TR201904291A2 - TETRAHYMENA THERMOPHILA YAPAY KROMOZOMU 2 (TtAC2) VE REKOMBİNANT PROTEİN ÜRETİMİNDE KULLANIMI - Google Patents
TETRAHYMENA THERMOPHILA YAPAY KROMOZOMU 2 (TtAC2) VE REKOMBİNANT PROTEİN ÜRETİMİNDE KULLANIMI Download PDFInfo
- Publication number
- TR201904291A2 TR201904291A2 TR2019/04291A TR201904291A TR201904291A2 TR 201904291 A2 TR201904291 A2 TR 201904291A2 TR 2019/04291 A TR2019/04291 A TR 2019/04291A TR 201904291 A TR201904291 A TR 201904291A TR 201904291 A2 TR201904291 A2 TR 201904291A2
- Authority
- TR
- Turkey
- Prior art keywords
- artificial chromosome
- sequence
- tetrahymena
- nts
- tetrahymena thermophila
- Prior art date
Links
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 title claims abstract description 99
- 241000248384 Tetrahymena thermophila Species 0.000 title claims abstract description 64
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 title description 19
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 title description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 138
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 62
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 48
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 claims abstract description 37
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 claims abstract description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 35
- 210000002231 macronucleus Anatomy 0.000 claims abstract description 18
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 18
- 102100040407 Heat shock 70 kDa protein 1B Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 101710093640 Heat shock 70 kDa protein 1B Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 7
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 98
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 98
- 241000223892 Tetrahymena Species 0.000 claims description 46
- 241001092905 Thermophis Species 0.000 claims description 26
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 26
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 20
- 241000223782 Ciliophora Species 0.000 claims description 18
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 17
- 241001123204 Tetrahymenidae Species 0.000 claims description 14
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 13
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 10
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 8
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 2
- 241001136792 Alle Species 0.000 claims 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 claims 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 25
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 21
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 21
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 21
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 18
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 13
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 12
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 10
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 8
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 7
- 101100536484 Tetrahymena thermophila BTU2 gene Proteins 0.000 description 7
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- UOZODPSAJZTQNH-UHFFFAOYSA-N Paromomycin II Natural products NC1C(O)C(O)C(CN)OC1OC1C(O)C(OC2C(C(N)CC(N)C2O)OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)N)OC1CO UOZODPSAJZTQNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 6
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000011194 good manufacturing practice Methods 0.000 description 6
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 6
- UOZODPSAJZTQNH-LSWIJEOBSA-N paromomycin Chemical compound N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](N)C[C@@H](N)[C@@H]2O)O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)N)O[C@@H]1CO UOZODPSAJZTQNH-LSWIJEOBSA-N 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 5
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 5
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- 229960001914 paromomycin Drugs 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 101150090732 MTT1 gene Proteins 0.000 description 4
- 108020001027 Ribosomal DNA Proteins 0.000 description 4
- 101100444397 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) ECM32 gene Proteins 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 238000010304 firing Methods 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 3
- 108091081400 Subtelomere Proteins 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 description 3
- BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N cadmium atom Chemical compound [Cd] BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 108700022487 rRNA Genes Proteins 0.000 description 3
- 108091005946 superfolder green fluorescent proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930183010 Amphotericin Natural products 0.000 description 2
- QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N Amphotericin A Natural products OC1C(N)C(O)C(C)OC1OC1C=CC=CC=CC=CCCC=CC=CC(C)C(O)C(C)C(C)OC(=O)CC(O)CC(O)CCC(O)C(O)CC(O)CC(O)(CC(O)C2C(O)=O)OC2C1 QGGFZZLFKABGNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000763159 Tetrahymena thermophila CU428 Species 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- 229940009444 amphotericin Drugs 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 2
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 2
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 101710163595 Chaperone protein DnaK Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010018746 Growth accelerated Diseases 0.000 description 1
- 101150004157 HSP70-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710178376 Heat shock 70 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101710152018 Heat shock cognate 70 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101710113864 Heat shock protein 90 Proteins 0.000 description 1
- 102100034051 Heat shock protein HSP 90-alpha Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000519695 Ilex integra Species 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 101001024425 Mus musculus Ig gamma-2A chain C region secreted form Proteins 0.000 description 1
- 108010047956 Nucleosomes Proteins 0.000 description 1
- 241000223792 Paramecium tetraurelia Species 0.000 description 1
- 208000020584 Polyploidy Diseases 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241001239637 Tetrahymena thermophila SB210 Species 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000003190 augmentative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000003592 biomimetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000009133 cooperative interaction Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 210000003933 germline micronucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000025308 nuclear transport Effects 0.000 description 1
- 210000001623 nucleosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 101150093826 par1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 102000053632 repetitive DNA sequence Human genes 0.000 description 1
- 108091035233 repetitive DNA sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- -1 therapeutic drugs Proteins 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Mevcut buluş, SEQ ID NO: 4 ile en az %80 homolog bir nükleotid dizisine sahip olan ve SEQ ID NO: 1’e sahip modifiye edilmiş bir HSP70.2 promotoru, SEQ ID NO: 2’ye sahip 3´NTS dizisi ve SEQ ID NO: 3’e sahip “C3 orijin içeren 5´NTS, rDNA genleri ve 3´NTS” dizisi ihtiva eden Tetrahymena thermophila yapay kromozomu (TtAC2) ile ilgilidir. Tetrahymena thermophila makroçekirdek rDNA minikromozomunun biyotaklit edilmesi ile oluşturulmuş Tetrahymena thermophila yapay kromozomu ayrıca bir telomer dizisi, Neo4 kaseti ve TtsfGFP belirteç gen kaseti ihtiva etmektedir. Mevcut buluş kapsamında ayrıca, söz konusu Tetrahymena thermophila yapay kromozomunun elde edilmesi için bir yöntem sağlanmaktadır. Mevcut buluş diğer bir yönüyle Tetrahymena thermophila yapay kromozomun bir üretim sistemi/platformu olarak kullanılmasıyla homolog ve/veya heterolog genomik DNA, RNA ve/veya proteinler ve/veya türevlerini rekombinant olarak üretmek üzere bir yöntem sunmaktadır. Mevcut buluş diğer bir yönüyle Tetrahymena thermophila yapay kromozomunun homolog ve/veya heterolog genomik DNA, RNA ve/veya proteinleri ve/veya türevlerini rekombinant olarak üretmek amacıyla bir üretim sistemi/platformu olarak kullanımını sağlamaktadır.
Description
Tarifname
TETRAHYMENA THERMOPHILA YAPAY KROMOZOMU 2 (TtACZ)
VE REKOMBINANT PROTEIN ÜRETIMINDE KULLANIMI
Bulusun Ilgili Oldugu Alan
Mevcut bulus, SEQ ID NO: 4 ile en az %80 homolog olan bir nükleotid dizisine sahip olan ve SEQ
SEQ ID NO: 3'e sahip "C3 orijin içeren 5'NTS, rDNA genleri ve 3'NTS” dizisi ihtiva eden
Tetrahymena thermophi'la yapay kromozomu (TtACZ) ile ilgilidir. Tetrahymena thermophila
makroçekirdek rDNA minikromozomunun biyotaklit edilmesi ile olusturulmus Tetrahymena
thermophi'la yapay kromozomu ayrica bir telomer dizisi, Neo4 kaseti ve TtsfGFP belirteç gen
kaseti ihtiva etmektedir. Daha spesifik olarak mevcut bulus, içerdigi telomer dizisi sayesinde
dogrusal veya dairesel formlarda kullanilabilen, bir kolunda “C3 orijin içeren S'NTS, rDNA genleri
ve 3'NTS" dizisi, diger kolunda ise 3'NTS dizisi, Neo4 kaseti ve bir belirteç gen kaseti ihtiva eden,
yapisindaki modifiye edilmis HSP70.2 promotoru sayesinde isi soku indüklenmesiyle
rekombinant protein üretiminde kullanilabilen bir Tetrahymena thermophi'la yapay kromozomu
ile ilgilidir.
Teknigin Bilinen Durumu
Biyotaklit [Biyomimetikj, bir problem çözme veya var olan bir sistemin gelistirilmesi amaciyla
dogadaki model ve sistemlerin taklit edilmesi anlamina gelmektedir. Bu bilim dali sayesinde,
makro veya nano düzeydeki biyolojik çözümlerden esinlenen pek çok teknoloji gelistirilmistir.
Ekspresyon vektörlerinin biyotaklit ilkeleri ile olusturulmasiyla, transformasyon verimliligi ve
hücre içi kararliligi yüksek vektörler elde edilmesi mümkün olmaktadir. Hücrelerin kendilerine
ait yabani tip yapilari ile biyotaklit ürünlerini ayirt edemeyecegi benzerlikte vektörler
olusturulmasi, moleküler biyoloji alanindaki biyotaklit uygulamalarinin amacidir.
Tetrahymena thermophi'la silli ökaryotik tek hücreli bir organizmadir ve en iyi karakterize edilmis
tek hücreli ökaryotlardan biridir. Tetrahymena thermophi'la iki çekirdek tasir: transkripsiyonel
olarak inaktif diploid kalitsal üremeyi saglayan mikroçekirdek (MIK) ve transkripsiyonel olarak
aktif poliploid somatik makroçekirdek (MAK). Tetrahymena thermophila'nin biyolojik ve
biyoteknolojik çalismalarda rekombinant protein ekspresyonu için alternatif bir model
organizma olarak kullanimi uzun süredir bilinmektedir. Organizma, ilgili alanlarda sagladigi
avantajlar sebebiyle odak noktasi olmustur. Bu avantajlar arasinda, hücre bölünme süresinin
kisaligi [optimal kosullar altinda üreme süresi 1.5-3 saat araligindadir), üretilen proteinlere post-
translasyonel modifikasyonlar ekleme yetenegi ve laboratuvarda uygun maliyetli ve kolay bir
sekilde yetistirilebilmesi sayilabilir (AP. Turkewi'tz, E. Orias, G. Kapler, 2002. Functionalgenomics:
the coming of age for Tetrahymena thermophila, Trends Genel: 18 35-40; Weide, T., Herrmann, L.,
Bockau, U., Niebur, N., Aldag, I., Laroy, W., Contreras, R., Tiedtke, A. ve Hartmann, M. W., 2006.
Secretion offuncti'onal human enzymes by Tetrahymena thermophila. BMC Bi'otechnol, 6: 19). Bu
sebeple, Tetrahymena thermophi'lahin rekombinant protein üretimi amaciyla verimli ve etkili bir
sekilde kullanilmasi büyük önem tasimaktadir. Organizmaya ilgilenilen bir geni veya genleri
transforme etmek için mikroenjeksiyon, elektroporasyon ve biyolistik silah dahil olmak üzere pek
çok yöntem kullanilmaktadir [Cassidy-Hanley, D., et. al. 1 997. Germli'ne and somatlc transformation
Tetrahymena hücrelerini karistirmali tank (batch), beslemeli-karistirmali tank [fed-batch] ve
sürekli beslemeli (continuous) biyoreaktörler ile yaklasik 2x107 hücre/ml hücre yogunlugu, 80
g/L kuru hücre agirligi ile 1000 L tank hacmi büyütme (scale-up] degerlerine ulasilarak üretmek
mümkündür. Tipik bir reaktör süresi, inokülasyondan ürün toplamaya [harvest] kadar yaklasik
3-4 gün almaktadir.
