 91.5 化合物4 32.6 化合物5 38.3 化合物6 95.2 化合物7 44.7 化合物8 3.3 化合物9 10.6 化合物10 4.8 化合物11 14.9 化合物12 97.5 化合物13 98.6 化合物1 4 34.0 化合物15 18.1 化合物16 29.1
(實施例14)由人FN3K表現細胞質劃份之化合物1及化 合物1之同類體之磷酸化反應 用實施例1 〇調製之人FN3K表現細胞質劃份，以如下 條件施行同實施例1 3化合物1及化合物1之同類體之磷 -65- 200815600 酸化反應。
反應溶液：100mM HEPES，pH 7.4、5mM 氯化鎂、5mM ATP、ImM 二硫蘇糖醇、〇.5%CHAPS、0.3mg/mL 人 FN3K 表現細胞質劃份 反應容量：l〇〇pL 反應基質：1〇〇μΜ 反應條件：37°C，3小時
反應終了後，加甲醇2 0 0 pL來攪拌、離心（1 6，0 0 0 X g、1 0 分、4°C )，上清20μί供HPLC，以如實施例13所示條件 來分析。各同類體之磷酸化效率用實施例1 3所示式來算 出。 其結果，確認人FN3K爲使化合物1及化合物1之同類體 進行磷酸化之酵素（表4)。 表4由人FN3K之磷酸化效率 化合物 磷酸化效率 (%) 化合物1 28.1 ROX-2127 0.0 化合物2 17.9 化合物3 16.4 化合物4 4.7 化合物5 4.9 化合物6 19.3 化合物7 5.4 化合物8 0.0 化合物9 2.2 化合物10 0.0 化合物11 0.0 化合物12 24.8 化合物13 23.3 化合物1 4 0.0 化合物15 0.0 化合物16 3.4 (實施例15)由鼠紅血球之化合物1及化合物1之同類體之 磷酸化反應 -66· 200815600 由Wistar-Imamichi鼠（由財團法人動物繁殖硏究所購入 )仿實施例1調製紅血球，，以如下條件施行同實施例1 3化 合物1及化合物1之同類體之磷酸化反應。 反應溶液：鼠紅血球 反應容量：500pL 反應基質：100pg/mL 反應條件：3 7 °C，3小時 反應終了後，加甲醇1 mL來攪拌、離心（1 6，0 0 0 X g、5分、 4°C )。令上清再離心（1 6,000xg、1〇分、4°C )，又得之上清 • 20μί供HPLC，以實施例13所示條件來分析。各同類體 之磷酸化效率用實施例13所示式來算出。 其結果，得知鼠紅血球使化合物1及其同類體磷酸化（ 表5) 〇 表5由鼠紅血球之磷酸化效率 化合物 磷酸化效率 (%) 化合杨1 96.5 ROX-2127 3 1.7 化合物2 72.0 化合物3 61.4 化合物4 17.5 化合物5 45.9 化合物6 66.2 化合物7 2 5.9 化合物8 3.6 化合物9 13.3 化合物10 7.7 化合物11 44.6 化合物1 2 7 3.4 化合物1 3 8 2.2 化合物14 4 5.4 化合物15 3 1.6 化合物1 6 39.0 由以上實施例1至實施例15之一連實驗，得知人紅血 -67- 200815600 球中有人FN3KRP及人FN3K存在，且這些爲使化合物1 、化合物1之同類體及FTY720磷酸化之酵素。 產業上之利用可能性 由本發明得知，令例如（2R)-2-胺基-2-甲基-4-[5-(5-苯戊 醯基）噻吩-2-基]丁 -1-醇等化合物於活體内磷酸化之酵素、 可提供用該酵素之該化合物之磷酸化方法。更提供由該酵 素而磷酸化之物質之篩選方法。更提供判定被驗者之被驗 化合物之磷酸化能力之方法。又提供以本酵素之磷酸化能 力爲指標來判定被驗者之藥物代謝能力之方法。 φ 【圖式簡單說明】 第1圖由人血液中之各構成成分之化合物1之磷酸化。 第2圖各劃分中反應產物濃度。 第3圖化合物1之磷酸化活性。 第4圖（A)FTY720之磷酸化、（B)神經鞘胺醇之磷酸化。
-68- 200815600 序列表 <110〉三共股份有限公司 <120〉薬物代謝激酶 <130> FP0716 <150> JP2006-213734 <151〉2删-08-04 <160〉 8 <170〉專利第3.4版
<210〉 1 <211> 1466 <212> DNA <213〉人 <220> <221 > CDS <222〉⑹..（935)
<400〉 I 50 actcc atg gag cag ctg ctg cgc gcc gag ctg cgc acc gcg acc Gtg egg
Hat Giu Gin Leu Leu Arg Ala Qlu Leu Arg Thr Ala Thr Leu Arg 1 5 10 15
