TR201809422T4 - Anti-androjen peptitler ve bunların kanser tedavisinde kullanımları. - Google Patents

Abstract

Mevcut buluş, aşağıda yer alan genel formüle sahip izole edilmiş veya saflaştırılmış veya kısmen saflaştırılmış peptit türevli bir molekül ile ilgilidir. X-[(Pro)n-His-Pro-His-Ala-Arg-Ile-Lys]m-Y (S 1) Söz konusu peptitler, tıbbı amaçlarla, özellikle anti tümöral ajanlar olarak kullanıma yöneliktir.

Description

TEKNIK ALAN Insan prostat ve meme kanserlerinde androjen reseptörü Androjen reseptörü (AR), erkek cinsel gelisiminin indüklenmesine aracilik eden ve endojen androjenler` ile birlikte etkinligi araciligiyla islev gören bir ligand ile aktive edilmis transkripsiyon düzenleyici proteindir (Roy v.d. 1999).

Androjenler, genel olarak erkek üreme hormonlaridir. Androjenik hormonlar, Vücutta testisler ve adrenal bezin korteksi tarafindan üretilen veya laboratuvarda sentezlenebilen steroitlerdir. Androjenik steroitler, kas ve kemik kütlesi, prostat büyümesi, spermatogenez ve erkek tüy tipi gibi erkek cinsel özelliklerinin gelistirilmesi ve nmhafaza edilmesi de dahil olmak üzere birçok fizyolojik süreçte önemli bir rol oynamaktadir (Siiteri ve Wilson, 1974). Endojen steroidal androjenler arasinda testosteron ve dihidrotestosteron (DHT) bulunmaktadir. Testosteron, testisler tarafindan salgilanan temel steroittir ve eslerin plazmasinda bulunan primer dolasimdaki androjendir. Testosteron, birçok periferal dokuda 5- alfa-redüktaz enzimi tarafindan DHT'ye dönüstürülmektedir.

DHT'nin, çogu androjen eylemi için hücre içi araci görevi gördügü düsünülmektedir.

Diger steroidal androjenler arasinda sipiyonat, propiyonat, fenil propionat, siklopentil-propiyonat, izokarporat, enantat ve dekanoat esterleri gibi testosteron esterler ve 7-Meti1- Nortestosteron gibi diger sentetik androjenler bulunmaktadir.

Prostat kanseri ve gögüs kanseri, androjen reseptörünü (AR) eksprese eden iki ana kanser türüdür. Diger kanserler de AR pozitif olabilir. En yaygin AR pozitif kanser prostat kanseridir. Prostat kanserlerinin. yaklasik %80-90'1 ilk tani sirasinda androjene bagimlidir ve prostat kanserinin endokrin tedavisi, serum androjenlerinin azaltilmasina ve AR'nin inhibisyonuna yöneliktir (Denis ve Griffiths, 2000). Ancak androjen ablasyon terapisinin sonuç olarak basarisiz oldugu durumda, prostat kanseri bir hormon refrakter durumuna ilerlemektedir. AR, prostat kanseri ilerlemesi boyunca eksprese edilmektedir ve hormon refrakter hastaligi olan hastalarin çogunda devam etmektedir (Mohler v.d. 1996; van der Kwast v.d.

Ayrica, hormon refrakter prostat kanserinden tanimlanan çogu AR mutanti, transkripsiyon etkinligine sahiptir. Bu gözlemler, AR fonksiyonu kaybinin androjen ablasyon basarisizliginin önemli bir nedeni olmadigini ve AR-negatif prostat kanseri hücrelerinin anlamli bir büyüme veya hayatta kalma avantajina sahip olmadigini göstermektedir. Bunun yerine, mevcut klinik ve deneysel kanitlar, prostat kanserinin ilerlemesinin, AR aktivitesinin sinyal iletimi kaskadlari ile yanlis düzenlenmesi, AR ko-regülatörlerinin ekspresyonunda degisiklik olmasi ve AR'nin testosteron ve DHT'den baska ligantlara yanit olarak transkripsiyonel olarak aktif olmasini saglayan mutasyonlari ile normal androjen ekseninin degistirilmesi yoluyla gerçeklestigini göstermektedir. Tek basina serum androjenlerin prostat karsinogenezi desteklememesine ragmen, androjen eylemi ve.AR'nin fonksiyonel durumu prostat kanserinin ilerlemesinde önemli aracilaridir. Yeni teshis edilmis ve tedavi edilmemis prostat kanseri olan erkeklerde düsük serum testosteron düzeylerinin, daha yüksek AR ekspresyonu, tümör içindeki yüksek kapiler damar yogunlugu. ve daha yüksek Gleason skoru ile iliskili oldugu bulunmustur (Schatzl V.d. 2002). Preoperatif tedavi görmeyen hastalardan elde edilen klinik prostat kanseri örnekleri üzerinde yakin zamanda gerçeklestirilen analiz, yüksek AR ekspresyonunun daha düsük nüksetme olmaksizin sagkalim ve hastaligin ilerlemesi ile iliskili oldugunu göstermistir (Lee, 2003). Prostat kanserinin endokrinolojik tedavisi, esas olarak, cerrahi kastrasyon veya Östrojen. (dietilstilbestrol) ve LHRH (luteinize edici hormon salgilayici hormon) agonistleri ile kimyasal kastrasyon yoluyla dolasimdaki testiküler androjenlerin deprivasyonu yoluyla AR etkinliginin modülasyonunu içermektedir.

AR etkinligi ayrica, tek basina ya da cerrahi veya kimyasal kastrasyon (birlestirilmis androjen blokaji olarak anilacaktir) ile kombinasyon halinde anti-androjenlerin uygulanmasi ile bloke edilebilir. Hastalarin %80'inden fazlasi androjen ablasyonuna pozitif yanit göstermektedir. Ancak metastatik prostat kanserli hastalar, sonuç olarak androjen deprivasyon tedavisinden sonra 12 ila 18 aylik bir medyanda hastaligin ilerlemesi ile karsi karsiya kalmaktadir. Bu hastalarin tümörleri, hormon refrakter olarak kabul edilmektedir. Bu tümörlerin serum androjenindeki bir azalmaya ve/veya antiandrojenler ile gerçeklestirilen tedaviye ragmen ilerlemeleri bakimindan refrakter olmalarina karsin, bu tümörlerin çogunun androjenlere karsi tamamen dirençli olmalari olasi degildir. Hormon refrakter metastatik prostat kanserli hastalarin %97'sinde ekzojen androjen tedavisi, hastalik alevlenmesi ve istenmeyen yanit ile sonuçlanmaktadir (Fowler ve Postmortem, 1982). Hormon refrakter prostat kanserli hastalar için ikincil tedavi ayrica, agirlikli olarak androjen üretimi ve AR fonksiyonuna hedeflenmektedir ve ikincil anti- androjen uygulanmasi, adrenal androjen üretiminin inhibisyonu ve ikincil progesteron veya östrojenik. ajanlarla LH (luteinize edici hormon) inhibisyonununu içermektedir (Dawson ve Vogelzang, 2000). Meme kanseri gibi diger kanserler de AR pozitif olabilir (Moinfar v.d. 2003). Androjen reseptörleri yaygin olarak in situ meme duktal karsinomunda ve ayni zamanda invaziv meme karsinomunda eksprese edilmektedir. Önemli sayida kötü diferansiye meme karsinomu, ER (östrojen reseptörü)-negatif ve PR (progesteron reseptörü)-negatif ile ayni zamanda AR- pozitiftir. Prostat kanseri gibi, gögüs kanseri de hormon deprivasyonu ile tedavi edilmektedir ve bu durumda hormon deprivasyonu, östrojen ve östrojen reseptörünün taklit edilmesiyle gerçeklestirmektedir. Meme kanseri zaman içinde östrojen ihtiyaci olmadan büyümenin yollarini bulmakta ve öldürücü duruma gelmektedir. Hormon refraktör hale gelen meme kanserleri, vakalarin çogunda AR eksprese etmeye devam etmektedir. Sekonder hormonal tedavinin de basarisizliga ugrayabilmesine ragmen, AR'ye yönelik terapilerin pozitif terapötik yarar saglayabilmeleri, AR etkinliginin hem prostat hem de meme kanseri büyümesinin ve sagkaliminin önemli bir araci oldugunu göstermektedir.

Bu baglamda, steroidal reseptörlerin sinyal iletim kaskadlarini aktive ettigine dair kanitlar (Migliaccio v.d. 1996) bu kanserlerin tedavisi için yeni bir cephe hatti açmistir.

Androjenlerin yani sira östrojenlerin, DNA. sentezini stimüle etmek için Src/ras/erk. yolagi aktivasyonunu gerek duydugunu gösterilmistir` (Migliaccio v.d. 2000). Bu yolak aktivasyonu, reseptör tirozin-kinaz Src ile steroidal reseptörlerin dogrudan etkilesimi üzerine gerçeklesmektedir. Bu etkilesimler için hayati önem tasiyan alanlar tespit edilmistir.

Güncel terapiler Hormona yanit veren prostat kanseri terapisinde flutamid (Eulexin®), biklutamid (Casodex®) veya nilutamid (Anandron®) gibi steroidal olmayan anti-androjenler kullanilmistir. Benzer sekilde, hormona yanit veren meme kanserinde tamoksifen (Nolvadex®) veya ICI ile anti-östrojen terapisi yaygin olarak kullanilmaktadir.

Ne yazik ki, bu ve benzer yaklasimlar, ilaç direncinin gelismesi nedeniyle siklikla etkisiz hale gelmektedir. Ayrica, bu bilesiklerin, kardiyovasküler komplikasyon riskinde bir artis ve kronik kullanimin ardindan bir rahim kanseri insidansinda küçük bir artis gibi istenmeyen bazi yan etkileri bulunmaktadir. Bu nedenle, toksik olmayan alternatif bilesikler kullanilarak prostat ve meme kanserlerinin daha spesifik bir sekilde tedavi edilmesine yönelik acil bir ihtiyaç mevcuttur. Yakin zamanda, hormon veya büyüme faktörü ile uyarilan androjen reseptörünün, indükleyen tirosin kinaz Src ile etkilestigi bulunmustur WO 98/46250 sayili yayinda çogunlukla Leu motifleri ile karakterize edilen anti-östrojen fosfotirozin veya maloniltirozin peptitlerini açiklanmaktadir. Bu bulus, bu tür molekülleri ifade etmemektedir. 39l'den türetilmis peptitleri açiklanmaktadir. Açiklanan peptitlerin bazilarinin bulusun molekülleri ile bir dizi benzerlik paylasilmasina ragmen, önceki teknige ait doküman, AR/Src baglanma/aktivasyon yolagina göre bu peptitlerin antagonist etkinligini açiklamamaktadir. Ek olarak, WO 00/1813 sayili yayinda açiklanan peptitlerin, prostat veya meme tümör hücresi büyümesini azalttigi veya bloke ettigi gösterilmemistir.

Gerçek ve uygulanabilir bir anti-tümör etkinligi gösterdikleri görülmemistir.

Bu nedenle, androjen reseptörü/Src baglantilarini bozmaya hedeflenmis peptitlerin saglanmasina ve hem prostat hem de meme kanseri tedavisi için yeni bir bilesik sinifi gelistirilmesine ihtiyaç duyulmaktadir.

MEVCUT BULUSUN ÖZETI Mevcut bulus istemlerde tanimlanmaktadir.

Mevcut bulus, asagida yer alan genel formüle sahip izole edilmis veya saflastirilmis veya kismen saflastirilmis peptit türevli bir molekül saglamakta olup: X- [(Pro)n-His-Pro-His-Ala-Arg-lle-LysJm- Y (S 1) burada X, H veya bir asetil grubu veya herhangi bir dogal amino asit veya serbest veya en azindan asetil türevli bir NH2 grubu ile saglanan amino asit sekansidir; Y, bir OH grubu veya bir NH2 grubudur; "n , 1 ila 10 arasinda bir tam sayidir ve 3 arasinda bir tam sayidir ve burada peptit türevli molekülün amino asit sekansi, asagidakilerden olusan gruptan seçilmektedir: Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-lle-Lys (SEQ.ID NO. l); Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-lle-Lys (SEQ.ID No.

Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-lle-Lys (SEQ.ID NO. 3) ve Gly-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-lle- Lys (SEQ.ID NO. 4).

Tercihen, peptit türevli molekül, androjen reseptörünün (AR) tirozin kinaz Src'nin SH3 domeniyle etkilesimini inhibe edebilmekte veya önleyebilmektedir.

Tercihen peptit türevli molekül, in vitro veya in ViVO anti- tümör etkinlige sahiptir.

Tercihen peptit türevli molekül, asagidakilerden olusan gruptan seçilen amino asit sekansina sahiptir: Ac-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-lle-Lys-NH2; Ac-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-lle-Lys-NH2; Ac-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-lle-Lys-NHz Ac-Gly-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg- lle-Lys-NHz.

Mevcut bulus ayrica, istemlerde tarif edildigi gibi farmasötik olarak kabul edilebilir ve etkili bir miktarda peptit türevli molekül içeren bir farmasötik bilesim saglamaktadir.

Tercihen, (i) bahsi geçen peptidin, BSA veya KLH gibi bir tasiyici moleküle baglanabilecegi ve/veya bir farmasötik eksipiyan ile birlikte bir lipit partikülü, bir nanokapsül, bir lipozom veya lipit vesiküller gibi bir lipit bilesimi halinde bulunacagi ve/Veya (ii) bilesimin en az bir ikinci antikanser ajani içerdigi farmasötik bilesim saglanmaktadir.

Mevcut bulus ayrica, istemlerde tarif edildigi gibi peptit türevli bir molekül veya istemlerde tarif edildigi gibi bir ilaç olarak kullanilmak üzere farmasötik bir bilesim saglamaktadir.

Tercihen, peptit türevli molekül veya farmasötik bilesim, bir anti-tümöral ajan olarak kullanima yöneliktir. Tercihen peptit türevli molekül veya farmasötik bilesim (i) meme veya prostat kanserine ve/veya (ii) tek basina ya da estradiyol reseptörleri ile birlikte androjen reseptörlerini eksprese eden diger kanserlere karsi kullanima yöneliktir. Mevcut bulus ayrica peptit türevli molekülün istemlerde tarif edildigi gibi bir ilacin hazirlanmasina yönelik kullanimini da saglamaktadir.

Mevcut bulus ayrica peptit türevli bir` molekülün istemlerde tarif edildigi gibi kanser tedavisi için bir ilacin hazirlanmasina yönelik kullanimini da saglamaktadir.

Tercihen istemlerde tarif edilen kullanimda söz konusu ilaç (i) meme veya prostat kanserinin 've/veya (ii) tek basina ya da estradiol reseptörleri ile birlikte androjen reseptörlerini eksprese eden diger kanserlerin tedavisine yöneliktir. Mevcut bulus ayrica, istemlerde tarif edildigi gibi spesifik olarak peptit türevli bir molekülü taniyabilen bir antikor saglamaktadir.

Mevcut bulus ayrica, tek ya da çoklu kaplarda saptanabilir bir etikete ve immünolojik saptama ayiraçlarina islevsel olarak baglanmis, istemlerde tarif edilen sekilde bir antikor içeren bir kit sunmaktadir.

Mevcut bulus ayrica, bir peptit veya istemlerde tarif edildigi gibi bir peptidi eksprese eden bir rekombinant vektörü kodlayan bir nükleik asit sekansi saglamaktadir.