Tetrahymena ribozomal RNA genleri [rDNA] en iyi karakterize edilmis ökaryotik genlerden
biridir (Yu, G. L., Hasson, M., & Blackburn, E. H., 1988. Ci'rcular ribosomal DNA plasmids transform
Tetrahymena thermophi'la by homologous recombi'nati'on with endogenous macronuclear ribosomal
DNA. Proceedi'ngs ofthe NationalAcademy ofSci'ences ofthe United States ofAmeri'ca, 85(14}, 5151 -
). rDNA genleri, Tetrahymena orijin bölgesini tasiyan 5'NTS, subtelomerik bölgeleri içeren 3'NTS
ve telomer dizisi ile birlikte palindromik olarak iki adet seklinde Tetrahymena'nin minikromozom
adi verilen 21 kbç büyüklügündeki kromozomlarini (rDNA kromozomu] olustururlar. Bu rDNA
kromozomlari, organizmanin makroçekirdeginde ekstrakromozomal olarak yaklasik 9000
kopyaya ulasirlar. Tetrahymena rDNA genleri ve orijin dizisi içeren vektörler, sahip olduklari
avantajlardan dolayi organizmaya istenilen genlerin transformasyonu isleminde araci olarak
siklikla kullanilmaktadirlar [Blomberg P, Randolph C, Yaa CH, Yao MC., 1997. Regulatorysequences
for the amplifi'cati'on and replicati'on of the ribosomal DNA minichromosome in Tetrahymena
extrachromosomal rDNA molecule from the ci'li'ate Tetrahymena thermophi'la strain BI868VII.
kaseti, antibiyotik direnç geni, orijin ve telomer gibi elementlerin hepsi ayni anda bulunmamakta
olup, kullanimda olan bu vektörler etkin transformasyon ve sonrasinda uzun süreli muhafazaya
uygun bir kombinasyonla olusturulmamislardir.
Klonlama vektörü bir baska DNA parçasini bir konakçi organizmaya tasimak için araç olarak
kullanilabilen bir DNA parçasi olarak tanimlanabilir. Klonlama vektörleri bir virüsten, prokaryotik
bakteri hücrelerinden ya da daha yüksek bir organizma hücresinden elde edilen DNA dizilerinin
birlestirilmesi ile olusturulabilir. Klonlama vektörleri, bir nükleik asit dizisinin konakçi
organizmaya transfer edilmesi ve konakçi içerisinde DNA dizisinin miktarsal olarak arttirilmasi
için kullanilan araci DNA dizileridir. Ideal bir klonlama vektörünün sahip oldugu özellikler su
sekilde siralanabilir: konakçi organizmada rekombinasyon ya da mutasyon yoluyla istenmeyen
degisikliklere yol açabilecek DNA elemanlari içermemesi, organizmaya transferinden sonra
seleksiyona yardimci bir gen bulundurmasi, bir DNA parçasinin klonlanabilecegi bölge içerecek
sekilde tasarlanmis olmasi, kontrol edilebilir ve kararli kopya sayisi saglayan bir orijin bölgesi
tasimasi, vb.
Yapay kromozomlar hem klonlama vektörü hem ekspresyon vektörü olarak kullanilirlar. Plazmid
veya lambda-faj türevi vektörlerin tasima kapasitesinden daha büyük DNA parçalarini
tasiyabilirler. Diger klonlama vektörleri gibi yapay kromozomlar da, vektörün ve vektör
ürününün konakçi hücredeki replikasyonu ve stabilitesi için gerekli olan nükleik asit elemanlarini
içerir. Bu kisimlar hücre bölünmesinden sonra yavru hücrelerdeki vektörün kopya sayisinin
sürekliligini saglarlar. Yapay kromozomlar, birkaç genin koordineli olarak ekspresyonunda veya
büyük genler tarafindan kodlanan proteinlerin kararli, kontrollü ve yüksek düzeyde üretiminde
ideal olarak kullanilan vektörlerdir. US 8,288,610 B2 patent belgesi yapay kromozomlar içeren
bitki hücre hatlarinin hazirlanmasina iliskindir. Ilgili patent basvurusunda ayrica yapay
kromozomlara heterolog nükleik asit eklenmesi, yapay kromozomlarin seçili hücrelere
yönlendirilmesi ve yapay kromozomlarin izole edilmesi konu edilmistir. Bahsedilen yapay
kromozomlar bitki hücrelerine yönlendirilmistir.
Antibiyotik direnç kasetleri klonlama ile vektör yapilandirmasinda kullanilan önemli araçlardir.
Antibiyotik direnci, pozitif transformantlarin kolayca ve etkili bir sekilde seçilmesini saglar.
Vektörü içeren transformant hücreler seçilen antibiyotik varliginda büyüyebilir, bu da
transformasyonun basarili oldugunu ve vektörün hücre içinde islevini yerine getirdigini kanitlar.
Tetrahymena thermophila'da rekombinant protein üretimi yaygin olarak kullanilmaktadir.
Fonksiyonel insan enzimleri dahil olmak üzere farkli türlerden çok sayida protein,
Tetrahymena'nin ekspresyon sistemi olarak kullanilmasiyla üretilmistir (Weide T., Herrmann L.,
Bockau U., Niebur N., Aldag I., Laroy W., Contreras R., Tiedtke A., Hartmann M. W, 2006. Secreti'on of
functional human enzymes by Tetrahymena thermophila. BMC Biotechnol. 6:19). Bu nedenle,
organizmaya özgü çesitli vektörler ve promotorlar gelistirilmistir. Bununla birlikte, mevcut
tekniklerin ve araçlarin, yukarida tarif edilen avantajlari yaninda dezavantajlari da vardir. Ilk
olarak, kullanilan vektörler çogunlukla daireseldir. Kullanimi ve transformasyonu kolay olmakla
birlikte, dairesel vektörler transforme edilebilir nükleik asit baz çifti sayisini sinirlar. Bu da, büyük
gen dizilerinin kodladigi proteinlerin vektörler tarafindan üretimini zorlastirir. Ayrica, metabolik
yolaklar isbirligi içinde çalisan birkaç genin ekspresyonunu gerektirir. Bu nedenle, daha büyük
gen dizileri tasiyabilen ifade sistemleri gereklidir. Mevcut vektörler hakkinda çözülmesi gereken
bir baska problem, transformasyon verimliliginin yüksek düzeyde olmamasidir. Kopyasal
verimlilik ve kararlilik, özellikle proteinin büyük miktarlarda üretilmesi gerekiyorsa, bir vektörün
sahip olmasi gereken önemli özelliklerindendir.
Tetrahymena thermophi'la'da rekombinant protein üretimi için çalisilan promotorlar arasinda en
yaygin kullanilan promotorlardan biri MTTl promotorudur. MTTl, Tetrahymena thermophila'da
heterolog veya homolog genlerin yüksek seviyeli ekspresyonunu saglamak için kullanilan
indüklenebilir-baskilanabilir bir promotordur. Tetrahymena thermophi'la'nin Cd-indüklenebilir
metallotionin genine (MTTI) aittir. Promotorun aktivasyonu ve deaktivasyonu, kadmiyumun
eklenmesi veya ortamdan kaldirilmasi ile gerçeklestirilir. Protein üretimi için etkili bir promotor
olmasina ragmen, Cd agir bir metal oldugundan bu promotor iyi üretim uygulamalari için uygun
degildir. Agir metaller zehirlidir ve hücre büyümesini engeller. Ayrica, kontamine olmus
besiyerinin imha edilmesi zaman ve kaynak gerektirmektedir, çünkü agir metaller çevre ve insan
için de bir tehdit olusturmaktadir. Konakçi organizma, insan ve çevre üzerinde daha az olumsuz
etkiye sahip farkli bir promotorun kullanimi faydali olacaktir.
yanit proteinleridir. Bu proteinleri kodlayan genler, isi ile oldugu gibi diger stres faktörleri ya da
dis etkenler ile de uyarilabilir. Bu da hücrelerin, yüksek sicaklik gibi bir stres durumunda, yüksek
seviyelerde HSP'ler üreterek tepki verdigi anlamina gelir. HSP'lerin düzenlenmesi kapsamli
olarak çalisilmistir ve HSP promotorlarinin güçlü ve etkili promotorlar oldugu görülmüstür.
Ayrica, üretim sürecinde kimyasal maddelere ihtiyaç duymadan sicaklik degisiklikleri ile basitçe
aktive edilip devre disi birakilabilirler. Bu nedenle, isi soku promotorlari, rekombinant çalismalar
için uygundur ve yüksek seviyelerde kontrollü heterolog gen ekspresyonu için kullanilabilir. WO
HSP90 promotorunun kullanimi hakkindadir. Ilgili promotorun silli Tetrahymena thermophi'la'da
promotor dizisi GFP belirteç geninin ekspresyonunda kullanilmistir. Bu patent basvurusunda
uzunlugundaki HSP70.2 promotor dizisi ve genin mRNA'sinin 5'UTR bölgesini, l-lSP'7Ü.2 geninin
ATG baslangiç kodonundan itibaren protein kodlayan 21 bç uzunlugundaki kismini ve 6 bç
uzunlugundaki BamHI restriksiyon enziminin klonlama bölgesini içermektedir.
Yukarida belirtilen hususlar göz önüne alindiginda, Tetrahymena thermophila'da rekombinant
protein ekspresyonunda bir iyilestirme gerekli görülmektedir. Tetrahymena thermophila
organizmasinin organizmal fabrika olarak kullaniminin yayginlastirilmasi, özellikle de
DNA/RNA/protein kaynakli ilaç-enzim-hormon üretim çalismalarinda protein ekspresyon
platformu olusturmak için vektör sistemi gelistirilmesi bulusun amaçlari arasindadir.
Sekillerin Kisa Açiklamasi
Sekil 1, TtACZ yapay kromozomunu olusturan elemanlari ve dizileri, bu elemanlarin alindigi
vektörleri ve TtACZ yapay kromozomunun dairesel formunu göstermektedir.
Sekil 2, A. TtAC2 dairesel ve dogrusal yapilari, B. TtsfGFP geninin expresyonunun SDS-PAGE
görüntüsü, C. TtsfGFP geninin expresyonunun western blot görüntüsü, 1: ThermoFisher Scientific
PageRulerTM Plus Prestained Protein Ladder, 10 ila belirteç DNA olarak
kullanilmistir ve içerisinde ayrica pozitif kontrol olarak 6xHis-TtsfGFP [~27 kDa) bulunmaktadir,
2: Par+ TtACZ dairesel yapay kromozomu içeren hücre toplam proteini, 3: Par+ TtAC2 dogrusal
yapay kromozomu içeren hücre toplam proteini, 4: Par- TtACZ dairesel yapay kromozomu içeren
hücre toplam proteini, 5: Par- TtACZ dogrusal yapay kromozomu içeren hücre toplam proteini, D.
TtACZ yapay kromozomuna sahip hücrelerde seleksiyon sonrasi 5. ayda TtsfGFP geninin
ekpresyonunun floresan mikroskop analizi ve E. TtACZ yapay kromozomuna sahip hücrelerde
seleksiyon sonrasi 24. ayda gerçeklestirilen TtsfGFP geninin ekpresyonunun floresan mikroskop
analizini göstermektedir.
Bulusun Ayrintili Açiklamasi
Bu ayrintili açiklamada, mevcut bulusa konu olan Tetrahymena thermophii'a yapay
kromozomunun elde edilme asamalari ve rekombinant protein üretimi için kullanimi, konunun
daha iyi anlasilmasi için tarif edilmektedir.