gcc tta ggc ggc Gcc ggc gcc ggc tgc ate age gag ggc ega gee tac Aia Phe Gly Qly Pro 6ty Ala Gly Cys lie Ser Glu Gly Arg Ala Tyr 20 25 30 gac aeg gac gca ggc cca gtg ttc gtc aaa gtc aac ege agg aeg oag A$p Thr Asp Ala G!y Pro Val Phe Vai Lys Val Asn Arg Arg Thr Gin 35 40 45 98 146 gcc egg cag atg ttt gag ggg gag gtg gee age ctg gag gee etc egg Ala Arg Gin Met Phe Glu Gly G!u Val Ala Ser Leu Glu Ala Leu Arg 50 55 60 age aeg ggc ctg gtg egg gtg ccg agg occ atg aag gtc ate gac ctg Ser Thr Gly Leu Val Arg Val Pro Arg Pro Met Lys Vat lie Asp Leu 65 70 75 ccg gga ggt ggg gee gG〇 ttt gtg atg gag cat ttg aag atg aag age Pro Gly Gly Qly Aia Ala Phe Val Met Glu His Leu Lys Met Lys Ser 194 242 290 -69· 338200815600 80 85 90 95 ttg age agt caa gca tea aaa ett gga gag cag atg gca gat ttg cat Leu Ser Ser Gin Ala Ser Lys Leu Gly G!u Gin Met Ala Asp Leu His 100 105 110 ett tac aac cag aag etc agg gag aag ttg aag gag gag gag aac aca Leu Tyr Asn Gin Lys Leu Arg Glii Lys Leu Lys Glu Glu Glu Asn 了hr 115 120 125 386
gtg ggc ega aga ggt gag ggt get gag cct cag tat gtg gac aag ttc Val Gly Arg Arg Gly Glu Gly Ala Glu Pro Gin Tyr Val Asp Lys Phe 130 135 140 ggo ttc cac aeg gtg aeg tgc tgc ggc ttc ate ccg cag gtg aat gag Gly Phe His Thr Val Thr Cys Cys Gly Phe lie Pro Qfn Vai Asn Qlu 145 150 155 tgg cag gat gac tgg ccg ace ttt ttc gee egg cac egg etc cag geg Trp Gin Asp Asp Trp Pro Thr Phe Phe Ala Arg His Arg Leu Sin Ala 160 165 170 175 cag ctg gac etc att gag aag gac tat gat gac ega gag gca ega gaa Gin Leu Asp Leu lie Glu Lys Asp Tyr Ala Asp Arg Glu Ala Arg Glu 180 185 190 etc tgg tee egg eta cag gtg aag ate oeg gat ctg ttt tgt ggc eta Leu Trp Ser Arg Leu Gin Val Lys Ι1θ Pro Asp Leu Phe Cys Giy Leu 195 200 205 gag att gtc ccc geg ttg etc cac ggg gat etc tgg teg gga aac gtg Glu lie Val Pro Ala Leu Leu His Sly Asp Leu Trp Ser 6ly Asn Val 210 215 220 get gag gac gac gtg ggg ccc att att tac gac ccg get tee ttc tat Ala Glu Asp Asp Val Gly Pro lie He Tyr Asp Pro Ala Ser Phe Tyr 225 230 235 ggc cat tee gag ttt gaa atg gca ate gee ttg atg ttt ggg ggg ttc Qly His Ser Glu Phe Qlu Leu Ala Me Ala Leu Met Phe 6Iy Gly Phe 240 245 250 255 ccc aga tee ttc ttc acc gee tac cac egg aag ate ccc aag get ccg Pro Arg Ser Phe Phe Thr Ala Tyr His Arg Lys He Pro Lys Ala Pro 260 265 270 434 482 530 578 626 674 722 770 818 ggc ttc gac cag egg ctg ctg etc tac cag ctg ttt aac tac ctg aac Gly Phe Asp Gin Arg Leu Leu Leu Tyr Gin Leu Phe Asn Tyr Leu Asn 866 -70- 914 914