Mevcut bulus ayrica, istemlerde tarif edildigi gibi nükleik asit sekansini veya rekombinant vektörü içeren memeli, insan veya bakteriyel konak hücreleri saglamaktadir.

Mevcut bulus ayrica bir in vitro bir gögüs veya prostat kanseri hücresi de dahil olmak üzere bir kanser hücresinin öldürülmesine yönelik in vitro bir yöntem saglamakta ve söz konusu yöntem, istemlerde tarif edildigi gibi hücreye bir peptit türevli molekül saglanmasini içermektedir.

Mevcut bulus, prostat ve meme kanserinin tedavisinde kullanilacak yeni bilesimlerin ve in vitro yöntemlerin saglanmasiyla önceki teknikte mevcut olan gizli tehlikelerin üstesinden gelmektedir. Bulus, insan prostat ve/Veya meme kanseri terapisinde veya önlenmesinde kullanilmak üzere anti- androjen reseptör etkinligi sergileyen yeni sentetik peptitler saglamaktadir. Bu peptitler, AR'nin, tirozin kinaz Src'nin SH3 domeni (Migliaccio v.d. 2000) ve potansiyel olarak diger Src ailesi kinazlari ile etkilesmesinde önemli bir rol oynadigi düsünülen prolin uzantilari içermektedir. SH3 domenleri 50-70 amino asit uzunlugundadir ve siklikla ökaryotik sinyal iletiminde ve sitoskeletal proteinlerde taninabilmektedir (Kay v.d. 2000). Bu domenler, prolin bakimindan zengin peptitleri baglamakta ve böyle bir etkilesim yoluyla, kinaz etkinliginin düzenlenmesinde ve lokalizasyon ve substrat tanimada önemli bir rol oynamaktadir. Her bir Src kinaz ailesi üyesi kendi sekansinda bir SH3 domenine sahiptir. Bu ailenin dokuz üyesi bulunmaktadir (Williams v.d. 1998) ve digerleri ileride tanimlanabilir.

Agonistlerin isgal ettigi androjen ve progesteron reseptörlerinin, Src'nin SH3 domeniyle etkilesime girebildigi bildirilmistir (Migliaccio v.d. 2000; Boonyaratanakornkit v.d. 2001). Bu baglantilar muhtemelen SH3 domeninin inhibitör etkisini kaldirmakta ve Src aktivasyonunu tetiklemektedir.

Dolayisiyla mevcut bulusta tarif edilen peptitler, Src'nin SH3 domenine baglanmakta ve AR'nin Src ile etkilesime girmesini ve sinyal iletimini aktive etmesini önlemektedir. Androjen ve estradiol reseptörlerinin (ER) bazal kosullar altinda baglantili oldugu bildirilmistir (Migliaccio v.d. 2005): Iki reseptörden birinin bir steroid agonisti veya bir büyüme faktörü ile aktive edildigi durumda, iki reseptör Src ile etkilesime girmektedir.

Bu nedenle, AR'nin SC ile baglantisinin önlenmesi ayni zamanda ER'nin bu kinaz ile baglantisini ve ER tarafindan Src aktivasyonunu önlemektedir. Sonuç olarak burada tarif edilen peptitler, ayni zamanda bir anti-estrojenik etkiye sahiptir.

Burada genel formüle sahip izole edilmis veya saflastirilmis veya kismen saflastirilmis peptit türevli bir molekül tarif edilmekte, fakat ancak hak talebinde bulunulmamakta olup: X-[(Pro)n-His-Pro-His-Ala-Arg-lle-Lys]m-Y (Sl) burada X, H veya bir asetil grubu veya herhangi bir dogal amino asit veya serbest veya en azindan asetil türevli bir NH2 grubu ile saglanan amino asit sekansidir; Y, bir OH grubu veya bir NH2 grubu veya herhangi bir dogal amino asit veya bir C terminal karboksi-amit grubuna sahip amino asit sekansidir; "n", 1 ila 10 arasinda bir tam. sayidir ve "m", 1 ila 3 arasinda. bir tam sayidir.

Peptit türevli molekül, androjen reseptörünün (AR) tirozin kinaz Src'nin SH3 domeniyle etkilesimini inhibe edebilmekte veya önleyebilmektedir.

Peptit türevli molekül, bir in vitro veya in Vivo anti-tümör etkinlige sahiptir.

Bu peptitlerin ilave varyantlari da mevcut tarifnamenin amacidir. Aslinda formül 51 ile tarif edilenler tarafindan türetilen ve benzer biyolojik fonksiyonlari yerine getirebilen bilesikler, tarif edilen dogrusal peptitlerin herhangi türde bir sekans duplikasyonu, triplikasyon veya daha genel olarak multimerizasyonu gerçeklestirilerek tasarlanabilir (veya türetilebilir). Bir örnek olarak burada tarif edilen peptitler, Tam ve çalisma arkadaslari tarafindan bildirilen Çoklu Antijen Peptitlerinin (Multiple Antigen Peptides) hazirlanmasina iliskin yöntemlere (Tani ve Spetzler JC, 1997) ve Mutter ve çalisma arkadaslari tarafindan bildirilen Sablon ile olusturulmus Sentetik Proteinin hazirlanmasina iliskin yöntemlere (TASP, Tuchscherer ve Mutter, 1996) göre modifiye edilebilmektedir.

Elde edilen moleküller, mevcut bulusun amaçlari için, teknikte uzman kisilerce yaygin olarak kullanilan çalisma tamponlarinda trifloroasetik tuzlar, asetat tuzlar, hidroklorik tuzlar, sülfat tuzlar veya çözünme ile türetilen baska herhangi bir tuz olarak kullanilabilmektedir.

Mevcut basvuruda tarif edilen polipeptit sekanslarinin örnekleri, Tablo 1'de yer alanlardir: Sekans SEQ.ID NO.

Ac-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-lle- (SEQ.ID NO.l) Ac-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala- (SEQ.ID NO.2) Arg-lle-Lys-NHZ (SEQ.ID NO.3) His-Ala-Arg-lle-Lys-NHZ (SEQ.ID NO.4) His-Pro-His-Ala-Arg-lle-Lys-NHZ (SEQ.ID NO.5) Pro-His-Ala-Arg-lle-NHZ Ac-His-Pro-His-Ala-Arg-lle-Lys-NH2 (SEQ.ID NO.6) Ac-His-Pro-Lys-Pro-Ala-Arg-lle-Pro-His- (SEQ.ID NO.7) Pro-NHZ* * SEQ ID NO. 7, SEQ.ID#NO. l'in karistirilmis sekansidir Burada, yaklasik dört ila yaklasik 30 amino asit tortusu uzunlugunda izole edilmis bir peptit içeren bir bilesim tarif edilmekte, ancak hak talebinde bulunulmamakta olup, burada söz konusu peptit, kendi sekansi içinde 51 genel formülüne sahip olan bir peptiti içermektedir ve her bir amino asit, ilgili amino asitin herhangi bir türevi veya analogu ile degistirilebilmektedir.

Bir uygulamada söz konusu bulus, on ila yaklasik 50 amino asit tortusu uzunlugunda izole edilmis bir peptit içeren bir bilesim ile ilgili olup, burada söz konusu peptit, kendi sekansi içinde asagidakilerle temsil edilen bir amino asit sekansi içermektedir: Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-lle-Lys (SEQ.ID NO.l) ve burada her bir amino asit, ilgili amino asitin herhangi bir türevi veya analogu ile degistirilebilmektedir.

Ikinci bir uygulamada söz konusu bulus, on iki ila yaklasik 50 amino asit tortusu uzunlugunda izole edilmis bir peptit içeren bir bilesim ile ilgili olup, burada söz konusu peptit, kendi sekansi içinde asagidakilerle temsil edilen bir amino asit sekansi içermektedir: Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-lle-Lys (SEQ.ID NO.2) ve burada her bir amino asit, ilgili amino asitin herhangi bir türevi veya analogu ile degistirilebilmektedir. Üçüncü bir uygulamada söz konusu bulus, on dört ila yaklasik 50 amino asit tortusu uzunlugunda izole edilmis bir peptit içeren bir bilesim ile ilgili olup, burada söz konusu peptit, kendi sekansi içinde asagidakilerle temsil edilen bir amino asit sekansi içermektedir: Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-lle-Lys (SEQ.ID ve burada her bir amino asit, ilgili amino asitin herhangi bir türevi veya analogu ile degistirilebilmektedir.

Dördüncü bir uygulamada söz konusu bulus, on alti ila yaklasik 50 amino asit tortusu uzunlugunda izole edilmis bir peptit içeren bir bilesim ile ilgili olup, burada söz konusu peptit, kendi sekansi içinde asagidakilerle temsil edilen bir amino asit sekansi içermektedir: Gly-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-lle- Lys (SEQ.ID NO.4) ve burada her bir amino asit, ilgili amino asitin herhangi bir türevi veya analogu ile degistirilebilmektedir.

Tercih edilen peptit bilesimleri, hücre büyümesi üzerinde androjen reseptör etkinligini indirgeyen veya inhibe edenlerdir.

Söz konusu indirgemenin ya da inhibisyonunun, AR'nin Src kinaz (SH3-baglayici peptit(ler)) ile etkilesiminin indirgenmesi ya da ortadan kaldirilmasiyla gerçeklestigi bulus sahipleri tarafindan gösterilmistir. Peptit bilesimi tercihen, en az on olmak üzere amino asite kadar olan uzunluktaki peptitler içermektedir.

Yaklasik 10, 12, 14, 16 amino asitli örnek niteligindeki peptitlerin, AR etkinliginin ve DNA sentezinin indirgenmesinde özellikle etkili oldugu gösterilmistir. Söz konusu örnek niteligindeki peptitler, SEQ.ID NO.l ila SEQ.ID NO.4 sekanslarinda açiklanmaktadir.

Bulusa ait peptitler, tercihe bagli olarak amino terminalinde bir veya daha fazla amino asit içerebilmektedir. Burada, istege bagli olarak tarif edilen peptitlerin karboksi terminal ucunda bir veya daha fazla amino asit içerebilen veya alternatif olarak, tarif edilen anti-androjen motifinin her iki ucunda bir veya daha fazla amino asit içerebilen bir peptit tarif edilmekte, ancak hak talebinde bulunulmamaktadir. Bu amino asitler, dogal amino asitler, amino asit türevleri veya ornatilmis amino asitler olabilmektedir. Burada, amino asitlerin, peptide ait primer amino asit sekansinin toplam uzunlugunu, karboksi terminaline veya burada tarif edilen AR-Src etkilesiminde yer alan AR motiflerinin her iki ucuna ilave 5, 10, 15, 20 ve hatta amino asit ile uzatabilecegi tarif edilmekte, ancak hak talebinde bulunulmamaktadir.

Burada, diger sterik olarak benzer bilesiklerin, peptit yapisinin anahtar bölümlerini taklit edecek sekilde formüle edilebildigi ve bu bilesiklerin, kanserin ve özellikle de prostat ve meme hücresi karsinomlarinin tedavisinde bulusa ait peptitler ile ayni kullanima sahip olabilecegi tarif edilmekte, ancak hak talebinde bulunulmamaktadir.

Burada, en az 5 veya daha fazla tortu içermesi ile karakterize edilebilen ve sekanslarinda en az iki veya daha fazla prolin tortusu bulunan bir peptit tarif edilmekte, ancak hak talebinde bulunulmamaktadir.

Söz konusu peptitler, terapötiklerde kullanilmak üzere, örnegin asilasyon, asetilasyon veya aminasyon gibi N veya C terminalleri için gruplarin eklenmesiyle, L-aminoasit(ler) yerine bir veya daha fazla D-amino asitin kullanilmasiyla modifiye edilebilmektedir. Bunlar ayrica lipitler, nano-kapsüller, lipit kompleksleri_ ve/Veya lipozomlar içinde kapsüllenebilmektedir.

Ayrica peptitler, yavas salinimi saglamak için kaplamali kapsüllerin içine katilabilmektedir.

Bulusa ait peptit türevli molekül, tercihen meme veya prostat kanserine veya tek basina ya da estradiyol reseptörleri ile birlikte androjen reseptörlerini eksprese eden diger kanserlere karsi anti tümör ajani olarak kullanilabilmektedir. Söz konusu bulus, istemlerde belirtildigi gibi farmasötik. olarak kabul edilebilir ve etkili bir miktarda peptit türevli molekül içeren bir farmasötik bilesim saglamaktadir.

Tercih edilen bir uygulamada, söz konusu bilesiminde içinde, istemlerde tarif edilen sekilde peptit, BSA veya KLH gibi bir tasiyici moleküle baglanmakta ve/veya bir farmasötik eksipiyan ile birlikte bir lipit partikülü, bir nanokapsül, bir lipozom veya lipit vesiküller gibi bir lipit bilesimi halinde bulunabilmektedir. Söz konusu bilesim tercihen en az bir ikinci Bulusa ait peptitler ayrica, bir ilacin ve ayni zamanda bir asinin hazirlanmasi için kullanilabilmektedir. Bulusun bir diger amaci ise istemlerde tanimlandigi gibi spesifik olarak peptit türevli bir molekülü taniyabilen bir antikordur. Bulusun bir baska özelligi, istemlerde tanimlandigi gibi bir polinükleotit, bir rekombinant vektör, bir veya daha fazla peptidi içeren bir konak hücre, polinükleotit veya rekombinant vektör bilesimleridir. Bunlarin her biri ayni zamanda anti kanser formülasyonlarinin hazirlanmasinda kullanilabilmektedir.

Bulus, parental, intramüsküler, intravenöz enjeksiyon veya oral, nazal veya topikal uygulama için uygun, istemlerden tanimlandigi gibi anti östrojen peptit bilesimlerinin birini veya daha fazlasini içeren bir kit sunmaktadir. Söz konusu kit, bir veya daha fazla ilave ilaç, bir peptidomimetik veya baska bir ajan içerebilmektedir. Istemlerde tarif edilen peptitler, bir asinin hazirlanmasinda kullanilabilir.

Bir~ baska uygulamada söz konusu bulus, kültür içindeki bir hücrede androjen reseptör etkinliginin azaltilmasina ve söz konusu hücreye bir miktar anti-androjen peptit saglanmasina yönelik bir yöntem sunulmaktadir.

Burada, androjen reseptörü/Src baglantisini azaltilmasina yönelik bir yöntem tarif edilmekte, ancak hak talebinde bulunulmamaktadir.

Burada, bir hayvanda bulunan kanserin tedavi edilmesine yönelik bir yöntem tarif edilmekte, ancak hak talebinde bulunulmamaktadir. Bu yöntem. genel olarak. prostat veya meme kanseri gibi bir kanseri olan bir hayvani tanimlamayi ve bir eksipiyan veya bir lipozom veya baska bir lipid tasiyici içinde formüle edilebilen anti-androjen peptit bilesiminin terapötik olarak etkili bir miktarinin hayvana uygulanmasini içermektedir ve herhangi bir konvansiyonel ilaç verme yoluyla uygulama için hazirlanabilmektedir.

Söz konusu bulus ayrica, istemlerde tanimlandigi gibi, terapötik olarak etkili bir miktarda bir anti östrojen peptidin saglanmasini içeren, bir tümör hücresinin öldürülmesine yönelik in vitro bir yöntem saglamaktadir. Burada, bir hayvanda bulunan bir tümör hücresinin öldürülmesine yönelik bir yöntem tarif edilmekte, ancak hak talebinde bulunulmaktadir ve söz konusu yöntem genellikle kansere sahip olmasindan süphelenilen bir hayvani tanimlamayi ve hayvana terapötik olarak etkili miktarda anti-androjen peptidin verilmesini içermektedir. Bulusa ait formülasyon ayrica, tümör hücresi gelisiminin önlenmesinde kullanilabilmektedir.

