TW200808977A - A method for the detection and neutralization of bacteria - Google Patents

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200808977 九、發明說明 【發明所屬之技術領域】 本發明大體而言係關於治療細菌感染。更特定言之，本 =明係關於鑑別存在於錢部位處之細菌及使㈣菌體來 /台療感染。 【先前技術】 細菌感染為由一或多種細菌種對宿主有機體之有 殖。通常在時常未鑑別存在何細菌之情況下且（在某^ 況下）甚至根本不確定是否存在細菌的情況下，用抗生: 及/或消毒劑來治療此等感染。在嘗試㈣細g時，μ 物培養係通常使用之方法。以此方法，自潛在患病 液體採集樣本且與生長培養基或生長培養基之板接觸。在 生長培養基上形成之細菌菌落之大小、色彩、形狀及形式 可為特定細菌種之特性。此外，細菌在某些類型之生長培 養基上生長、不生長，或產生特性色彩之能力亦用於鏗別 樣本中存在之細g。f要微生物培養之診斷技術的缺點包 括生長細菌所需之時間及某些微生物(諸如，分支桿菌幻 難以培養之事實。 &可獨立地使用或結合微生物培養而使用之另一工具為顯 被法。顯微法可用於基於細菌之形態來鑑別細菌種。此 外可結合生物化學染色技術而使用顯微法來鑑別細菌。 ^等染色技術可採用諸如吉氏染色、革蘭氏染色及抗酸性 染色技術中之染料的染料。生物化學染色技術亦可採用對 特定細菌種特異之抗體。 122022.doc 200808977 治療細菌感染通常包含使用抗生素。某些抗生素在治療 某，細菌種方面較有效，將自錢培養之 細囷暴露於抗生素板以便邦定細菌敏感或耐受之抗生素。 :方法可耗去右干日。為避免可能與細菌之鑑別相關 延遲，通常在未具體鑑別細菌之情況下或甚至在未確 二是否由’菌引起感染之情況下給予抗生素治療。此情形 起不必要或對於5ί起感染之細菌不適當之治療。不必 要或不適當制抗生素錢進耐隸細㈣株之選擇。斑 =素療法㈣叙其他障礙包括某些抗生素在某些患者 二之不良反應’及耐抗生素性細菌菌株之出現。 【發明内容】 法=:例中’本發明提供-種偵測感染中之細菌的方 乂 /、 ⑷自受試體中之感染部位獲得樣本Whm. °玄樣本與一&多種細菌特異性適體接觸.及7 : 異性適體與樣本中存在之細菌之間=二^ 了感染中之細菌。在本發明羊其中偵測 ^ 明之某些態樣中，嗜方、本★ 土 匕含基於樣本中之至少—細菌種體1 作用來_該至少-細菌種。在本發明之;， 方法包含選擇感染所鑑別之細菌種之^悲樣中’該 將有效量之噬菌體投予受試體。;夕種噬菌體’且 包含.(:自知例中’本發明提供一種治療感染之方法，1 匕3 ·⑷自受試體中之感染部位 万法其 或多種細菌特異性適體接觸；(c)偵、、則"’將該樣本與- 本中存在之細菌之間的、特異性適體與樣 作用，⑷基於樣本中之至少— I22022.doc 200808977 、種人、田囷特'異性適體的相互作用來鑑別該至少一細菌 種，及（e)選擇感染所鑑別之細菌種之一或多種噬菌體；及 ()將有放4之嗟菌體投予受試體，其中感染係經治療。在 某些貫施例中，該方法進一步包含量化存在於樣本中之細 菌的量。 在另一貫施例中，本發明提供一種治療創口或促進創口 癒合的方法，其包含··（a)自創口獲得組織或液體樣本； (b)將叆樣本與一或多種細菌特異性適體接觸；(〇)偵測細 菌特異性適體與樣本中存在之細菌間的相互作用；（幻基於 樣本中之至少一細菌種與細菌特異性適體的相互作用來鑑 別遠至少一細菌種；及⑷選擇感染所鑑別之細菌種之一或 夕種噬菌體；及（f)將有效量之噬菌體局部地投予該創口， 其中治療了該創口及/或促進了創口之癒合。該創口可為 (例如）外科手術創口、急性創口（諸如由極性損傷引起之創 口）、燒傷、潰瘍（諸如糖尿病性潰瘍或褥瘡）。 本發明之方法及組合物可用於鑑別及治療任何細菌感 染，包括（例如）以下各者之感染：皮膚、軟組織、肌肉、 骨骼、上消化道、下消化道、肺系統、心血管系統、中極 神經系統、眼、泌尿道、生殖道、竇或血液（亦即，敗血 症）。將根據本發明而治療之受試體可為易受細菌感染之 任何有機體，包括（但不限於）諸如人類、家畜（例如，牛、 馬、羊，及豬），及家養寵物（例如，貓及犬）之哺乳動物。 可針對細菌之存在而在體外或在體内檢定感染。在本發 明之某些悲樣中，自感染部位處或感染部位周圍獲得樣 122022.doc 200808977 本。