Bahsedilen yapay kromozom, tek hücreli bir ökaryotik organizma olan Tetrahymena thermophila
ve Tetrahymenidae familyasi üyesi diger siliat konak hücreler için tasarlanmistir. Bulusun amaci,
hücre içi kararliligini uzun süre koruyan bir yapay kromozom olusturarak rekombinant proteinler
üretmek ve Tetrahymena thermophfla'mn ekspresyon sistemi olarak kullaniminda verimliligini
arttirmaktir. Mevcut bulus olan bu yapay kromozom [TtACZ] Tetrahymena thermophi'la rDNA
minikromozomunun biyotaklitinin yapilmasiyla gelistirilmistir.
Biyoloji alaninda Tetrahymena thermophila iyi çalisilmis bir organizmadir. Kisa üreme süresiyle
yüksek hücre yogunluklarina ulasabilme, laboratuvarda düsük maliyetle ve kolay sekilde
yetistirilebilme ve üretilen proteinlerde post-translasyonel modifikasyonlari gerçeklestirebilme,
bu organizmanin yaygin olarak kullanilmasinin nedenlerinden bazilaridir. Bu son özellik, özellikle
ökaryotik kökenli proteinlerin üretiminde gereklidir, çünkü post-translasyonel modifikasyonlar
ökaryotlarda protein fonksiyonunda önemli rol oynarlar. Bu nedenle, ökaryotik bir organizma
olan Tetrahymena thermophi'la, rekombinant protein üretiminde prokaryotik konakçi
organizmalara kiyasla bazi avantajlar saglar.
Yapay kromozomlar; orijin dizisi, telomer dizisi, seleksiyon için gerekli antibiyotik direnç kaseti
ve indüklenebilir bir promotor gibi gerekli elemanlarin laboratuvar kosullarinda çogaltilmasi ve
bir araya getirilmesiyle olusturulur. Bu "vektör iskeleti'ne" daha sonra ilgili protein veya enzimin
gen dizisi eklenir. Mevcut bulusta, iskelet elemanlarinin kaynagi olarak kullanilan vektörler
pUC19 [Yanisch-Perron C, Vieiraj, Messing f., 1985. Improved M13 phage cloning vectors and host
(Machizuki, K., 2008. High effici'ency transformation of Tetrahymena using a coden-optimized
neomyci'n resistance gene. Gene, 425{1), 79-83] olarak tercih edilmistir.
Mevcut bulusun yapay kromozomu bir yönüyle, SEQ ID NO: 1'e sahip modifiye edilmis bir HSP70.2
promotoru, SEQ ID NO: Z'ye sahip bir 3'NTS dizisi ve SEQ [D NO: 3'e sahip "C3 orijin içeren 5'NTS,
rDNA genleri ve 3'NTS” dizisi ihtiva eder.
Bulusun spesifik bir HSP70.2 promotoru, TtsfGFP kaseti içinde yer almakta olup SEQ ID NO: 1'de
verilen nükleotid dizisine sahiptir. Bu dizide, rekombinant proteinlerin N-ucuna istemsiz eklenen
yapay 11 amino asitlik HSP7Ü protein dizisini kodlayan gen bölgesinin ATG kodonunun G [guanin]
bazinin T [timin) bazi ile mutasyon yoluyla degistirilmesi ile kodon ATT dönüstürülmüs ve
böylece 11 amino asidi kodlayici dizi kodlayamaz forma modifiye edilmistir. Buna ek olarak,
HSP70.2 promotor dizisinin 3' ucundaki Pmel enzim kesim dizisinden önce bir A (adenin) bazi
eklenmistir.
Tetrahymena thermophi'la'da kullanilmak üzere birçok vektör ve promotor gelistirilmistir.
Tetmhymena thermophi'l'a'nin Cd-indüklenebilir metallotionin genine ait MTT1 promotoru,
rekombinant protein üretiminde yaygin olarak kullanilmaktadir. Bununla birlikte, Cd agir bir
metaldir ve Cd ile indüksiyon hem organizmaya hem de çevreye zarar verir. Bu nedenle Cd-
indüklenebilir promotorlar, iyi üretim uygulamalari açisindan elverisli degildir. Diger taraftan, isi
soku promotorlari, isi veya diger stres kosullari ile indüklenirler. Tüm ökaryotik hücrelerde
bulunan isi soku genlerine aittirler. Transkripsiyonun indüksiyonu ve sonlandirilmasi, büyüme
sicakliginin arttirilmasi veya azaltilmasi ile gerçeklestirilebilir. Dolayisiyla, mevcut bulusun
spesifik modifiye edilmis HSP70.2 promotoru, iyi üretim uygulamalarina uygun bir sekilde
büyüme sicakliginin arttirilmasi ile indüklenebilmesi sebebiyle önemli ve avantajlidir.
Mevcut bulusa ait Tetrahymena thermophila için üretilen yapay kromozom bir 3'NTS dizisi (SEQ
SB210 susu genomik DNA'sindan spesifik primerlerle çogaltilabilir ve yapay kromozomu elde
etmek için bir vektör iskeleti dizisine eklenebilir. Bulusun spesifik 3'NTS dizisi, Tetrahymena
thermophila'da rDNA minikromozomu subtelomerik dizilerini içerir ve telomerler ile telomere
yakin genlerin kararli bir sekilde çalismasini saglar. Böylece yapay kromozomun hücre içerisinde
kalma süresinin arttirilmasina yardimci olur. Buna ek olarak 3'NTS dizisi, rekombinant protein
üretimi için gerekli gen kasetleri ile telomer dizileri arasinda yer alarak, genlerin
transkripsiyonunda meydana gelebilecek olasi telomer baskisini durdurur.
Mevcut bulusa ait Tetrahymena thermophila yapay kromozomu ayrica, “C3 orijin içeren 5'NTS,
rDNA genleri ve 3'NTS" dizisi [SEQ ID NO: 3] ihtiva eder. Mevcut bulusun spesifik rDNA lokusu ve
C3 ori dizisi Tetrahymena thermophi'la C3.368.1 susu rDNA minikromozomundan spesifik
primerlerle çogaltilarak, mevcut bulusun vektör iskeletine eklenebilir. TtACZ yapay
kromozomunun bir kolunu olusturan rDNA lokusu ve C3 ori dizisi, Tetrahymena thermophi'la
rDNA minikromozomunun biyotaklit edilmesi ve transformasyon sonrasi uzun süreli biyolojik
muhafazasi açisindan önemlidir.
Mevcut bulusun bir yönünde, söz konusu vektör iskeleti pUC19 vektörüdür. Bulusun spesifik
vektör iskeleti, klonlama bölgesindeki restriksiyon enzimi çesitliligi, vektör boyutunun küçük
olmasi (2.6 kbç] ve orta seviye kopyali orijine (100+) sahip olmasi dolayisi ile avantajlidir.
Mevcut bulusun bir açidan, Tetrahymena thermophi'i'a için üretilen yapay kromozomda ayrica bir
telomer dizisi ihtiva eder. Mevcut bulus baglaminda, bahsedilen telomer dizisi pPXV-GFP
vektöründen kesilebilir, çogaltilabilir ve yapay kromozomu elde etmek için bir vektör iskeleti
dizisine eklenebilir. Bulusa ait telomer kaseti, TtACZ yapay kromozomunun kullanimina dairesel
ya da dogrusal bir biçimde izin verdigi için önemli ve avantajlidir. Dogrusal vektör kullanimi,
vektöre eklenebilen sinirli dizi büyüklügü kisitinin kalkmasi avantajini sunar. Dolayisiyla yapay
kromozomun dogrusal formu, daha fazla gen kaseti eklendiginde de vektörün kullanilabilir
olmasini saglamaktadir. Bu yönüyle mevcut bulus, nispeten büyük protein(leri) kodlayan
gen(ler]i ve/veya birkaç genin koordineli çalismasini gerektiren metabolik yolaklari arastirmak
için faydalidir. Mevcut bulusun telomer kaset dizisi, dairesel vektörü dogrusal vektöre döndürmek
için Sfil enzimi ile iki ucundan kesilen ve salinan bir parça dizi içermektedir.
Mevcut bulusa ait Tetrahymeno thermophi'la yapay kromozomu ayrica bir Neo4 neomisin direnç
kaseti ihtiva eder. Mevcut bulusun spesifik Neo4 kaseti, pNe04 vektöründen spesifik primerlerle
çogaltilarak mevcut bulusun vektör iskeleti pUC19'a eklenebilir. MTT1 promotoru yoluyla CdCIz
ile indüklenebilen Neo4 kaseti, içerdigi Tetrahymena thermophilaýa kodon optimize edilmis
neomisin direnç kaseti sayesinde pozitif transformantlarin artan antibiyotik baskilamasi ve
azalan kadmiyum indüklemesi ile etkili bir sekilde seçilimine imkan tanimasi açisindan
elverislidir.
Mevcut bulusa ait Tetrahymena thermophi'lo yapay kromozomu ayrica bir belirteç gen kaseti ihtiva
eder. Elde edilen yapay kromozomun, konakçi organizmada rekombinant protein üretimini
yönlendirebildigini göstermek için, TtsfGFP-öxHis geni içeren ekspresyon kaseti pVTtsfGFP
vektöründen alinmis ve bazi dizisel degisiklikler yapilarak bir belirteç gen olarak TtACZ'ye
yerlestirilmistir (Yilmaz, G., & Arslonyolu, M. 2015. Emcient expression of codon-adopted ojjînity
tagged super folder green fluorescent protein for synchronous protein Iocali'zati'on and offini'g/
puri'fication studies in Tetrahymeno thermophila. BMC biotechnology, 15(1), 22). Kasette yer alan
modifiye edilmis HSP7Ü.2 promotorunun [SEQ ID NO: 1] 151 ile indüklenebilmesi ve bu sayede
belirteç genin üretiminin kimyasallara gerek kalmadan gerçeklesmesini saglamasi elverisli bir
üretime imkan saglamaktadir.
Mevcut bulusa ait Tetrohymena thermophi'la yapay kromozomu (TtACZ) tarafindan TtsfGFP-6XHis
proteininin üretilebilmesi, kromozom yapilandirmasinin ve transformasyonunun basarili
oldugunu ve TtACZ'nin hücrede etkili bir sekilde çalistigini kanitlamaktadir. sfGFP proteini
floresan isigi yayar, bu özellik sayesinde izlenmesi kolaylasir. Bulusta kullanilan belirteç genin
yerine, homolog ve/veya heterolog genomik DNA, RNA ve/veya proteinler ve/veya türevlerini
kodlayan bir DNA dizisi eklenebilir. Bu sayede mevcut bulus ait yapay kromozom, Tetrahymena
thermophila'da istenilen herhangi bir dizinin rekombinant üretimi için kullanilabilir.
Böylelikle mevcut bulusun yapay kromozomu, bir kolunda “C3 orijin içeren 5'NTS, rDNA genleri
ve 3'NTS” dizisi (SEQ lD NO: 3] ve diger kolunda ise 3'NTS dizisi (SEQ ID NO: 2), Neo4 kaseti ve
TtsfGFP belirteç gen kaseti bulunacak sekilde yapilandirilir. Her iki kolda bulunan gen kas etlerinin
transkripsiyon yönü merkezden telomerlere dogru olacak sekilde yapilandirilir, bu sayede DNA
replikasyonu ve transkripsiyonda görev alan komplekslerin ortaya çikabilecek olasi karsilasmasi,
biyotaklit ile azaltilmis olur.
Mevcut bulusun tercih edilen yapilanmasinda, bulus kapsaminda yapilandirilan Tetrohymena
thermophila yapay kromozomu [TtACZ] SEQ ID NO: 4'e en az %80 homolog olan bir nükleotid
dizisine sahiptir.