Anti androjenik peptit bilesimi Mevcut bulus, istemlerde tanimlandigi gibi anti kanser özelliklere sahip, saflastirilmis ve tercih edilen uygulamalarda büyük ölçüde saflastirilmis, prolin açisindan zengin peptit türevleri saglamaktadir. Burada kullanilan “saflastirilmis peptitler" terimi, peptit açisindan zengin peptitlerin, dogal olarak elde edilebilen durumlarina göre herhangi bir dereceye kadar saflastirildigi bir proteinik bilesimi ifade etmek üzere kullanilmaktadir. Bu nedenle saflastirilmis bir peptit veya peptit ayni zamanda, dogal olarak bulundugu ortamdan arinmis bir peptidi veya proteini belirtmektedir.

Genel olarak "saflastirilmis" ifadesi, çesitli peptit türevi olmayan bilesenleri çikarmak için fraksiyonlamaya tabi tutulmus peptit bilesimini belirtmektedir. bilesimin ana bilesenini olusturdugu, örnegin bilesikteki proteinlerin yaklasik% SO'sini veya daha fazlasini meydana getirdigi bir bilesim belirtilmektedir. Tercih edilen uygulamalarda büyük ölçüde saflastirilmis bir protein, bilesimin olusturacaktir.

Mevcut bulusa uygulandigi sekilde "homojenlik derecesinde saflastirilmis" bir polipeptit veya protein, polipeptit veya proteinin, diger proteinler ve biyolojik bilesenlerden büyük ölçüde arinmis oldugu bir saflik seviyesine sahip oldugu anlamina gelmektedir. Örnegin saflastirilmis bir polipeptit, diger peptit bilesenlerinden yeterince arindirilmis olacaktir ve böylece degradatif sekanslama basarili bir sekilde gerçeklestirilebilmektedir.

Bu bulus özellikle, genel formül Sl'den elde edilen amino asit sekanslarini içeren 50 dahil olmak üzere 50'ye kadar amino asit uzunlugundaki peptitler dahil olmak üzere en az dört veya daha fazla kalinti uzunlugundaki izole peptitler gibi istemlerde tarif edilen prolin açisindan zengin peptit türevleriyle ilgilidir. Tercihen bu peptitler, AR'nin Src-SH3 domeni ile baglantisini inhibe etmektedir ve bir insan gibi etkilenmis bir hayvanda tümörlerin ve prostat ve meme kanserlerinin tedavisinde aktiftir. Terapötiklerde küçük peptitlerin kullanilmasi çesitli nedenlerden dolayi tercih edilmektedir. Bu tercihlerin arasinda düsük maliyet, genis ölçüde hazirlama kolayli ve ürün güvenilirligi bulunmaktadir. Ayrica, peptitlerin dokulara nüfuz edebilme kolayligi, düsük immünojeniklikleri, proteazlar için daha küçük bir hedef sunmalari ve böylece daha uzun biyoyararlanim saglamalari gibi biyolojik özellikleri de tercih edilmektedir ve ayrica bunlarin, AR-Src etkilesiminin önlenmesinde ve anti-androjen terapötikler olarak islev görmesinde daha etkin bir sekilde islev görecekleri düsünülmektedir.

Bununla birlikte bazi uygulamalarda kullanilmasi tercih edilmesine ragmen prolin açisindan zengin olan SH3 baglayici peptitlerin, her zaman en saflastirilmis hallerinde saglanmasina yönelik genel bir gereklilik bulunmamaktadir. Bu bakimdan teknikte uzman kisilerce iyi bilinen herhangi bir saflastirma yöntemi, yeterli seviyede peptit safligina ulasildigi sürece kullanilabilmektedir.

Sentetik peptitler, örnegin L-amino asitleri yerine bir veya daha fazla D-amino asidi kullanilarak, asilasyon veya aminasyon gibi N- veya C-terminallerine gruplarin eklenmesiyle veya peptitlerin lipitler, nanokapsüller, lipit kompleksleri ve/veya lipozomlar veya yavas salinim yapmasi için tasarlanmis biyolojik olarak uyumlu bir kaplama halinde kapsüllenmesiyle modifiye edilebilmektedir. Mevcut bulusta hem aktif hem de pasif immünizasyonda kullanilmak üzere asilar tasarlanmaktadir. Söz konusu asilar, en kolay sekilde burada tarif edilen bir sekilde hazirlanan immünojenik peptitlerden hazirlanabilmektedir.

Nükleik asit segmentleri Mevcut bulus ayrica, hemen hemen her kaynaktan izole edilebilen, toplam genomik DNA'dan arindirilmis ve burada tarif edilen yeni peptitlerin tamamini veya bir kismini kodlayan istemlerde tanimlanan DNA segmentleri ile ilgilidir. Yeni peptit türlerini kodlayan polinükleotitler, teknikte uzman kisilerce iyi bilinen yöntemler kullanilarak tamamen in vitro olarak sentezlenebilmektedir. "DNA segmenti" terimi, DNA segmentleri ve bu segmentlerin daha küçük fragmanlari ve ayrica örnegin plazmitler, kozmidler, fajmidler, faj, virüsler ve benzerleri dahil rekombinant vektörleri kapsamaktadir.

Benzer sekilde, istemlerde tarif edildigi gibi izole edilmis veya saflastirilmis bir anti-androjen peptit kodlayan geni içeren bir DNA segmenti, peptit kodlama sekanslarina ek olarak, Önemli ölçüde digerlerinden izole edilmis düzenleyici sekanslar gibi dogal olarak. olusan genler veya protein kodlama sekanslarindan büyük ölçüde izole edilmis diger bazi elementleri de içerebilen bir DNA segmentini belirtmektedir. Bu bakimdan kodlama birimini basit bir sekilde ifade etmek için kullanilmaktadir. Teknikte uzman kisiler tarafindan anlasilacagi üzere bu fonksiyonel terim, ekstra kromozomal DNA sekanslari dahil olmak üzere sadece genomik sekanslari degil, ayni zamanda proteinleri, polipeptitleri veya peptitleri ekspres eden veya eksprese edecek sekilde adapte edilebilen operon sekanslari ve/Veya tasarlanmis gen segmentlerini içermektedir. ifadesi, ilgili genin, bu durumda bir anti-androjen polipeptit geninin, DNA segmentinin kodlama bölgesinin önemli kismini olusturdugu ve DNA segmentinin büyük kromozomal fragmanlar veya diger fonksiyonel genler* veya operon kodlama bölgeleri gibi dogal olarak olusan kodlama DNA'sinin büyük bölümlerini içermedigi anlamina gelmektedir. Tabii ki bu ifade, orijinal olarak izole edilmis DNA segmentini belirtmektedir` ve insan eliyle daha sonra segmente eklenen genleri, rekombinant genleri, sentetik baglayicilari veya kodlama bölgelerini hariç tutmamaktadir.

Belirli uygulamalarda bulus, kendi amino asit sekansinda genel formül Sl'de veya SEQ.ID NO.l ila SEQ.ID NO.6 polipeptitlerinin örneklerinde belirtilen amino asit sekanslarinin herhangi birini bulunduran bir anti östrojen peptit türünü kodlayan DNA sekanslarini içeren izole edilmis DNA segmentleri ve rekombinant vektörler ile ilgilidir. Daha tercihen DNA sekansi, amino asit sekansi içinde genel istemlerde tanimlandigi gibi formül 81 veya SEQ.ID NO.1 ila SEQ.ID NO.6'da belirtilenlere bitisik en az on amino asit sekansi içeren bir anti androjen peptit türünü kodlayan bir nükleik asit sekansi içermektedir.

NO.6 polipeptitlerine ait örneklerde belirtilen sekilde bir sekans” terimi, söz konusu sekansin büyük ölçüde genel formül Sl sekansina veya SEQ.ID NO.l ila SEQ.ID NO.6 polipeptitlerine ait örneklerdeki sekanslarin bir parçasina tamamlayici oldugu ve bu sekanslarin herhangi birine ait amino asitlere özdes veya biyolojik olarak fonksiyonel bir esdegeri olmayan nispeten az sayida amino aside sahip oldugu anlamina gelmektedir. "Biyolojik olarak fonksiyonel esdeger" terimi, teknikte iyi bilinmektedir ve burada ayrintili olarak açiklanmaktadir. Buna göre, yaklasik arasinda veya yaklasik %91 ila yaklasik %99 arasinda amino asit sekansi özdesligine veya SEQ.ID NO.1 ila SEQ.ID NO.6'dan herhangi birinin amino asitlerine fonksiyonel esdegerlige sahip sekanslar.

Buna göre, yaklasik %70 ila yaklasik %80 arasinda veya yaklasik arasinda amino asit sekansi özdesligine veya SEQ.ID NO.1 ila SEQ.ID NO.6'dan herhangi birinin amino asitlerine fonksiyonel esdegerlige sahip sekanslar, “büyük ölçüde SEQ.ID NO.1 ila SEQ.ID NO.6'dan herhangi birinde belirtilen” sekanslar olacaktir.

Ayrica sekans, peptit ekspresyonunun söz konusu oldugu durumda biyolojik anti androjen aktivitesinin sürdürülmesi de dahil olmak üzere yukarida belirtilen kriterleri karsiladigi sürece, amino asit ve nükleik asit sekanslarinin ilave N- veya C-terminal amino asitleri veya 5 'veya 3' sekanslari gibi ek kalintilar içerebilmesi ve yine de büyük ölçüde burada tarif edilen sekanslarin birinde belirtilen sekilde olmasi takdir edilecektir. Terminal sekanslarinin eklenmesi özellikle, kodlama bölgesinin 5' veya 3' ucu bölümlerinden birini çevreleyen çesitli kodlayici olmayan sekanslari içerebilen veya çesitli iç sekanslari, diger bir deyisle genler içinde meydana gelmesi ile bilinen intronlari içerebilmektedir.

Mevcut bulusa ait nükleik asit segmentleri, kodlama sekansinin uzunluguna bakilmaksizin, promoterler, poliadenilasyon sinyalleri, ilave restriksiyon enzimi alanlari, çoklu klonlama alanlari, diger kodlama segmentleri ve benzerleri gibi diger DNA sekanslari ile toplam uzunlari önemli ölçüde degisecek sekilde birlestirilebilmektedir. Bu nedenle, hemen hemen her uzunluktaki nükleik asit fragmaninin kullanilabilmesi, toplam uzunlugun tercihen, tasarlanan rekombinant DNA protokolünde hazirlama ve kullanim kolayligina tabi olmasi düsünülmektedir. Örnegin, SEQ.ID No:1 ve/Veya SEQ.ID NO:2'de belirtilen peptit sekansinin tamamini kodlayan bitisik kisa bir uzanti içeren veya SEQ.ID No:1 ve/Veya SEQ.1D NO:2'de belirtilen peptitlerin herhangi birini kodlayan DNA sekanslarina özdes veya tamamlayici olan nükleik asit fragmanlari hazirlanabilmektedir. Örnegin, yaklasik nükleotitlik ve (tüm ara ürün uzunluklari dahil olmak üzere) yaklasik 50 ve yaklasik 30 baz çifti uzunlugundaki DNA sekanslarinin da yararli oldugu düsünülmektedir.

Rekombinant vektörler ve izole edilmis DNA segmentleri bu nedenle çesitli peptit kodlama bölgelerini içerebilmektedir ve söz konusu kodlama bölgeleri, temel kodlama bölgesinde, seçilmis degisiklikleri veya modifikasyonlari barindirmaktadir veya bu bölgeler, bu peptit kodlayan bölgeleri içeren daha büyük polipeptitleri veya farkli amino asit sekanslarina sahip biyolojik olarak fonksiyonel esdeger proteinleri veya peptitler kodlayabilmektedir.

Burada, biyolojik olarak fonksiyonel ve esdeger peptitler açiklanmakta, ancak. hak talebinde bulunulmamaktadir. Bu sekanslar, nükleik asit sekanslari ve bu sekilde kodlanan proteinler içinde dogal olarak meydana geldigi bilinen kodon fazlaligi ve fonksiyonel esdegerligin bir sonucu olarak ortaya çikabilmektedir. Alternatif olarak, fonksiyonel olarak esdeger proteinler veya peptitler, protein yapisindaki degisikliklerin, degistirilen amino asitlerin özelliklerine bagli olarak tasarlanabildigi rekombinant DNA teknolojisinin uygulanmasiyla olusturulabilmektedir. Insanlar tarafindan tasarlanan degisiklikler, örnegin, alan hedefli mutagenez tekniklerinin uygulanmasiyla, örnegin, proteinin antijenisitesine yönelik iyilestirmelerin sunulmasi veya moleküler seviyedeki aktivitesini incelemek için mutantlarin test edilmesi yoluyla gerçeklestirilebilmektedir.

Arzu edildigi taktirde, saflastirma ve immünolojik saptama amaçlari dogrultusunda, peptit kodlama bölgelerinin ayni ekspresyon birimi içinde, arzu edilen diger islevlere sahip proteinler ve peptitler ile hizalandigi füzyon proteinleri ve peptitleri hazirlanabilmektedir.

Rekombinant vektörler, mevcut bulusun diger yönlerini olusturmaktadir. Özellikle yararli vektörlerin, istemlerde tanimlandigi gibi DNA segmentinin kodlama kisminin, bir promotörün kontrolü altinda konumlandirildigi vektörler oldugu düsünülmektedir. Söz konusu promotör, kodlama segmentinin veya eksonun üst kismina yerlestirilmis 5' kodlayici olmayan sekanslarin izole edilmesiyle elde edilebilecegi gibi, istemlerde tanimlandigi gibi mevcut bulusa ait bir gen kodlayici peptit ile dogal olarak baglantili promoter formunda olabilmektedir.

Hibridizasyon problari ve primerleri olarak DNA segmentleri Burada tasarlanan nükleik asit sekanslari, mevcut bulusun peptitlerinin ekspresyonunda istemlerde tarif edilen sekilde kullanimlara ek olarak, çesitli baska kullanimlara da sahiptir. Örnegin nükleik asit hibridizasyon uygulamalarinda problar veya primerler olarak faydalidirlar. Söz konusu nükleik asit problarinin bir anti androjen peptit kodlayan sekanslara spesifik olarak hibridize olma kabiliyetleri, belirli bir örnekte tamamlayici sekanslarin mevcudiyetinin saptanmasinda kullanilmalarini saglayacaktir. Bununla birlikte, mutant tür primerlerinin hazirlanmasina yönelik olarak sekans bilgilerinin kullanilmasi veya diger genetik yapilarin hazirlanmasinda kullanilmaya yönelik olarak primerlerin kullanilmasi dahil olmak üzere baska kullanimlar da öngörülmektedir.

Tarif edilen polipeptitleri kodlayan DNA sekanslarina özdes veya 200 nükleotidin bitisik nükleotit uzantilarindan olusan sekans bölgelerine sahip nükleik asit molekülleri, özellikle hibridizasyon problari olarak örnegin Southern ve Northern blotlamada kullanilmaya yönelik olarak düsünülmektedir. Daha küçük fragmanlar, genellikle hibridizasyon uygulamalarinda kullanilacaktir ve burada bitisik tamamlayici bölgenin uzunlugu degisebilmekte, ancak tespit edilmek istenen bitisik sekanslarin uzunluguna göre daha büyük bitisik tamamlayici uzantilar kullanilabilmektedir.