獲得樣本之方法可取決於感染之位置 組織而變化。醫.生將能判定何方法適用：二感染之 件。舉例而言，可藉由抽吸、活組織檢查、抹之條 刺、腰椎穿刺，或尿樣本來獲得樣本。 "f脈牙 許多細菌種能在宿主有機费中丨 夕… 引起感杂。若(例如)宿主 統不全或細菌進入正常無菌之宿主有機體的一， 貝=至通常被視^與其宿主互惠或共生^ =囷亦可能引起感染。由損傷、潰瘍（例如，糖尿病性 4、褥瘡）或外科手術引起之創口因其在皮膚或點膜 提供細菌可進入宿主之裂口而提供細菌感染之機會。通 自創口及其他錢恢復之細，種包括：大腸埃希氏菌、變 形桿菌種、克雷伯氏菌種、綠膿桿菌及其他假單胞菌種、 腸內杯菌種、釀膿鏈球菌及其他鏈球菌種、擬桿菌種、並 雷沃氏菌種、芽孢梭菌種、金黃素葡萄球菌及其他葡萄^ 菌種。厭氧細菌尤其傾向於在腐爛組織及較深創口中大量 生長，尤其在組織具有較差血液供應時。引起疾病之厭氧 菌包括·梭菌、消化球菌（pept〇c〇cci)、消化鏈球菌 (PePt〇Streptococci)、擬桿菌、放線菌、普雷沃氏菌，及細 梭菌。可能感染宿主有機體之其他細菌的實例包括〔桿 菌、黃單胞菌、弧菌、沙門氏菌、志賀桿菌、伊文氏桿 菌、立克次體、彼衣菌、支原體、放線菌、鏈黴菌、分支 杯菌、球菌、乳桿菌’雙球菌及螺旋體菌。感染可能含有 一或多種之細菌。在本發明之某些態樣中，在感染中鑑別 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、η、13、14、 I22022.doc 200808977 15 、 16 、 17 、 18 、 19 、 20插+ 廿丄 20種或其中可衍生之任 同細菌種。 乾lij之不 如上所述’可使用細菌特異性適 樣本中之細菌。細菌特盈性、帛_/ 、/、]並釔別存在於 菌特異性適體係特異地與細 可=之標記結合且區別細菌菌株、細菌種或細菌群愈、— :菌菌株、細菌種或細菌群的適體。細菌特異性適體所： 獨特之蛋白或基元。在竿此，：株 '細囷種或細菌群 合至蛋白酶、毒辛或諸mr細菌特異性適體結 紫次堵如月酶素酶之耐藥性蛋白。 奋 施例t，細菌特異性適體特里性地社人5 貝 或革蘭m㈣。料w /y革以陰性細菌 牛例而吕，起黏附作用之磷壁質酴 nt —僅存在於革蘭氏陽性細菌中。因此，特显性 菌作二 適體可用於偵測並㈣革蘭氏陽性細 ^為另—實例，腊蛋白僅存在於革蘭氏陰性細菌中。 =異性地結合細菌脂蛋白之適體可用於 在本發明之某些態樣中，細菌特異性適 ml二至大_希氏菌、釀腺鏈球菌、產氣莢膜芽 或金黃素葡萄球菌。在本發明之某些態樣中小 I 17、18、19、2〇、25、3〇、35、40、45、5。、55、 之任:二:7〇、75、80、85、90、95、100種或其中可衍生 *圍之不同細菌特異性適體被用於偵測及/或識別 灭*使用不同細菌特異性適體之板，可同時識別多 禋不同細菌。 122022.doc •10- 200808977 為便於偵測及/或鑑別細菌，可標記細菌特異性適體。 已知許多方法來標記適體。舉例而言，可以螢光團、發色 團、放射團、酶標記物、抗體、化學發光物、電致發光 物、親和標記、生物感應器、分子信標、量子點或奈米碳 管來標記適體。螢光國之實例包括（但不限於）以下物質： 所有 Alexa Fluor® 染料、AMCA、BODIPY® 630/650、 BODIPY® 650/665、BODIPY⑩-FL、BODIPY⑧-R6G、 BODIPY®‘TMR、BODIPY ㊣-TRX、Cascade Blue®、 CyDyes™(包括但不限於 Cy2TM、Cy3™及 Cy5™)、DNA插 入染料、6-FAM™、螢光素、：HEX™、6-JOE、Oregon Green® 488、Oregon Green® 500、Oregon Green㊣ 514、 Pacific Blue™、REG、藻色素蛋白（包括但不限於藻紅素 及別藻藍蛋白）、Rhodamine Green™、Rhodamine Red™、 ROX™、TAMRA™、TETTM、四曱基若丹明及 Texas Red®。 在本發明之某些實施例中，將細菌特異性適體固定在一 固體支撐物上，諸如微球體、載玻片、晶片、柱狀物或硝 化纖維素。在本發明之某些態樣中，標記了微球體。在某 些實施例中，其中第一細菌特異性適體固定在一固體上， 可藉由使用以報導分子標記之第二、未結合之細菌特異性 適體來達成細菌與適體間之相互作用的觀測。第一及第二 細菌特異性適體可能或可能不具有相同之結合特異性。 