200815600 275 280 285 oao tgg aac cac ttc ggg egg gag tac agg age cct tog ttg ggc acc His Trp Asn His Phe 6ty Arg 6lu Tyr Arg Ser Pro Ser Leu 6ly Thr 290 295 300 atg ega agg ctg etc aag tag cggcccctgc cctcccttcc ootgtccccg
Met Arg Arg Leu Leu Lys 305 tccccgtctc cgtctccccg tccctgtccc cccgtcccoc gtccctgtgc GCCGgtCCCt gtccccctgt tcccgtctcc ccgtooctcc gtctccatcc occcgtcccc ccatcctcct gtCGCCgtCC CGCCgtGCCC gtccctccat GGCtgtCCCC GgtCGCGCtg tcoctgtccc cctgtccaca taccaatccc cctgtocccg accocGatcc ccgtccccoa tctccgtccc CgtCCCCCGt gcoccgtccc cgtctccgtt cccccgtccc oatcctccat ccccgtctcc catcgccgtc occcGgtocc cgtcccccgt ccccccgtgc ccocgtcaac gtcccccctg tccctgtccc ccttcccccg acocctccca gatcctgggg accaataaag cccgcagcgg gcctcggctg gGgaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a <210> 2 <211> 309 <212> PRT <213〉人 <400〉 2
Met Giu Gin Leu Leu Arg Ala G!u Leu Arg Thr Ala Thr Leu Arg Ala 15 10 15
Phe Gly Qly Pro Gly Ala 6ly Cys He Ser Glu 81y Arg Ala Tyr Asp 20 25 30
Thr Asp Ala Gly Pro Val Phe Val Lys Val Asn Arg Arg Thr Gin Ala 35 40 45 965 1025 1085 1145 1205 1265 1325 1385 1445 1466 -71- 200815600
Arg Gin Met Phe 6lu G!y 61u Va! Ala Ser Leu Qlu Ala Leu Arg Ser 50 55 60
Thr Giy Leu Vat Arg Val Pro Arg Pro Met Lys Val lie Asp Leu Pro 65 70 75 80
Gly Gly Gly Ala Ala Phe Val Met Glu His Leu Lys Met Lys Ser Leu 85 90 95
Ser Ser Gin Ala Ser Lys Leu Gly Glu Gin Met Ala Asp Leu His Leu 100 105 110
Tyr Asn Gin Lys Leu Arg Glu Lys Leu Lys Glu Glu Glu Asn Thr Val 115 120 125
Gly Arg Arg Gly Glu Gly Ala Glu Pro Gin Tyr Vai Asp Lys Phe Qly 130 135 140
Phe His Thr Val Thr Cys Cys Gly Phe Ile Pro 6ln Val Asn Glu Trp 145 150 155 160
Gin Asp Asp Trp Pro Thr Phe Phe Ala Arg His Arg Leu Gin Ata Gin 165 170 175
Leu Asp Leu lie Glu Lys Asp Tyr Ala Asp Arg Glu Ala Arg Glu Leu 180 185 190
Trp Ser Arg Leu Gin Val Lys Ile Pro Asp Leu Phe Cys Gly Leu Glu 195 200 205
He Vai Pro Ala Leu Leu His 6!y Asp Leu Trp Ser Giy Asn Val Ala 210 215 220
Glu Asp Asp Val Gly Pro He He Tyr Asp Pro Ala Ser Phe Tyr Giy 225 230 235 240 -72- 200815600