Yaklasik 14 nükleotit uzunlugundaki bir hibridizasyon probunun kullanilmasi, hem kararli hem de seçici olan dupleks bir molekülün olusmasini saglamaktadir. Hibridin stabilitesini ve seçiciligini arttirmak ve böylece elde edilen spesifik hibrit moleküllerin kalitesini ve derecesini gelistirmek için, 14 bazdan daha uzun uzantilara tamamlayici bitisik sekanslara sahip moleküller genellikle tercih edilmektedir. Uzunlugu 15 ila 20 bitisik nükleotit olan, arzu edildigi taktirde daha uzun olabilen gen-tamamlayici uzantilara sahip nükleik asit molekülleri genel olarak tercih edilecektir. Bazi uygulamalarda, hibridizasyonun saptanmasi için istemlerde tarif edildigi gibi mevcut bulusun nükleik asit sekanslarinin bir etiket gibi uygun bir vasita ile kombinasyon halinde kullanilmasi avantajli olacaktir. Flüoresan, radyoaktif, enzimatik `veya avidin/biyotin, gibi diger ligandlar` da dahil olmak. üzere, teknikte saptanabilir` bir sinyal verebilen. çok çesitli uygun indikatörler bilinmektedir. Tercih edilen uygulamalarda, bir radyoaktif veya diger çevresel istenmeyen ayiraçlar yerine, üreaz, alkalin fosfataz veya peroksidaz gibi bir floresan isareti veya› bir enzini etiketi kullanilmasinin istenmesi muhtemeldir. Enzim etiketlerinde, tamamlayici nükleik asit içeren numunelerle spesifik hibritlesmenin tespit edilmesine yönelik, insan gözüyle veya spektrofotometrik olarak görülebilir araçlar saglamak üzere kullanilabilen kolorimetrik indikatör substratlar bilinmektedir.

Genel olarak burada tarif edilen hibridizasyon problarinin, hem hibridizasyon çözeltisinde ayiraç olarak hem. de kati fazin kullanildigi uygulamalarda yararli olmasi öngörülmektedir. Kati fazlarin bulundugu uygulamalarda test DNA'si (veya RNA), adsorbe edilmekte veya seçilen bir matrise veya yüzeye eklenmektedir. Bu sabitlenmis, tek iplikli nükleik asit daha sonra istenen kosullar altinda seçilmis problar ile birlikte hibridizasyona tabi tutulmaktadir. Seçilen kosullar, belirli sartlara (örnegin G+C içerigine, hedef nükleik asidin tipine, nükleik asidin kaynagina, hibridizasyon probunun büyüklügüne Vb.) dayanan özel durumlara bagli olacaktir.

Rekombinant vektörler ve polipeptit ekspresyonu Söz konusu bulus istemlerde tarif edildigi gibi, tarif edilen anti androjen peptitlerinden herhangi birini içeren bilesimleri tarif etmekte ve bunlara iliskin hak talebinde bulunmaktadir.

Söz konusu bilesim, bir anti androjen peptidini kodlayan bir nükleik asit segmentini eksprese eden bir veya daha fazla konak hücre, peptitleri veya peptitler içeren füzyon proteinlerini eksprese eden rekombinant konak hücreler, hücre süspansiyonlari, ekstratlar, inklüzyon cisimcikleri veyat tarif edilen anti androjen peptileri içeren doku kültürleri ve kültür ekstratlari, kültür süpernatanti, parçalanmis hücre, hücre ekstratlari, lizatlar, homojenatlar ve benzerlerinin içinde bulunabilmektedir. Söz konusu bilesimler, sulu formda veya alternatif olarak kuru, yari-islak 'veya hücre macunu, hücre topagi gibi benzer formlarda veya alternatif olarak dondurularak kurutulmus, toz haline getirilmis, liyofilize edilmis, buharlastirilmis olabilmekte veya benzer sekilde kuru formda hazirlanabilmektedir. Anti androjen peptitleri hazirlamayan yonelik. yollar, protein izolasyonu ve saflastirnß. tekniginde uzman kisilerce iyi bilinmektedir. Bazi uygulamalarda anti androjen peptitleri saflastirilabilmekte, konsantre edilebilmekte, diger ayiraçlar ile karistirilabilmekte veya arzi edilen nihai bir form haline getirilmek üzere islemden geçirilebilmektedir. Söz konusu bilesim tercihen, anti androjen peptidinin agirlikça yaklasik %1 ila yaklasik %90'ini ve daha tercihen agirlikça yaklasik %5 ila yaklasik %SO'sini olusturabilmektedir.

Tercih edilen bir uygulamada istemlerde tanimlandigi gibi bulusun anti-androjen peptit bilesimleri, bir anti androjen peptit eksprese eden bir konak hücrenin söz konusu peptit gibi bir peptit üretmek için etkili kosullar altinda kültürlenmesi ve daha sonra söz konusu hücreden peptidin elde edilmesi seklindeki adimlari içeren bir süreç marifetiyle hazirlanabilmektedir.

Böyle bir anti androjen peptidinin elde edilme süreci, ayrica saflastirma, konsantre etme, islemden geçirme ve söz konusu polipeptidin bir veya daha fazla ayiraç içine katilip karistirilmasini içermektedir. Anti androjen peptit tercihen, agirlikça yaklasik %1 ila yaklasik %90 ve daha tercihen yaklasik bir miktarda elde edilmektedir.

Burada, bir anti androjen peptit bilesiminin hazirlanmasina yönelik bir yöntem tarif edilmekte, ancak hak talebinde bulunulmamaktadir. Söz konusu yönteni genel olarak, bir anti androjen peptit eksprese eden bir konak hücrenin söz konusu peptidi üretmek için etkili kosullar altinda kültürlenmesi ve daha sonra bu sekilde üretilen polipeptidin elde edilmesi seklindeki adimlari içermektedir.

Istemlerde tanimlandigi gibi bulusa ait rekombinant plazmit vektörleri, bulusa ait anti androjen polipeptitlerini üretmek için diger uygun bakteriyel veya ökaryotik hücreleri dönüstürmede kullanilabilmektedir.

NIH3T3, COS7 ve CAOVB'ün yani sira maya hücrelerini içeren Ökaryotik konak hücrelerin, peptit türlerinin hazirlanmasinda özellikle yararli oldugu düsünülmektedir. Benzer sekilde, E. coli, Pseudomonas spp. ve ilgili Enterobacteraceae ve benzerleri gibi Gram-negatif hücreler dahil olmak üzere prokaryotik konak hücrelerin hepsinin, istemlerde tarif edildigi gibi bulusa ait anti-androjen peptitlerinin hazirlanmasinda yararli oldugu düsünülmektedir.

Kodlayici DNA segmentinin bir rekombinant veya heterolog promotörün kontrolü altinda konumlandirilmasiyla belirli avantajlar elde edilecektir. Burada kullanilan bir rekombinant veya heterolog promotörün, dogal ortaminda bir anti androjen peptidini kodlayan bir DNA. segmenti ile normalde baglantili olmayan bir promotörü belirtmesi amaçlanmistir. Bu promotörler, normalde diger genler ile baglantili promotörleri ve/veya herhangi bir bakteriyel, viral veya ökaryotik hücreden izole edilen promotörleri içerebilmektedir. Tercih edilen ökaryotik hücreler arasinda, memeli hücreleri olmak üzere hayvan hücreleri, özellikle en çok tercih edilen insan hücreleri bulunmaktadir. Dogal olarak, DNA segmentinin ekspresyonunu, ekspresyon için seçilen hücre tipi, doku, organizma, hayvan veya rekombinant konak hücrede etkili bir sekilde yönlendiren bir promoterin kullanilmasi önemlidir. Protein ekspresyonu için promotör ve hücre tipi kombinasyonlarin kullanimi genel olarak moleküler biyoloji alaninda uzman kisilerce bilinmektedir, örnegin bkz. Sambrook v.d. 1989. Kullanilan promotörler, konstitütif veya indüklenebilir olabilmektedir ve büyük ölçekli rekombinant protein veya peptit üretiminde avantajli oldugu gibi, dahil edilen DNA segmentinin yüksek seviyeli ekspresyonunu yönlendirmek için uygun kosullar altinda kullanilabilmektedir.

Terapötik ve diyagnostik kitler Mevcut bulusun terapötik kitleri, protein, peptit, inhibitör, gen, vektör veya diger peptit baglayici protein efektörünü içeren prolin açisindan zengin peptit içeren kitlerdir. Söz konusu kitler genellikle uygun kap araçlarinda, protein, peptit, inhibitör, gen, vektör veya tercihe bagli olarak baska anti kanser ajanlarini içeren farmasötik olarak kabul edilebilir bir formülasyonda yukaridakilerin herhangi birini eksprese eden baska bir peptit baglayici protein efektörünü veya vektörünü içeren burada tarif edilen prolin açisindan zengin peptidin farmasötik olarak kabul edilebilir formülasyonunu içermektedir.

Söz konusu kit, tek bir kap aracina sahip olabilmekte veya her bir bilesik için farkli kap araçlarina sahip olabilmektedir.

Söz konusu kitin bilesenlerinin bir veya birden fazla sivi çözelti içinde bulundugu durumda söz konusu sivi çözelti, bir sulu çözelti, özellikle bir steril sulu çözeltidir. Yukarida bahsedilen bilesimler siringalanabilir bir bilesim halinde de formüle edilebilmektedir. Bu durumda söz konusu kabin kendisi bir siringa, pipet veya bunlara benzer söz konusu formülasyonun Vücudun enfekte bir bölgesine uygulanabildigi, bir hayvana enjekte edilebildigi veya hatta kitin diger bilesenlerine uygulanip bunlarla karistirildigi aparatlardir.

Ancak söz konusu kitin bilesenleri, kurutulmus toz(1ar) olarak saglanabilmektedir. Ayiraçlarin ve bilesenler kuru bir toz halinde saglandigi durumda söz konusu toz, uygun bir çözücünün eklenmesiyle sulandirilabilmektedir. Söz konusu çözücünün ayrica baska bir kapta saglanmasi öngörülmektedir. Ikinci bir anti kanser terapisinin bulunmasi durumda, söz konusu kit, genellikle ikinci bir kap içerecektir. Kitler, ayrica kabul edilebilir seyreltici için baska kaplar da içerebilmektedir.

Nükleik asit iletimi ve DNA transfeksiyonu yöntemleri Bazi uygulamalarda, burada tarif edilen nükleik asit segmentlerinin, istemlerde tanimlandigi gibi uygun konak hücreleri transfekte etmek için kullanilacagi düsünülmektedir.

DNA'nin hücrelere yerlestirilmesi için gereken teknoloji, teknikte uzman kisilerce iyi bilinmektedir. Bir nükleik segmentinin hücrelere yerlestirilmesine yönelik asagida yer alan dört genel yöntem kabul edilebilir: (1) kimyasal yöntemler (Graham ve VanDerEb, 1973); (2) mikroenjeksiyon (Capecchi, 1980), elektroporasyon (Wong ve gibi fiziksel yöntemler; (3) Viral vektörler (Clapp, 1993; Eglitis v.d. 1988; Eglitis ve Anderson, 1988) ve (4) reseptör aracili mekanizmalar (Curiel v.d. 1991; Wagner v.d. 1992).

Lipozomlar ve nanokapsüller Bazi uygulamalarda bulus sahibi, istemlerde tanimlanan peptit bilesimlerinin konak hücrelere yerlestirilmesine yönelik lipozomlarin ve/Veya nanokapsüllerin kullanilmasini tasarlamaktadir. Söz konusu formülasyonlar, burada tarif edilen polipeptitlerin, farmasötiklerin ve/veya antikorlarin farmasötik olarak kabul edilebilir formülasyonlarinin yerlestirilmesi için tercih edilmektedir. Lipozomlarin olusturulmasi ve kullanimi, genel olarak teknikte uzman kisilerce bilinmektedir (örn. bkz. hedeflenmis antibiyotik terapisi ve bakteriyel enfeksiyonlar ve hastaliklarda lipozomlarin ve nanokapsüllerin kullanilmasini açiklayan Couvreur V.d. 1977 referansli yayin). Yakin zamanda serum stabilitesi ve sirkülasyon yariömürleri arttirilmis lipozomlar gelistirilmistir` (Gabizon ve Papahadjopoulos, 1988; Allen ve Çizimler, mevcut tarifnamenin bir parçasini olusturmaktadir ve mevcut bulusun belirli yönlerini daha fazla göstermek için dahil edilmistir. Söz konusu bulus, burada sunulan spesifik uygulamalarin detaylari tarifleriyle birlikte bu çizimlerden bir veya daha fazlasina referansla daha iyi anlasilabilmektedir.

SEKIL 1 A. Insan prostat kanseri hücrelerinin DNA sentezinin AR'den (SEQ.ID NO.1) modellenen Src-SH3 baglayici peptit tarafindan gerçeklestirilen inhibisyonu. Insan prostat kanserinden türetilen LNCaP hücreleri, daha önce tarif edildigi gibi odun kömürü ile muamele edilmis serum. katilmis fenol kirmizisiz ortam içinde büyütülmüs (Migliaccio V.d 2000) ve tek basina 10 nM Rl881 sentetik androjen ile veya 1000 kat fazla anti androjen Casodex veya 1 nM SH3 baglayici peptitin (SH3, SEQ.ID NO.1) veya 1 nM Ss (karistirilmis sekans: SEQ.ID NO.7) peptidi varliginda 24 saat boyunca muamele edilmistir. Hormon tedavisinin sonunda, muamele edilmemis (kontrol) veya tek basina R veya SH3 baglayici peptidin (SH3, SEQ.ID NO.1) veya karisik peptit sekansi SEQ.ID NO.l (Ss, SEQ.ID NO.7) varliginda muamele edilmis hücrelerde BrdU katilmasi (incorporation) bildirilen sekilde analiz edilmistir (Castoria V.d. 1999). Veriler, 6 deneyden elde edilen verilen ortalamasi alinarak, BrdU içeren hücre yüzdesi olarak sunulmustur.

SEKIL lB. Estradiol ile uyarilmis insan meme kanseri hücrelerinin DNA sentezinin AR'den (SEQ.ID NO.l) türetilen SH3 baglayici peptitler tarafindan gerçeklestirilen inhibisyonu.

Insan meme kanserinden türetilen› MCF-7 hücreleri, daha önce tarif edildigi gibi odun kömürü ile muamele edilmis serum içeren fenol kirmizisiz ortam içinde 3 gün boyunca muhafaza edilmistir ve tek basina 10 nM 178 estradiol ile veya 1000 kat fazla anti östrojen ICI 182,780 veya 1 nM SH3 baglayici peptidin SEQ.ID NO.l veya karistirilmis sekans (Ss, SEQ.ID NO.7) peptidi varliginda 24 saat boyunca muamele edilmistir. Hormon tedavisinin sonunda, muamele edilmemis (kontrol) veya tek basina estradiol (E2) ile veya ICI ya da Ss peptit varliginda, hücrelerde BrdU katilmasi analiz edilmistir. Veriler, 6 deneyden elde edilen verilen ortalamasi alinarak, BrdU içeren hücre yüzdesi olarak bildirilmistir.