可藉由各種技術來完成結合至細菌之細菌特異性適體的 觀測。有待採用之特定技術將部分地取決於所使用之標 122022.doc -11 - 200808977 牿士、^明之某些態樣中，使用流式細胞儀來该測細菌 中二體與細菌間的相互作用。在本發明之其他態樣 (用螢光顯微鏡來偵測細菌特異性適體與細菌間的相 互作用。微流體裝置亦可用於處理及#測細 體 與細菌間的相互作用。 ]週體 ”體療时特異地針對存在於錢巾之特定細菌而特 Γ舉例而言4存在鏈球菌、葡萄球菌及大腸埃希氏 囷’則可將大腸埃希氏菌嗟菌體、鍵球菌嗟菌體 菌嗟菌體之混合液施用 衣 用至感禾。在本發明之某些態樣中， 可將 1、2、3、4、S ^ . 一 5、6、7、8、9、10、u、12、13、 14、15、16、17、18、19、2〇、3〇、4〇、5〇、6〇、7〇、 H⑽種或其中可料之任何範圍之不同嗟菌體投 予：試體。可同時或連續地投予不同之嗟菌體。藥師或臨 ，家可現场組合口里菌體隔離株以便允許個人化之療法。可 藉由若干方法中之_本忠 者末局σΜ也施用噬菌體或噬菌體混合 液。此等方法包括局部乳液或敷料、液體調配物、胸腔二 注射、靜脈~施用、直接注射至感染部位中、錠劑、检 劑、灌洗術、嘴霧劍乃喳4 務…及賀務。在本發明之某些態樣中，可 經由真空滴注將嗟菌體輸注諸如創口之感染區域中。在某 些實施例中，可結合咩詰雕也、+十丄 巫囷脸療法來使用抗生素及/或消毒 劑。在此等組合治疼Φ，π 縻中可一起投予噬菌體、抗生素及/ 或消毒劑或可經由不同挣僻b /斗、上 个丨』逆么及/或在不同時間投予噬菌 體、抗生素及/或消毒劑。 在其他實施例中，本發明係關於與關於鑑別及/或治療 122022.doc -12- 200808977 供”示之方法一起使用的套組。可在 菌特異性適體之組合物。可使用此等套 及來t備用且可健存之容器中提供一或多種 3、 ：之某W中’在套"提供h2、 9、1〇、U、12、13、u、15、16 17、18、19、2〇、25、3。，、4。、65〇、55、:〇 65 70 75、80、85、90、95、〗〇。種或其中可衍生之任 何辄圍之不同細菌特異性適體。套組之容器通常可包括至 :::瓶、試管、燒瓶、'、注射器及/或其他容：： /、中可置放及/或較佳地適合等分至少一 极、 體。可在套組中提供包+ ' 適 用此等套組來在備用且;^多㈣菌體之組合物。可使 _。在本發明之竿：=容器中提供-或多種此等 /月之某些恶樣令，可在套組中提供卜2、 6、7、S、9、10、nm、14、15、16 Η 、 18 、 19 、 20 、 30 、 4〇 、 5〇 、 μ 、 或其中可衍生之任何範圍菌70套8:、90、1 °〇種 可包括至少-小瓶、試管、二“：。套組之容器通常 容器，在其中可置放及… 射器及/或其他 體。本發明之套組可:括= 任何其他試劑容器容納於：中異生適體、嗟菌體或 件。此㈣器可包括所要^限制中以用於商_售的構 ^ 所要小瓶所固持至之射出成形及/或 ::形之塑膠容器。可將細菌特異性適 —起 一套組中或可將其提供於獨立套組中。丄； 亦可含有㈣之試劑.，諸如標記分子及固體支撐物。'- I22022.doc -13- 200808977 預期關於本文所ρ、+、 卜十ή 34之任何方法或組合物來實施本文所 W之任何其他方法或組合物。 所 儘管揭示内容支持僅指待替代物及"及/或"之定義 指示僅指待替代物或替代物為互斥的，否則在申―: 專利乾園中術語”戋,， ^ /之使用係用於意謂”及/或"^ 貝穿本申請案，術語”大 壯 保用於指不一值包括用於判 μ 裝置或方法之誤差的標準差。 遵循長期存在之專利法，除非拉a ^陈非特疋指出，否則當在申枝 專利範圍或說明書中結合詞”包含,，使用時，詞” : 或多種。 日不一 自以下詳細描述，本發明之其他目的、特徵及益處將變 為顯而易見的。然而，應瞭解，因為自此詳細描述本發明 之精神及範嘴内之各種改變及修改將對於熟習此項技術者 而變為顯而易見的，所以雖然指示本發明之特定實施例， 但詳細描述及特定實例係僅以說明之方式給出。 【實施方式】 A.細菌之偵測 本發明提供用於偵測及治療細菌感染之方法及組合物。 藉由初始鑑別與感染相關聯之細菌，可特異地特製療法以 治療該感染。所有細菌由硬質肽聚糖細胞壁封閉，且細胞 壁之組合物在不同細菌中較大地變化。此差異提供用於根 據本發明鑑別不同細菌種及菌株之基礎。該肽聚糖層形成 自由β-(1，4)-糖芽鍵連接之胺基糖（亦即，&乙醯葡萄胺糖 及Ν-乙醯胞壁酸）之鏈。