His Ser Qlu Phe Giu Leu Ala lie Ala Leu tet Phe Giy Gly Phe Pro 245 250 255
Arg Ser Phe Phe Thr Ala Tyr His Arg Lys lie Pro Lys Ala Pro Gly 260 265 270
Phe Asp 6!n Arg Leu leu Leu Tyr Gin Leu Phe Asn Tyr Leu Asn His 275 280 285
Trp Asn His Phe Gly Arg Glu Tyr Arg Ser Pro Ser Leu Gly Thr Met 290 295 300
Arg Arg Leu Leu Lys 305
<210> 3 <211〉 1781 <212〉 DNA <213〉人 <220> <221> CDS <222> (27).. (956) <400〉 3 53 ggcgggtccg aggccgcggc gggaac atg gag gag ctg ctg agg cgc gag ctg
Met Glu Glu Leu Leu Arg Arg Qlu Leu
ggc tgc age tet gtc agg gcc aeg ggc cac teg ggg ggc ggg tgc ate Gly Gys Ser Ser Val Arg Ala Thr 6ly His Ser Gly Gly Qly Cys lie 10 15 20 25 age cag ggc egg age tac gac aeg gat caa gga ega gtg ttc gtg aaa Ser Gin Qly Arg Ser Tyr Asp Thr Asp 61n Gty Arg Val Phe Val Lys 30 35 40 gtg aac ccc aag geg gag gcc aga aga atg ttt gaa ggt gag atg gca Val Asn Pro Lys Ala Giu Ala Arg Arg Met Fhe Glu Gly Glu Met Ala 45 50 55 agt tta act gcc ate ctg aaa aca aac aeg gtg aaa gtg ccc aag cco 101 149 197 245 -73- 293 200815600
Ser Leu Thr Ala lie Leu Lys Thr Asn Thr Val Lys Val Pro Lys Pro 60 65 70 ate aag gtt ctg gat gcc cca ggc ggc ggg age gtg ctg gtg atg gag lie Ly$ Vaf Leu Asp Ala Pro Gly Gly Q!y Ser Val Leu Val Met 61u 75 80 85 341 389 437 485 533 581 629 677 725 oac atg gac atg agg cat Gtg age agt Gat get gca aag ett gga goo
His Met Asp Met Arg His Leu Ser Ser His Ala Ala Lys Leu Gly Aia 90 95 100 105 cag ctg gcc gat tta cac ett gat aac aag aag ett gga gag atg Ggc
Gin Leu Ala Asp Leu His Leu Asp Asn Lys Lys Leu 6!y Giu Met Arg 110 115 120 ctg aag gag geg ggc aca gtg ggg aga gga ggt ggg cag gag gaa egg
Leu Lys Glu Ala 6ly Thr Val Gly Arg Gly 6Iy Gly Gin Glu Glu Arg 125 130 135
ccc ttt gtg gcc egg ttt gga ttt gac gtg gtg aeg tgc tgt gga tac
Pro Phe Val Ala Arg Phe Gly Phe Asp Val Val Thr Cys Cys Gly Tyr 140 145 150 etc ccc cag gtg aat gac tgg cag gag gac tgg gtc gtg ttc tat gGC Leu Pro Gin Val Asn Asp Trp Gin Glu A印 Trp Val Val Phe Tyr Ala 155 160 165 egg cag ege att cag ccc cag atg gac atg gtg gag aag gag tet ggg
Arg Gin Arg Ile Gin Pro Gin Met Asp Met Val Glu Lys Glu Ser Qly 170 . 175 180 185 gac agg gag gee etc cag ett tgg tet get ctg cag tta aag ate cct
