TW200307750A - Stabilized formulations of adenovirus - Google Patents

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TW200307750A
TW200307750A TW092101013A TW92101013A TW200307750A TW 200307750 A TW200307750 A TW 200307750A TW 092101013 A TW092101013 A TW 092101013A TW 92101013 A TW92101013 A TW 92101013A TW 200307750 A TW200307750 A TW 200307750A
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ch2ch20
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adenovirus
virus
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Erno Pungor
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Schering Ag
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Description

200307750 玖、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關一種使病毒組合物安定之方法及經安定之 病毒組合物。 【技術領域】 本發明係有關一種使病毒組合物安定之方法及經安定之 病毒組合物。 【發明内容】 本發明有關例如使組合物如醫藥組合物安定之方法，該 組合物包括氣生病毒（如腺病毒），該方法係於該組合物中添 加安定有效量之包括烷基部分及聚乙二醇部分[PEG(亦稱 為聚環氧乙烷結構），具有結構〇_((：；1120：112〇)2-11，其中z至少 為2]之非離子性清潔劑如Brij清潔劑或聚山梨酸酯如聚山 梨酸g旨20。較佳具體例中，該非離子清潔劑具有式〗所示結 構：
R-〇_(CH2CH2〇)x-H I 其中 X為4·30，及 R為10-70個碳原子之直鏈或分支烷基，其視情況經一或多 個（如1-3個）叛基、羧醯胺、由素（F、α、Br、^、羥基胺 基或可為芳族（如含6-14個C原子）或環烷基（如含3_12個c原 子）之1-3環之取代基取代，該1-3環亦可為雜環（如含4i_ c原子及1_wn、s、〇或P原子）且其中該環可視情況經-或 多個燒基（如含卜12個C原子）、經基、胺基、鹵素（如上述）、 83140 -6 - 200307750 硝基、次硫酸基（sulfoxy)、叛基或碳酿胺基取代（其中環基 較好為單-、雙-或三環）， 或具有式II結構： h-(〇ch2ch2)w-o
(CH2CH2〇)y-H 一〇-(〇ch2ch2)z-r
0-(CH2CH20)x-H 其中R為含10至70個碳之-C02iT及W+X+Y+Z=20，其中R’如 上述R之定義， 或具有式III結構：
R
I H0(CH2CH20)x - (CH-CH20)y - (CH2-CH20)z - Η ΙΠ 其中R如上述及X為5-100，Υ為25-75及Ζ為50-100， 或具有式IV結構：
〇(CH2CH2〇)x-H IV 其中X為5-丨5，較好為7-10，環Α為伸苯基或伸環己基，及 R’為上述之R， 或其組合。 特佳具體例中， 式I中，R^(CH3)(CH2)Yd其中Y為10-15 ;及最佳具體例 中，X為 23 及 Y為 12(Brij 35)或 X為 20 及 Y為 12(Brij 58); 式II中，R為CaH(2a+1)COr，其中a為10至70，及最佳具體例 中，R=CiiH23C〇2- (Tween 20); 式 III 中，R為 CH3, X為 55及 Y為 29及 Z=55(Pluronic F68) 83140 200307750 或R為 CH3，X為 98，Y為 67及Z為 98(Pluornic F_127);或 式 IV 中，IT 為（CH3)3OCH2C(CH3)2-，A為伸苯基及X為 9-10 (Triton X-100，NP40)或 R，為（CH3)3C.CH2C(CH3)2-，A為伸環 己基及X為9_10(還原之Triton X-100)。 本發明一目的係一種使包括腺病毒之組合物安定之方 法，包括於組合物中添加安定有效量之本發明非離子性清 潔劑如上述式I、II、III或IV或其組合；其中該腺病毒為可 表現轉基因如治療基因例如用於基因療法者之重組腺病 毒；其中該非離子性清潔劑為Brij清潔劑如Brij 35或Brij 58、聚山梨酸酯（Tween)清潔劑如聚山梨酸酯20、40、60或 65，尤其聚山梨酸g旨20、或pluronic分子如Pluronic F127或 F68，或似 Triton分子如 Triton X-100、Triton X-114或NP_40， 其濃度約為臨界微胞濃度（CMC)，如約0.005%至約0.1 %(體 積/體積），較好約0.05%至約0.08%，更好約0.05%。 本發明另一目的係一種醫藥組合物，包括藉上述方法製 備之安定腺病毒組合物及至少一種醫藥可接受性載體。 本發明另一目的係一種組合物如醫藥組合物，包括腺病 毒及安定有效量之本發明非離子性清潔劑如上述式I、II、 III或IV或其組合及視情況之一或多種鹽及/或賦形劑，且在 醫藥組合物之例中，又包括一或多種醫藥可接受性載體、 鹽及/或賦形劑，其中該腺病毒為可表現轉基因如治療基因 例如用於基因療法者之重組腺病毒；其中該中性清潔劑為 Brij清潔劑如Brij 35或Brij 58、聚山梨酸酯（Tween)清潔劑如 聚山梨酸酯20、40、60或65，尤其聚山梨酸酯20、或pluronic 83140 -8 - 200307750 分子如Pluronic F127或F68，或似 Triton分子如Triton X-100 、TritonX-114或NP-40,其濃度約為臨界微胞濃度（CMc)， 如約0.005%至約0.1%(體積/體積），較好約〇 〇5%至約 0·08%，更好約 〇〇5%。 