附著至胺基糖的為序列及結構在 122022.doc 14 200808977 婉菌種中變化之胺基酸鍵。在某些實施例中，該摘測包含 :由使用特異地辨別暴露在細胞壁之表面上之組份的適體 來鑑別細菌種。 細s特異性適體可指向之標記的實例包括蛋白酶、毒 2耐藥性蛋白、填壁質酸，及脂蛋白。—般熟習此項技 V者亦將能選擇適用於使用 偵測及鑑別細菌的各 種“記，其可在全球資訊 庐得 、、罔上在 ncbl.nlm.nih.gOV/T〇〇ls/處 為識別感染細菌，鑑別對於 j 7 %、、，田菌獨特之一或多種蛋白或 土 το。在一實施例中，對於 玄臼次、、、田胞表面基元特異之適 體可經選擇且用於鑑別細菌。 、θϊ + . 在本發明之某些態樣中，偵 測亦可包含量化存在之每一 俏 、’、函種。除先前所述之實施 例，可利用用於診斷目的之觀 硯測之其他方法。舉例而言， 可經由使用附著至適體旦 里子點來進行體外分析。可將各 種大小之量子點結合至 ^ 等各 ^ ^ ” Γ生通體。當用光能激發時， 母一大小之量子點可作為略' π , U不冋波長之光而為可男的。 因此，使用量子點亦將允許多 、 之觀測之其他方法包括（但 、〜斷目的 (一不限於)抗體-螢光素1 其他抗體-染料或螢光組份。 “物，及 B.適體 如上所述，對於蛋白或細胞表面基元特異之適” 擇且用於鑑別細菌。適胃A 可經遠 之體外選擇而設計以結合 重複輪二人 核酸、細胞、組織及有機 ）蛋白、 有機體。因其特異性及結合能力，適 122022.doc -15- 200808977 體作為診斷劑具有較強潛力。在某些情況下，已展示適體 為優於其他分子（諸如，抗體）之診斷劑。使用適體之額外 益處為大量生產不需要動物或培養之細胞。可經由聚合酶 鏈反應（"PCR")或寡核苷酸合成來進行適體合成，且所得 _ 適體在室溫下為穩定的且具有較長存放斯。 通常經由SELEX (指數富集之配位子系統進化）或SELEX 方法之變化體來進行適體之開發。SELEX方法已由Turek 及Gold於1990描述且描述在美國專利第5,270,163號及第 ’ 5，475,096號（其以引用方式併入本文）中。亦報導SELEX方 法之變化體，諸如光 SELEX、逆SELEX (coimter-SELEX)、 化學 SELEX (chemi-SELEX)、嵌合 SELEX (chimeric-SELEX)、混合 SELEX (blended_SELEX)，及自動 SELEX (automated-SELEX)。經由SELEX，允許大量之寡核苷酸 與所涉及之標革巴（例如，細菌細胞或與細菌細胞之表面隔 離之蛋白）相互作用。結合至標靶之（稱為成功的）分子係與 ^ 未經由若干技術中之一者結合之分子分離。舉例而言，可 經由結合至硝化纖維素、親和性層析法等自群體移除適體 結合標靶。隨後可藉由PCR來放大結合適體。 - 為有助於利用適體以達診斷目的，可將適體結合至某形 ， 式之標記以供觀測。為此目的可使用大量不同標記，諸如 螢光團、發色團、放射團、酶標記物、抗體、化學發光物 質、電致發光物質、親和標記、生物感應器或分子信標。 觀測之方法可取決於在體内還是在體外進行細菌偵測而不 同。在一實施例中，可將適體結合至奈米碳管，當用紅色 122022.doc -16- 200808977 光激發時，车来石$总ι + 、， 人g可在近紅外區域中發螢光。可將單壁 奈=!之外表面官能化，使其能在吸收特定生物分子時 凋即石反官之發射。在某些實施例中，可將染料或螢光團併 入適體hiux結合至雙層外部之㈣封裝於脂質雙層中。 在某二α才羡中，，亦可將抑止劑分子併入適體中g以結合至 雙層外部之適體封裝於㈣雙層中。將經 至其特異性細菌將允許觀測。n

、方法包含多卫微球體。可將諸如購自Luminex Corporation 或B1〇-Rad之微球體的微球體偶合至特定適體。將每一類 型之：菌特異性適體偶合至具有略微不同之螢光特性的珠 粒γ ik後與可疑感染樣本一起培養珠粒/適體之混合物。 、、菌將、、° a至其特異性適體。與（例如）經結合生物素化之 適體進行之第二培養將允許制後接著進行抗生蛋白鍵菌 素培養。可在雙雷射、流式細胞儀（亦即，技術） 中靖取邊等珠粒。分類雷射將允許珠粒-適體類型（例 如，葡萄球菌適體）之分類。第二、報導雷射將允許經由 "貝取抗生蛋白鏈菌素信號之強度來量化所存在之細菌。在 單一分析期間可以藉由此技術鑑別並量化高達一百或更多 種之細菌。Luminex技術係描述於（例如）美國專利第 5,736,330號、第5,981，18〇號及第6,〇57，1〇7號中，將所有 該等專利以引用方式具體地併入。 