Asp Arg Glu Ala Leu Gin Leu Trp Ser Ala Leu Gin Leu Lys Ile Pro 190 195 200 gac ctg ttc cgt gac ctg gag ate ate cca gcc tta etc cac ggg gac
Asp Leu Phe Arg Asp Leu Glu He Me Pro Aia Leu Leu His Gly Asp 205 210 215 etc tgg ggt gga aac gta gca gag gat tee tet ggg ccg gtg att ttt leu Trp Qiy Gly Αδη Val Ala Glu Asp Ser Ser Gly Pro Val lie Phe 220 225 230 gac cca get tet ttc tac ggc cac teg gaa tat gag ctg gca ata get 773
Asp Pro Ala Ser Phe Tyr Gly His Ser Glu Tyr Glu Leu Ala He Ala 235 240 245 ggc atg ttt ggg ggc ttt age age tee ttt tac too gcc tac cac ggc 821 -74- 869 869
200815600
Giy Met Phe Gly Giy Phe Ser Ser Ser Phe Tyr Ser Ala Tyr His Giy 250 255 260 265 aaa ate ccc aag gcc cca gga ttc gag aag ege ett cag ttg tat cag
Lys lie Pro Lys Ala Pro Giy Phe Glu Lys keg Leu Gin Leu Tyr Gin 270 275 280 etc ttt cac taG ttg aac oac tgg aat cat ttt gga teg ggg tac aga
Leu Phe His Tyr Leu Asn His Trp Asn His Phe Giy Ser Giy Tyr Arg 285 290 295 gga tee tee ctg aac ate atg agg aat ctg gtc aag tga gegggeetta Giy Ser Ser Leu Asn lie Met Arg Asn Leu Val Lys 300 305 ctctggaagg aggcctcaga ggtttctcca cagtcotctt ctgggcaaat tcttgtttct toacatgccg gactagctta agaccaatgc agtagettat ttccaagcct tgcaaagtat ataatateta agaggaaagg ttttgtcatc ccagcgttgt ccactttgtg gggctttgta ggtagacgga gGcacactac aggcagggta tgageagagg gatgtatgga gtgtgggtga ctctgagcct cactgctgct gcaaggtggg gaaactgtaa gtgaacccct gtgggtgcgg g^gagggtat ccggtgcaca gggaggtggc cagcgcacGc gggcactgct gctcataggt acctttcagc tgcctcGtcc ctgctctcct gtgcaggaat gtctctgagc tgttcacgtt gatgettett ggttggcaag acttgggtgt agatatgaaa ccatcttact aaaagcgtct taaaatfacc aattccagaa tcaagcgtat tccgttttct tcctgcatga tcctgggccc tcccgcaggc tgagcaagtc tgtaaactga ttctgggaga aaccaagctg ctggccgtag ggtgtocttg ggtacatcca ggagtattca ttgcttctgt tattaccccg tctcctctgc cattttctac agettgotga gttgtaattc ctttgcaaca ttaaaataca tgGtgaactc atatttttcc ttccttcact gttgtagtaa agagacatat ttcatgaatg gcattgatgc taataaatco tttgcacaaa aaadaaaaaa aaaaa <210> 4 <211〉 309 <212> PRT <213〉人 917 966 1026 1086 1146 1206 1266 1326 1386 1446 1506 1566 1626 1686 1746 1781 75- 200815600 <400〉 4
Met Glu Glu Leu Leu Arg Arg Glu Leu G!y Cys Ser Ser Val Arg Ala 1 5 10 15