本發明另一目的為一種使包括腺病毒之組合物安定之方 法’该改良處為其中於該組合物中添加安定有效量之本發 明非離子性清潔劑如上述式I、II、叩或…或其組合。 本發明另一目的係一種使包括氣生病毒之組合物安定之 方法包括於该組合物中添加安定有效量之本發明非離子 性清潔劑如上述式I、II、III或IV或其組合。本發明另一目 的係一種組合物如醫藥組合物，包括氣生病毒；本發明非 離子性清潔劑如上述式I、II、m或1¥或其組合，·及視情況 之一或多種鹽或賦形劑。醫藥組合物包括一或多種醫藥可 接受性載體、鹽及/或賦形劑。 【實施方式】 例如使包括病毒之組合物安定之"安定，，一詞意指在界定 時間期間内，抑制組合物中病毒可提供（可測）量及/或活性 之損失，係與在相同條件儲存但無該安定劑之樣品之損失 量相較。 藉本發明方法所達成之安定化一般程度顯示於實例2及 圖1-6。例如如圖丨所示，在無安定劑存在下，高度純化之 腺病毒組合物在玻璃容器中在2_8t培育i個月後損失約2 5 1〇g感染力（230倍損失）；但當存在有Tween2〇，該損失小於 約〇.5 1叫（約3倍損失）。換言之，在1^“112〇存在下在2_8。〇 83140 -9- 200307750 1個月後所回收之病毒活性約比無Tween 20所回收之活性 高約80倍。圖】亦顯示當在塑膠容器中進行相同實驗時，在 Tween 20存在下之活性相對降低約40%。圖2中，測量病毒 濃度（藉HPLC)。圖2顯示在玻璃或塑膠容器中，於Tween 20 存在下於2-8°C 1個月後，腺病毒組合物均未展現可偵測量 之腺病毒濃度損失。相反地，玻璃容器中之病毒在此溫度 僅約0.25個月已損失其濃度之約1/3。 圖3及4顯示Tween 20可使在-70°C培育之腺病毒組合物安 定。圖3顯示在玻璃或塑膠容器中，病毒在-70°C培育均未 發生可偵測之感染力損失。在1至12個月培育期間之任何時 間病毒感染力之回收在有Tween 20存在下比不存在下高約 0.5至0.8 log (約高3至4倍）。圖4顯示當測量病毒濃度（藉 HPLC)時顯示類似發現。 圖5及6顯示Tween 20可使在-20°C培育之腺病毒組合物安 定。圖5顯示在玻璃或塑膠容器中，病毒在_20°(：培育時， 當存在有Tween 20時，培育2.5個月後病毒感染力之回收實 質上未改變；但在無Tween 20時，僅在培育1個月後感染力 降低約0.6 log (約80%)。圖6中，測量病毒濃度（藉HPLC)。 圖6顯示在玻璃或塑膠容器中，在-20°C培育14個月後，當 存在有Tween 20時，病毒濃度實質上未改變。當未添加 Tween 20時，病毒濃度降至低於此分析可偵測之極限。在 玻璃管或塑膠管中培育時，病毒回收至少比無Tween 20時 優異約15倍。 本發明有關一種使包括病毒如腺病毒之組合物安定之方 83140 -10- 200307750 法’包括於組合物中添加某量之上述非離子性清潔劑，其 中在約2-8°C、室溫、37°C、-20°C或-70°C既定時間後（如至 少5小時）’與不存在該清潔劑時之損失相較，該病毒量及/ 或活性之損失小於約30%如0-30%，較好小於約1〇%，更好 小於約5%及最好小於約2%。病毒製劑可藉本發明方法安定 化至至少約5-24小時之程度，較好至少約1-3〇天，更好至少 約1-12個月，及最好至少約2-3年或更久。在既定時間後相 對於起始量，殘留病毒量可大於2❶/。以上至例如1〇〇%，例如 大於約2〇/。、5%、10%、25〇/〇或75%。最佳具體例中，該量大 於約90%(如約95、98或99%)。 本文之”活性，，意指病毒之存活率及/或感染力（感染單 位、感染力價）。 未受理論限制，本發明之安定劑可藉例如抑制病毒之自 我凝集及/或抑制病毒結合至其存在之容器表面或結合至 該組合物其他成分而發揮功能。此安定作用可在不干擾病 毒結構整體性（如表面蛋白f未變性）或不干擾其感染力之 下而完成。 較佳具體例中，使腺病毒之組合物錢之藥劑可抑制在 腺病毒於特定溫度儲存喊時間所發生之可測量腺病毒濃 度及/或活性敎，絲無該安定㈣在下產生之降低比 較。 本万法-優點為提供在任何變化溫度長期使病毒安定化 <作用。例如其可使病毒製劑長期儲存，尤其在高於冷滚 溫度，因而不需使用高成本之冷滚及/或冷束器系統。該方 83140 •11· 200307750 法可用於例如實驗目的（如在HPLC分析前於玻璃或塑膠自 動取樣機小瓶中之腺病毒製劑安定）；對製劑而言，可用於 醫藥組合物之儲存及/或保存；及用於確保作為參考藥劑之 病毒感染力之保存，及用於供診斷所收集之臨床式樣。 本發明所包含之任何適當清潔劑例如上述式I、II、III或 IV可用於本發明方法或組合物。例如式I包含Brij 35 (當X 為 23及 Y為 12) ; Brij 58(當 X為 20及 Y為 12);及Brij 3J (當 X 為23及Y為11)。式II包含例如各種聚山梨酸酯（聚氧乙烯20 山梨糖醇酐分子），包含聚山梨酸酯20(聚氧乙烯20山梨糖醇 酐單月桂酸酯，Tween 20)、聚山梨酸酯40(聚氧乙稀20山梨 糖醇纤單棕櫚酸酯，Tween 40)、聚山梨酸酯60(聚氧乙諦20 山梨糖醇Sf單硬脂酸酯，Tween 60)、及聚山梨酸酯65。式 III包含例如各種Pluronic類，包含Pluronic 127 (當X=98， Y=67 及 Z=98)及 PluronicF68(當 X=55, Y=29 及 Z=55)。式 IV 包含例如各種似Triton分子例如當X=9-10及A=伸環己基時 為還原之T.riton X-100及當X=9-10及A=伸苯基時為Triton X-100或NP-40。 