Mevcut bulusa ait Tetrahymena thermophi'la yapay kromozomu ihtiva ettigi telomer kaseti
sayesinde, istege bagli olarak dairesel veya dogrusal formda bulunabilmektedir. Mevcut bulusun
spesifik telomer kaset dizisi, dairesel kromozomun dogrusal kromozoma dönüstürülmesi için Sfil
enzimi ile iki ucundan kesilip salinabilen bir parça dizi ihtiva etmektedir. Dogrusal formdaki yapay
kromozomun uçlarinda yer alan telomer dizilerinin muhafazasi, 3'NTS dizileri ile saglanmaktadir.
Mevcut bulus bir baska yönü ile, yukarida tanimlanan Tetrahymena thermophila yapay
kromozomunu (TtACZ) üretmek için asagidaki adimlari içeren bir yöntem saglamaktadir:
- Tetrahymena thermophila yapay kromozomu için vektör iskeletinin sunulmasi,
- iskelet vektöre modifiye edilmis bir HSP, bir telomer
dizisi, bir 3'NTS dizisi [SEQ ID NO: 2), bir Neo4 kaseti ve "C3 orijin içeren 5'NTS, rDNA
genleri ve 3'NTS" dizisinin (SEQ ID NO: 3) rDNA minikromozomu biyotaklit edilerek
yerlestirilmesi, ve
- yapay kromozomun elde edilmesi.
Mevcut bulusa ait yöntemin tercih edilen uygulamasinda, söz konusu yöntem vektör iskelete
ayrica TtsfGFP belirteç gen kaseti veya homolog ve/veya heterolog genomik DNA, RNA ve/veya
proteinler ve/veya türevlerini kodlayan bir DNA dizisinin yerlestirilmesi adimini ihtiva
etmektedir.
Mevcut bulusa ait yöntemin bir uygulamasinda, söz konusu vektör iskeleti pUC19'dur, böylece
yöntem sonucunda elde edilen Tetrahymena thermophila yapay kromozomu SEQ ID NO: 4 ile en
az %80 homolog olan bir nükleotid dizisine sahip olmaktadir.
Mevcut bulus diger bir yönüyle, Tetrahymena thermophi'la yapay kromozomunun bir üretim
sistemi/platformu olarak kullanilmasiyla homolog ve/veya heterolog genomik DNA, RNA ve/veya
proteinleri ve/veya türevlerini rekombinant olarak üretmek için bir yöntem sunmaktadir. Söz
konusu yöntem asagidaki adimlari ihtiva etmektedir:
- makroçekirdegin rDNA minikromozomunda C3 orijin alleli disindaki çekinik bir allel
içeren bir Tetrahymena thermophi'la veya Tetrahymenidae familyasi üyesi bir siliat
konak hücrenin sunulmasi,
- makroçekirdek rDNA minikromozomunda baskin C3 orijini ihtiva eden dairesel
ve/veya dogrusal Tetrahymena thermophil'a yapay kromozomunun [TtAC2) C3 orijin
alleli disindaki çekinik bir allel içeren bir Tetrahymena thermophi'la veya
Tetrahymenidae familyasi üyesi bir siliat konak hücrenin makroçekirdegîne
ekstrakromozomal olarak entegre edilmesi, ve
- Tetrahymena thermophi'la yapay kromozomunda tasinan DNA, RNA ve/veya
proteinleri kodlayan bir homolog ve/veya heterolog dizinin kodladigi DNA, RNA
ve/veya proteinin ve/veya türevlerinin Tetrahymena thermophi'la veya
Tetrahymenidae familyasi üyesi bir siliat konak hücre tarafindan üretilmesi.
Tetrahymena hücrelerine yeni olusturulan vektörlerin transferinde genellikle mikroenjeksiyon,
elektroporasyon veya biyolistik silah yöntemleri tercih edilmektedir. Mevcut bulusa ait yöntemin
tercih edilen uygulamalarinda, yapay koromozomun transferi için biyolistik silah yöntemi
kullanilmaktadir. Tetrahymena thermophi'la yapay kromozomu biyolistik silah yöntemi
kullanilarak Tetrahymena thermophi'la veya Tetrahymenidae familyasi üyesi bir siliat konak
hücrenin makroçekirdegine yönlendirilebilir.
Mevcut bulusa ait yöntemin tercih edilen uygulamalarinda, söz konusu Tetrahymena thermophila
veya Tetrahymenidae familyasi üyesi bir siliat konak hücre kültürize edilmis vejetatif bir siliat
hücresi veya konjugasyon yapan iki siliat hücresi olarak bulunmaktadir.
Mevcut bulus bir baska yönüyle, bulusa ait Tetrahymena thermophila yapay kromozomunun bir
üretim sistemi/platformu olarak kullanilmasiyla homolog ve/veya heterolog genomik DNA, RNA
ve/veya proteinleri ve/veya türevlerini rekombinant olarak üretme yöntemi sonucunda elde
edilmis, en az bir homolog ve/veya heterolog dizi tasiyan TtACZ'nin transformasyonu ile
olusturulmus transformant Tetrahymenidae familyasi üyesi siliat konak hücre sunmaktadir.
Mevcut bulus baska bir yönüyle, Tetrahymena thermophi'la yapay kromozomunun homolog
ve/veya heterolog genomik DNA, RNA ve/veya proteinleri ve/veya türevlerini rekombinant
olarak üretmek amaciyla bir üretim sistemi/platformu olarak kullanimini saglamaktadir.
Dolayisiyla mevcut bulus modifiye edilmis bir HSP7Ü.2 promotoru (SEQ ID NO: 1), bir 3'NTS dizisi
(SEQ ID NO: 2) ve "C3 orijin içeren 5'NTS, rDNA genleri ve 3'NTS" dizisinin (SEQ ID NO: 3) pUC19
vektör iskeletine yerlestirilmesi ile olusturulmustur. Mevcut bulus kapsaminda vektör iskeletine
ayrica bir telomer dizisi, Neo4 neomisin direnç kaseti ve TtsfGFP belirteç gen kaseti
yerlestirilmektedir. Bu yapisiyla mevcut bulus, Tetrahymena thermophi'la'da veya
Tetrahymenidae familyasi üyesi bir siliat konak hücrede rekombinant protein üretimi için
kullanilabilecek yeni bir yapay kromozom vektörüdür. Söz konusu Tetrahymena thermophila
yapay kromozomu, SEQ ID NO: 4» ile en az %80 homoloji gösterir.
A) Tetrahymena Thermophi'la Yapay Kromozomunun (TtACZ) Yapilandirilmasi
Bulusa konu olan TtACZ yapay kromozomunun yapilandirilmasinda, E. coli' klonlamasinda altyapi
vektörü olarak pUC19 vektörü kullanilmistir (Yani'sch-Perron, C., Vlei'ra, j., & Messi'ng, ]. 1985.
restriksiyon enzimi çesitliligi, vektör boyutunun küçük olmasi [2.6 kbç) ve orta seviye kopyali
orijine (100+) sahip olmasidir. Biyotaklit tasarimina göre pUC19 vektörüne sirasiyla 3'NTS
bölgesi (1.8 kbç), Neo4 kaseti [2 kbç), TtsfGFP kaseti [2 kbç], telomer bölgesi [2.4 kbç] ve C3 orijini
içeren rDNA gen lokusu (10.6 kbç] klonlanmistir [Sekil 1). Bu adimlar sonucunda TtACZ yapay
kromozomu elde edilmistir. Tetrahymena thermopliila yapay kromozomu TtACZ'yi olusturan
elementler, dizilisleri ve yapay kromozomun büyüklügü Tetrahymena thermophlla
makroçekirdek rDNA kromozomuna biyotaklit ile benzetilmistir [Sekil 1).
Yabani tip Tetrahymena rDNA kromozomu sentromer içermez, benzer sekilde TtAC2 yapay
kromozomu da sentromer içermemektedir. Yapay kromozomda transkripsiyon yönü merkezden
telomerlere dogru olacak sekilde yapilandirilmistir. Böylelikle bir kolunda rDNA lokusu diger
kolunda ise belirteç gen (TtsfGFP) ve Ne04 kasetleri olacak sekilde bir yapay kromozom elde
edilmistir. Dairesel formda kullanilabilen TtACZ yapay kromozomu, telomer bölgeleri arasinda
yer alan Sfil kesim bölgesinden kesilerek dogrusal formda da kullanilabilmektedir. TtACZ yapay
kromozomunun dairesel ve dogrusal formlari ile dairesel formun dogrusal forma dönüsümü Sekil
2-A'da gösterilmektedir.
1. 3'NTS Elementinin (3'n0n-transcribed spacer) Eklenmesi
Tetrahymena thermophi'la makroçekirdek rDNA kromozomlarinin her iki ucunda, telomer ve
rDNA gen dizisi arasinda kalan bölgede birer k0pya olarak 3'NTS bölgesi bulunmaktadir. 3'NTS
bölgesi telomer iliskili DNA dizisi içerir. Bu telomer alti bölgelerin görevlerinden biri DNA
lokusunu içeren kromozomlarin uç bölgelerinin replikasyonunu ve muhafazasini saglamaktir
(Challoner, P. U., Amin, A. A., Pearlman, R. E., & Blackburn, E. H. 1985. Conservea' arrangements of
repeated DNA sequences i'n nontranscri'bed spacers of ci'li'ate ribosomal RNA genes: evi'a'ence for
transkripsiyon ve translasyon sonlandirici tekrarli DNA dizilerinden olusan elementleri
içermeleridir. Son olarak ise, bu bölgeler telomer bölgesinde nükleozomlarin olusumundan
sorumlu olup kromozomun DNA-protein kompleksine paketlenmesine yardimci olurlar (Budarß
M. L., Blackburn, E. H. 1986. Chromati'n structure of the telomeri'c region and 3'-nontranscrlbed
1.8 kbç uzunlugundaki 3'NTS dizisini Polimeraz Zincir Reaksiyonu [PZR] ile üretmek için kaynak
DNA olarak Tetrahymena thermophil'a SB210 irkindan saflastirilmis genomik DNA kullanilmistir.
Ilgili ileri ve geri primerler kullanilarak 3'NTS bölgesi üretilmîstir. Üretilen 1.8 kbç uzunlugundaki
3'NTS dizisinin uçlari ile pUC19 vektörü, Kpnl (Thermo, #EROSZ 1] ve Baml-lll [Thermo,
vektörü ve 3 'NTS dizisi %0,6'11k agaroz jelde görüntülenmis ve 365 nm dalga boyundaki UV kabini
altinda jelden kesilmistir. Daha sonra ilgili dizi ve vektör, jelden saflastirma kiti (Thermo, Genelet
Gel Extraction Kit, #K0691] kullanilarak saflastirilmistir. Yapiskan uçlu 3'NTS dizisi ve pUC19
vektörü T4 DNA ligaz (NEB, MOZOZS) enzimi ile 16 saat boyunca 16°C'de inkübe edilerek
birlestirilmis ve E. coli'XLIBlue kompotent hücrelerine 42°C'lik isi soku ile transforme edilmistir.
37°C'de 16 saat inkübasyon sonrasi transformant kompotent hücrelerden master tabak
(amfisilin-LB agar içeren] yapilmis, seçilmis kolonilerin PZR ile taramasi yapilmistir. PZR ürünleri
eklenmis LB sivi besiyerine, seçilen pozitif koloniler ekilerek inkübasyona alinmis ve 16 saat
sonrasinda Thermo GeneJET plasmid miniprep kit (#KOSOZ] ile plazmidler saflastirilmistir. Bu
islemler sonucunda pUC. pUC19-3'NTS
vektörünün basarili olarak üretildigi, KpnI-BamHl restriksiyon enzimleriyle yapilan çiftli kesim
parmak izi analizi ve Sall [Thermo, #ER0642) enzimleri ile tekli kesim yapilarak dogrulanmistir.