Thr Gly His Ser Giy Gly Gly Cys lie Ser Qln Gly Arg Ser Tyr Asp 20 25 30
Thr Asp Gin Giy Arg Vai Phe Va! Lys Val Asn Pro Lys Ala Glu Ala 35 40 45
Arg Arg Met Phe 6lu Sly Glu Met Ala Ser Leu Thr Ala lie Leu Lys 50 55 60
Thr Asn Thr Val Lys Val Pro Lys Pro lie Lys Val Leu Asp Ala Pro 65 70 75 80
Giy Qly Gly Ser Val Leu Val Met Glu His Met Asp Met Arg His Leu 85 90 95
Ser Ser His Ala Ala Lys Leu Qly Ala Qln Leu Ala Asp Leu His Leu 100 105 110
Asp Asn Lys Lys Leu 61y Glu Met Arg Leu Lys Glu Ala Gly Thr Val 115 120 125
Gly Arg Gly Gly Gly Gin Glu Glu Arg Pro Phe Val Ala Arg Phe Gly 130 135 140
Phe Asp Val Val Thr Cys Cys Gly Tyr Leu Pro Gin Val Asn Asp Trp 145 150 155 160
Gin Glu Asp Trp Val Val Phe Tyr Ala Arg Gin Arg lie Qln Pro Qln 165 170 175
Met Asp Met Val Glu Lys Glu Ser Gly Asp Arg Qiu Ala Leu Qln Leu -76- 200815600 180 185 190
Trp Ser Ala Leu Gin Leu Lys He Pro Asp Leu Phe Arg Asp Leu Glu 195 200 205
He l ie Pro Aia Leu Leu His Gly Asp Leu Trp G!y Gly Asn Val Ala 210 215 220
Glu Asp Ser Ser Gly Pro Val lie Phe Asp Pro Ala Ser Phe Tyr Gly 225 230 235 240
His Ser 6lu Tyr Glu Leu Ala tie Ala Gly Met Phe Gly Gly Phe Ser 245 250 255
Ser Ser Phe Tyr Ser Ala Tyr His.Gly Lys He Pro Lys Ala Pro Giy 260 265 270
Phe Glu Lys Arg Leu 6ln Leu Tyr Gin Leu Phe His Tyr Leu Asn His 275 280 285
Trp Asn His Phe Gly Ser Gly Tyr Arg Gly Ser Ser Leu Asn lie Met 290 295 300
Arg Asn Leu Val Lys 305
<210〉 5 <211〉 30 <212> DMA <213〉人 <400> 5 30 atggagcagc tgctgcgcgc cgagctgcgo <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213〉人 77- 200815600 <400> 6 ctacttgagc agccttcgca tggtgcccaa
<210〉 7 <211〉 40 <212〉 DNA <213〉 人工序列 <220〉 <223〉 PCR引子用以增幅FN3KRP cDNA <400〉 7 ataagaatgc ggccgccacc atggaggagc tgctgaggcg <210〉 8 <211〉 37 <212> DNA <213〉 人工序列 <220> <223〉 PCR引子用以增幅FN3KRP cDNA <400〉 8 atagtttagc ggccgctcac ttgaccagat tcotcat

Claims (1)