較佳具體例中，特別是組合物為醫藥組合物時，該清潔 劑為已認可可用於併患者，如可注射等級之清潔劑如可注 射 Tween 20 〇 可使用任何適當濃度之清潔劑，但其為安定有效量，亦 即可在組合物中達成病毒安定之量。典型上，該清潔劑存 在濃度約為CMC，如約0.005%至0.1 %體積/體積，較好約 0.05至0.08%，及更好約0.05%。測定安定組合物中之病毒 83140 -12- 200307750 需要多少量之清潔劑之方法為本技藝習知。分析病毒濃度 或活性之典型方法述於本文他處。 可藉本發明方法安定化之病毒為熟知本技藝者所悉知。 此病毒可為致病性或非致病性。通常，可藉本發明方法安 定之病毒為氣生病毒。此病毒中較佳為如DNA或RNA病 毒’落入下列族群之病毒：小DNA病毒（包含腺體相關病 毒）、腺病毒、疱疹病毒、痘病毒、似B型肝炎病毒、腸鼻 炎病毒、凱希病毒（Calciviruses)、星病毒、拢葛病毒 (Togaviruses)，、黃病毒、冠狀病毒、副黏液病毒、橫紋病毒、 絲狀病毒、流感病毒、沙狀病毒、布亞病毒（Bunyaviruses)、 呼吸道與與腸道滤過性病毒、逆轉錄病毒等。其中可藉本 發明方法安定之病毒微與呼吸道感染有關之病毒如鼻病 毒、副流感病毒及呼吸道融合細胞病毒（RSV)。可藉本發明 方法安定之病毒包含具有蛋白質包衣及疏水性表面之病 毒。 最佳為腺病毒如禽鳥或哺乳類腺病毒，其任何血清類型 已經鑑定，包含腺病毒2及腺病毒5。最佳具體例中，使用 適合基因療法之重組病毒如重組腺病毒。各種病毒載體已 被描述，包含於適當基因中缺陷之腺病毒（如E1基因缺乏腺 病毒），其適用於基因療法用途。任何各種基因可作為例如 標記基因或作為治療劑，且可在控制適當調節序列之下轉 殖入此載體中接著導入例如基因療法之病患中。選擇在其 内可表現之適當載體及基因及製造此架構之方法及其用於 體内或體外基因療法之用途為習知且為本技藝者所系知 83140 -13· 200307750 (例如參見Sambrook，J·等人（1989)，分子選殖··實驗室手冊， 冷泉港出版社，冷泉港，NY)。可用於本發明方法之基因包 含例如編碼多吹之基因如酵素、激素、細胞素（如干擾素或 介白素）、生長因子（如FGF-1至FGF_23任一者）等。又，標 記基因如lacZ或綠螢光蛋白質可被表現。當然，任何上述 病毒之突變株或變體可藉本發明方法製備（安定），如可為此 等病毒之重組體、雜交、嵌合等型態。其内之許多討論有 關於腺病毒之製備。然而，熟知本技藝者將了解任何適當 病毒可藉本方法安定，尤其氣生病毒。測定特定病毒是否 藉本發明清潔劑予以安定之方法為習知。測量病毒濃度或 活性之典型分析述於後文。 本文所用之’’使腺病毒安定”代表使包括單一類型或多類 型腺病毒（包括腺病毒顆粒或任何數量之顆粒）之製劑安定。 任何適宜濃度之病毒均可藉本發明方法予以安定。例 如’腺病毒濃度範圍可自約lxlO8病毒顆粒/毫升至約lxl〇u 病毒顆粒/毫升。具有多種純度之病毒可藉本發明方法予以 安定。例如，其範圍可自適度純化之製劑至高度純化之製 劑，如藉層析及膜分離步驟（如超過濾）製備之病毒。本發明 特別適用於使高度純化之病毒製劑（如約99 9%純度之均質 製劑9其具有小於0.1%之蛋白質污染）安定。除非另予以安 定，否則此高純度製劑在儲存期間感染力快速損失。例如， 自玻璃自動取樣機小瓶中回收高純度腺病毒（如rP-Hplc 或SEC-HPLC)在室溫儲存1.6小時後僅觀察到約71%，及2小 時後僅觀察到約60%(藉HPLC分析所測量）。該損失相信係 83140 -14- 200307750 (至少部分）由於病毒顆粒吸附至自動取樣機小瓶之壁上之 故，其不欲受理論限制。 病毒可藉各種方式安定化。例如，本發明清潔劑可添加 至腺病毒之意體製劑中；或其可在解凍前、期間或之後， 添加至冷凍腺病毒之容器中；或其可添加至液體製劑中接 著象乾。 測量病毒量（質量、濃度）之方法為例行且習知。就腺病 毒而言，例如可藉HPLC測量病毒顆粒量（如測定蛋白殼蛋 白質如hexon量）或可藉例如顆粒計數測定法測定病毒顆粒 量。此測量偵測可獲得（可測量）病毒質量，如未吸附至含有 該病毒之容器壁上之病毒量。例如參見實例2，其說明使用 RP_HPLC測量病毒濃度。藉由測定及比較兩種或多種不同 殼蛋白成分之量，可測定病毒是否完整。以HPLC測量可偵 測包衣蛋白質分子内之變化（如氧化、去胺化等），其可影響 病毒之例如免疫基因學、生物分布等。 測量病毒活性（如存活率及/或感染力）之方法亦為例行且 習知。就腺病毒而言，例如可藉例如細胞病變（CpE)、終點 稀釋（EPD)或菌斑形成分析測量感染之顆粒數，或可使用 FACS分析如與FITC標記之抗penton(包衣蛋白質）抗體聯合 使用。例如參見Mittereder等人（1996)，病毒學期刊，70， 7498。此測量偵測可提供（可測量）之病毒感染力數量，如未 吸附至其他感染粒子或未吸附至含該粒子之容器壁上之感 染性感染粒子。參見例如實例2，其說明使用終點稀釋法測 量病毒感染力。在表現轉基因之重組腺病毒之例中，腺病 83140 -15- 200307750 毒活性與轉基因表現量有關；因此，該活性可藉定量所表 現轉基因之量或活性而測定。 可在任何各種時間點測量病毒濃度。例如，將病毒組合 物轉移至容器後，其最初可能會快速損失病毒濃度或活性 (可能因病毒黏附至容器壁之故），接下來期間緩慢損失。熟 知本技藝者可在進行分析期間選擇適當時間點，視所研究 之變數而定。 本發明亦包含一種醫藥組合物，其包括有效量之病毒如 腺病毒。本文所用之”有效量’’意指有效達成治療效果之 量。例如包括CF基因之有效量重組腺病毒為當對膀胱纖維 變性病患投藥時可有效降低疾病病徵者。 本發明之醫藥組合物含有任何各種習知醫藥可接受性載 體。較佳具體例中，醫藥組合物為液態，但其亦可為固態（如 凍乾）。本發明之醫藥組合物包括無菌水（如USP等級之注射 用水）及視情況之習知緩衝劑如PBS (pH約6.5至7.5，較好約 7且濃度約0.IX至4X)或Tris (pH約7至8,較好約7.5且濃度約 0.05 Μ至0.1 M)。