c·蛋白技術 在某些貫施例中，本發明採用使蛋白/與細菌隔離之方 法。隨後可將對於特定細菌種或菌株獨特之經隔離之蛋白 122022.doc -17- 200808977 用於諸如SELEX之方法中以設計特異地結合至 體。分離蛋白之方法對於熟習此項技術者為熟 =於)各議法(例如，陰離子交換層析二 运析去、連續萃取及向效能液體層析法）。 ’、 在一實施例中，本發明採用二維凝膠電 樣本分離為蛋白點之二維陣列。一 u夺蛋白與生物 今、^ J —維電冰為用於分離分子. 之稷雜混合物的適用技術，其通常提供較在 獲得之解析能力高得多之解析能力。可=刀料可 知夕女θ J便用此項技術中已 方法（見（例如）美國專利第5,534，121號 辦、也、仓 乂- 弟 6,398,93 3 籬嫌*占 百先猎由等電聚焦來分 …令之蛋白’在等電聚焦期間將樣本中 梯度來分離直至其達到一點 XpH值 (亦即，等電點)。此第一分離”;蛋白之淨電荷為零 ^ ffl 刀離步驟產生蛋白之一維陣列。 使用大體上顯著不同於在第—分 枯W 终刀離步驟中所使用之技術的 二進一步分離一維陣列中之蛋白。舉例而言，在第二 在十二烧基硫酸納之存在下藉由聚丙埽醯胺凝膠電 /白=侧E)來進-步分離蛋白。Sds page允許基於蛋 曰炙分子量來進行進一步分離。 =用此項技術中已知之任何適合方法來偵測二維陣列 可用比色染料（例如，庫馬斯卜銀染色或營光 H石紅；SyproRuby)來完成蛋白之染色。如一般熟 幸輿員技術者已知，可進-步分析所產生之點或蛋白圖. ::舉例：言’可自凝膠切除蛋白且藉由質譜法來分析。 …’可藉由施加一電場而將蛋白轉移至惰性膜且可藉由 122022.doc -18- 200808977 質譜法來分析大致對應於標記之分子量的膜上之點。 在某些實施例中，本發明採用質譜法。質譜法提供藉由 在真空中離子化分子且藉由揮發使其”飛行"來"稱重"個別 分子的方法。在電場及磁場之組合的影響下，離子取決於 其個別質量（m)及電荷（z)而沿轨道行進。在藉由電極肩測 之前離子的”飛行時間”為離子之質荷比（m/z)之量測值。質 譜法（MS)因其極度選擇性及敏感性而成為量化包括藥物、 代謝物、肽及蛋白之較廣範圍之生物分析物的強大工具。 W 基質輔助雷射解吸附離子化飛行時間質譜法（MALDI- TOF MS)為一類型之質譜法，在其中在雷射解吸附之前將 分析物物質分布在基質中。MALDI-TOF MS已成為肽、蛋 白及大部分其他生物分子（寡核苷酸、碳水化合物、天然 產物，及脂質）之普遍分析工具。結合二維凝膠電泳， MALDI-TOF MS尤其適用於藉由身份辨識（fingerprinting) 或微量定序（microsequencing)來進行蛋白點之鏗別。 ^ 在MALDI-TOF分析中，首先將分析物與基質化合物共 結晶，此後此分析物-基質混合物之脈衝UV雷射輻射引起 運載分析物之基質的汽化。因此，基質藉由強烈吸收雷射 ^ 光能量且間接引起分析物汽化而起關鍵作用。基質亦充當 . 質子供體及受體，其在正性與負性離子化模式中用以離子 化分析物。通常，可藉由MALDI-TOF分析蛋白之組份肽 (藉由化學或酶處理樣本而產生）來明確地鑑別蛋白。 另一類型之質譜法為表面增強雷射解吸附離子化飛行時 間質譜法（SELDI-TOF MS)。可藉由SELDI-TOF MS來分析 122022.doc -19- 200808977 整個蛋白，SELDI-TOF MS為MALDI-TOF MS之變化體。 在SELDI-TOF MS中，使用基於蛋白親和性特性之分德來 減少樣本複雜性。舉例而言，可使用疏水性、親水性、陰 離子交換、陽離子交換及固定金屬親和性表面來分餾樣 本。隨後用雷射照射選擇性結合至表面之蛋白。雷射解吸 附所黏附之蛋白，使該等蛋白如離子般發射。已商業地實 施蛋白分析之SELDI-丁〇F MS方法（例如，Ciphergen)。 串聯質譜法（MS/MS)為此項技術中已知之另一類型的質 譜法。以MS/MS分析，在第一階段分析器中根據離子之 m/z值分離的離子經選擇以斷裂且隨後在第二分析器中分 析斷片。熟習此項技術者將熟悉使用MS/MS之蛋白分析， 包括QTOF、離子阱，及FTMS/MS。MS/MS亦可經由電喷 霧或奈米喷霧界面或MALDI界面而結合液相層析法來使 用，諸如LCMS/MS、LCLCMS/MS，或CEMS/MS。 除以上所描述之方法之外，此項技術中已知之蛋白分離 及分析之其他方法可用於本發明之實踐。