Bundan sonraki klonlama asamalari da benzer sekilde gerçeklestirilmistir.
2. Ne04 Gen Kasetinin Eklenmesi
Neo4 kaseti, agir metal kadmiyum ile tetiklenebilen MTTl promotoru ve BTUZ sonlandirma dizisi
içeren paramomisine dirençli Neo4 geni içermektedir. Bu kaset, yapay kromozom yapisina vektör
içeren pozitif Tetrahymena thermophila hücrelerinin seçilebilmesi için eklenmektedir.
PZR reaksiyonunda kaynak DNA olarak pNeo4 (Mochi'zuki, K., 2008. High effi'ci'ency transformati'on
of Tetmhymena using a codon-opti'mi'zed neomyci'n resistance gene. Gene, 425(1), 79-83] vektörü
kullanilmis ve PZR reaksiyonu ile 2 kbç uzunlugundaki DNA çogaltilmistir. Söz konusu 2 kbç
uzunlugundaki DNA bandi agaroz jelden saflastirilmistir. pUC19-3'NTS [TtAC2.1] vektörü ve
Neo4 gen kaseti, Sall [Thermo, #ER0642] ve BamHII (Thermo, #EROÜSZJ restriksiyon enzimleri
kullanilarak yapiskan uçlu hale getirilmis ve ligasyon ile birlestirilmistir. Elde edilen vektör E. coII'
XL1Blue kompotent hücrelerine 42°C'lik isi soku ile transforme edilmistir. Koloni PZR ile pozitif
koloniler saptanmistir. Plazmid izolasyonu sonrasinda, çiftli Sall (Thermo, #ER0642] ve BamHIl
vektörünün basarili bir sekilde olusturuldugu dogrulanmistir [Sekil 1).
3. TtsfGFP Gen Kasetinin Eklenmesi
Bulus kapsaminda GFP gen kaseti, Tetrahymena thermophila yapay kromozomu TtACZlnin
kullanilmasiyla rekombinant protein, terapötik ilaç veya enzimlerin üretilebilirligini göstermek
amaciyla, belirteç gen olarak kullanilmistir. Rekombinant protein üretiminde promotor
tetikleyicisi olarak toksik maddelerin veya agir metallerin kullanimi “Iyi Üretim Uygulamalari”
(IÜU veya GMP] kurallarina uygun bulunmamaktadir. Bu yüzden GFP gen kasetinde, fiziksel
olarak 151 soku ile tetiklenebilen ve iyi üretim uygulamalarina uygun olan modifiye HSP70.2
promotoru kullanilmistir. Ayrica transkripsiyon ve translasyon durdurucu BTU2 terminasyon
dizisi de bu kasette yer almaktadir. HSP70.2 promotoru [Heat Shock Promotor) (Barchetta, 5., La
Terza, A., Ballarini, P., Pucciarelli, S., & Miceli, C. 2008. Combination oftwo regulatory elements in
the Tetrahymena thermophila HSP70-1 gene controls heat Shock activation. Eukaijiotic cell, 7[2),
robust inducible-repressible promotergreatly facilitates gene knockouts, conditional expression, and
overexpression ofhomologous and heterologous genes in Tetrahymena thermophila. Proceedings of
kaset sentetik olarak Shinegene Firmasi'na ürettirilmistir.
Sentetik olarak ürettirilen ve pUC57 vektörüne klonlanmis olan HSP70.2 promotoru ile BTU2
dizileri PZR reaksiyonuyla çogaltilmistir. Bu reaksiyonla; HSP70.2 promotor dizisinin 3' ucuna
Ascl restriksiyon dizisi, BTU2 terminasyon dizisi öncesine ise Pmel restriksiyon dizisi eklenmistir.
Yapay kromozom tasarimina TtsfGFP gen kasetinin eklenebilmesi için, pVTtsfGFP vektöründen
TtsfGFP geni Ascl ve Pmel restriksiyon dizisi içeren primerlerle çogaltilmistir (Yilmaz, G., &
Arslanyolu, M. 2015. Ejýîcient expression of codon-adapted affinity tagged super folder green
fluorescent protein for synchronous protein locolization and aßinity purification studies in
Tetrahymena thermophila. BMC biotechnology, 150], 22). TtsfGFP geni l-lSP7Ü.2 promotoru ile
BTU2 dizileri arasina örtüsen PZR yöntemi ile yerlestirilmis ve birlestirme sirasinda ayrica
TtsfGFP'nin C' ucuna 6xHis afinite takisini kodlayici dizi de eklenmistir. Örtüsen PZR teknigi ile
birlestirilen Cfr9l-HSP70.2/TtsfGFP-6xl-lis/BTU-BamHl gen ekspresyon kaseti içeren vektörün
DNA'sinin E. coli'ye transformasyonu gerçeklestirilmistir. Pozitif E. coli transformantlarindan
saflastirilan vektör DNA'si ve uçlari yapiskan hale getirilmis TtsfGFP-6XHis kaseti agaroz jelden
saflastirilan pUC19-3'NTS-Neo4 (TtAC2.2] vektörü ile hazirlanmis olan TtsfGFP-ßxl-lis kaseti
ligasyon ile birlestirilmis, E. coli'ye transforme edilmistir. Koloni PZR islemleri ile taranip bulunan
pozitif klonlardan izole edilen plazmid, BamHl ve Cfr91 enzimleriyle çift enzim kesimine, EcoRl ve
Hindlll enzimleriyle ise tek enzim kesimlerine alinmis ve TtsfGFP-öxHis gen kasetinin varligi teyit
edilmistir. Yeni olusturulan bu vektör pUC olarak
isimlendirilmistir [Sekil 1).
Tasarlanan yapay kromozomun hem dairesel hem de dogrusal olarak kullanimi planlanmaktadir.
Dogrusal formda kromozomun uçlarinin korunmasi için biyotaklite uygun olarak telomerlerin de
kromozomun uçlarina eklenmesi gerekmektedir. Telomer dizileri genel olarak dogrusal
kromozom uçlarinin kararliligmin korunmasi, uçlarda DNA replikasyonun tamamlanmasi, mayoz
ve karyokinesis sirasinda nükleer tasimanin gerçeklestirilmesi gibi roller üstlenmektedirler (Kirk,
K. E., Blackburn, E. H. 1995. An unusual sequence arrangernent in the telomeres of the germ-line
micronucleus in Tetrahymena thermophila. Genes & development, 9(1), 59-71).
Tetrahymena thermophila telomer kaseti, pPXV-GFP vektörünün [Hauser, K., Haynes, W. 1., Kung,
C., Plattner, H., 8: Kissmehl, R. [2000). Expression of the green fluorescent protein in Paramecium
tetraurelia. European journal of cell biology, 79(2), 144-149) kaynak DNA olarak kullanildigi, Apal
ve XhoI restriksiyon enzimlerini uygun konumlara ekleyen primerlerin kullanildigi PZR
reaksiyonu ile 2.4 kbç uzunlugundaki ürün olarak üretilmistir. Satlastirilmis pUC19-3'NTS-Neo4-
TtsfGFP [TtAC2.3) vektörü ve telomer kaset dizisi, Apal (Thermo, #ER1411] ve Xhol (Thermo,
islemleri sonrasinda olusan pUCl9-3'NTS-Neo4-TtsfGFP-Telomer (TtAC2.4] vektörünün telomer
kaset dizisi içerdigi, Xhol ve Apal çiftli enzim kesimi ve SfiI tekli enzim kesimiyle dogrulanmistir
. Tetrahymena thermophila "C3 orijin içeren S'NTS, rDNA genleri ve 3'NTS" Dizisinin
Eklenmesi
Yabani tip 21 kbç uzunlugundaki Tetrahymena thermophila makroçekirdek rDNA kromozomu,
orijin bölgesi (5'NTS) [Reischmann, K. P., Zhang, Z., & Kapler, G. M. 1999. Long range cooperative
interactions regulate the initiation of replication in the Tetrahymena thermophila rDNA
dizisini palindromik oryantasyonda 2 kopya olarak içermekte olup uçlarda telomer ile
korunmaktadir. Tetrahymena thermophila rDNA orijin dizisini içeren 5'NTS allelleri
farklilasmistir ve B tipi allel 42 bazlik delesyonundan dolayi C3 tipi allele kiyasla dezavantajli
durumdadir. Allellerin rDNA replikasyon üstünlügü veya baskinlik siralamasi C3>B>C3 rmml
veya C3 rmm4 seklindedir [Yaeger, P. C., Orias, E., Shaiu, W. L., Larson, D. D., & Blackburn, E. H. 1989.
The replication advantage ofa free linear rRNA gene is restored by somatic recombination in
Tetrahymena thermophila. Molecular and cellular hiology, 9(2), 452-460). Palindromik iki kopya
olarak bulunan bu rDNA lokusunun [5'NTS-rDNA genleri-B'NTS) sadece bir kopyasinin
bulunmasi ile olusturulan dairesel vektörlerden elde edilen transformant hücrelerin bu vektörün
kopyalarini makroçekirdek genomu içinde kararli olarak muhafaza ettigi gösterilmistir (Yu, G. L.,
ribosomal' DNA plosmi'd vector. Proceedi'ngs of the National Academy of Sciences, 86(21), 8487-
8491). Ayrica, delesyon olmaksizin bütün palindromik rDNA gen lokusunu içeren pMND-1
vektörü, 9.000 kopya sayisina ulasmistir (Blomberg, P., Randolph, C., Yaa, C. H., & Yao, M. C. 1997.
Regulatory sequencesfor the amplificati'on and repli'ccition ofthe ribosomal DNA minichromosome
Bu literatür bilgileri isiginda, biyotaklit prensipleri kullanilarak en az 1'er kopya “C3 orijin içeren
'NTS, rDNA genleri ve 3'NTS” dizilerinin kullanilmasina ihtiyaç duyulmustur. Makroçekirdek
bölünmesini takip eden DNA replikasyonu esnasinda allelik baskinlik saglanabilmesi amaciyla, C3
orijin içeren yabani tip Tetrahymena thermophi'la C3.368.1 irkindan [Stock ID: SD0026, Cornell
University Tetrahymena Stock Center] genomik DNA saflastirilarak, kaynak olarak kullanilmistir.
C3 orijine sahip yapay kromozomlar, B orijine sahip Tetrahymena thermophila CU428 irkina
transforme edilmistir. Böylelikle transformantlar C3>B allelik baskinlik antibiyotik seçilimi ile
yönlendirilerek, vejetatif hücre makroçekirdeginde yapay kromozom kopya sayi artisi
saglanmistir.
Büyük boyutlu bir dizi olan 10.3 kbç uzunlugundaki "C3 orijini içeren 5'NTS-rDNA genleri-B'NTS”
dizisi çogaltilacagindan dolayiI Herculase Fusion DNA Polymerase ll enzimi (Agilent, #600675] ve
kaynak DNA olarak da yabani tip Tetrohymena thermophi'la C3.368.1 irkindan saflastirilmis
genomik DNA kullanilarak PZR reaksiyonu gerçeklestirilmistir. PZR reaksiyonunun asamalari su
sekilde Optimize edilmistir: 2 dakika 92°C baslangiç denatürasyonu, 10 döngü olacak sekilde 10
artacak sekilde] 68°C uzama ve bir kerelik 68°C son uzama. Böylece iki asamali PZR
reaksiyonunun ilk asama ürünü üretilmistir. Bu PZR ürünü ikinci reaksiyonda DNA kaynagi olarak
kullanilarak, miktari arttirilmistir.