亦可使用在中性pH有效之其他緩衝劑如 擰檬酸鹽緩衝劑。本發明組合物亦可包括視情況之鹽（如 MgCl2，濃度約1-5 mM，較好約2 mM)及/或調節滲透性/滲 透壓之藥劑如蔗糖（濃度約1-8%，較好約2%(±10%)(重量/ 體積））。 最佳具體例中，本發明之醫藥組合物包括約5xl07至 5xlOu顆粒/毫升之腺病毒（較好為重組腺病毒）、約0.05%(體 積/體積）之Tween 20、約2 mM MgCl2及約2%(重量/體積）蔗 83140 •16· 200307750 糖，於1X PBS中，pH約6.95。視情況，尤其當為醫藥組合 物時，本發明組合物可含有一或多種其他習知醫藥可接受 性賦形劑或安定劑。 本發明調配物在各種容器如玻璃或塑膠容器中可安定， 如由任何各種塑膠材料如聚丙晞、聚乙埽或聚碳酸酿所製 造之小瓶或針筒（如包括内部矽氧塗層之Hypak針筒）或玻 璃如棕色或白色硼矽酸鹽HPLC小瓶。 本發明之醫藥組合物可用於各種治療用途。例如，可表 現治療轉基因-之重組腺病毒可用於基因療法中，其中轉基 因替代缺陷基因，獲得增進之免疫學反應等。 未進一步推敲，相信熟知本技藝者可利用前述敘述，使 用本發明至其最完整之程度。因此，下列較佳特定具體例 可架構為僅用以說明，而非用以限制本發明範圍。 前述及後述實例中，所有溫度未經校正且為攝氏度且所 有份數及百分比均以重量計，除非另有說明。 實例
腺病毒如腺病毒5型藉注射至RP-HPLC管柱上而崩解成 其蛋白質且以乙晴/TFA梯度溶離時該蛋白質分離。獲得特 徵化<蛋白質指紋，其可用於腺病毒製造方法中有些步騾 :疋量及純度分析。然而，除非另經安定，否則已發現病 母蛋白貝產里為可變且隨時間降低，因樣品留下取樣機管 中。 為了研究此性能，高純度之腺病毒樣品在取樣機系統中 83140 -17- 200307750 儲存數小時後9注射至HPLC管柱上。除非另經安定，否則 病毒蛋白質峰之積分面積（如hexon峰以下）（藉習知 RP-HPLC或SEC-HPLC分析測量）P遺著樣品在室溫或4〇C於 取樣機系統中鍺存數小時之時間而降低。例如，在室溫儲 存1.6小時後回收率僅約70%，且儲存2小時後僅約60%。該 損失顯示係（至少部分）由於病毒結合至表面（自動取樣機管 壁）之故；此結合有時受病毒凝集物（病毒結合至其他病毒） 沉澱之調節。 添加數種藥劑以使該等吸附性製程逆作用且測試其使該 組合物安定之能力。樣品於取樣機管中培育任何所需時 間，如約1-20小時。若需要，在所需時間點如分析期間等 距時間點進行分析。其中測試Pluronic、Brij 58及Tween 20 等藥劑。 以Brij 58及Tween 20進行進一步實驗，以測定例如改變 HPLC儲存小瓶種類、儲存溫度、及清潔劑濃度（範圍自0至 〇. 1%體積/體積）之影響。亦評估在清潔劑存在下冷凍病毒樣 品之效果。Brij 58及Tween 20之最佳濃度各約0.05%(體積/ 體積）。在0.1%，兩種清潔劑均出現使病毒部分破裂之結 果。Tween 20使病毒冷象且自HPLC病毒之定量回收率比 Brij 58佳。添加0.05% Tween 20在病毒樣品解象後於自動取 樣機中超過16小時之安定性。 實例2-Tween 20在各種條件下之測試 腺病毒組合物在2-8°C、-20°C或-7〇°C於玻璃或塑膠容器 (如小瓶或針筒）中培育高達1個月（2-8°C)或14個月（-20°C或 83140 -18 - 200307750 -70°C)。内容物屆終點稀釋法或RPHPLC分析法定期分析。 一般實驗結果示於圖1-6且於後文討論。所有條件測試下， 當樣品在Tween 20存在下培育時獲得比無Tween 20更高之 病毒安定性。 實例3-Tween 20在又其他條件下之測試 如實例2般進行測試，但亦測試額外參數如Tween 20之最 佳濃度、在室溫（約20-25°C)及37°C培育、及較長之培育時 間（如達約2-3年或更久）。結果確認在室溫及較長培育期， Tween 20可有效地使腺病毒組合物安定。 由前述描述，熟知本技藝者可易於探究本發明基本特 徵，且在不違離本發明精神及範圍下，可對本發明作各種 改變及修飾用於各種用途及條件。 未進一步推敲，相信熟知本技藝者可使用前述描述，利 用本發明至最完全之程度。因此，前述較佳特定具體例僅 用以說明而非限制他處揭示之範圍。 上述引述之所有申請案、專利及公報之整個揭示均併於 本文供參考。 本發明目的包含： 一種使包括腺病毒之組合物安定之方法，包括於組合物 中添加安定有效量之非離子性清潔劑，該清潔劑包括烷基 部分及聚乙二醇（PEG)部分； 一種使包括腺病毒之組合物安定之方法，包括於組合物 中添加安定有效量之式I之非離子性清潔劑：
R-0-(CH2CH20)x-H I 83140 -19- 200307750 其中X為4-30，及 R為10-70個碳原子之直鏈或分支烷基，其視情況經一或多 個羧基、羧醯胺、鹵素、羥基或胺基、或經可為芳族或環 烷基且亦可為雜環之1-3環之取代基取代，其可視情況經一 或多個燒基、經基、胺基、函素、硝基、次硫酸基、瘦基 或碳醯胺基取代， 或式II之非離子性清潔劑：
H-(OCH2GH2)w-0.^^^〇.(CH2CH2〇)x-H
. (^\ 0-(CH2CH20)y-H II
0 V^O-(OCH2CH2)2-R 其中R為含10至70個碳之_C02R’及W+X+Y+Z=20，其中R▼如 上述R之定義， 或式III之非離子性清潔劑：
R I . H0(CH2CH20)x - (CH-CH20)y - (CH2-CH20)z - Η m 其中R如上述及X為5-100，Υ為25_75及Ζ為50-100， 或式IV之非離子性清潔劑：
R,—~(^\-〇(CH2CH20)x-H IV 其中X為5-15，環A為伸苯基或伸環己基，及Rf為上述之R， 或其組合； 一種使包括腺病毒之組合物安定之方法，包括於組合物 中添加安定有效量之式I之非離子性清潔劑：
