TR201802686T4 - Transferrin-tumstatin füzyon proteini ve bu proteinin üretilmesine ve kullanılmasına yönelik yöntemler. - Google Patents
Transferrin-tumstatin füzyon proteini ve bu proteinin üretilmesine ve kullanılmasına yönelik yöntemler. Download PDFInfo
- Publication number
- TR201802686T4 TR201802686T4 TR2018/02686T TR201802686T TR201802686T4 TR 201802686 T4 TR201802686 T4 TR 201802686T4 TR 2018/02686 T TR2018/02686 T TR 2018/02686T TR 201802686 T TR201802686 T TR 201802686T TR 201802686 T4 TR201802686 T4 TR 201802686T4
- Authority
- TR
- Turkey
- Prior art keywords
- tumstatin
- transferrin
- protein
- recombinant protein
- recombinant
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title abstract description 104
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title abstract description 101
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title description 21
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title description 20
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 claims abstract description 68
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 claims abstract description 67
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 claims abstract description 65
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 52
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 52
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 18
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 8
- 108010012374 type IV collagen alpha3 chain Proteins 0.000 claims description 143
- 208000005590 Choroidal Neovascularization Diseases 0.000 claims description 34
- 206010060823 Choroidal neovascularisation Diseases 0.000 claims description 34
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 23
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 17
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 15
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 15
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 7
- 102100028187 ATP-binding cassette sub-family C member 6 Human genes 0.000 claims description 3
- 201000002563 Histoplasmosis Diseases 0.000 claims description 3
- 201000004613 Pseudoxanthoma elasticum Diseases 0.000 claims description 3
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 claims description 3
- 208000023558 pseudoxanthoma elasticum (inherited or acquired) Diseases 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 102100033780 Collagen alpha-3(IV) chain Human genes 0.000 claims 11
- 208000005598 Angioid Streaks Diseases 0.000 claims 1
- 208000033825 Chorioretinal atrophy Diseases 0.000 claims 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 claims 1
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 abstract description 8
- 102400000731 Tumstatin Human genes 0.000 description 122
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 99
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 91
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 40
- 229960000397 bevacizumab Drugs 0.000 description 38
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 32
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 27
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 26
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 23
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 22
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 22
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 21
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 21
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 15
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 13
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 13
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 12
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 12
- 210000003161 choroid Anatomy 0.000 description 12
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 210000003583 retinal pigment epithelium Anatomy 0.000 description 11
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 10
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 10
- MAAMCHVQLWJBKY-UHFFFAOYSA-N transferrin fragment Chemical compound NC(=N)NCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(CC(O)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CS)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(O)=O)NC(=O)C(CCCNC(N)=N)NC(=O)C(CC(O)=O)NC(=O)C(C)N)CC1=CC=C(O)C=C1 MAAMCHVQLWJBKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 9
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 8
- TUIOUEWKFFVNLH-DCAQKATOSA-N Leu-Val-Cys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O TUIOUEWKFFVNLH-DCAQKATOSA-N 0.000 description 7
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 7
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 7
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 7
- 229960003876 ranibizumab Drugs 0.000 description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 7
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 7
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 6
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 6
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 6
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 6
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 6
- 101000808011 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor A Proteins 0.000 description 5
- PPBKJAQJAUHZKX-SRVKXCTJSA-N Leu-Cys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C PPBKJAQJAUHZKX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 108010033576 Transferrin Receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000007238 Transferrin Receptors Human genes 0.000 description 5