Ikinci PZR asamasi sonrasinda 10.3 kbç uzunlugundaki "C3 orijini içeren 5'NTS-rDNA genleri-
3'NTS” dizisi içeren PZR ürünü jelden saflastirilmis, küt uçlu p]ET1.2/blunt klonlama vektörüne
CloneJet PCR Cloning Kit (Thermo, #K1231) ile entegre edilmistir. Klonlanan bölgenin büyüklügü
PZR ile, DNA dizisi ise DNA dizi analizi ile dogrulanmistir. Sonrasinda "C3 orijin içeren 5'NTS,
rDNA genleri ve 3'NTS” dizisini içeren DNA parçasini tasiyan p]ET1.2/blunt vektörü içeren E. 0011'
klonu üretilerek vektör saflastirilmis ve Xhol-Cfr9l [Thermo, #ER0691 - #ER1171) çiftli enzim
kesimi uygulanmis 10.3 kbç'lik DNA parçasi jelden saflastirilmistir. Daha sonra, ayni enzimlerle
kesilerek saflastirilmis yapay kromozom ara vektörü [TtAC2.4] ve “C3 orijin içeren 5'NTS, rDNA
genleri ve 3'NTS” dizisi ligasyon islemine alinmistir. Ligasyon sonrasinda olusan vektör TtAC2.5
olarak isimlendirilmistir. Klonlama asamalari sonrasinda klonlama, TtAC2.5*nin hem çiftli Xhol-
Cfr91 kesimi, hem de tekli Apal ve Xbal kesimleri ile dogrulanmistir.
TtAC2.5 vektörünün endüstriyel kullaniminin kolaylastirilmasi amaciyla, TtsfGFP ve Ne04
kasetlerinin Xma-Sall enzim kesimiyle [TtAC2.3 vektör yapisinda görülen Neo-ii ile TtsfGFP
kasetleri arasinda bulunan] BamHl restriksiyon enzim kesim bölgesinin silinmesi baslatilmistir.
TtsfGFP gen kasetinde bulunan HSP70.2, TtsfGFP geni ve BTU2 dizisinde gerçeklestirilen bazi
tasarimsal degisiklikler de bu asamada yapilmistir. Bunlardan ilki HSP70.2 promotorunun 3'
ucunda yer alan olasi lRES elementi dizisindeki N-ucuna istemsiz eklenen yapay 11 amino asitlik
HSP70 protein dizisini kodlayan bölgenin “ATG” kodonunun G (guanin) bazinin T [timin] bazina
mutasyon ile dönüstürülmesidir. Bu islem spesifik bir primer kullanilarak PZR yöntemiyle
gerçeklestirilmistir. Ayrica PZR primerleri ile çogaltilma sirasinda HSP70.2 promotor dizisinin 3'
ucundaki Pmel enzim kesim dizisinden önce bir A [adenin) bazi eklenmistir. TtsfGFP ileri
primerine Prnel dizisi ve geri primerine ise Ascl dizisi yerlestirilmistir. BTU2 dizisinin geri
primerine de SfaA] enzim kesim dizisi yerlestirilmistir. Modifiye edilmis HSP70.2 promotoru,
TtsfGFP geni ve BTU2 dizilerinin örtüsen PZR ile birlestirilmesiyle TtsfGFP gen kaseti tekrar elde
edilmistir. Neo4 kaseti dizisinde bir degisiklik yapilmamistir, ancak ileri primerine BamHl yerine
SfaAl restriksiyon enzimi tanima dizisi eklenmistir. TtsfGFP ve Ne04 kasetleri örtüsen PZR ile
birlestirilerek, XmaI-Sall enzimleri ile vektöre entegre edilmistir. Bu asamalar sonucunda TtACZ
yapay kromozomu [SEQ lD NO: 4) elde edilmistir. TtACZ yapay kromozomunun dizisel dogrulugu
DNA dizi analizi yapilarak teyit edilmistir [Sekil 1).
B) Tetrahymena thermophila Yapay Kromozomunun [TtACZ] Vejetatif Hücrelere Biyolistik
Silah Yöntemi ile Transformasyonu
Tasarlanan kromozom DNA'larinin altin tanecikleri ile kaplanarak biyolistik silah yardimiyla
belirli basinç altinda hücre içine gönderilmesi, hücre içinden geçerken de yapay kromozom
(TtACZ) vektör DNA'larinm çekirdege transferi saglanir.
Transformasyonu yapilacak vektörler dogrusal ya da dairesel formda 1 ul'de 2 ug DNA olacak
sekilde hazirlandiktan sonra, altin partiküllerinin DNA ile kaplanmasi gerekmektedir. Kaplama
için altin partiküllerini içeren tüplere hizli bir sekilde sirasiyla lpl dogrusallastirilmis veya
dairesel vektör DNA'si, 10 ul 2.5 M CaClz ve 4 uL spermidin eklenmistir. Her eklemenin ardindan
yaklasik 3 saniye vorteks islemi yapilmis ve tüm bilesenler eklendikten sonra 4°C'de 10 dakika
çalkalama yapilmistir. Çalkalamanin bitiminde, örnekler 41°C sicaklikta ve 10.000 g'de 6 saniye
santrifüj edilerek DNA kapli altin partikülleri toplanmistir. Süpernatant, mikropipetle nazik bir
sekilde çekilerek uzaklastirilmis ve yikama adimlarina geçilmistir. Kromozom DNA'si ve DNA'ya
bagli altin partikülleri %70'lik 100 ul etanol ile yikanip santrifüj edilmistir. Süpernatant tekrar
pipetle çekilerek uzaklastirildiktan sonra, peletin üzerine %100'lük 100 pl etanol eklenmis ve ayni
islem tekrarlanmistir. Ardindan 10 ul %100'lük etanol, vektör DNA'sina bagli altin partikülleri
üzerine eklenerek çözülmüs ve bu karisim biyolistik silahin makrotasiyici haznesinin orta kismina
aktarilmistir. Makrotasiyici, alkolün uzaklasmasi için desikatörde bekletilmistir.
Bu islemlerin sonrasinda transform edilecek hücrelerin hazirlanmasi asamasina geçilmistir.
Bunun için, SPP besiyerinde B orijinli Tetrahymena thermophi'la CU428 hücreleri çogaltilmis,
açliga alinmislardir. Transformasyon günü, 2)(105 hücre/ml yogunlugunda ve 50 ml hacmindeki
aç hücreler, konik dipli bir tüpte 1100 g*de 3 dakika santrifüj edilerek toplanmis ve böylelikle her
bir atesleme için 10 milyon hücre elde edilmistir. Santrifüj sonrasi süpernatant uzaklastirilarak
her bir atesleme için 10 milyon hücre, 500 pl 10 mM Tris-HCl (pH 7.5] içerisinde çözülmüstür.
Petri tabagina [100 mm] yerlestirilerek sterilize edilmis olan dairesel “whatmann 50” filtre kagidi,
1 ml'lik 10 mM Tris-HCl [pH 7.5) ile nemlendirilmistir. Açlik tamponunda çözülen hücrelerin 500
ul*si filtre kagidinin ortasindan baslanarak 3/4'lük kismina yayilmistir.
Hücreler ve makrotasiyicidaki DNA örnekleri hazir oldugunda biyolistik silahla atesleme adimina
geçilmistir. lzopropanol ile islatilmis 900 psi'lik rupture diski tutucu aparata yerlestirilmistir.
Tutucu kisim partikül bombardiman aparatinin içindeki disli helyum portu üzerine döndürülerek
monte edilmistir. Makrotasiyici da yerine yerlestirildikten sonra hücreleri içeren petri tabagi
cihazin en alt rafina yerlestirilerek atesleme için gerekli sartlar saglanmistir. Kosullar hazir
oldugunda atesleme gerçeklestirilmistir. Transforme edilen hücrelerin üzerine 30°C'de 10 ml SPP
eklenmis ve diger ateslemeler bitirilinceye kadar, 30°C'de inkübasyona birakilmistir. Biyolistik
silahla transformasyon islemlerinin tümü steril kabin içinde gerçeklestirilmistir.
C] Pozitif Transformantlarin Antibiyotik Baskisi ile Seleksiyonu
Transformasyondan sonra steril filtre kagidi üzerindeki hücreler, kagidin 1XSPP besiyerinin içine
atilmasiyla besiyerine aktarilmistir. Besiyeri 3 saat süre ile 30°C'de çalkalamasiz bekletilerek,
hücrelerin toparlanmasi saglanmistir. Bu süre sonunda besiyerine 0,5 tig/ml CdClz ve 100 tig/ml
paromomisin eklenmistir. Hücreler dilüe edilerek, 96 kuyucuklu mikroplakanin her bir kuyusuna
100 ul olacak sekilde paylastirilmistir. Bu hücrelerin 30°C'de 6 günlük takibi yapilirken,
antibiyotik miktari 3. günde 300 ug/ml'ye, 5. günde ise 600 pg/ml'ye çikarilarak seleksiyon
yapilmistir. Bu sürede azalan konsantrasyonda CdClz eklenmistir. Bu islemler ayrica bulk
kültürleri için de aynen uygulanmistir. Antibiyotik seleksiyonun 10. gününde ise, antibiyotik
miktari 1000 ug/ml'ye çikartilarak seleksiyon sürdürülmüs ve dinamik canlilik gösteren pozitif
transformant hücreler cam tüplere aktarilmistir. Tüplenmis hücrelerin aylik pasajlanmasi
esnasinda, ”antibiyotikli deney grubuna (Par +)” uygulanan paromomosin baskisi 100 tig/ml
düsürülerek, transformant hücreler aylarca bu baskida muhafaza edilmistir. Bu deney grubunun
yaninda "antibiyotiksiz deney gurubu (Par -)” için de tüpleme yapilmis, fakat aylik pasajlama
sirasinda hücrelere antibiyotik eklemesi yapilmamistir. Ilk 2 ay boyunca, antibiyotik baskisinda
olan tüplere 3 günde bir paromomisin ve kadmiyum eklemesi yapilmistir. Haftada bir ise tüm
tüplerdeki hücrelere, Pen/Strep ve Amfoterisin eklenmis ve bu hücreler NEFF besiyerine
aktarilarak pasajlamalar yapilmistir. Tüp içindeki hücreler ilk 2 aydan sonra aylik pasajlama ile
Bulus kapsaminda, antibiyotik baskili ve baskisiz olmak üzere toplam 2 ana deney grubu
kullanilmaktadir. Bu gruplar asagida verilmistir.
Paromomisin ile baskilanmis transformant hücreler (Par +l:
1. Dairesel TtACZ
2. Dogrusal TtACZ
Paromomisin ile baskilanmamis transformant hücreler (Par -l:
3. Dairesel TtACZ
4-. Dogrusal TtACZ
D) TtACZ Yapay Kromozomunun Protein Ekspresyon Vektörü Olarak Kullanilmasiyla
Rekombinant TtsfGFP Üretimi
Transforme edilmemis Tetrahymena thermophi'la CU428 hücreleri, rekombinant TtsfGFP'nin
üretim denemesinin negatif kontrolü olarak kullanilmistir. Transformant hücre hatlarinin
modifiye HSP70.2 promotorlari haftalik veya aylik olarak isi soku ile tetiklenmis, TtsfGFP-6xHis
rekombinant proteininin üretimi mikroskopik yöntemler ve SDS-PAGE ve western blot
analizleriyle takip edilmistir. Takip edilecek hücreler logaritmik büyüme fazina ulasincaya kadar
ml veya 25 ml NEFF besiyeri içerisinde çalkalamali etüvde üretilmistir. Inkübasyon sonrasi,
hücreler swing rotorlu santrifüj Cihazinda 1100 g'de 5 dk santrifüj edilerek peletlenmistir.