R-0-(CH2CH20)x-H I 83140 -20- 200307750 其中 X為 4-30，及R為（CH3)(CH2)Y-，其中 Y為 10-15， 或式II之非離子性清潔劑： h-(〇ch2ch2)w-〇
〇.(CH2CH2〇)x-H o-(ch2ch2o)y-h o-(och2ch2)z-r
II 其中R為CaH(2a+1)C02-，其中a為10至70， 或式III之非離子性清潔劑：
R
I
H0(GH2CH20)x - (CH-CH20)y - (CH2-CH20)z - Η ΠΙ 其中 R為 CH3，X為 55 及 Υ為 29及 Ζ=55 (Pluronic F68)或 R為 CH3，X為 98，Y為 67及Z為 98 (Pluornic F127)， 或式IV之非離子性清潔劑：
R，—ckc^chpvh IV
其中 R’為（CH3)3OCH2C(CH3)2·，A為伸苯基及X為 9_10 (Triton X-100，NP4.0)或R’為（CH3)3C.CH2C(CH3)2-，A為伸環己基及X 為 9-10(還原之Triton X-100)， 或其組合； 一種使包括腺病毒之組合物安定之方法，包括於組合物 中添加安定有效量之式I之非離子性清潔劑：
R-0(CH2CH20)x-H I 其中 R為（CH3)(CH2)Y_ 及 其中 X為 23 及 Y為 12(Brij 35)或 X為 20 及 Y為 12 (Brij 58)， 或式II之非離子性清潔劑： 83140 -21- 200307750
卜(〇CH2CH2)w-〇y_^-(CH2CH2〇)x-H
. (^3~^〇-(CH2CH2〇),H II
〇 \^〇-(〇CH2CH2)rR 其中 R=CiiH23C〇2-(Tween 20)， 或其組合； 如上述之方法，其中清潔劑為聚山梨酸酯20 (Tween 20)， 其中該腺病毒為重組腺病毒，其中腺病毒為適用於基因療 法之腺病毒，其中清潔劑濃度為0.005%至0。1%(體積/體 積），其中該清潔劑濃度為〇·〇5至0.08%(體積/體積）或其中 清潔劑濃度為〇·〇5%(體積/體積）； 一種醫藥組合物，包括藉本發明方法製得之經安定腺病 毒組合物及至少一種醫藥可接受性載體； 一種醫藥組合物，包括°· a) 腺病毒， b) 安定有效量之本發明非離子性清潔劑；及 c) 至少一種醫藥可接受性載體； 其中該腺病毒為適用於基因療法之腺病毒，其中清潔劑 濃度為0.005%至0.1%(體積/體積）、或0.05至0.08%(體積/體 積）或0.05%(體積/體積）； 如本發明之醫藥組合物，其中該腺病毒為適用於基因療 法之腺病毒，該清潔劑為濃度0.05%(體積/體積）之Tween 20,且該醫藥可接受性載體包括2 mMMgCl2及2%蔗糖（重量 /體積）及較好為無菌水。 其他目的包含： 83140 -22- 200307750 一種使包括氣生病毒之組合物安定之方法，包括於組合 物中添加安定有效量之非離子性清潔劑，該清潔劑包括烷 基部分及聚乙二醇（PEG)部分； 一種使包括氣生病毒之組合物安定之方法，包括於組合 物中添加安定有效量之式I之非離子性清潔劑：
R-0-(CH2CH20)x-H I 其中X為4-30，及 R為10-70個碳原子之直鏈或分支烷基，其視情況經一或多 個羧基、羧醯胺、齒素、羥基或胺基、或經可為芳族或環 烷基且亦可為骓環之1-3環之取代基取代，其可視情況經一 或多個烷基、羥基、胺基、由素、硝基、次硫酸基、羧基 或碳醯胺基取代， 或式II之非離子性清潔劑：
H-(OCH2CH2)w-0^_^〇-(CH2CH2〇)x-H
/sf 〇-(ch2ch2〇)，h II
V^O-(〇CH2CH2)z-R 其中R為含10至70個碳之-C02R，及W+X+Y+Z=20，其中R’如 上述R之定義， 或式III之非離子性清潔劑：
R
I H0(CH2CH20)x - (CH-CH20)y - (CH2-CH20)z - Η ΙΠ 其中R如上述及X為5-100，Υ為25-75及Ζ為50-100， 或式IV之非離予性清潔劑： 83140 -23- 200307750 R'
〇(CH2CH2〇)x-H
其中X為5-15，環A為伸苯基或伸環己基，及R’為上述之R， 或其組合， 一種使包括氣生病毒之組合物安定之方法，包括於組合 物中添加安定有效量之式I之非離子性清潔劑：
R-0-(CH2CH20)x-H I 其中 X為 4-30，及R為（CH3)(CH2)Y-，其中 Y為 10-15， 或式II之非離子性清潔劑：
o-(ch2ch2〇)x-h 0-(CH2CH2〇)y-H -〇.(〇CH2CH2)z-R H-(OCH2CH2)w-0 其中R為CaH(2a+i)C〇2_，其中a為10至70， 或式III之非離子性清潔劑：
R
I HQ(CH2CH20)x - (CH^CH20)y - (CH2-CH20)z - Η ΠΙ 其中 R為 CH3, X為 55 及 Υ為 29及 Ζ=55 (Pluronic F68)或 R為 CH3，X為 98，Y為 67及Z為 98 (Pluornic F127)， 或式IV之非離子性清潔劑：
其中 R·為（CH3)3C.CH2C(CH3)2·，A為伸苯基及X為 9-10 (Triton X-100，NP40)或 R·為（CH3)3OCH2C(CH3)2_，A為伸環己基及 X 為 9-10(還原之 Triton X-100)， 83140 -24- 200307750 或其組合； 一種使包括氣生病毒之組合物安定之方法，包括於組合 物中添加安定有效量之式I之非離子性清潔劑： r-o-(ch2ch2o)x-h 其中 R為（CH3)(CH2)Y-及 其中 X為 23 及 Y為 12(Brij 35)或 X為 20 及 Y為 12 (Brij 58)， 或式II之非離子性清潔劑：