SEKIL lC. EGF ile uyarilmis insan prostat kanseri hücrelerinin DNA sentezinin AR'den (SEQ. ID NO.l) modellenen SH3 baglayici peptit (SH3) tarafindan gerçeklestirilen inhibisyonu. LNCaP hücreleri, daha önce tarif edildigi gibi odun kömürü ile muamele edilmis serum katilmis fenol kirmizisiz ortam içinde büyütülmüs ve tek basina 100 ng/ml EGF ile veya 10 uM anti östrojen ICI veya karistirilmis peptit sekansi SEQ.ID NO.l (SEQ.ID NO.7) varliginda 24 saat boyunca muamele edilmistir. Büyümü faktörü tedavisinin sonunda, muamele edilmemis (kontrol) veya tek basina EGF (EGF) ile veya ICI veya karistirilmis peptit sekansi SEQ. ID NO.l (Ss) varliginda hücrelerde BrdU katilmasi analiz edilmistir. Veriler, BrdU içeren hücre yüzdesi olarak bildirilmistir. SEKIL 1D. EGF ile uyarilmis insan meme kanseri hücrelerinin DNA sentezinin AR'den (SEQ. ID NO.l) modellenen SH3 baglayici peptiteri tarafindan gerçeklestirilen inhibisyonu. MCF-7 hücreleri, daha önce tarif edildigi gibi odun kömürü ile muamele edilmis serum katilmis fenol kirmizisiz ortam içinde büyütülmüs ve tek basina 100 ng/ml EGF ile veya 10 uM anti östrojen ICI 182,780 veya 1 nM AR türevli (SH3 baglayici) peptit veya karistirilmis peptit sekansi SEQ ID NO.l (SEQ.ID NO.7) varliginda 24 saat boyunca muamele edilmistir. Büyümü faktörü tedavisinin sonunda, muamele edilmemis (kontrol) veya tek basina EGF (EGF) ile veya ICI veya karistirilmis peptit sekansi SEQ. ID NO.l (Ss) varliginda hücrelerde BrdU katilmasi analiz edilmistir. Veriler, BrdU içeren hücre yüzdesi olarak bildirilmistir.

SEKIL 2A. AR türevli (Src-SH3 baglayici) peptit (SEQ.ID NO.l) tarafindan androjen ile uyarilmis AR. ile Src baglantisinin inhibisyonu. Insan prostat kanseri LNCaP hücreleri, tek basina baglayici peptit veya SEQ.ID NO.l peptidinin karistirilmis sekansinin (SEQ.ID NO.7) varliginda 2 dakika boyunca uyarilmadan bekletilmistir veya uyarilmistir. Hücre lizatlari, anti-Src antikorlari ile inkübe edilmis ve immunopresipitasyona ugramis proteinler SBS-PAGE üzerinde çözdürülmüs ve nitroselüloz filtrelerine aktarilmistir. Filtreler üzerinde daha sonra, Src ile baglantili AR'yi saptamak üzere anti-Src veya anti-insan AR antikorlari ile blotting islemi uygulanmistir.

Immünokompleksler, ECL saptama kiti kullanilarak ortaya çikarilmistir. Serit l: uyarilmamis hücreler; serit 2: Rl88l ile muamele edilmis hücreler; serit 3: Casodex (Cdx) varliginda Rl881 ile muamele edilmis hücreler; serit 4: SH3 baglayici peptit (SH3, SEQ. ID NO.l) varliginda Rl88l ile muamele edilmis hücreler; serit 5: karistirilmis peptit sekansi SEQ.ID NO.l (Ss, SEQ. ID NO.7) varliginda Rl88l ile muamele edilmis hücreler.

SEKIL 2B. AR türevli (Src-SH3 baglayici) peptit (SEQ.ID NO.l) tarafindan östrojen ile uyarilmis AR ile Src baglantisinin inhibisyonu. Insan meme kanseri MCP-7 hücreleri, tek basina 10 SH3 baglayici peptit veya SEQ.ID NO.l peptidinin karistirilmis sekansinin (SEQ.ID NO.7) varliginda 2 dakika boyunca uyarilmadan bekletilmistir veya uyarilmistir. Hücre lizatlari, anti-Src antikorlari ile inkübe edilmis ve immunopresipitasyona ugramis proteinler SUS-PAGE üzerinde çözdürülmüs ve nitroselüloz filtrelerine aktarilmistir. Filtreler üzerinde daha sonra, Src ile baglantili AR'yi saptamak üzere anti-Src veya anti-insan AR antikorlari ile blotting islemi uygulanmistir.

Immünokompleksler, ECL saptama kiti kullanilarak. ortaya çikarilmistir. Serit l: uyarilmamis hücreler; serit 2: estradiol (E2) ile muamele edilmis hücreler; serit 3: ICI varliginda E2 ile muamele edilmis hücreler; serit 4: SH3 baglayici peptit (SH3) varliginda estradiol ile muamele edilmis hücreler; serit 5: karistirilmis peptit sekansi SEQ.ID NO.l (Ss) varliginda E2 ile muamele edilmis hücreler SEKIL 3A. AR türevli Src-SH3 baglayici peptit (SEQ.ID NO.1) tarafindan androjen ile uyarilmis siklin Dl ekspresyonunun inhibisyonu. Uyku halindeki MCP-7 ve LNCaP hücreleri, muamele edilmeden birakilmistir veya tek basina 10 nM R188l ile veya 5 uM PI3-kinaz inhibitörü LY294,002 veya 1 nM AR. türevli SH3 baglayicisi veya karistirilmis peptit sekansi SEQ.ID NO.l (SEQ.ID. NO.7) varliginda 8 saat boyunca muamele edilmistir.

Hücre lizatlarindan alinan protein, SDS-PAGE üzerinde çözdürülmüs ve daha sonra nitroselüloz filtrelerine aktarilmistir. Endojen Siklin Dl, uygun antikorlar kullanilarak ortaya çikarilmistir. Serit l: uyarilmamis hücreler; serit 2: Rl88l ile nwamele edilmis hücreler; serit 3: IX varliginda Rl88l ile muamele edilmis hücreler; serit 4: AR kaynakli (SH3-baglayici) peptit (SH3) varliginda Rl881 ile muamele edilmis hücreler; serit 5: karistirilmis peptit sekansi SEQ.ID NO.l (Ss) varliginda Rl881 ile muamele edilmis hücreler.

SEKIL 3B. AR türevli SH3 baglayici peptit (SEQ.ID NO.1) tarafindan östrojen ile uyarilmis siklin Dl ekspresyonunun inhibisyonü. Uyku halindeki MCP-7 ve LNCaP hücreleri, muamele edilmeden birakilmistir veya tek basina 10 nM l7ß estradiol ile baglayicisi veya karistirilmis peptit sekansi SEQ.ID NO.l (SEQ.ID. NO.7) varliginda 8 saat boyunca muamele edilmistir.

Hücre lizatlarindan alinan protein, SBS-PAGE üzerinde çözdürülmüs ve daha sonra nitroselüloz filtrelerine aktarilmistir. Endojen Siklin Dl, uygun antikorlar kullanilarak ortaya çikarilmistir. Serit l: uyarilmamis hücreler; serit 2: estradiol ile muamele edilmis hücreler; serit 3: LY varliginda estradiol ile muamele edilmis hücreler; serit 4: SH3 baglayici peptit (SH3) varliginda estradiol ile muamele edilmis hücreler; serit 5: karistirilmis peptit sekansi SEQ.ID NO.l (Ss) varliginda estradiol ile muamele edilmis hücreler.

SEKIL 4A. AR kaynakli (SH3 baglayici) peptidin (SEQ. ID NO.1) prostat kanserinde (LNCaP hücreleri) androjen reseptörü ile regüle edilmis gen transkripsiyonu üzerindeki etkisizligi. LNCaP hücreleri, bir androjen yanitli elemanin (ARE 3416) kontrolü altinda lusiferaz genini kodlayan bir raportör gen ile transfekte edilmistir (Castoria v.d. 2003). Transfeksiyondan alti saat sonra hücreler, 24 saat daha tek basina 10 nM Rl881 varliginda veya 1000 kat fazla Casodex veya 1 nM SH3 baglayici peptitle (SEQ.ID NO. 1) veya 1 nM karistirilmis peptid sekansi SEQ.ID NO.l (SEQ.ID. NO.7) ile birlikte 10 nM R1881 varliginda veya bunlar olmaksizin tutulmustur. Daha sonra hücre lizatlarinda lusiferaz etkinligi test edilmistir. Sütun 1: uyarilmamis hücreler; Sütun 2: R1881 ile muamele edilmis hücreler; Sütun 3: Casodex (Cdx) varliginda Rl881 ile muamele edilmis hücreler; Sütun 4: SH3 baglayici peptit (SH3) varliginda Rl881 ile muamele edilmis hücreler; Sütun 5: karistirilmis peptit sekansi SEQ.ID NO.l (Ss) varliginda Rl881 ile muamele edilmis hücreler.

SEKIL 4B. AR kaynakli (SH3 baglayici) peptidin (SEQ. ID NO.1) meme kanserinde (MCP-7 hücreleri) östrojen reseptörü ile regüle edilmis gen transkripsiyonu üzerindeki etkisizligi. MCF-7 hücreleri, bir östrojen yanitli elemanin (vt-tk-LUC) kontrolü altinda lusiferaz genini kodlayan bir raportör gen ile transfekte edilmistir (Castoria v.d. 2003). Transfeksiyondan alti saat sonra hücreler, 24 saat daha tek basina 10 nM l7ß- 1 nM SH3 baglayici peptitle (SEQ.ID NO. 1) veya 1 nM karistirilmis peptid sekansi SEQ.ID NO.l (SEQ.ID. NO.7) ile birlikte 10 nM l7ß-estradiol (E2) varliginda veya bunlar olmaksizin tutulmustur. Daha sonra hücre lizatlarinda lusiferaz etkinligi test edilmistir. Sütun 1: uyarilmamis hücreler; Sütun 2: E2 ile muamele edilmis hücreler; Sütun 3: ICI varliginda E2 ile muamele edilmis hücreler; Sütun 4: SH3 baglayici peptit (SH3) varliginda E2 ile muamele edilmis hücreler; Sütun 5: karistirilmis peptit sekansi SED ID NO.l (Ss) varliginda E2 ile muamele edilmis hücreler.

SEKIL 5A SH3 baglayici peptidin insan prostat kanseri hücreleri üzerindeki in vivo etkisi. LNCaP prostat kanseri hücreleri, çiplak (nude) erkek farelerde subkütanöz olarak büyütülmüstür.

Tümör boyutunun 200-400 mm3'e ulasmasindan sonra fareler, intraperitonal enjeksiyon yoluyla çözeltisi (daireler) ile veya ayni çözeltinin 2 uM SH3 (SH3) baglayici peptit SEQ.ID NO.l (kareler) içeren haliyle tedavi edilmistir. Tedavi, hafta O'in basinda baslatilmistir ve peptitler, grup basina 5 hayvan kullanilarak 4 hafta boyunca alternatif günlerde verilmistir.

SEKIL 5B SH3 baglayici peptidin insan meme kanseri hücreleri üzerindeki in vivo etkisi. MCP-7 insan meme kanseri hücreleri, çiplak erkek farelerde subkütanöz olarak büyütülmüstür. Tümör boyutu yaklasik 1000 mm3 oldugunda fareler, intraperitonal enjeksiyon yoluyla ile veya ayni çözeltinin 2 uM SH3 baglayici peptit SEQ.ID NO.l (SH3, kareler) içeren 200 uI'lik haliyle tedavi edilmistir. Tedavi, hafta O'in basinda baslatilmistir ve peptitler, grup basina 5 hayvan kullanilarak 5 hafta boyunca alternatif günlerde verilmistir.

SEKIL 6A. SH3 baglayici peptidinin insan prostat kanseri hücrelerinde Ki-67 antijen ekspresyonu ve apoptoz üzerindeki etkisi. Erkek çiplak farelerde LNCaP hücre ksenogreftleri, Sekil 5A'da sunulan deneyde kullanilan ile aynidir. Tedavinin sonunda, tümör örnekleri Ki-67 antijen ekspresyonu ve apoptoz bakimindan analiz edilmistir. Sol panelde muamele edilmemis (ctrl) ve SEQ.ID NO.1 peptit ile muamele edilmis (SH3) farelerde Ki-67 antijeninin ekspresyonu Ki-67 pozitif hücrelerin yüzdesi olarak gösterilmektedir. Sag panelde, temsili alanlarda gözlemlenen TUNEL testi pozitif hücreler gösterilmektedir.

SEKIL 68. SBS baglayici peptidinin insan meme kanseri hücrelerinde Ki-67 antijen ekspresyonu ve apoptoz üzerindeki etkisi. Erkek çiplak farelerde MCP-7 hücreleri ksenogreftleri, Sekil 5B'da yer alan deneyde kullanilan ile aynidir. Tedavinin sonunda, tümör örnekleri Ki-67 antijen ekspresyonu ve apoptoz bakimindan analiz edilmistir. Sol panelde muamele edilmemis (ctrl) ve SEQ.ID NO.1 peptit ile muamele edilmis (SH3) farelerde Ki-67 antijeninin ekspresyonu Ki-67 pozitif hücrelerin yüzdesi olarak gösterilmektedir. Sag panelde, temsili alanlarda gözlemlenen TUNEL testi pozitif hücreler gösterilmektedir. ÖRNEKLER Asagidaki örnekler, mevcut bulusun tercih edilen uygulamalarini içermektedir. ÖRNEK 1: kimyasal sentez yoluyla AR türevli Src-SH3 baglayici peptidin (SEQ. ID. No.1) hazirlanisi. 1 ila 4 arasindaki peptitler, kati faz yöntemi (Bodansky M ve Bodansky A, 1995) ve büyük ölçüde bilimsel literatürde tarif edilen ve teknikte tecrübeli kisilerce iyi bilinen Fmoc/tBu (Fmoc: 9-florenil-metoksikarbonil) kimyasi uygulanarak uygun sekilde el ile hazirlanabilmektedir (Carpino ve Han, 1972; Fields ve Noble, 1990). Hazirlama islemini hizlandirmak ve kolaylastirmak için otomatik çoklu peptit sentezleyiciler kullanilabilmektedir. Tek veya çok kanalli herhangi bir kimyasal yöntem veya mekanik sentezleyici, ayni zamanda, nihai bilesiklerin biyolojik özelliklerini etkilemeden sentezi gerçeklestirmek için uygun sekilde kullanilabilmektedir.

Peptit sentezi, C terminal amit peptitlerini verebilen bir RINK baglayici ile uygun sekilde türetilmis bir reçine kullanilarak 50 umol'luk bir ölçekte gerçeklestirilebilmektedir (Rink, 1987).

Söz konusu reçinelerden biri, teknikte ayni zamanda tecrübeli kisilerce RINK AMIDE reçinesi olarak da bilinen 4- (2', 4'- Dimetil-oksi) henil-Fmoc-aminometil)-fenoksi reçine, 100-200 mesh; kopolistiren %1 Di-vinilbenzen), ornatik 0,50 mmol/g kullanilir. Reçine, alt kisminda bir filtrasyon septum bulunan ml polipropilen tepkime kabi içine yerlestirilir (Shimadzu dakika karistirilarak sisirilir ve daha sonra alttan hafif bir vakum uygulayarak çözücünün kaldirilmasi yoluyla birkaç kez (en az 4) 1,0 ml kuru N,N-dimetilformamidin (DMF, Peptit sentez derecesi, LabScan, cat. N. H6533) ile durulanir. Reçine daha sonra ilk Fmoc grubunu kaldirmak için karisitirilarak oda sicakliginda 15 dakika boyunca DMF içinde 1,0 mL %20 V/V piperidin (BIOSOLVE LTD, cat. N. 16183301) çözeltisi ile muamele edilir ve ayiraç fazlaligini kaldirmak için 2 dakika boyunca yikanmistir.