可單獨使用或結 合使用蛋白分離及分析之方法。 在一實施例中，本發明採用二維凝膠電泳而將蛋白分離 為蛋白點之二維陣列。二維電泳為用於分離分子之複雜混 合物的適用技術，其通常提供較在一維分離中可獲得之解 析能力南得多之解析能力。可使用此項技術中已知之方法 (見（例如）美國專利第5,534，121號及第6,398,933號）來進行 二維凝膠電泳。通常，首先藉由等電聚焦來分離樣本中之 蛋白，在等電聚焦期間將樣本中之蛋白以pH值梯度來分離 122022.doc -20- 200808977 直至，、達到一點，在該 —^ 點）。此第一 贫曰之孕電何為零(亦即，等電 不同於在第2離步驟產生蛋白之一維陣列。使用大體上 離一维陣分離步射所使用之技術的技術來進-步分 准障列中之蛋白。舉例而言，在 基硫酸鈉之存/ — 維中可在十一烷 來進一牛八f在下稭由聚丙烯醯胺凝膠電泳⑼S-PAGE) 乂为離蛋白。SDS-ΡΑΓϊΡ合i甘 M SDSPAGE允终基於蛋白之分子量來 進盯進一步分離。 可使用此項技術中已知之任 / 中的蛋白。可用比色_如，庫二^ 光毕 卞糊士庫馬斯）、銀染色，或螢 貝广’ SyproRuby)來完成蛋白之染色。如一般 无、έ此項技術者已知，可一八 ^刀析所產生之點或蛋白圖 舉例而言，可自凝膠切除蛋白且藉由質譜法來分析。 替代地，可藉由施加一電場而將蛋白轉移至情性膜且 由質譜法來分析大致對應於標記之分子量的膜上之點。曰 ^某些實施例中，本發明採用質譜法。質譜法提供藉由 /、空中離子化分子且藉由揮發使其，，飛行”來”稱重”個別 /刀子的方法。在電場及磁場之組合的影響下’離子取決於 其個別質量㈣及電荷㈡而沿執道行進。在藉由電㈣測 之前離子的”飛行時間”為離子之質荷比（m/z)之量測。質迷 法剛因其極度選擇性及敏感性而已成為量化包括藥物、曰 代謝物、肽及蛋白之較廣範圍之生物分析物的強大工呈。 已開發MS之修改且可將其用於隔離及鑑別蛋白中1等 修改包括（例如）基質輔助雷射解吸附離子化飛行時間質譜 法（MALDI-TOF MS)、表面增強雷射解吸附離子化飛行時 I22022.doc 200808977 間質譜法（SELDI-T0F Ms)，及串聯質譜法⑽蝴。 除以上所述之方法之外，此項技術中已知之蛋白分離及 其他方法可祕本發明之實踐。可單獨❹或結合 =分離及分析之方法。層析法用於基於有機化合物 =、大小、形狀及溶解度來分離有機化合物。層析法 =動相（㈣及㈣㈣之分子）及移動相所行進穿過之 組成，固定相為I紙（在濾紙層析中）或被稱為樹醋 3璃珠粒(在管柱層析”。分子因其化學性質而以不同 =行進穿過固定相。在本發W用之層析法之類型

)高效能液相層析法（HPLC)、離子交換層析 法（IEC)，及逆相層析法（R ’ J便用之其他種類之層析法 吸附、分溶、親和性、凝膠過濾及分子筛，以及使 ㈣專層析法之許多專用技術’包括管柱、濾紙、薄層及 氣相層析法（Freifelder，1982)。 D·嗟菌體療法 藉由初始 舉例而言 則可將大 -旦鑑別了細菌’則開始進行嗟菌體療法 別所存在之細菌，療法可針對感染特異訂製 若有鏈球菌、葡萄球菌及大腸埃希氏菌存^〜对八 埃希氏菌噬菌體、鏈球菌噬菌體及葡萄球菌嗟菌體：： =至感染處。藥師或臨床家可現場組合嗟菌體隔離 十進打個人化療法。可藉由若干方法中之-者來 P施用巫囷胆或口巫菌體混合液。此等方法包括局部乳液 敷料、液體霞物、胸腔内注射、靜脈内施用、錠劑及 霧劑。大部分此等转皆已經過叫。事實上尚未報導 122022.doc *22- 200808977 巫囷體療法有關聯之併發症。除了噬菌體傳遞之先前所述 方法外，可經由真空滴注將噬菌體輸注至諸如創口之感染 區域中。此注入將需要使用諸如V A C 0 instin⑧系統之裝 置。在某些實施例中，抗生素及/或消毒劑可與噬菌體療 法、、"D使用。在此等組合洽療中，可一起投予噬菌體、抗 -生素及/或消毒劑或可經由不同途徑及/或在不同時間投予 嗟菌體、抗生素及/或消毒劑。 嗟菌體為㈣染細菌之病毒。㈣體通t在其標乾細菌 之表面上結合至特定分子。將病毒dna注入發生噬菌體繁 殖之宿主細菌令。通常將噬菌體分成溶菌性的或溶原性 的。通常僅有溶菌性噬菌體適用於治療目的。在使用溶菌 性耗體時，細菌代謝後接著發生之破壞引起細菌溶解。 動物只驗已展不噬菌體療法在治療細菌感染方面係優於抗 生素療法。舉例而言，抗生素時常殺滅有害及有用之細 菌，而嗟菌體僅在殺滅感染細菌方面較具特異性。