0-(CH2CH20)y-H /〇(〇ch2ch2)z-r 其中 R=CuH23C〇2- (Tween 20)， 或其組合； 如上述之方法，其中清潔劑為聚山梨酸酯20 (Tween 20) 或濃度0.005%至0.1%(體積/體積）； 一種醫藥組合物，包括藉本發明方法製得之經安定氣生 病毒組合物及至少一種醫藥可接受性載體； 一種醫藥組合物，包括： a) 該病毒’ b) 安定有效量之本發明非離子性清潔劑；及 c) 至少一種醫藥可接受性載體； 其中清潔劑濃度為0.005%至0.1 %(體積/體積）。 本發明又一目的為使包括腺病毒之組合物安定之方法， 其改良處為添加安定有效量之本發明非離子性清潔劑至該 組合物中。 83140 -25- 200307750 一種組合物，包括氣生病毒或較好腺病毒，及安定有效 量之非離子性清潔劑，其包括烷基部分及聚乙二醇（PEG) 部分；其他較佳目的中，此組合物包括式I-VI之非離子性 清潔劑或上述用於本發明其他組合物之其他次目的。 【圖式簡單說明】 圖1說明Tween 20使在2-8°C於玻璃或塑膠容器中儲存之 腺病毒組合物安定，藉感染力分析測量。 圖2說明Tween 20使在2-8°C於玻璃或塑膠容器中儲存之 腺病毒組合物安定，藉HPLC測量。 圖3說明Tween 20使在-70°C於玻璃或塑膠容器中儲存之 腺病毒組合物安定，藉感染力分析測量。 圖4說明Tween 20使在-70°C於玻璃或塑膠容器中儲存之 腺病毒組合物安定，藉HPLC測量。 圖5說明Tween 20使在_20°C於玻璃或塑膠容器中儲存之 腺病毒組合物安定，藉感染力分析測量。 圖6說明Tween 20使在-20°C於玻璃或塑膠容器中儲存之 腺病毒組合物安定，藉HPLC測量。 83140 26-

Claims (1)

  1. 200307750 拾、申請專利範園： 1. 一種使包括氣生病毒之組合物安定之方法，包括於組合 物中添加安定有效量之式I之非離子性清潔劑： R-0-(CH2CH20)x-H 其中 X為4-30，及R為10-70個碳原子之直鏈或分支烷基， 或式II之非離子性清潔劑：
    〇-(CH2CH2〇)y-H ^〇-(OCH2CH2)z-R 其中R為含10至70個碳之-C02R’及W+X+Y+Z=20，其中R’ 如上述R之定義， 或式III之非離子性清潔劑： H0(CH2CH20)x - (CH-CH20)y - (CH2-CH20)z- Η ΙΠ 其中R如上述及X為5_ 100，Υ為25-75及Ζ為50-100， 或式IV之非離子性清潔劑：
    其中X為5_15,環Α為伸苯基或伸環己基，及R/為上述之R， 或其組合。 2 如申請專利範圍第1項之方法，其中該氣生病毒為腺病 毒。 3 ·如申請專利範圍第2項之方法，其中該腺病毒為表現轉基 83140 200307750 因之重組腺病毒。 ^申叫專利範圍第!項之方法’其中該清潔劑為㈣清潔 劑、聚山梨酸酿（Tween)清潔劑、或pl⑽仏分子、或似 Triton分子。 浚申《月專利範圍第1項〈方法，其中該濃度範圍約〇 〇〇5% 至約0.1% (體積/體積）。 6.如申請專利第5項之方法，其中該濃度範圍約〇〇5% 至約0.08% (體積/體積）。 7’ 一種使包括氣生病毒之組合物安定之方法，包括於組合 物中添加安定有效量之㈣子性清潔劑，該清潔劑包括 燒基部分及聚乙二醇（PEG)部分。 8. 如申請專利範圍第7項之方法，其中該氣生病毒為腺病 毒。 9. 如申請專利範圍第7項之方法，其中該非離子性清潔劑具 有式I所示結構： • R_〇_(ch2ch2o)x-h I 其中 X為4-30，及R為10-70個碳原子之直鏈或分支燒基， 或具有式II結構： h-(〇ch2ch2)w-〇
    〇-(ch2ch2o)x-h .0-(CH2CH20)y-H 〇-(OCH2CH2)rR 其中R為含10至70個碳之-C02R，及W+X+Y+Z=20，其中R， 83140 200307750 如上述R之定義， 或具有式III結構： R I H0(CH2CH20)x - (CH-CH20)y - (CH2-CH20)z - H m 其中R如上述及X為5-100，Υ為25·75及Ζ為50-100， 或具有式IV結構： R·—<^>-〇(αΗ2αΗ2〇)χΉ IV 其中X為5-15,環Α為伸苯基或伸環己基，及R’為上述之R， 或其組合。 10. 如申請專利範圍第9項之方法，其中R經一或多個羧基、 羧醯胺、由素、羥基、胺基或可為芳族或環烷基或亦可 為雜環之1-3環取代。 11. 如申請專利範圍第10項之方法，其中該1-3環可視情況經 一或多個燒基、經基、胺基、鹵素、確基、次硫酸基、 羧基或碳.醯胺基取代。 12. 如申請專利範圍第9項之方法，其中 式1中，11為（(：113)(0：112),，其中丫為10-15; 式 II 中，R為 CaH(2a+1)C02-，其中 a為 10至 70 ; 式III中，R為CH3, X為55及Y為29及Z=55或R為CH3, X 為98，Y為67及Z為98 ;或 式IV中，R’為（CH3)3C，CH2C(CH3)2·，A為伸苯基及X為 9-10或 R’為（CH3)3OCH2C(CH3)2_，A為伸環己基及X為 9_10。 13. 如申請專利範圍第12項之方法，其中式I中，R為 83140 200307750 (CH3)(CH2)Y·、X為 23 及 Y為 12，或 R為（CH3)(CH2)Y-、X為 20及Y為12。 14. 如申請專利範圍第1 2項之方法，其中式I I中R = C11H23CO2-。 15. —種使包括腺病毒之組合物安定之方法，包括於組合物 中添加安定有效量之非離子性清潔劑，該清潔劑包括烷 基部分及聚乙二醇（PEG)部分。 16. —種使包括腺病毒之組合物安定之方法，包括於組合物 中添加安定'有效量之式I之非離子性清潔劑： R-0-(CH2CH20)x-H I 其中X為4-30，及R為10-70個碳原子之直鏈或分支烷基， 或式II之非離子性清潔劑：