Önceden içerisine Pen/Strep ve amfoterîsin eklenen besiyeri 38°C'de isitilmis, peleti çözecek
kadar bir hacim çok yavas bir sekilde hücre pelletleri üzerine eklenerek hücreler çözülmüstür.
Çözülen hücreler, steril 15 ml veya 25 ml besiyeri içeren genis yüzeyli erlene aktarilmistir.
Hücreler 38°C'lik su banyosunda 3 saat isi sokuna maruz kalmistir. Hücrelerin isik ve floresan
mikroskop analizleri, bu 3 saatlik TtsfGFP ürettirme periyodundan sonra gerçeklestirilmistir. Bu
amaçla floresan aparatli Olympus Ix53 marka mikroskop, GFP filtresiyle ve Siyah-beyaz 10x-1R
kamerasiyla (24. ay sonundaki görüntüleme için] ve Olympus Bx50 marka mikroskop GFP
filtresiyle ve DP72 kamerasiyla (5. ay sonundaki görüntüleme için] kullanilmistir (40X büyütme).
In-vi'vo mikroskopik hücre analizleri, hücrelerin 5. ayda [Sekil 2-D] ve 24. ayda (Sekil 2-E) kuvvetli
GFP isimalarina sahip olduklarini göstermistir.
TtACZ'nin TtsfGFP-öxHis rekombinant protein üretiminin gösterilmesi için üretilen bu hücrelerin
bazilarindan saflastirilan toplam proteinlerin GFP isimasinin gözlemlenmesi amaciyla SDS-PAGE
(Shapiro, A. L., Viiîuela, E., & Maizeljr, ]. V. 1967. Moleciilar weight estimati'on ofpolypeptide chains
by electrophoresis in SDS-pob/acrylami'de gels. Biochemi'cal and bi'ophysical research
communications, 28(5), 815-820) ve western blot analizleri gerçeklestirilmistir. Aylik olarak
büyütülmüs hücreler 1100 g'de 5 dk santrifüjleme ile pelletlenmis, Tris-HC] pH 7.5 ile yikanmis,
8000 rpm'de 5 dk santrifüj sonucunda supernatant uzaklastirilmis ve hücre pelletleri protein
NaCl, %1 Triton-X-lOO, 2 mM PMSF, 1x Proteaz lnhibitör Kokteyl] tamponu kullanilarak protein
izolasyonuna alinmistir. Saflastirilan t0plam proteinler kaynatilmaksizin SDS-PAGE jeli (%5-12)
ile GFP isimasi analizine alindiginda; Par+ halkasal TtAC2 (Sekil Z-B, 2 numarali kuyu] ve Par+
dogrusal TtAC2 (Sekil 2-B, 3 numarali kuyu] içeren 5 aylik hücrelerin güçlü GFP isimasina sahip
olduklari görülmüstür. Antibiyotik baskisi altinda olmayan transformant hücre deney grubunda
ise Par- halkasal TtAC2 (Sekil Z-B, 4 numarali kuyu] ve Par- dogrusal TtAC2 (Sekil 2-B, 5 numarali
kuyu) içeren 5 aylik hücrelerin GFP isimasina zayiflamis seviyede de olsa sahip olduklari
bulunmustur. Söz konusu saflastirilmis toplam protein örnekleri ayni zamanda western Blot
Görüntüleme, TMB kolorimetrik yöntemiyle gerçeklestirilmistir [Sekil 2-C). Saflastirilan toplam
proteinler kaynatilarak SDS-PAGE jeline (%5-12) yüklenmistir. Par+ halkasal TtAC2 (Sekil 2-C, 2
numarali kuyu] ve Par+ dogrusal TtAC2 (Sekil 2-C, 3 numarali kuyu) içeren 5 aylik hücrelerde,
GFP proteininin varliginin yüksek oranda oldugu görülmüstür. Antibiyotik baskisi altinda
olmayan 5 aylik transformant hücre deney grubunda ise, Par- halkasal TtAC2 (Sekil Z-C, 4
numarali kuyu] ve Par- dogrusal TtAC2 (Sekil 2-C, 5 numarali kuyu] içeren hücrelerde GFP
varliginin zayif oldugu tespit edilmistir. SDS-PAGE ve Western blot analizlerinde pozitif kontrol
olarak, E. coli'de üretilmis 6XHis-TtsfGFP (~31 kDa), protein belirtecinin içine eklenerek
kullanilmistir (Sekil 2-B, 1 numarali kuyu ve Sekil 2-C, 1 numarali kuyuda 35 kDa hizasinin
altindaki mavi protein bandi). Negatif kontrol olarak ise, transforme edilmemis Tetrahymena
CU428 toplam proteini kullanilmis fakat hiçbir isima veya protein bandi görülmemistir (data
verilmemistir].
E] Tetrahymena thermophila TtACZ Yapay Kromozomunun Kopya Sayisinin Real-Time PCR
Yöntemiyle Belirlenmesi
Tetrahymena thermophila genomunda yer almayan fakat bulusa konu olan yapay kromozomlarda
bulunan neomisin direnç geni TtACZ vektörlerinin kopya sayisini belirlemek için belirteç gen
olarak kullanilmistir. Real-time PZR için, neomisin direnç-belirteç genine uygun Taqman prob
(bulucu) ile primerleri tasarlanmistir. Ayrica ayni örneklerde, Real-Time PZR'da kullanilmak
üzere, Tetrahymena genomunda tek kopya olarak bulunmasindan dolayi nanogram DNA basina
için de Taqman prob ve primerleri tasarlanmistir. Yapay kromozom vektörlerinin kopya sayisinin
muhafazasinin belirlenmesi amaciyla Par+ ve Par- deney guruplari için 1 haftalik, 2 aylik ve 7 aylik
hücre peletlerînden DNA izolasyonlari, DNA izolasyon kiti (Promega, Wizard Genomic DNA
Purification Kit, A1120] kullanilarak gerçeklestirilmistir. Bu yolla Real-Time PZR deneylerinde
kullanilabilecek kalite ve konsantrasyonda olup olmadiklari incelenmis, ayrica DNA'larin
nanogram miktarlari belirlenmistir. Saflastirilan DNAJIar agaroz jelde kosturularak Real-Time
PZR'de kullanilabilirlikleri teyit edilmistir.
Primer3 programi [http://bioinf0.ut.ee/primer3-0.4.0/] kullanilarak Neomisin direnç genine
göre tasarlanan Taqman Prob ve primerler asagida verilmistir:
Taqman Prob: 5' FAM TCTGGTTTCATCGACTGTGG TAMRA 3'
Ileri primer: 5' CTGCTTACCCAATATCATG 3'
Katalaz geni için hazirlanan prob ve primerler ise asagida sekildedir:
Taqman Prob: 5' FAM AATCCCTGAAAGAGTCGTCCACGC TAMRA 3'
Ileri primer: 5' TGACAACCAAAATTCCGTCACTGCA 3'
Real time PZR deneyi için yukarida anlatilan prob ve primer konsantrasyonlari finalde 10.000 nM
olacak sekilde dilüe edilmistir. Reaksiyon için ise 500 nm konsantrasyonda olacak sekilde
kullanilmislardir. Real-time PZR'de TtAC2'nin kopya sayisi hesaplamalarinda temel alinacak "DNA
kopya sayisi standart egrisi" olusturmak için baz içerigi ve sayisi bilinen TtACZ vektörü
kullanilmistir. Bu standart egriyi olusturmak için 267 ng/ul TtACZ vektöründen 3 bagimsiz
dilüsyon yapilmistir. Çizilen standart egrinin R2 degeri 0,989 olup verimliligi %101,7 olarak
hesaplanmistir. Deney gruplarinda kullanilacak egri denklemi y:3,282x+39,144 olarak
belirlenmistir [Tablo 1].
Katalaz geninin “DNA kopya sayisi standart egrisini" olusturabilmek için vektör boyutu ve baz
dizisi bilinen pVGF-katalaz vektörü [267 ng/ul] hazirlanarak 3 bagimsiz dilüsyon yapilmis ve egri
olusturma amaciyla Real-time PZR'de kullanilmistir. Katalaz geni standart kopya sayilari;
belirlenmistir. Standart egrinin R2 degeri 0,997 olup verimliligi %892 olarak bulunmustur. Bu
degerler güvenilir ve kullanilabilir araliktadir. Böylece, deney gruplarinin örneklenmesi sirasinda
hücre sayisinin belirlenmesinde kullanilacak denklem; y=3,612x+43,889 olarak belirlenmistir
Real-time PZR reaksiyonu, Brilliant III Ultra-Fast QPCR Master Mix (Katalog #600880, Agilent
Technologies) kiti ile kurulmustur. Real-time PZR reaksiyonu, 95°C'de 3 dk ön denatürasyon
Antibiyotik baskisi altinda olan Par+ halkasal TtAC2 ve Par+ dogrusal TtAC2 içeren hücreler ile
antibiyotik baskisi altinda olmayan Par- halkasal TtAC2 ve Par- dogrusal TtACZ içeren
hücrelerden sallastirilan genomik DNA'lar ile kalipsiz reaksiyon kontrolleri birlikte Real-time PZR
reaksiyonuna alinmistir. Deney grubu genomik DNA'lari 50 ng/ul olacak sekilde dilue edilmis ve
reaksiyonda kalip genomik DNA 100 ng/ul olarak kullanilmistir. Gerekli görüldügünde, kontrol
amaciyla 50 ng/ul'lik genomik DNA kalip miktarlari içeren reaksiyonlar da kurulmustur. Neo4 ve
katalaz genleri için ayri prob ve primerler kullanilarak reaksiyonlar gerçeklestirilmistir.
Reaksiyonlar 3'er tekrarli olarak gerçeklestirilmistir. Katalaz geni ile her örnek için hücre sayisi
belirlendikten sonra deney grubu neomisin geni kopya sayisi yani TtACZ kopya sayisi, ortalama
deger olarak standart egri denklemleri kullanilarak hesaplanmistir (Tablo 1).
Deney Guruplari 1. Hafta 2. Ay 7. Ay
Dogrusal TtAC2 5 601 2735
Dogrusal TtACZ 1933 138 52
TtACZ yapay kromozom vektörü, Par+ ve Par- deney gruplarinda dairesel ve dogrusal formda
makroçekirdek genomu içinde muhafaza edilmektedir [Tablo 1]. TtACZ'nin dairesel ve dogrusal
formlari kopya sayisi artisi, Par+ ve Par- deney gruplari arasinda farklilasmistir. Antibiyotik
baskisi olmayan deney gruplari ilk haftalarda çok hizli bir kopya sayisi artisi gösterirken, zamanla
kopya sayisinin azaldigi gözlenmektedir. Antibiyotik baskisi altindaki deney gruplari ise ilk
haftalarda yavas bir kopya sayisi artisina sahipken zamanla kopya sayisi artisi ivme
kazanmaktadir. Bu durum, transformasyondan sonra hemen antibiyotik baskisi uygulanmasi
yerine, C3 allel'in B alleli üzerinde sahip oldugu dogal baskinligina dayanarak hücrelerin ilk
haftadan sonra antibiyotik baskisina alinmasi gerektigini göstermektedir. Böylelikle çok daha
yüksek TtACZ kopya sayilarina ulasmak mümkündür. Özetle Tablo 1'deki veriler, TtACZ'nin yapay
bir kromozom özelliklerine sahip oldugunu ve paromomisin baskisi olmadan uzun süre hücre
tarafindan muhafaza edilebilecegini göstermis olup, bu durum endüstriyel kullanim açisindan
büyük öneme sahiptir.