嗟菌體 在細菌中係自我複製的並可滲透至感染深處以破壞細菌。 此外’因為㈣體需要其特異性細g以便存在I在缺乏此 細菌時噬菌體可迅速消㉟，所以噬菌體亦為自限性的。噬 菌體製劑亦為高度穩定的且容易分散在介質中。嗟菌體製 劑亦具有較低製造成本且可儲存較長之時間。 E·醫藥製劑 1.調配物 藉由本發明可預期用於投予受試體之噬菌體的醫藥製 劑。-般熟習此項技術者將熟悉對受試體投予嗤菌體之技 122022.doc -23- 200808977 2料，—般熟習此項技術者將熟悉在對受試體投予谨 囷體之前製備此等噬菌體所必須之技術及醫藥試劑。 在本發明之某些實施例中，醫藥製劑為包括噬菌體之含 口物本备明之含水組合物包含溶在醫藥學上可接受 之載劑或含水介質中的有效量之嗟菌體溶液。如本文中所 1放液介f、塗層、抗菌劑及抗真菌劑、等張及吸收延遲 劑及其類似者。此等介質及試劑對醫藥活性物質之使用為 此=技術中所熟知的。除任何習知介質或試劍與嗟菌體不 相谷之外’其在治療性組合之用途係為人所預期的。 亦可將補充活性成份併人組合物中。對於人類投藥 般安全性及純度標準 應滿足如由咖⑹⑽^細斤要求之無菌性^ 熱性、 . 在調配B夺，將溶液以與劑量調配物相容之方式且以治療 上有效之量來投予。可將DMg體與作為受試體之治療方案 之一部分，諸如抗生素療法的其他試劑來投予。 2·.劑量 本發明預期投予_體以治療細菌錢…般熟習此項 技術者將m本揭示案來散有待好之_體之數目 及杈予頻率。有待投予之量（根據治療之數目與劑量）亦可 取決於有待治療之受試體、受試體之狀態、感染之位置、 存在於感染中之钿菌之量，及/或感染部位之血液供應的 2質。精確量之醫藥組合物亦取決於開業者之判斷且對於 每-個體為特別的。⑮予之頻率可取決於開業纟之判斷而 122022.doc *24- 200808977 時、至_小時、至u日、至i，或更長之 在某些實施例中，可能需要對患者提供嚷菌體調配物之 連續供應。連續灌注所涉及之區域（諸如，創口）可為較佳 • 的。可由臨床家對特定患者及情況選擇灌注之時間，但時 * 間可在約1-2小時、至2-6小時、至约6-10小時、至約1〇_24 ^ 至約丨-2日、至約1-2週或更長的範圍中。經由連續 _ ^，之噬菌體的劑量應與藉由單一或多次劑量所給之劑量 均等（關於投予該等劑量之時間而調整）。 可能需要將噬菌體療法與用於治療感染之其他抗菌劑或 方去結合。此等抗菌劑可為抗生素或消毒劑。亦可結合噬 菌體療法來完成清除感染之部位。可藉由對受試體投予包 括噬菌體與額外抗菌劑之單一組合物或醫藥調配物，或藉 由對受試體投予兩個不同組合物或調配物（其中一組合物 包括"巫菌體且另一者包括該或該等額外抗菌劑）來達成組 _ 。療去。在兩個或兩個以上不同組合物或調配物投予至該 :忒to之h况下，可以若干分鐘至若干週之範圍的時間間 隔在其他治療之前或之後投予噬菌體。無論同時投予或間 隔技予，亦預期經由不同之投予途徑來投予不同組合物或 . 調配物。舉例而言，可局部地投予含噬菌體之組合物同時 經口投予含抗生素之組合物。 可根據本揭示案在無不當實驗之情沉下製造及進行本文 中所揭不及主張之所有組合物及方法。雖然已根據較佳實 施例描述了木於明> 4 不心月之組合物及方法，但熟習此項技術者應 122022.doc -25- 200808977 瞭解在不背離本發明之概念、精神及_情況下可將變 化體應用於本文中所描述之組合物及方法以及方法之步： 或步驟之序列中。更具體言之，將顯而易見的是，化^性 地與物理性地相關之某些試劑可取代本文中所描述之試 劑，同時達成相同或相似之結果。對於熟習此項技術者顯 而易見之所有此等相似取代及修改被認為在如由隨附申請 專利範園所定義之本發明之精神、範疇及概念中的。 參照案 以下參照案以引用方式具體地併入本文中，以致其提供 作為本文所闡述之細節之補充的例示性程序或其他細節。 美國專利第5,270，163號 美國專利第5,475,096號 美國專利第5,534，121號 美國專利第5,736,330號 美國專利第5,981，180號 美國專利第6,057，107號 美國專利第0，398,933號

Freifelder, Physical Biochemistry Applications to

Biochemistry and Molecular Biology，第二版， Freeman and Co·，NY，1982年0