    0-(CH2CH20)x-H 0-(CH2CH20)y-H V^O-(OCH2CH2)z-R H-(0CH2CH2)w-0 其中R為含10至70個碳之-C02R·及W+X+Y+Z=20，其中R 如上述R之定義， 或式III之非離子性清潔劑： R H0(CH2CH20)x - (CH-CH20)y - (CH2-CH20)z - Η ΙΠ 其中R如上述及X為5-100，Υ為25-75及Ζ為50-100， 或式IV之非離子性清潔劑： R， -<5 0(CH2CH20)x-H IV 83140 -4- 200307750 其中X為5-15,環A為伸苯基或伸環己基，及R，為上述之R， 或其組合。 17. 18. 19. 如申請專利範圍第16項之方法，其中該烷基經一或多個 幾基、羧醯胺、函素、羥基、胺基或可為芳族或環烷基 或亦可為雜環之1-3環取代。 如申請專利範圍第17項之方法，其中該1-3環可視情況經 一或多個燒基、羥基、胺基、卣素、硝基、次硫酸基、 羧基或碳醯胺基取代。 一種使包括腺病毒之組合物安定之方法，包括於組合物 中添加安定有效量之式I之非離子性清潔劑： R-〇.(CH2CH2〇)x-H I 其中 X為 4-30,及 R為（CH3)(CH2)y-，其中 Y為 10-15， 或式II之非離子性清潔劑： h-(och2ch2)w-o
    0-(CH2CH20)x-H .0-(CH2CH20)y-H V^O-(OCH2CH2)z-R
    其中R為CaH(2a+i)C〇2_，其中a為10至70， 或式III之非離子性清潔劑： R I H0(CH2CH20)x . (CH-CH20)y - (CH2-CH20)z - Η ΙΠ 其中R為CH3，X為55及Υ為29及Ζ=55或R為CH3，X為98， Y為67及Z為98， 或式IV之非離子性清潔劑： 83140 200307750 R·—(AV—〇(CH2CH20)x-H IV 其中1^為（0：113)300：1120((：113)2-，八為伸苯基及又為9_10、或 R’為（CH3)3OCH2C(CH3)2-，A為伸環己基及X為9_10， 或其組合。 20. —種使包括腺病毒之組合物安定之方法，包括於組合物 中添加安定有效量之式I之非離子性清潔劑： R-0-(CH2CH20)x-H I 其中 R為（CH3)(CH2)Y•及 其中X為23及Y為12或X為20及Y為12， 或式II之非離子性清潔劑：
    0-(CH2CH20)x-H 〇-(ch2ch2〇)y-h \-^0-(0CH2CH2)z-R h-(〇ch2ch2)w-o 其中 R=CuH23C〇2· ’ 或其組合.。 21. —種使包括氣生病毒之組合物安定之方法，包括於組合 物中添加安定有效量之式I之非離子性清潔劑： r-o-(ch2ch2o)x-h I 其中X為4-30，及R為10-70個碳原子之直鏈或分支烷基， 或式II之非離子性清潔劑：
    o-(ch2ch2o)x-h .0-(CH2CH20)y-H V—O-(OCH2CH2)z-R h-(〇ch2ch2)w-o 83140 -6- 200307750 其中R為含10至70個碳之-C02R’及W+X+Y+Z=20，其中R’ 如上述R之定義， 或式III之非離子性清潔劑： H0(CH2CH20)x - (CH-CH20)y - (CH2-CH20)z - H m 其中R如上述及X為5-100，Υ為25-75及Ζ為50-100， 或式IV之非離子性清潔劑：
    R， 0(CH2CH20)x-H IV 其中X為5-15,環A為伸苯基或伸環己基，及R’為上述之R， 或其組合，其濃度範圍約0.005%至約0.1%(體積/體積）。 22. 如申請專利範圍第21項之方法，其中該烷基經一或多個 羧基、羧醯胺、函素、羥基、胺基或可為芳族或環烷基 或亦可為雜環之1-3環取代。 23. 如申請專利範圍第22項之方法，其中該1-3環可視情況經 一或多假燒基、經基、胺基、鹵素、硝基、次硫酸基、 羧基或碳醯胺基取代。 24. —種使包括氣生病毒之組合物安定之方法，包括於組合 物中添加安定有效量之式I之非離子性清潔劑： R-0-(CH2CH20)x-H I 其中 X為 4_30，及 R為（CH3)(CH2)Y-，其中 Y為 10_15， 或式II之非離子性清潔劑： h-(〇ch2ch2)w-〇
    0-(CH2CH20)x-H o-(ch2ch2o)y-h II V^O-(OCH2CH2)z-R 83140 200307750 其中R為CaH(2a+1)C02-，其中a為10至70， 或式III之非離子性清潔劑： R I H0(CH2CH20)x - (CH-CH20)y - (CH2-CH20)z - η m 其中R^CH3，X為55及Υ為29及Ζ=55或R為CH3，X為98， Y為67及Z為98， 或式IV之非離子性清潔劑： R，一(^a\—〇(CH2CH2〇)x-H IV 其中11?為（(^3)3〇(：112(：((：113)2_，八為伸苯基及乂為9-10、或 R，為（CH3)3C.CH2C(CH3)2_，A為伸環己基及X為9_10， 或其組合。 25. —種使包括氣生病毒之組合物安定之方法，包括於組合 物中添加安定有效量之式I之非離子性清潔劑： R-〇.(CH2CH20)x-H 1 其中R為(.CH3)(CH2)Y-及X為23及Y為12或x為20及Y為12， 或式II之非離子性清潔劑： ^ f 0-(GH2CH20)y-H II ^V-〇-(OCH2CH2)z-R 其中 R為 R=CuH23C02_， 或其組合。 26. —種使包括氣生病毒之組合物安定以降低病毒量或活性 損失之方法，包括於組合物中添加安定有效量之式1之非 83140 -8 - 200307750 離子性清潔劑： R-0-(CH2CH20)x-H I 其中 X為4-30，及R為10-70個碳原子之直鏈或分支烷基， 或式II之非離子性清潔劑： H-(0CH2CH2)w-0 〇-(CH2CH2〇)x-H /y 0-(CH2CH20)y-H II 0 v—〇-(〇CH2CH2)z-R 其中R為含i〇至70個碳之_C02R’及W+X+Y+Z=20，其中R’ 如上述R之定義， 或式III之非離子性清潔劑： 、 R 1 H0(CH2CH20)x - (CH-CH20)y - (CH2-CH20)z- H m 其中R如上述及X為5-100，Υ為25-75及Ζ為50-100， 或式IV之非離子性清潔劑： • R，—^y-〇(CH2CH2〇)x-H IV 其中X為5-15,環A為伸苯基或伸環己基，及ΪΤ為上述之R， 或其組合，其中病毒量或活性損失，在約2-8°C、室溫、 37°C、-20°C或-70°C —段既定時間後，與不存在有該非離 子性清潔劑時之損失相較，係小於約30%。 27. 如申請專利範圍第26項之方法，其中該損失小於約10%。 28. 如申請專利範圍第27項之方法，其中該損失小於約5%。 29. 如申請專利範圍第28項之方法，其中該損失小於約2%。 83140 -9- 200307750 30. —種醫藥組合物，包括氣生病毒及安定有效量之式I之非 離子性清潔劑： R.〇.(CH2CH20)x-H 其中 X為4-30，及R為10-70個碳原子之直鏈或分支烷基， 或式II之非離子性清潔劑：