Ardindan asagida yer alan 6 adim takip edilmistir: 1. 250 umol (117 mg) Fmoc-L-Lys(Boc)-OH (Novabiochem, cat. 04- 12-1026), 500 uL kuru DMF içerisinde çözdürülmüstür. 2. Korumali amino asit, karistirilarak oda sicakliginda 4 dakika boyunca 400 uL'lik çözelti A ve 400 uL'lik çözelti B ile önceden aktive edilmistir ve burada: Çözelti A asagidakileri içerir: üronyum tetrafloroborat (TBTU, >%99, Chem-lmpex Inti, cat. N. Çözelti B asagidakileri içerir: DMF içinde 1 M Di-izopropil-etilamin (DIEA, SIGMA-ALDRICH, cat. 3. Çözelti reçinesine aktarilir ve 30 dakika boyunca karistirilir. 4. Ayiraç, vakum altinda çikarilir ve reçine, 1,0 mL kuru DMF ile 4 defa yikanir.

. Reçine, N terminal Fmoc'u çikarmak için oda sicakliginda karistirilarak 15 dakika boyunca DMF içinde 1,0 mL'1ik %20 V/V piperidin ile tekrar muamele edilir. 6. Reçine, 1,0 mL DMF ile 3 defa yikanir.

Adim 1'den 6'ya kadar olan adimlar, adim 1'de sekansta talep edilen ilgili korumali amino asitin degistirilmesiyle tekrarlanir. Kullanilan korumali türevler, asagidaki Tablo Il'de bildirilmektedir.

Tablo II. Peptit SEQ. 1D NO.l'in kimyasal sentezi için kullanilan yaygin korumali amino asitler ve gereken miktarlar.

AA Korumali Miktar Kod türevler lIe Fmoc-L-lle-OH 88 mg (250Novabiochem, cat.

Arg Fmoc-L- 161 mg (250Novabiochem, cat.

Arg(be)-OH umolI) 04-12-1145 Ala Fmoc-L-Ala-OH 78 mg (250Novabiochem, cat.

His Fmoc-L- 155 mg (250Novabiochem, cat.

His(Trt)-OH umoI) 04-12-1065 Pro Fmoc-L-Pro-OH 84 mg (250Novabiochem, cat. (tablonun devami) Korumali AA Miktar Kod türevler Lys Fmoc-L- 117 mg (250Novabiochem, cat.

Lys(Boc)-OH umol) 04-12-0069 Fmoc-L-Lys(Boc)-OH, korumali 1izin türevi: N-d-Fmoc-N-s-t-Boc- L-lizini belirtmektedir ve "t-Boc" sembolü, koruyucu grubu t- butiloksikarbonili isaret etmektdir; Fmoc-L-lle-OH, korumali izolösin türevi: N-d-Fmoc-L-izolösini belirtmektedir; Fmoc-L- Arg(be)-OH, korumali arjinin türevi; N-d-Fmoc-NG-22,4,6,7- pentam-etildihidrobenzofuran-S-sülfonil-L-arginini belirtmektedir; Fmoc-L-Ala-OH, korumali alanin türevi: N-d- Fmoc-L-alanini belirtmektedir; Fmoc-L-His(Trt)-OH korumali histidin türevi: N-d-Fmoc-N-im-tritel-L-histidini belirtmektedir ve "tritil" sembolü, koruyucu grubu t- fenilmetili belirtmektedir; Fmoc-L-Pro-OH, prolin türevi: N-a- Son Fmoc grubunun çikarilmasindan sonra reçine, karistirilarak oda sicakliginda 30 dakika boyunca kuru DMG içinde 1,0 M DIEA içeren 1,0 M'lik Asetik Anhidrit (Fluka, cat. 45830) çözeltisi ile muamele yoluyla asetile edilir. DMF ile yogun bir sekilde durulama isleminden sonra seçine, asagida yikama islemlerine tabi tutulur: Çözücü Yikama Sayisi Hacim (mL) * Metanol (MeOH, LabScan, cat. N. A3513), ** Etil Eter (EtzO, LabScan. cat. N. A3509E).

Reçine, bir Nitrojen akisi uygulanarak kurutulur ve daha sonra agirligi ölçülür. Reçinenin nihai agirligi 280,0 mg'dir. karisimi (TIS, tri-izo- propilsilan, SIGMA-ALDRICH cat. N. 23,378-1) taze olarak hazirlanir ve reçineye eklenir. 3 saat karistirildiktan sonra reçine filtre edilir ve asidik çözelti, 15 mL soguk EtzO içeren ml'lik bir polipropilen tüp içinde dogrudan toplanir. Beyaz çökelti, 3000 rpm'ik santrifügasyon yoluyla 10 dakikada ayrilir ve organik çözücüler atilir. Söz konusu çözelti, 5,0 mL'lik soguk EtZO ile bir kez yikanir ve santrifügasyon isleminden sonra 2,0 mL deiyonize HQO içinde çözdürülür ve liyofize edilir. Beyaz katinin agirligi 102 mg'dir.

Liyofilize peptit, örnegin Phenomenex tarafindan temin edilen Jupiter 25x2,1 cm ID Cl8 kolonlari (Phenomenex cat. N. OGG-4053- PO) gibi piyasa mevcut preparatif ters faz Cl8 kolonlarina sahip Shimadzu Corp. tarafindan temin edilen LC-8 sistemi gibi piyasada mevcut Yüksek Performansli Sivi Kromatografisi (HPLC) sistemleri kullanilarak ters faz kromatografisi ile uygun sekilde saflastirilabilir. Peptit saflastirma için tipik gradyanlar, deiyonize HzO, %0,1 trifloroasetik asit (TFA, Sigma- Aldrich, Cat N. 91700) ve asetonitril (CH3CN, LabScan, Cat. N° C2503, %O,l TFA gibi çözücüleri kullanir ve 20 mL/dk'lik tipik çalisma akis hizi ile 35 dakikadan fazla %5 CH3CN, %O,1 TFA ila iyi bilinmekte olup, bu yöntemlerle ticari analitik RP18 kolonlari, örnegin Phenomenex Jüpiter kolonu, 250x4,6 mm ID RP- 18 (Phenomenex cat. N. OOG-4053-E0) üzerinde gerçeklestirilen analitik HPLC analizi ile belirlendigi üzere %95-99'a varan oranlarda saflik düzeyine sahip saflastirilmis peptitler elde edilecektir. Gradyanlar, 1,0 mL/dk'lik tipik akis hizi ile 35 dakikadan fazla %5 CH3CN, %0,1 TFA ila %60 konsantrasyondadir.

Görüntüleme, tipik olarak HPLC sistemlerine uygulanan UV-Vis detektörü kullanilarak gerçeklestirilir` ve tipik bir 214 nm dalga boyuna ayarlanir.

Nihai peptit, uygun bir sekilde MALDI-TOF ve ESI-MS gibi kütle spektrometrisi yöntemleri ile karakterize edilir. Tipik bir örnekte, br ESI-MS kütle spektrometresi ile belirlenen deneysel moleküler agirlik (MW), teorik deger olan 1189,68 amu (monoizotopik. türler) ile uyumlu. olarak 1189,5 atomik kütle birimi (amu)'dir. ÖRNEK 2: AR türevli Src-SH3 baglayici peptit SEQ.ID NO.1' “in vitro" anti tümör etkisi nM R1881 sentetik androjen ile gerçeklestirilen insan prostat kanseri LNCaP tedavisinin, DNA sentezini güçlü bir sekilde uyardigi görülmüstür. Dolayisiyla LNCaP hücreleri, fenol kirmizisi, 2 mM L-glutamin (GIBCO), penisilin (10OU/ml), gentamisin (50 uI/ml), insulin (Humulin 10,2 U.l/ml, Roche) ve (GIBCO) içinde havada %5 CO2 içinde büyütülür. Hücreler daha sonra yaklasik %40 konflüansta jelatin ile önceden kaplanmis lamellere ekilir ve minumum veya sifir streoit kontaminasyonu saglamak için (Shi V.d. 1994) 3 gün boyunca insilün ve odun kömürü ile soyulmus buzagi serumu içeren fenol kirmizisi RPMI- 1640 içinde muhafaza edilir. LNCaP hücreleri daha sonra tek basina 10 nM sentetik androjen Rl ile veya 1000 kat fazla molar antiandrojen Casodex (Astra-Zeneca) veya belirtilen peptitler varliginda 24 saat boyunca muamele edilmistir.

Sekil 1A'da sunulan, alti farkli deneyden elde edilen ortalamalar halindeki sonuçlar, androjenin BrdU katilma hizini uyarilan katilma, l nM konsantrasyona sahip SH3 baglayici peptit (SH3) ile güçlü bir sekilde azaltilmistir (%25 rezidüel BrdU katilmasi). SH3 peptidinin etkisi, benzer bir ölçüde DNA sentezini azaltan saf anti androjen Casodex'in etkisiyle (%21 rezidüel BrdU katilmasi) karsilastirilmistiru Ayrica SEQ. ID NO.1'e ait karistirilmis sekans (SEQ.ID NO.7)'a tamamlayici olan asentetik peptit de kullanilmistir (Ss). Bu peptidin hücrelerin androjen ile uyarilmasi sirasinda eklenmesi, hormon bagimli DNA sentezi üzerinde sadece göz ardi edilebilir bir inhibitör etkiye sahiptir (%48 rezidüel BrdU katilmasi). Yukarida belirtilen peptitlere ek olarak SEQ.ID NO.2-SEQ.ID NO.4 peptitleri de test edilmistir. Inhibitör etkisi, SEQ.ID NO.1 peptidinden daha güçlü olmamistir.

SEQ.ID NO.1 peptidinin etkisi ayni zamanda, MCP-7 insan meme kanserinin estradiol ile uyarilan DNA sentezi üzerinde test edilmistir. MCF-7 hücreleri, fenol kirmizisi, 2 mM L-glutamin (GIBCO), penisilin (100U/ml), gentamisin (50 uI/ml), hidrokortizon 3,75 ng/ml, insulin (Humulin 10,2 U.l/l, Roche) ve Eagle ortami (DMEM, GIBCO) içinde havada %5 C02 içinde büyütülmüstür. Hücreler daha sonra yaklasik %40 konflüansta jelatin ile önceden kaplanmis lamellere ekilir ve 3 gün boyunca insilün ve odun kömürü ile soyulmus buzagi serumu içeren fenol kirmizisi DMEM içinde muhafaza. edilir. MCF-7 hücreleri daha sonra tek basina 10 nM 17ß estradiol (SIGMA, Mo) ile veya 1000 kat fazla molar anti östrojen ICI varliginda veya belirtilen peptitler ile 24 saat boyunca muamele edilmistir. Sekil lB'de sunulan, alti farkli deneyden elde edilen ortalamalar halindeki sonuçlar, estradiolün (Ez) BrdU katilma hizini %8 ila %61 oraninda arttirdigini göstermektedir.

Horman ile uyarilan katilma, l nM konsantrasyona sahip SH3 baglayici peptit (SH3) ile büyük. ölçüde azaltilmistir (%23 rezidüel BrdU katilmasi). SH3 peptidinin etkisi, östrojen ile indüklenen DNA sentezini ortadan kaldiran saf anti östrojen ICI l82,780'in etkisi ile karsilastirilabilirdir (%7 rezidüel BrdU katilmasi). SEQ.ID NO.l (Ss) peptidinin karistirilmis sekansi, östrojen ile indüklenmis DNA sentezi üzerinde anlamli bir etkiye sahip degildir.

SEQ.ID NO.l peptidi son olarak insan prostat kanseri LNCaP (lC) ve MCF-7 (1D) hücrelerinde EGF ile indüklenen. DNA. sentezini azaltma veya inhibe etme kabiliyetleri açisindan analiz edilir.

LNCaP ve MCP-7 hücreleri, yukarida tarif edilen sekilde kültürlenir ve daha sonra lamellere ekilir. Hücreler, daha sonra 1 nM SEQ. ID NO.l varliginda ve yoklugunda lOO ng/ml yüksek derecede EGF (Boheringer, CA) ile uyarilmistir.

Sekil lC'de EGF'nin %8 ila %21 oraninda BrdU katilimini uyardigi gözlemlenebilmektedir. Peptidin eklenmesi, saf antiöstrojen ICI 182,780' benzer sekilde (%7 rezidüel katilma), %5,8 BrdU katilmasini azaltmaktadir. SEQ.ID NO.l (Ss) peptidinin karistirilmis sekansi, BdrU katilmasi üzerinde küçük bir etkiye sahiptir (%15 rezidüel katilma). Sekil lD'de gösterildigi üzere MCP-7 hücrelerinde EGF, ayni zamanda BrdU katilmasini (%6 ila 36 oraninda) uyarmaktadir; peptit eklenmesi ise %1 3 BrdU katilmasini ve %9 rezidüel katilmayi azaltmaktadir. Buna karsin SEQ. ID NO.l peptidinin karistirilmis sekansi (Ss), BdrU katilmasini (%48 katilmasi) azaltmaktadir.

YÖNTEMLER DNA sentezi, lOOpM (nihai konsantrasyon) BrdU (Boeheringer) ile 6 saatlik bir darbe yoluyla tek hücrelilerde analiz edilir.

Lameller üzerinde hücreler sabitlenir ve seyreltilmis (PBS içinde 111) fluoresein ile konjuge fare anti-BrdU mAb'leri (Boheringer Mannheim Co., IN sirketinden temin edilen klon BMC9318) ile inkübe edilip, ardindan PES ile üç kez yikanir.

Fare antikorlari, seyreltilmis (PBS içinde 1: 200) Texas-red ile konjuge keçi anti-fare antikorlari (Calbiochem, CA) kullanilarak ortaya çikarilir; Tüni lameller, PBS'de üç kez yikanir, ters çevrilir ve cam slaytlar üzerinde Moviol (Calbiochem, CA) içine monte edilir. Slaytlar, bir Axiophot floresan mikroskobu (Zeiss) kullanilarak analiz edilir. ÖRNEK 3: AR türevli (Src-SH3 baglayici) peptit (SEQ.ID NO.1) tarafindan androjen ile uyarilmis AR. ile Src baglantisinin inhibisyonu Hormon ile bagli AR'nin muhtemelen bir prolin uzantisi ile Src kinazinin SH3 domeni ile etkilestigi gösterilmistir (Migliaccio v.d. 2000). Bu etkilesimin bir sonucu olarak kinaz ve alt sinyal yolaklari aktive edilir ve son olarak DNA sentezi aktive edilir.

Bu etkilesimde AR domenini taklit eden küçük peptit sekanslarinin kullanilmasi, AR-Src baglantisini rekabet yoluyla inhibe edebilmeli ve DNA sentezini bloke edebilmelidir. Bu hipotezi test etmek adina LNCaP hücreleri, fenol kirmizisi, 2 mM L-glutamin (GIBCO), penisilin (100U/ml), gentamisin (50 uI/ml), insulin (0.2 U.I./ml) ve %10 fetal buzagi serumu ile takviye edilmis RPM içinde havada %5 C02 içinde büyütülür. Hücreler, 4 gün boyunca fenol kirmizisi olmaksizin yukaridaki gibi glutamin, penisilin, gentamisin ve insülin ile takviye edilmis ve %10 odun kömürü ile soyulmus fetal buzagi serumu içeren RPMI 1640 içinde tutulur. Hücreler daha sonra, tek veya 1 nM SEQ. ID NO.1 peptiti veya 1 nM SEQ. ID NO.1 peptidinin karistirilmis sekansi (SEQ.ID NO.7) ile 2 dakika boyunca uyarilir' ve parçalanir (lize edilir). Hücre lizatlari, fare monoklonal anti-Src antikorlari (Clone 327, Oncogene Science, Manhasset, NY) kullanilarak immünolojik çökeltmeye tabi tutulur.