  1. 200815600 十、申請專利範圍： 1. 一種包括下述工程1)至3)之由人FN3KRP及/或人FN3K •而磷酸化之物質之篩選方法， 1) 由以下a)至c)而成之群選擇之多肽與被驗物質接觸之 工程： a) 由序列表之序列編號2之胺基酸編號1至309所示胺 基酸序列而成之多肽、 。 b) 序列表之序列編號4之胺基酸編號1至309所示胺基 # 酸序列而成之多肽、 c) 由上述a)或b)選擇之多肽之胺基酸序列中1或數個胺 基酸欠缺、取代或附加之胺基酸序列而成’且具有 (2R)-2-胺基-2-甲基-4-[5-(5-苯戊醯基）噻吩-2-基]丁 -1-醇之磷酸化能力之多肽； 2) 測定被驗物質之磷酸酯之生成量之工程； 3) 比較被驗物質不與由上述a)至c)選擇之多肽接觸時測 定之被驗物質之磷酸酯之量與上述2)測定之磷酸酯之 • 生成量之工程。 2. —種含有下述之工程1)至4)之由人FN3KRP及/或人 FN3K而磷酸化之物質之篩選方法， 1)令由以下a)至c)而成之群選擇之多肽與被驗物質接觸 之工程： a) 由序列表之序列編號2之胺基酸編號1至309所示 胺基酸序列而成之多肽、 b) 由序列表之序列編號4之胺基酸編號1至309所示 -79 - 200815600 胺基酸序列而成之多肽、 c)與上述a)或b)選擇之多肽之胺基酸序列中1或數個 胺基酸欠缺、取代或附加之胺基酸序列而成’且具 有（2R)-2-胺基-2 -甲基-4-[5-(5-苯戊醯基）噻吩-2-基] 丁-1·醇之磷酸化能力之多肽； 2) 測定被驗物質之磷酸酯之生成量之工程； 3) 比較被驗物質不與由上述a)至c)選擇之多肽接觸時測 定之被驗物質之磷酸酯之量與上述2)測定之磷酸酯之 • 生成量之工程； 4) 令被驗物質與由上述a)至c)選擇之多肽不接觸時測定 之磷酸酯量比較，若上述2)測定之磷酸酯之量多時’ 判定爲被驗物質被磷酸化之工程。 3.—種包括下述工程1)至3)之具有免疫抑制活性之物質之 篩選方法， , 1)由以下a)至c)而成之群選擇之多肽與被驗物質接觸之 工程： ® a)由序列表之序列編號2之胺基酸編號1至309所示 胺基酸序列而成之多肽、 b) 序列表之序列編號4之胺基酸編號1至309所示胺 基酸序列而成之多肽、 ' c) 由上述a)或b)選擇之多肽之胺基酸序列中1或數個 胺基酸欠缺、取代或附加之胺基酸序列而成，且具 有（2R)-2-胺基-2-甲基-4-[5-(5-苯戊醯基）噻吩-2-基] 丁-1-醇之磷酸化能力之多肽； -80- 200815600 2) 測定被驗物質之磷酸酯之生成量之工程； 3) 令被驗物質與由上述a)至〇選擇之多肽不接觸時測定 之被驗物質之磷酸酯之量與上述2)測定之磷酸酯之生 成量比較之工程。 4.一種包括下述工程1)至4)之具有免疫抑制活性之物質之 篩選方法， 1)由以下之a)至c)而成之群選擇之多肽與被驗物質接觸 之工程： φ a)由序列表之序列編號2之胺基酸編號1至309所示 胺基酸序列而成之多肽、 b) 由序列表之序列編號4之胺基酸編號1至309所示 胺基酸序列而成之多肽、 c) 由上述a)或b)選擇之多肽之胺基酸序列中1或數個 胺基酸欠缺、取代或附加之胺基酸序列而成，且具 有（2R)-2-胺基-2-甲基-4-[5-(5-苯戊醯基）噻吩.-2-基] 丁 -1-醇之磷酸化能力之多肽； # 2)測定被驗物質之磷酸酯生成量之工程； 3) 令被驗物質與由上述a)至c)選擇之多肽不接觸時測定 之被驗物質之磷酸酯之量與上述2)測定之磷酸酯之生 成量比較之工程； 4) 令被驗物質與由上述a)至c)選擇之多肽不接觸時測定 之磷酸酯量比較，若上述2)測定之磷酸酯量多時，判 定爲被驗物質具有免疫抑制活性之工程。 5.如申請專利範圍第1至4項中任一項記載之篩選方法， …81- (I) 200815600 其中被驗物質爲如下式（I)化合物
    (式中R1及R2爲氫原子，R3爲CM-C6烷基或羥甲基，R4 爲氫原子、鹵原子或C1-C6烷基，R5爲氫原子、鹵原子 、氰基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C3-C6環烷基、鹵 C1-C6烷基、有苯基及苄氧基而成之群選擇之基1至3
    個取代之苯基、鹵原子或氫原子、X爲伸乙烯基（CH = CH 基）、氧原子、硫原子或甲胺基，Y爲單鍵、氧原子、硫 原子或羰基，Z爲單鍵或C1-C8伸烷基，η爲/ 2或3)、 6.—種包括以下工程1)及2)之磷酸酯之製造方法、 1) 令式（I)化合物與由以下a)至c)而成之群選擇之多肽接 觸之工程： a) 由序列表之序列編號2之胺基酸編號1至309所示 胺基酸序列而成之多肽、 b) 由序列表之序列編號4之胺基酸編號1至309所示 胺基酸序列而成之多肽、 c) 由上述a)或b)選擇之多肽之胺基酸序列中1或數個 胺基酸欠缺、取代或附加之胺基酸序列而成，且具 有（2R)-2·胺基-2-甲基-4-[5-(5-苯戊醯基）噻吩-2-基] 丁 -1 -醇之磷酸化能力之多肽； 2) 由1)中反應溶液取得式（I)化合物之磷酸酯之工程。 7·—種包括下述工程1)至3)而判定被驗者之式（I)化合物之 -82- 200815600 .磷酸酯生成能力之方法， 1) 由被驗者採集之檢體萃取全RN A之工程； 2) 測定全RNA中，由下述之a)至c)而成之群選擇之多核 苷酸之表現量之工程： a) 由含有序列表之序列編號1之核苷酸編號6至935 所示核苷酸序列而成之多核苷酸、 b) 由含有序列表之序列編號3之核苷酸編號27至95 6 所示核苷酸序列而成之多核苷酸、 φ c)與上述a)或b)記載之核苷酸序列互補之核苷酸序列 而成之多核苷酸於嚴格條件下雜交，令具有使式⑴ 化合物於活體内磷酸化能力之多肽編碼之多核苷酸 j 3) 於確認2)測定之多核苷酸之表現量和具有式（I)化合物 於活體内磷酸化能力之檢體中，比較該多核苷酸之表 現量，來檢定被驗者之式（I)化合物之磷酸化能力之工 程。 • 8.—種包括下述工程1)及2)而判定患者生成式⑴化合物之 磷酸酯之能力之方法， 1)測定被驗者採集之檢體中，由下述之a)至c)而成之群 選擇之多肽之表現量之工程： a) 序列表之序列編號2之胺基酸編號1至309所示胺 基酸序列而成之多肽、 b) 序列表之序列編號4之胺基酸編號1至309所示胺 基酸序列而成之多肽、 -83- 200815600 C)上述a)或b)選擇之多肽之胺基酸序列中1或數個胺 基酸欠缺、取代或附加之胺基酸序列而成，且具有 (2R)-2-胺基-2-甲基-4-[5-(5-苯戊醯基）噻吩-2-基]丁-1-醇之磷酸化能力之多肽； 2)於確認1)測定之多肽之表現量和具有使式（I)化合物於 活體内磷酸化能力之檢體中，比較該多肽之表現量， 來檢定被驗者使式（I)化合物磷酸化能力之工程。 9·一種包括下述工程1)及2)之判定患者生成式（I)化合物之 磷酸酯之能力之方法， 1) 測定被驗者採集之檢體中，由下述之a)至c)而成之群 選擇之多肽之酵素活性之工程： a) 序列表之序列編號2之胺基酸編號1至309所示胺 基酸序列而成之多肽、 b) 序列表之序列編號4之胺基酸編號1至309所示胺 基酸序列而成之多肽、 c) 由上述a)或b)選擇之多肽之胺基酸序列中1或數個 胺基酸欠缺、取代或附加之胺基酸序列而成，且具 有（2R)-2-胺基-2 -甲基-4-[5-(5-苯戊醯基）噻吩-2-基] 丁 -1-醇之磷酸化能力之多肽； 2) 於確認1)測定之多肽之酵素活性和具有使式（I)化合物 於活體内磷酸化能力之檢體中，比較該多肽之酵素活 性，來檢定被驗者使式（I)化合物磷酸化能力之工程。 10·—種包括下述工程1)至3)之判定被驗者生成式（I)化合 物之磷酸酯之能力之方法， -84- 200815600 1) 調査被驗者採集之檢體中由以下a)至c)而成之群選擇 之多核苷酸之核苷酸序列之工程： a) 含有由序列表之序列編號1之核苷酸編號1至1466 所示核苷酸序列而成之多核苷酸、 b) 含有由序列表之序列編號3之核苷酸編號Μ至1781 所示核苷酸序列而成之多核苷酸、 c) 與上述a)或b)記載之核苷酸序列互補之核苷酸序列而 成之多核苷酸於嚴格條件下雜交，令具有使式（I)化合 Φ 物於活體内磷酸化能力之多肽編碼之多核苷酸； 2) 調査上述多核苷酸中對酵素活性有影響之核苷酸序列 有無變異之工程； 3) 有降低該多核苷酸所編碼之多肽之磷酸化活性之核苷 酸序列之變異之被驗者判定爲式（I)化合物之磷酸化能 力低，而無降低該多肽之磷酸化活性之核苷酸序列之變 異之被驗者判定爲具有式（I)化合物之磷酸化能力之工 程。 • 11. 一種包括下述工程1)至3)而鑑定由以下之a)至〇而成 之群選擇之多核苷酸所編碼之對多肽之磷酸化活性有影 響之核苷酸序列之變異之方法， a) 包括由序列表之序列編號1之核苷酸編號1至1466 所示核苷酸序列而成之多核苷酸、 b) 包括由序列表之序列編號3之核苷酸編號1至1781 所示核苷酸序列而成之多核苷酸、 c) 與上述a)或b)記載之核苷酸序列互補之核苷酸序列而 -85- 200815600 成之多核苷酸於嚴格條件下雜交，令具有使式⑴化合 物於活體内磷酸化能力之多肽編碼之多核苷酸； 1) 調査被驗者採集之檢體中由上述a)至〇而成之群選 擇之多核苷酸之核苷酸序列之工程； 2) 調査上述多核苷酸中核苷酸序列之變異之有無之工 程； 3) 調査該多核苷酸序列之變異與該多核苷酸所編碼之 多肽之磷酸化活性之關連，鑑定對磷酸化活性有影 # 響之多核苷酸序列之變異之工程。 12. 如申請專利範圍第7至11項中任一項之方法，其中檢 體爲末梢血。 13. —種含有由下述1)至5)而成之群選擇之至少1以上之 藥物代謝能力診斷用套組， 1)使由序列表之序列編號1或3記載之核苷酸序列而成 之多核苷酸之一部分至全部專一地增幅之15至30鹼 長之連續寡核苷酸引子； • 2)由序列表之序列編號1或3記載之核苷酸序列而成之 多核苷酸於嚴格條件下雜交，而用以檢出該多核苷酸 之1 5核苷酸以上之連續多核苷酸探針； 3) 上述1)記載之寡核苷酸引子或上述2)記載之多核苷 酸探針之任一多核苷酸被固定之固相化試料； 4) 於由下述之a)至c)選擇之多肽專一地結合，而用以檢 出該蛋白質之抗體： a)由序列表之序列編號2之胺基酸編號1至309所示 -86- 200815600 胺基酸序列而成之多肽、 b) 由序列表之序列編號4之胺基酸編號1至309所示 胺基酸序列而成之多肽、 c) 由上述a)或b)選擇之多肽之胺基酸序列中1或數個 胺基酸欠缺、取代或附加之胺基酸序列而成，且具 有（2R)-2-胺基-2-甲基-4-[5-(5-苯戊醯基）噻吩-2-基] 丁-1-醇之磷酸化能力之多肽； 5)於上述4)記載之抗體結合之二次抗體。
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