Turek及 Gold，Science，249:505 至 510, 1990年。 【圖式簡單說明】 圖1展示在結合至細菌12之前（左上）與之後（右下）固定在 微球體10上之細菌特異性適體11及經標記之細菌特異性適 122022.doc -26- 200808977 體.13。 、 【主要元件符號說明】 10 微球體 11 細菌特異性適體 12 細菌 13 經標記之細菌特異性適體 122022.doc -27-

Claims (1)

1. 200808977 十、申請專利範萄： κ 一種偵測-感染中之細菌之活體外方法，其包含： ⑷將自受試體之感染部位獲得之樣本與 特異性適體接觸，·及 (=該等細菌特異性適體與該樣本中存在之細菌之 .2如 相互作用’其令偵測到該感染中之該細菌。 •二項1之方法，其進一步包含基於該樣本冲之至少 •該等細菌特異性適體之相互作用來鑑別該至 3·如請求項2之方法，其進-步包含選擇柄所㈣ 、細菌種之一或多種嗟菌體。 4木錢鑑別之 4 ·如請求項1 古 、 毕、# % ，/、中該感染為一皮膚感染、肌肉威 染、，、…：：、、々化道錢、下消化道感染、肺感 八、九U官感染、中樞神經系統感染、眼减毕m 感染、峰詁、皆rV、&上 民认木、泌尿道 生殖道感染或血液感染。 5. 如請求項1 $古、土 ^ h Μ或靜脈穿^2樣本係藉由抽吸、活組織檢 6. 如請求項^! 、 ' 其十該樣本與介於1盥1 0種門的尤Π 細菌特異性適體接觸。 …、10種間的不同 7 ·如請求項 同細，、中該樣本與介於1G與1GG種間的不 闺特異性適體接觸。 8·如請求項1之方法，复 記的。 〃中邊專細函特異性適體係經過標 9 ·如睛求項 、 其中该標記為一螢光染料、一量子 122022.doc 200808977 其中該細菌特異性適體係固定於— 點或—奈米碳管。 10·如請求項1之方法 固體支撐物上。 η.如請求項8之方法，其中 12 ·如往* s 叉探物為一微球體。 ^項1之方法，盆中彳貞 在於％… Z、中價’,亥“菌特異性適體與名 13如：=本中之細菌間的該相互作用包含流式細胞儀。

   .在其中仙料細時異性適體與存 =本中之細菌間的該相互作用包含發光顯微鏡。 的不同細菌種。-中在練本中鑑別介於！與3種間 1 5 ·如請求項2之古 、 法，其申在該樣本中鑑別介於3與10種間 的不同細菌種。 16 ·如請求項2之古、土 、 / ，，、中該樣本中所鑑別之一或多種細 囷種為一,, 菌、由以下細菌組成之群的屬：桿菌、芽孢梭 :·假皁胞菌、黃單胞菌、弧菌、擬桿菌、埃希氏菌、 "髀氏菌γ沙門氏菌、志賀桿菌、伊文氏桿菌、立克 ^ 皮衣菌、支原體、放線菌、鏈徽菌、分支桿菌、 j囷、葡萄球菌、乳桿菌、雙球菌、鏈球菌及螺旋體 17.如請求jgq 、之方法，其中選擇了介於1與5種間的不同噬 菌體。 θ求項3之方法，其中該等噬菌體中之一或對 桿菌、捻# 知国、假單胞菌、黃單胞菌、弧菌、擬桿菌、埃 希氏每i 、士 π ' 克锫伯氏菌、沙門氏菌、志贺桿菌、伊文氏桿 122022.doc 200808977 菌、立克次體、披衣菌、支原體、放線菌、 支桿菌、球菌、葡萄球I、乳桿菌、雙球菌、鏈球= 螺旋體菌中之一或多者具有特異性。 ^ 之…其"包含量—樣本中 20· —種治療創口之方法，其包含： (a)自該創口獲得組織或液體樣本； • (b)將該樣本與—❹種細㈣異性適體接觸； ⑷㈣該等細菌特異性適體與該樣本 的相互作用； 之細菌間 ⑷基於該樣本中之至少—細g種與該等細 ㈣相互作用來鑑別該至少—^菌種；&〜、性適 ⑷選擇感染該所別之細菌種之_ ⑺將有效量之該等噬菌體局部投予該創口工，：’及 了該創口。 、中治療 # 2丨.如請求項2 〇之方法，其中該創口為外科手術創口 22.如請求項20之方法，其中該創口為急性創口。 23·如請求項20之方法，其中該創口為燒傷。 24·如請求項20之方法，其中該創口 瘡。 两『生，瘍或褥 25·如請求項20之方法 所獲得。26·如請求項20之方法 其中該組織樣本係藉由清除該倉 或抹拭該創口所獲得。 其中該液體樣本係ϋ由抽。及、 灌 122022.doc 200808977 2叉如請求項20之方法，其中該等噬菌體之該局部投予勺人 將局部乳液或敷料施用於該創口。 5 28·=ί^之方法，其中該等仙體之該局部投予包含 將贺務劑或噴霧施用於該創口。 飞 29· 士明求項2〇之方法，其中該等噬菌體之哕 使甩真空、、_、± & w局邻投予包含 工滴注對該創口進行輸注。

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