Immünolojik çökeltmeye tabi tutulan proteinler, %12'lik bir SDS poliakrilamit jel üzerinde çözülür ve daha sonra nitroselüloz filtrelerine aktarilir. Filtreler, anti-Src antikorlari veya fare monoklonal anti AR antikorlari ile inkübe edilir.

Nitroselüloz filtreler üzerindeki immünokompleksler, bir kemilüminesan substrati (Pierce Chemicals, IL) ile birlikte peroksidaz ile bagli anti-fare antikorlari kullanilarak ortaya çikarilir. Beklenildigi üzere hormon ile tedavi edilen hücrelerde AR, anti Src antikorlari ile birlikte immünolojik olarak çökeltilmistir (Sekil 2A, Serit 2). AR ve Src arasindaki baglanti, LNCaP hücreleri, Casodex varliginda hormon ile uyarildiginda ortadan kalkar (Serit 3). Benzer sekilde androjenler ve SH3 baglayici peptit ile muamele edilen hücrelerde hiçbir AR, anti Src antikorlari ile birlikte immünolojik olarak çökeltilmez. Buna karsin hormon ile uyarilmis Src-Ar baglantisi, ayni konsantrasyondaki SEQ ID NO.l peptidinin karistirilmis sekansi (Ss, SEQ.ID NO.7) ile gerçeklestirilen tedaviden sadece hafif bir sekilde etkilenir.

YÖNTEMLER Hücre lizatlarinin hazirlanmasi. Hücreler, 5 mM MgClZ, 150 mM NaCI, O,5% Triton X-lOO içeren 1 ml liziz tamponu: 50 mM Tris- HCI, pH 7,40 içinde süspanse edilir ve 4°C'de 2 dakika boyunca hafif çalkalama altinda birakilir. Süspansiyonlar daha sonra 30 dakika boyunca yaklasik 800 g'da santrifüj edilir ve üst faz toplanir ve immünolojik çökeltme için kullanilir. ÖRNEK 4: AR türevli (Src-SH3 baglayici) peptit (SEQ.ID NO.1) tarafindan östrojen ile uyarilmis ER ile SRC baglantisinin inhibisyonu.

Daha önce AR ile birlikte ER'nin, Src ile üçlü bir kompleks olusturdugu gösterilmistir (Migliaccio v.d. 2000). ER veya AR'in Src ile etkilesiminin inhibe edilmesi, bu üçlü kompleksin bozunmasina ve Src aracili sinyallemenin inhibe edilmesine yol açar. Bu nedenle AR-Src etkilesiminin SH3 baglayici peptit(ler) tarafindan gerçeklestirilen inhibisyonu, ayni zamanda ERd'nin Src ile baglantisini ve estradiol ile indüklenen sinyal transdüksiyonunu ortadan kaldirmalidir. Bu noktaya deginmek adina meme kanseri kaynakli MCF-7 hücreleri, fenol kirmizisi, 2 mM L-glutamin (GIBCO), penisilin (lOOU/ml), gentamisin (50 uI/ml), hidrokortizon (3,75 ng/ml), insulin (0.2 U.1 ./ml) ve %5 fetal buzagi serumu ile takviye edilmis DMEM ortami (GIBCO) içinde havada %5 C02 içinde büyütülür. Hücreler, 4 gün daha fenol kirmizisi olmaksizin yukaridaki gibi glutamin, penisilin, gentamisin ve insülin ile takviye edilmis ve %5 odun kömürü ile soyulmus fetal buzagi serumu içeren DMEM içinde tutulur.

Hücreler daha sonra, tek basina 10 nM l7ß estradiol ile veya peptiti veya SEQ. ID NO.1 peptidinin karistirilmis sekansi ile 3 dakika boyunca uyarilir ve parçalanir (lize edilir). Hücre lizatlari, fare monoklonal anti-Src antikorlari (Oncogene Science, Manhasset, NY) kullanilarak immünolojik çökeltmeye tabi tutulur. immünolojik çökeltmeye tabi tutulan proteinler, %12'lik bir SDS poliakrilamit jel üzerinde çözülür ve daha sonra nitroselüloz filtrelerine aktarilir. Filtreler, anti-Src antikorlari veya fare monoklonal anti AR antikorlari ile inkübe edilir. Nitroselüloz filtreler üzerindeki immünokompleksler, yukarida tarif edilen bir kemilüminesan substrati ile birlikte peroksidaz ile bagli anti-fare antikorlari kullanilarak ortaya çikarilir.

Beklenildigi üzere hormon ile tedavi edilen hücrelerde ER, anti Src antikorlari ile birlikte immünolojik olarak çökeltilmistir (Sekil 2B, Serit 2). ER. ve Src arasindaki baglanti, MCF-7 hücreleri, ICI 182,780 varliginda hormon ile uyarildiginda ortadan kalkar (Serit 3). Androjenler ve SH3 baglayici peptit ile muamele edilen hücrelerde hiçbir ER, 1 nM'lik bir konsantrasyonda anti Src antikorlari ile birlikte immünolojik olarak çökeltilmez. Src-Ar baglantisi, SEQ ID NO.1 peptidinin l nM (Ss) karistirilmis sekansi ile gerçeklestirilen tedaviden sadece hafif sekilde etkilenir. ÖRNEK 5: Prostat kanseri (LNCAP) ve meme kanseri (MCP-7) hücrelerinde AR-Y (Src-SH3 baglayici) peptit (SEQ.ID NO.1) tarafindan androjen ile uyarilan siklin-d ekspresyonunun inhibisyonu. Östrojen ve androjen reseptörleri Src'yi uyarir ve dolayisiyla Src de fosfatidil-3-kinaz (PI3-K) yolaklarini aktive eder (Castoria v.d. 2000). PI3-K aktivasyonu, sonucunda yüksek Siklin Dl ekspresyonunun gerçeklestigi PKB/Akt kinaz fosforilasyonuna yol açar. Bu, hormon bagimli hücreleri hücre döngüsü Gl/S geçisine tasir (Castoria V.d. 2000). Src veya PIB-K inhibisyonu, Gl evresine hücre birikimine ve DNA sentezinin bloke edilmesine sebep olur. Bu nedenle SH3 baglayici peptitler, Src kinaz ve PI- 3K bagimli Siklin Dl ekspresyonunu inhibe etmek için kulanilabilir. Bu olasiligi dogrulamak adina SH3 baglayici peptidi (SEQ.ID NO.l), MCF-7'e eklenir ve LNCaP hücreleri androjen ile uyarilir. MCP-7 ve LNCaP hücreleri, yukarida bahsedildigi gibi rutin bir sekilde büyütülür. Hücreler daha sonra streoid konsantrasyonunu en aza indirmek için 4 gün boyunca yukarida tarif edilen sekilde takviye edilmis ve dekstran ile kapli odun kömürü ile muamele edilmis fetal buzagi serumu eklenmis fenol kirmizisiz ortam içinde tutulur. Hücreler daha sonra tek basina 10 nM R1881 veya 1 nM SH3 baglayici peptit (SH3, SEQ.ID NO. 1) veya 1 nM SEQ.ID NO.l peptidinin karistirilmis sekansi (SEQ.ID NO.7) (Ss) varliginda 6 saat boyunca muamele edilmistir, ardindan parçalanir ve anti-Siklin Dl antikorlari kullanilarak western blot islemine tabi tutulmustur (Sekil 3A, üst ve alt paneller). Beklenildigi gibi androjen, MCP-7 ve LNCaP hücrelerinde Siklin Dl ekspresyonunu uyarir. 5 uM konsantrasyonda PI3-K inhibitorü LY 294,002 ve Src inhibitörü PP2 (gösterilmemis), hormon ile uyarilmis Siklin ekspresyonunu ortadan kaldirir. l nM SH3 baglayici peptidi (SEQ.ID NO.l) (SH3)'nin eklenmesi ayni zamanda Siklin D'nin Rl881 tarafindan indüksiyonunu bastirirken, SEQ.ID NO.l (Ss) peptidinin karistirilmis sekansi bu etkiyi kismen azaltir. ÖRNEK 6: Prostat (LNCAP) ve meme (MCP-7) kanseri hücrelerinde AR türevli (Src-SH3 baglayici) peptit (SEQ.ID NO.l) tarafindan Östrojen ile uyarilan siklin-dl ekspresyonunun inhibisyonu.

SH3 baglayici peptidinin (SEQ.ID NO.l) östrojen ile uyarilan Siklin Dl ekspresyonu üzerindeki etkisini test etmek adina söz konusu peptit, lO nM l7ß-estradiol ile uyarilmis LNCaP ve MCF-7 hücrelerine eklenir (Sekil 3B). MCP-7 ve LNCaP hücreleri, yukarida belirtildigi gibi rutin bir sekilde büyütülür. Hücreler daha sonra streoid kontaminasyonunu en aza indirmek için 4 gün boyunca yukarida tarif edilen sekilde takviye edilmis ve dekstran ile kapli odun kömürü ile muamele edilmis fetal buzagi serumu eklenmis fenol kirmizisiz ortam içinde tutulur. Hücreler daha sonra, tek basina 10 nM l7ß estradiol veya PI-3K inhibitörü veya SEQ ID NO.1 peptidinin 1 nM karistirilmis sekansi (SEQ ID NO.7) varliginda 6 saat boyunca muamele edilir (Sekil 3B, üst ve alt paneller) ve ardindan parçalanir ve yukaridaki gibi anti- Siklin Dl antikorlari kullanilarak western blot islemine tabi tutulur. Androjen gibi l7ß estradiol de Siklin Dl ekspresyonunu uyarir. PI3-K inhibitorü LY 294,002, bu durumda ayrica hormon ile uyarilmis siklin ekspresyonunu ortadan kaldirir. Bir nM SH3 baglayici peptidi (SEQ.ID NO.1) (SH3), Siklin D'nin östrojen tarafindan indüksiyonunu tamamen bastirirken karistirilmis peptit SEQ.ID NO.1 (Ss)'in küçük bir etkisi vardir. ÖRNEK 7. Prostat kanseri (LNCaP) ve meme kanseri (MCP-7) hücrelerinde AR türevli (Src-sh3 baglayici) peptidin (SEQ.ID NO.1) androjen reseptörüne bagli gen transkripsiyonu üzerindeki etkisizligi.

Steroidal reseptörler, genel olarak ligand ile aktive edilen transkripsiyon faktörleri olarak bilinmektedir. Bu nedenle, SH3 baglayici anti androjen peptit etkisinin, androjen reseptörünün transkripsiyonal etkinligini içerip içermedigini degerlendirmek önemlidir. Fenol kirmizisi, 2 mM L-glutamin (GIBCO), penisilin (lOOU/ml), gentamisin (50 uI/ml), insülin ve %10 fetal buzagi serumu ile takviye edilmis RPMI içinde havada elemaninin (ARE34l6) kontrolü altindaki lusiferaz geni ile birlikte bir pSG5 ekspresyon vektöründe tasarlanmis bir raportör gen ile transfekte edilir (Verrijdt V.d. 2000). Transfeksiyondan alti saat sonra ortam, taze bir ortam ile degistirilmistir ve hücreler, 24 saat daha tek basina 10 nM R1881 varliginda veya 1000 kat fazla Casodex veya 1 nM SH3 baglayici peptitle (SEQ.ID NO. 1) veya 1 nM karistirilmis peptid sekansi SEQ.ID NO.1 (SEQ.ID. NO.7) ile birlikte 10 nM Rl881 varliginda veya yoklugunda dinlenmeye birakilmistir. Hücre lizatlari, lusiferaz etkinlik bakimindan analiz edilir. Ayni deney, insan meme kanseri hücrelerinde androjen peptidinin östrojen reseptörünün transkripsiyonal etkinligi üzerindeki etkisini analiz etmek üzere tekrarlanir. Fenol kirmizisi, 2 IMA L-glutamin (GIBCO), penisilin (lOOU/ml), gentamisin (50 uI/ml), hidrokortizon (3,75 ng/ml), insülin (0,2 U.l./ml) ve %5 fetal buzagi serumu ile takviye edilmis DMEM ortami (GIBCO) içinde havada %5 COz içinde tutulan MCP-7 hücreleri, bir androjen tepkime elemaninin kontrolü altindaki lusiferaz geni ile birlikte bir pSG5 ekspresyon vektöründe QUALE ile klonlanan bir raportör gen ile transfekte edilir. Son olarak hücre lizatlari, lusiferaz etkinlik bakimindan analiz edilir.

Sekil 4A, muamele edilmemis LNCaP hücrelerinde (sütun 1), sadece R1881 ile (sütun 2) veya Casodex fazlaliginin (sütun 3) veya SH3 peptidinin (SH3) (sütun 4) veya karistirilmis SEQ. ID NO.1 peptidinin (Ss) (sütun 5) varliginda uyarilan hücrelerde lusiferaz etkinligini göstermektedir.

Sekil 4B, muamele edilmemis MCF-7 hücrelerinde (sütun 1), sadece l7ß estradiol ile (sütun 2) veya ICI 182,780 fazlaliginin (sütun 3) veya SEQ. ID NO. 1 peptidinin (SH3) (sütun 4) veya SEQ. ID NO.1 peptidinin karistirilmis sekansi (Ss) (sütun 5) varliginda uyarilan hücrelerde lusiferaz etkinligini göstermektedir.

Konvansiyonel anti androjen, raportör genin androjen ile indüklenen transkripsiyonunu tamamen inhibe ederken, ne SH3 peptidi ne de SEQ. ID NO. 1 peptidinin karistirilmis sekansi, AR'nin transkripsiyon etkinligini etkilemedigi gözlemlenebilmektedir. ÖRNEK 8. AR türevli, Src-SH3 baglayici peptidin (SEQ. ID No:1) olabildiginden, LNCaP ve MCP-7 hücrelerinin antiandrojen peptide verdigi in vivo büyüme yaniti üzerinde çalisma gerçeklestirilmistir. Yukarida tarif edilen rutin kosullar altinda büyütülen LNCaP kanser hücreleri, steril PBS (pH 7,4) içinde %50 (vol/vol) Matrigel çözeltisi içinde süspanse edilir ve hormon priming olmaksizin 2.5 x 106 hücre/erken atimik fare (CD fareler, Charles-River) oraninda dorsal posterior bölgeye subkütanöz olarak enjekte edilir. l4-21 gün sonra benzer boyutta tümöre sahip hayvanlar, SH3 baglayici peptit SEQ. ID NO.l veya sadece araç ile 5 hafta daha tedavi edilmek üzere randomize edilir. Tedavi, yaklasik 200-400 mm3 büyüklükteki tümörler ile baslatilir. Tedavili veya tedavi olmaksizin LNCaP hücrelerinin ksenogreftlerinin tümör hacimleri, bir` kaliper ile ölçülür ve D'nin uzunlugu ve d'nin tümörün genisligini ifade ettigi D x d? x 0.5 formülüne göre kaydedilir.