    其中R為含10至70個碳之-C02R*及W+X+Y+Z=20，其中R’ 如上述R之定義， 或式III之非離子性清潔劑： R I H0(CH2CH20)x - (CH-CH20)y - (CH2-CH20)2. H m 其中R如上述及X為5-100，Υ為25-75及Ζ為50-100， 或式IV之非離子性清潔劑：
    其中X為5-15,環Α為伸苯基或伸環己基，及R’為上述之R， 或其組合，及至少一種醫藥可接受性載體、鹽或賦形劑。 31. 如申請專利範圍第30項之醫藥組合物，其中該氣生病毒 為腺病毒。 32. 如申請專利範圍第30項之醫藥組合物，其中該清潔劑為 83140 -10- 200307750 Brij清潔劑、聚山梨酸酯（Tween)清潔劑、或pluronic分子、 或似Triton分子。 33. 如申請專利範圍第30項之醫藥組合物，其中該非離子性 清潔劑濃度範圍約〇·〇〇5%至約0· 1% (體積/體積）。 34. 如申請專利範圍第33項之醫藥組合物，其中該濃度範圍 約0.05%至約0.08% (體積/體積）。 35. 如申請專利範圍第34項之醫藥組合物，其中該濃度約 〇·〇5% (體積/體積）。 36. —種醫藥組合物，包括腺病毒、濃度約0.05%(體積/體積） 之Tween 20、及包括2 mM MgCl2、2%蔗糖（重量/體積）及 水之醫藥可接受性載體。 37. —種醫藥組合物，包括： a) 腺病毒； b) 安定有效量之式I之非離子性清潔劑： R-0-(CH2CH20)x-H 其中 . X為4-30，及R為10-70個碳原子之直鏈或分支烷基， 或式II之非離子性清潔劑：
    0-(CH2CH20)y-H /〇-(〇ch2ch2)z-r 其中R為含10至70個碳之-C02R·及W+X+Y+Z=20，其中R’ 如上述R之定義， 或式III之非離子性清潔劑： 200307750 R I m HO(CH2CH20)x - (CH-CH2〇)v - (CH2-CH20)z - Η Π 其中R如上述及X為5_ 100，Y為25-75及Z為50-100， 或式IV之非離子性清潔劑： R·
    IV 其中X為5-15,環A為伸苯基或伸環己基，及R’為上述之R， 或其組合；及 c)至少一·種醫藥可接受性載體。 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 如申請專利範圍第37項之組合物，其中該腺病毒為重組 腺病毒。 如申請專利範園第37項之組合物，其中該腺病毒為適用 於基因療法之重組腺病毒。 如申請專利範園第37項之組合物，其中該非離子性清潔 劑存在濃度範圍約0.005%至約01% (體積/體積）。 如申請專.利㈣第15項之方法，其中該清潔劑存在濃度 範圍約0.005%至約〇·ι% (體積/體積）。 如申請專利範圍第1 5項之女、土 ^ , 不貝<万法，其中該腺病毒為重組腺 病毒。 如申請專利範圍第42項之古、车 ^ ^ <万决，其中該腺病毒為適用於 基因療法之重組腺病毒。 一種醫藥組合物，包括蕪私士、士 土 精如申1目專利範圍第1項之方法製 造之經安定腺病毒組合物 0物及至少一種醫藥可接受性載 體0 83140 •12- 200307750 45. —種醫藥組合物，包括藉如申請專利範園第1項之方法製 造之經安$氣生病毒組合物及至少一種醫藥可接受性載 體。 46. 如申請專利範圍第25項之方法，其中該清潔劑為聚山梨 酸 g旨 20 (Tween 20)。 47. 如申請專利範圍第7項之方法，其中該清潔劑濃度為 0.005%至0.1%(體積/體積）。 48. —種醫藥組合物，包括： a) 氣生病毒， b) 安定有效量之式I之非離子性清潔劑： R.〇-(CH2CH20)x-H 其中 X為4-30，及R為10-70個碳原子之直鏈或分支烷基， 或式II之非離子性清潔劑： H-(0CH2CH2)w-0
    o-(ch2ch2o)x-h 0-(CH2CH20)y-H \^o-(och2ch2)z-r 其中R為含10至70個碳之-C02R，及W+X+Y+Z=20，其中R’ 如上述R之定義， 或式III之非離子性清潔劑： H0(CH2CH20)x - (CH-CH20)y - (CH2-CH20)z - Η ΠΙ 其中11如上述及乂為5-100，丫為25-75及2為50-100, 或式IV之非離子性清潔劑： 83140 -13- 200307750 -R·
    〇(ch2ch2〇)x-h IV 其中X為5-15,環A為伸苯基或伸環己基， 或其組合；及 及汉’為上述之R， 49 50 51. c)至少一種醫藥可接受性載體。 如申請專利範圍第48項之組合物，其中該清潔劑濃度為 0.005%至〇·1%(體積/體積）。 如申請專利·範圍第”頁之方法，其中該烷基經一或多個羧 基、羧醯胺、鹵素、羥基、胺基或可為芳族或環烷基或 亦可為雜環之1-3環取代。 如申請專利範圍第49項之方法，其中該υ環可視情況經 或多個燒基、經基、胺基、卣素、硝基、次硫酸基、 羧基或碳醯胺基取代。 83140 14-
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