Claims (1)
- ISTEMLER SEQ ID NO: 4'e sahip Tetrahymena thermophila yapay kromozomu (TtACZ) olup, özelligi SEQ ID NO: 1'e sahip modifiye edilmis bir HSP70.2 promotoru, SEQ ID NO: Z'ye sahip 3'NTS dizisi ve SEQ ID NO: 3'e sahip "C3 orijin içeren 5'NTS, rDNA genleri ve 3'NTS" dizisi ihtiva etmesidir. Istem 1'e göre sunulan Tetrahymena thermophila yapay kromozomu olup, özelligi ayrica pUC19 vektör iskeleti ihtiva etmesidir. Istem 1'e göre sunulan Tetrahymena thermophi'la yapay kromozomu olup, özelligi ayrica bir telomer dizisi ihtiva etmesidir. Istem 1'e göre sunulan Tetrahymena thermophila yapay kromozomu olup, özelligi ayrica Neo4 antibiyotik direnç kaseti ihtiva etmesidir. Istem 1'e göre sunulan Tetrahymena thermophila yapay kromozomu olup, özelligi ayrica TtsfGFP belirteç gen kaseti veya homolog ve/veya heterolog genomik DNA, RNA ve/veya proteinler ve/veya türevlerini kodlayan bir DNA dizisi ihtiva etmesidir. Istem 1 ila 5'e göre sunulan Tetrahymena thermophi'la yapay kromozomu olup, özelligi kromozomun bir kolunda ”C3 orijin içeren S'NTS, rDNA genleri ve 3'NTS" dizisi (SEQ ID NO: 3), diger kolunda ise 3'NTS (SEQ ID NO: 2), Neo4 kaseti ve TtsfGFP belirteç gen kaseti ihtiva etmesidir. Istem 6'ya göre sunulan Tetrahymena thermophil'a yapay kromozomu olup, özelligi her iki kolundaki transkripsiyon yönünün kromozom merkezinden telomerlere dogru yönlendirilmis olmasidir. Önceki istemlerin herhangi birine göre sunulan bir yapay kromozom olup, özelligi SEQ ID NO: 4'e en az %80 homolog olan bir nükleotid dizisine sahip olmasidir. Önceki istemlerin herhangi birine göre sunulan Tetrahymena thermophii'a yapay kromozomu olup, özelligi dairesel veya dogrusal formda bulunabilmesidir. Istem 9'a göre sunulan Tetrahymena thermophila yapay kromozomu olup, özelligi dogrusal formda telomer dizilerininin muhafazasinin 3'NTS dizileri ile saglanmasidir. Istem 1'de tanimlanan Tetrahymena thermophi'la yapay kromozomunu üretmek için bir yöntem olup, özelligi asagidaki adimlari ihtiva etmesidir: - Tetrahymena thermophila yapay kromozomu için vektör iskeletinin sunulmasi, - iskelet vektöre modifiye edilmis bir HSP, bir telomer dizisi, bir 3'NTS dizisi [SEQ [D NO: 2], bir Neo4 kaseti ve “C3 orijin içeren 5'NTS, rDNA genleri ve 3'NTS” dizisinin [SEQ ID NO: 3] rDNA minikromozomu biyotaklit edilerek yerlestirilmesi, ve - yapay kromozomun elde edilmesi. Istem 11'e göre sunulan yöntem olup, özelligi iskelet vektöre ayrica TtsfGFP helirteç gen kaseti veya homolog ve/veya heterolog genomik DNA, RNA ve/veya proteinler ve/veya türevlerini kodlayan bir DNA dizisinin yerlestirilmesi adimini ihtiva etmesidir. Istem 11'e göre sunulan yöntem olup, özelligi bahsedilen vektör iskeletinin pUC19 olmasi, böylece yapay kromozomun SEQ ID NO: 4 ile en az %80 homolog olan bir nükleotid dizisine sahip olmasidir. Istem 1'de tanimlanan Tetrahymena thermophi'la yapay kromozomunu bir üretim sistemi/platformu olarak kullanarak homolog ve/Veya heterolog genomik DNA, RNA ve/Veya proteinleri ve/veya türevlerini rekombinant olarak üretme yöntemi olup, özelligi asagidaki adimlari ihtiva etmesidir: - makroçekirdegin rDNA minikromozomunda C3 orijin alleli disindaki çekinik bir allel içeren bir Tetrahymena thermophila veya Tetrahymenidae familyasi üyesi bir siliat konak hücrenin sunulmasi, - makroçekirdek rDNA minikromozomunda baskin C3 orijini ihtiva eden dairesel ve/veya dogrusal Tetrahymena thermophi'la yapay kromozomunun [TtACZ] C3 orijin alleli disindaki çekinik bir allel içeren bir Tetrahymena thermophi'la veya Tetrahymenidae familyasi üyesi bir siliat konak hücrenin makroçekirdegine ekstrakromozomal olarak entegre edilmesi, ve - Tetrahymena thermophila yapay kromozomunda tasinan DNA, RNA ve/veya proteinleri kodlayan bir homolog ve/veya heterolog dizinin kodladigi DNA, RNA ve/veya proteinin ve/veya türevlerinin Tetmhymena thermophila veya Tetrahymenidae familyasi üyesi bir siliat konak hücre tarafindan üretilmesi. Istem 14'e göre sunulan yöntem olup, özelligi yöntemin ikinci adiminda yer alan Tetrahymena thermophi'la yapay kromozomunun (TtAC2] C3 orijin alleli disindaki çekinik bir alle] içeren bir Tetrahymena thermophi'la veya Tetrahymenidae familyasi üyesi bir siliat konak hücrenin makroçekirdegîne ekstrakromozomal olarak entegre edilmesi isleminin biyolistik silah yöntemi ile gerçeklestirilmesidir. Istem 14'e göre sunulan yöntem olup, özelligi söz konusu Tetrahymena thermophila veya Tetrahymenidae familyasi üyesi bir siliat konak hücrenin kültürize edilmis vejetatif bir siliat hücresi veya konjugasyon yapan iki siliat hücresi olmasidir. Istem 14'te tanimlanan yönteme göre sunulan en az bir homolog 've/veya heterolog dizi tasiyan TtACZ'nin transformasyonu ile olusturulmus transformant Tetrahymenidae familyasi üyesi siliat konak hücre. Istem 1'de tanimlanan Tetrahymena thermophila yapay kromozomunun homolog ve/veya heterolog genomik DNA, RNA ve/veya proteinleri ve/veya türevlerini rekombinant olarak üretmek amaciyla bir üretim sistemi /platformu olarak kullanimi.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TR2019/04291A TR201904291A2 (tr) | 2019-03-22 | 2019-03-22 | TETRAHYMENA THERMOPHILA YAPAY KROMOZOMU 2 (TtAC2) VE REKOMBİNANT PROTEİN ÜRETİMİNDE KULLANIMI |
| PCT/TR2019/051165 WO2020197518A1 (en) | 2019-03-22 | 2019-12-20 | Tetrahymena thermophila artificial chromosome 2 (ttac2) and its use in the recombinant protein production |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TR2019/04291A TR201904291A2 (tr) | 2019-03-22 | 2019-03-22 | TETRAHYMENA THERMOPHILA YAPAY KROMOZOMU 2 (TtAC2) VE REKOMBİNANT PROTEİN ÜRETİMİNDE KULLANIMI |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TR201904291A2 true TR201904291A2 (tr) | 2020-10-21 |
Family
ID=69845510
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TR2019/04291A TR201904291A2 (tr) | 2019-03-22 | 2019-03-22 | TETRAHYMENA THERMOPHILA YAPAY KROMOZOMU 2 (TtAC2) VE REKOMBİNANT PROTEİN ÜRETİMİNDE KULLANIMI |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| TR (1) | TR201904291A2 (tr) |
| WO (1) | WO2020197518A1 (tr) |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030033617A1 (en) | 1996-04-10 | 2003-02-13 | Gyula Hadlaczky | Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes |
| CA2615075A1 (en) | 2005-07-13 | 2007-01-18 | Cilian Ag | Tetrahymena heat inducible promoters and their use |
| CA2755978C (en) * | 2009-03-20 | 2022-11-22 | Tetragenetics, Inc. | Polypeptide expression in ciliates |
| CN101586119B (zh) | 2009-05-15 | 2011-04-06 | 中国科学院水生生物研究所 | 含hsp70启动子和gfp的四膜虫转基因载体及制备方法和应用 |
-
2019
- 2019-03-22 TR TR2019/04291A patent/TR201904291A2/tr unknown
- 2019-12-20 WO PCT/TR2019/051165 patent/WO2020197518A1/en active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2020197518A1 (en) | 2020-10-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108138156A (zh) | 用于无标记基因组修饰的方法和组合物 | |
| JP2004524031A (ja) | 合成遺伝子、およびＣｐＧを欠く細菌プラスミド | |
| Heitzer et al. | Construction of modular tandem expression vectors for the green alga Chlamydomonas reinhardtii using the Cre/lox-system | |
| IL207851A (en) | A method of making a yeast library by electrophoresis of yeast cells | |
| Watson et al. | Optimisation of the Schizosaccharomyces pombe urg1 expression system | |
| CN112481309B (zh) | Ago蛋白的用途及组合物和基因编辑方法 | |
| JP5733609B2 (ja) | 藻類を形質転換するために用いられる新規プロモーター | |
| CN113637658A (zh) | 基于dCas9-oToV的基因转录系统及其应用 | |
| Hallmann et al. | Swapped green algal promoters: aphVIII-based gene constructs with Chlamydomonas flanking sequences work as dominant selectable markers in Volvox and vice versa | |
| TR201904291A2 (tr) | TETRAHYMENA THERMOPHILA YAPAY KROMOZOMU 2 (TtAC2) VE REKOMBİNANT PROTEİN ÜRETİMİNDE KULLANIMI | |
| US10280428B2 (en) | Molecular biology tools for algal engineering | |
| CN110106171B (zh) | 长链非编码rna及其在调控植物耐低温中的应用 | |
| WO2015118457A1 (en) | A modified microorganism having enhanced biomass synthesis capacity and a method thereof | |
| US8691505B2 (en) | Promoter for use in transformation of algae | |
| JP4721868B2 (ja) | 宿主ｄｎａの欠失対象領域の欠失方法 | |
| Chen et al. | Multiple-copy-gene integration on chromosome of Escherichia coli for beta-galactosidase production | |
| JP4049364B2 (ja) | 多コピー型・ゲノム挿入型の選択両用ベクター | |
| EP3841210A2 (en) | Tetrahymena thermophila artificial chromosome 1 (ttac1) and its use for the production of recombinant proteins | |
| KR101920036B1 (ko) | 대장균 및 앰피실린 저항성 유전자를 이용한 해독틀 이동 변이 및 종결 돌연변이가 없는 유전자의 선별 방법 | |
| Svoboda | Cloning a transgene for transgenic RNAi in mouse oocytes | |
| JP2804436B2 (ja) | ストレプトミセス属菌および大腸菌の新規の細菌プラスミドシャトルベクター | |
| Yoneji et al. | NAR Breakthrough Article Grand scale genome manipulation via chromosome | |
| DK2078076T3 (en) | INCREASED EXPRESSION OF Pm PROMO | |
| Marrero Coto | Transcription Regulation in the hyperthermophilic crenarchaeon Thermoproteus tenax strain Kra1 | |
| JPWO2010061923A1 (ja) | アミノ酸配列、ｄｎａ及び酵母の育成方法 |