Her bir hayvan için peptit tedavisi için, %0,1 DMSO veya sadece ayni miktarda araç içinde çözdürülmüs 20 nM SH3 baglayici peptit SEQ. ID NO.l'den 200 üI, farelere alternatif günlerde intraperitonal olarak uygulanir. Bu tür çalismalar, insan malignitelerinde yaygin olarak bulunan androjen reseptör düzeylerini eksprese eden insan prostat ve meme kanseri hücrelerinde potansiyel terapötik maddeler olarak peptitlerin etkililigini degerlendirmek için özellikle önemlidir. Bu peptidlerin (genel formül 81 ve SEQ. ID NO.1 ila SEQ. ID NO.6) dozu, türü ve büyüklügü ve peptitlerin verilme yolu, teknikte uzman kisilerce belirlenebilen tüm faktörlerdir.

Sekil 5A, SH3 baglayici peptit (SH3) veya tek basina araçla (ctrl) tedavi edilen çiplak erkek farelerde LNCaP hücre ksenogreftlerinin büyüme hizini gösterir.

Yazarlar, bu modelde kontrol grubuna kiyasla SH3 ile tedavi edilen grupta tümör kitlesinin anlamli derecede düsük oldugunu gözlemlemislerdir. Araç çözelti veya peptit ile tedavi edilen farelerin agirligi arasinda fark bulunmamistir (veriler sunulmamistir). Anti androjenik peptitlerinin çiplak farelerde olusturulan meme kanseri MCF-7 hücrelerinin ksenogreftleri üzerindeki etkisi de analiz edilir (Sekil 5B). Bu durumda yukarida tarif edilen sekilde büyütülmüs MCP-7 hücreleri, steril PBS içinde %50 Matrigel (vol/vol) içinde süspanse edilir ve atimik erkek farelerde 2.5 x 106hücre/hayvan oraninda subkütanöz olarak enjekte edilir. 14-21 gün sonra benzer boyutta tümörlere sahip hayvanlar, SH3 baglayici peptit SEQ. ID NO.l veya sadece araç ile 5 hafta daha tedavi edilmek üzere randomize edilir.

Tedavinin basinda tümörler yaklasik 1000 mm3 büyüklügündedir. baglayici peptidin 200 uI'si, farelere alternatif günlerde intraperitonal olarak uygulanir. Tedavili veya tedavi olmaksizin MCP-7 kanser hücresi ksenograftinin tümör hacimleri, yukarida bildirilen sekilde ölçülür ve kaydedilir. Kontrol fareleri veya peptit ile tedavi edilen fareler arasinda vücut agirligi açisindan bir fark bulunmamaktadir. LNCaP hücre ksenogreftleri modeli için gözlemlenenlere benzer sekilde, yazarlar ayrica MCF- 7 hücre ksenogreft modelinde, kontrol grubuna kiyasla SH3 ile tedavi edilen grupta tümör kütlesinin daha düsük oldugunu görmüstür. Araç çözelti veya peptit ile tedavi edilen farelerin agirligi arasinda fark bulunmamistir (veriler sunulmamistir).

Tedavinin sonunda hayvanlar sakrifiye edilir ve Ki67 antijeni ve apoptotik hücreler için tümör numuneleri analiz edilir. Kisaca her bir numuneden alinan kesitler, 3-5 mikronda kesilir, cam üzerine yerlestirilir ve 37°C'de gece boyunca kurutulur. Tüm kesitler' daha sonra ksilen içinde deparafinize edilir, derecelendirilmis bir alkol serisi ile rehidre edilir ve PES içinde yikanir. Bu tampon müteakip yikamalar ve antikor seyreltmesi içn kullanilir. Hematoksilen/eosin ve hematoksilin/Van Gieson ile boyamanin ardindan isik mikroskobu ile muayene gerçeklestirilir. Immünohistokimya için doku kesitleri, sitrat tamponu (pH 6) içinde 700 W'da 5 dakika boyunca mikrodalgada iki kere isitilir ve standart streptavidin-biyotin- immünoperoksidaz yöntemi (DAKO Universal Kit, DAKO Corporation, Carpinteria, California, USA) ile islemden geçirilir. DAKO sirketinden temin edilen tavsan anti-insan Ki67, 1:100 oraninda seyreltilerek kullanilir. Primer antikor, oda sicakliginda 1 saat boyunca inkübe edilir. Diaminobenzidin, nihai kromojen olarak, hematoksilin ise nükleer karsit boya olarak kullanilir.

Primer antikor disarida birakilarak her bir doku kesiti için negatif kontroller` gerçeklestiriliru Her bir deneyde bulunan pozitif kontroller, ilgili antijeni eksprese eden, daha önce gösterilen dokudan olusur. Iki gözlemci, iki proteinin boyanma modelini ayri ayri degerlendirir ve tüm kesiti tarayarak ve high- power-field lOX20 için görünebilir pozitif hücre sayisini tahmin ederek her örnekte protein ekspresyonunu puanlandirir.

Gözlemciler arasindaki anlasma yüzdesi olarak ifade edilen uyum düzeyi, %92'dir. Söz konusu puan, kalan örneklerde mesleki revizyon ve anlasmadan sonra elde edilir. TUNEL tepkimesi, peroksidaz bazli Apoptag kiti (Oncor, Gaithersburg, MD, ABD) kullanilarak gerçeklestirilir. Tedarikçinin talimatlarina göre TUNEL pozitif hücreler diaminobenzidin ve Hdb ile tespit edilir.

Iki gözlemci, iki proteinin boyanma modelini ayri ayri degerlendirir ve tüm kesiti tarayarak ve high-power-field lOXZO için görünebilir pozitif çekirdekler sayisini tahmin ederek her örnekte protein ekspresyonunu puanlandirir. Gözlemciler arasindaki anlasma yüzdesi olarak ifade edilen uyuni düzeyi, kontrol grubuna kiyasla SH3 ile tedavi edilen grupta Ki-67 antijen pozitif hücrelerin yüzdesinde önemli bir azalma (P < 0,002, Sekil 6A, sol panel) ve TÜNEL pozitif hücrelerinin sayisinda önemli bir artis (P < 0,009, Sekil 6A, sag panel) gözlemlenmistir. MCP-7 tümör ksenogreft örnekleri için benzer bir sonuç bulunmustur (Sekil 6B sol ve sag panel). ÖRNEK 9: antikor bilesimlerinin hazirlanmasi Yukarida tarif edilen sentetik peptitler ve rekombinant peptitler, bir hayvanda veya bir insanda bir immün yanitinin olusturulmasinda ve bu epitoplara özgü antikorlarin hazirlanmasinda kullanilabilir. Asilarin ve antikorlarin hazirlanmasi, yukarida tarif edilen teknikte uzman kisilerce iyi bilinmektedir. Kisaca mevcut bulusa ait yeni peptitler, hayvanlarda antijenler olarak asagidaki sekilde kullanabilir: Her bir peptit, keyhole limpet hemosiyanine (KLH) baglanabilir ve BALB/c farelerini subkütanöz olarak immünize etmek için kullanilabilir. Ilk enjeksiyonlar 250 pg protein içerir ve fareler, 7 hafta sonra 250 ug ilgili KLH ile bagli peptit ile güçlendirilir ve daha sonra 1 hafta sonra kan alinir. Enjekte edilen fareler tarafindan üretilen poliklonal antikorlar, bir ELISA deneyinde peptit antijenini taniyabilme kabiliyetleri açisindan test edilir. Ab'ler, ayrica AR ile indüklenen DNA sentezini inhibe edebilme kabiliyetleri açisindan analiz edilir.

REFERANSLAR Bodansky M, Bodansky A 1995 The practice of peptide synthesis (2nd edn.), Springer Verlag, Berlin Castoria G, Barone MV, Dl Domenico M, Bilancio A, Ametrano D, Couvreur, Tulkens, Roland, Trouet, Speiser 1977 FEBS Lett. 84 (2):323-326 Couvreur 1988 Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 5:1-20 Curiel, v.d. :8850-8854 Dawson NA, Vogelzang NJ 2000 Secondary hormonal therapy. 1n:Resnick Ml, Thompson M1, eds. Advanced therapy of prostate disease. Hamilton, Ontario: BC Decker; 378-384 Denis LJ, 6(7): 608-614,.

Fromm, Taylor, Walbot, 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA,82(1 7):5824-5828 Gabizon, Papahadjopoulos 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6949-6953 Lee D 2003 Clin Prostate Cancer 2: 13-14 Schatzl G, Madersbacher S, Gsur A, Preyer M, Haidinger G, Haitel Van der Kwast TH, Schalken J, Ruizeveld. de Winter JA, van Vroonhoven CCJ, Mulder E, Boersma W, Trapman J 1991 Int J Cancer 48:189-193 S EVRESI LNCAP S EVRESI MCF-7 60% ; 30% 7 g 40% ° g ' 40% m 20% : Il::: .....

Ezgi::: ni: 53 9 (9 C? E› 3 9 $ 0; C '1- '- `- o-i + v + *9:03 m E K *95001 C 5 EVRESI LNCAP D 5 EVRESI MC” %[ 6070 g 15% 40% """ g 10°/ m 50/0 5 2 5 Q 5› J; .53 :5 Ç› 5 5;; (3 (D (D (D (9 C) R1881 - + + + SH3 Ss E2 - + + + 4-SI'C R1881 - + + + + lnhib. - - LY SH3 Ss 52 - + + + + lnhib. - - LY SH3 Ss LNCaP hücreleri 11101 DUO Lusiferaz etkinligi (A. U.) 100000 750007 50000 25000 Lusiferaz etkinligi (A. U.) Tümör kütlesi (mm3) Tümör kütlesi (mma) 1600,0 1400,0 1200,0 1000,0 800,0 600,0 400,0 200,0 5000,00 4000.00 3000.00 2000,00 1000,00 LNCaP hücreleri *9 SH3 4 I .- 4 Tedavi haftasi MCP-7 hücreleri Tedavi haftasi Ki67 eksprese eden hücreler Ki67 eksprese eden hücreler 100°/ LNCaP hücreleri l Ki 67 7 TUNEL CTRL SH3 MCF-7 hücreleri Ki 67 6 TUNEL N: 5 5 N = 5 TUNEL pozitif çekirdek sayisi CTRL SH3

Claims (19)

ISTEMLER

1.Asagida yer alan genel formüle sahip izole edilmis veya kismen saflastirilmis peptit türevli bir molekül olup: X- [(Pro)n-His-Pro-His-Ala-Arg-lle-LysJm- Y (S 1) özelligi; X'in H veya bir asetil grubu veya herhangi bir dogal amino asit veya serbest veya en azindan asetil türevli bir NH2 grubu ile saglanan amino asit sekansi olmasi, Y'nin bir OH grubu veya bir NH2 grubu olasi, "n"nin, 1 ila 10 arasinda bir tam sayi olmasi ve "m"nin, 1 ila 3 arasinda bir tam sayi olmasi ve peptit türevli molekülün amino asit sekansinin, asagidakilerden olusan gruptan seçilmesidir: Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-lle-Lys (SEQ.ID NO. 1); Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-lle-Lys (SEQ.ID No. Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-lle-Lys (SEQ.ID NO. 3) ve Gly-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg- lle-Lys (SEQ.ID NO. 4).

2.Istem l'e göre peptit türevli molekül olup, özelligi; androjen reseptörünün (AR) tirozin kinaz Src'nin SH3 domeniyle etkilesimini inhibe edebilmesi veya önleyebilmesidir.

3.Istem 1 veya istem Z'ye göre peptit türevli molekül olup, özelligi; in vitro veya in Vivo anti tümör etkinlige sahip olmasidir.

4.Istem 1 ila 3'e göre peptit türevli molekül olup, özelligi; asagidakilerden olusan gruptan seçilen amino asit sekansina sahip olmasidir: Ac-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-lle-Lys-NHz; Ac-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-lle-Lys-NHz; Ac-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala-Arg-lle- Lys-NH2 ve Ac-Gly-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-Pro-His-Pro-His-Ala- Arg-lle-Lys-NHz.

5.Bir farmasötik bilesim olup, özelligi; istem 1 ila 4 arasindaki istemlerden herhangi birine göre farmasötik olarak kabul edilebilir ve etkili bir miktarda peptit türevli molekül içermesidir.

6.Istem 5'e göre farmasötik bilesim olup, özelligi; (i) bahsi geçen peptidin bir tasiyici moleküle baglanabilmesi ve/Veya farmasötik bir eksipiyan ile birlikte lipit bir bilesim içinde bulunabilmesi ve/veya (ii) söz konusu bilesimin en az bir ikinci anti-kanser ajani içermesidir.

7.Istem 5'e göre farmasötik bilesim olup, özelligi; söz konusu tasiyici molekülün BSA veya KLH olmasidir.

8.Istem 5'e göre farmasötik bilesim olup, özelligi; söz konusu lipit bilesimin lipit bir partikül, bir nanokapsül, bir lipozom veya lipit vesiküller olmasidir.

9.Istem 1 ila 4 arasindan herhangi bir isteme göre bir peptit türevli molekül veya istem 5 ila 8 arasindan herhangi bir isteme göre bir farmasötik bilesim olup, özelligi; bir ilaç olarak kullanilmasidir.

10. Istem 1 ila 4 arasindan herhangi bir isteme göre peptit türevli molekül veya istem 5 ila 8 arasindan herhangi bir isteme göre bir farmasötik bilesim olup, özelligi; bir anti tümör ajan olarak kullanilmasidir.

11. Istem lO'a göre peptit türevli molekül veya istem lO'a göre farmasötik bilesim olup, özelligi (i) meme veya prostat kanserine ve/Veya (ii) tek basina ya da estradiyol reseptörleri ile birlikte androjen reseptörlerini eksprese eden diger kanserlere karsi kullanilmasidir.

12. Istem 1 ila 4'e göre peptit türevli molekül kullanimi olup, özelligi bir ilacin hazirlanmasina yönelik olmasidir.

13. Istem 1 ila 4'ten herhangi birine göre bir peptit türevli molekül kullanimi olup, özelligi; kanser tedavisi için bir ilacim hazirlanmasina yönelik olmasidir.

14. Istem 13'e göre kullanim olup, özelligi; söz konusu ilacin (i) meme veya prostat kanserinin ve/veya (ii) tek basina ya da estradiyol reseptörleri ile birlikte androjen reseptörlerini eksprese eden diger kanserlerin tedavisine yönelik olmasidir.

15. Bir* antikor olup, özelligi; isteni 1 ila 4'ten herhangi birine göre bir peptit türevli molekülü spesifik olarak taniyabilmesidir.

16. Istem 15'e göre bir antikor içeren bir kit olup, özelligi; tekli ya da çoklu kaplarda saptanabilir bir etikete ve immünolojik saptama ayiraçlarina islevsel olarak baglanmis olmasidir.

17. Istem 1 ila 4 arasindaki istemlerden herhangi birine göre bir peptidi kodlayan bir nükleik asit sekansi veya bir peptit eksprese eden bir rekombinant vektör.

18. Memeli, insan veya bakteriyel konak hücreler olup, özelligi; istem l7'ye göre nükleik asit sekansi veya rekombinant vektör içermesidir.

19. Bir meme kanseri veya prostat kanseri hücresi dahil olmak üzere bir kanser hücresinin öldürülmesine yönelik in vitro bir yöntem olup, özelligi; hücreye istem 1 ila 4'e göre peptit türevli bir molekül saglanmasini içermesidir.