- UMPVMAYCLYMYGA-ONGXEEELSA-N Val-Leu-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O UMPVMAYCLYMYGA-ONGXEEELSA-N 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 108010000434 glycyl-alanyl-leucine Proteins 0.000 description 5
- 102000058223 human VEGFA Human genes 0.000 description 5
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 5
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 4
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 4
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 4
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 4
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 4
- 238000001142 circular dichroism spectrum Methods 0.000 description 4
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 4
- VHAQSYHSDKERBS-XPUUQOCRSA-N Ala-Val-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O VHAQSYHSDKERBS-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 3
- 238000000116 DAPI staining Methods 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 102000016621 Focal Adhesion Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 3
- 108010067715 Focal Adhesion Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 3
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 3
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 3
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 3
- WDTLNWHPIPCMMP-AVGNSLFASA-N Met-Arg-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O WDTLNWHPIPCMMP-AVGNSLFASA-N 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 3
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 3
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 239000007981 phosphate-citrate buffer Substances 0.000 description 3
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 3
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 3
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 3
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WLCZTRVUXYALDD-IBGZPJMESA-N 7-[[(2s)-2,6-bis(2-methoxyethoxycarbonylamino)hexanoyl]amino]heptoxy-methylphosphinic acid Chemical compound COCCOC(=O)NCCCC[C@H](NC(=O)OCCOC)C(=O)NCCCCCCCOP(C)(O)=O WLCZTRVUXYALDD-IBGZPJMESA-N 0.000 description 2
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 2
- 241001342895 Chorus Species 0.000 description 2
- UUERSUCTHOZPMG-SRVKXCTJSA-N Cys-Asn-Tyr Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 UUERSUCTHOZPMG-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- 108010041308 Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VSVZIEVNUYDAFR-YUMQZZPRSA-N Gly-Ala-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VSVZIEVNUYDAFR-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical group NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 2
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- OMHMIXFFRPMYHB-SRVKXCTJSA-N Phe-Cys-Asn Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N OMHMIXFFRPMYHB-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- AOKZOUGUMLBPSS-PMVMPFDFSA-N Phe-Trp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O AOKZOUGUMLBPSS-PMVMPFDFSA-N 0.000 description 2
- VVKVHAOOUGNDPJ-SRVKXCTJSA-N Ser-Tyr-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VVKVHAOOUGNDPJ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- BGDKAVGWHJFAGW-UHFFFAOYSA-N Tropicamide Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(CO)C(=O)N(CC)CC1=CC=NC=C1 BGDKAVGWHJFAGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SOAUMCDLIUGXJJ-SRVKXCTJSA-N Tyr-Ser-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O SOAUMCDLIUGXJJ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- PFMAFMPJJSHNDW-ZKWXMUAHSA-N Val-Cys-Asn Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N PFMAFMPJJSHNDW-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 description 2
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 2
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 2
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- HAORKNGNJCEJBX-UHFFFAOYSA-N cyprodinil Chemical compound N=1C(C)=CC(C2CC2)=NC=1NC1=CC=CC=C1 HAORKNGNJCEJBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000013534 fluorescein angiography Methods 0.000 description 2
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 2
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 2
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 2
- -1 leucine amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 229960003407 pegaptanib Drugs 0.000 description 2
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 210000001747 pupil Anatomy 0.000 description 2
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 2
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 2
- 229960004791 tropicamide Drugs 0.000 description 2
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 2
- 108010003137 tyrosyltyrosine Proteins 0.000 description 2
- 230000004393 visual impairment Effects 0.000 description 2
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-XJKSGUPXSA-N (+)-haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2C[C@]2(O)[C@H]1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-XJKSGUPXSA-N 0.000 description 1
- VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N (3e)-3-(1h-imidazol-5-ylmethylidene)-1h-indol-2-one Chemical compound O=C1NC2=CC=CC=C2\C1=C/C1=CN=CN1 VEEGZPWAAPPXRB-BJMVGYQFSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- VJVQKGYHIZPSNS-FXQIFTODSA-N Ala-Ser-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N VJVQKGYHIZPSNS-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 102000008076 Angiogenic Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010074415 Angiogenic Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102400000068 Angiostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010079709 Angiostatins Proteins 0.000 description 1
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 description 1
- KMFPQTITXUKJOV-DCAQKATOSA-N Arg-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KMFPQTITXUKJOV-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- ZMUQQMGITUJQTI-CIUDSAMLSA-N Asn-Leu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O ZMUQQMGITUJQTI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- OROMFUQQTSWUTI-IHRRRGAJSA-N Asn-Phe-Arg Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N OROMFUQQTSWUTI-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- MJIJBEYEHBKTIM-BYULHYEWSA-N Asn-Val-Asn Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N MJIJBEYEHBKTIM-BYULHYEWSA-N 0.000 description 1
- CZIVKMOEXPILDK-SRVKXCTJSA-N Asp-Tyr-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CZIVKMOEXPILDK-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- OQMGSMNZVHYDTQ-ZKWXMUAHSA-N Asp-Val-Cys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N OQMGSMNZVHYDTQ-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102400001047 Endostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010079505 Endostatins Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101000766307 Gallus gallus Ovotransferrin Proteins 0.000 description 1
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- IXKRSKPKSLXIHN-YUMQZZPRSA-N Gly-Cys-Leu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IXKRSKPKSLXIHN-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- YYXJFBMCOUSYSF-RYUDHWBXSA-N Gly-Phe-Gln Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O YYXJFBMCOUSYSF-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Natural products C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 1
- 108010065920 Insulin Lispro Proteins 0.000 description 1
- 102400001355 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 125000002842 L-seryl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 1
- 241000446313 Lamella Species 0.000 description 1
- IFMPDNRWZZEZSL-SRVKXCTJSA-N Leu-Leu-Cys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O IFMPDNRWZZEZSL-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- YESNGRDJQWDYLH-KKUMJFAQSA-N Leu-Phe-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N YESNGRDJQWDYLH-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- LFSQWRSVPNKJGP-WDCWCFNPSA-N Leu-Thr-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O LFSQWRSVPNKJGP-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- IRNSXVOWSXSULE-DCAQKATOSA-N Lys-Ala-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN IRNSXVOWSXSULE-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- IMAKMJCBYCSMHM-AVGNSLFASA-N Lys-Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN IMAKMJCBYCSMHM-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- SKRGVGLIRUGANF-AVGNSLFASA-N Lys-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O SKRGVGLIRUGANF-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 206010025421 Macule Diseases 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- MQASRXPTQJJNFM-JYJNAYRXSA-N Met-Pro-Phe Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 MQASRXPTQJJNFM-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- BKWJQWJPZMUWEG-LFSVMHDDSA-N Phe-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 BKWJQWJPZMUWEG-LFSVMHDDSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSKCKTUQPICLSO-AVGNSLFASA-N Pro-Arg-Lys Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O QSKCKTUQPICLSO-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- HFNPOYOKIPGAEI-SRVKXCTJSA-N Pro-Leu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 HFNPOYOKIPGAEI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- FCRMLGJMPXCAHD-FXQIFTODSA-N Ser-Arg-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O FCRMLGJMPXCAHD-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 101150052859 Slc9a1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 244000297179 Syringa vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000004338 Syringa vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- GLQFKOVWXPPFTP-VEVYYDQMSA-N Thr-Arg-Asp Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O GLQFKOVWXPPFTP-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 1
- BXJQKVDPRMLGKN-PMVMPFDFSA-N Tyr-Trp-Leu Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 BXJQKVDPRMLGKN-PMVMPFDFSA-N 0.000 description 1
- AUMNPAUHKUNHHN-BYULHYEWSA-N Val-Asn-Asp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N AUMNPAUHKUNHHN-BYULHYEWSA-N 0.000 description 1
- GNWUWQAVVJQREM-NHCYSSNCSA-N Val-Asn-His Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N GNWUWQAVVJQREM-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229960002833 aflibercept Drugs 0.000 description 1
- 108010081667 aflibercept Proteins 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 108010050025 alpha-glutamyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 229940121369 angiogenesis inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000004037 angiogenesis inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002424 anti-apoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 1
- FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N aspergillomarasmine B Natural products OC(=O)CNC(C(O)=O)CNC(C(O)=O)CC(O)=O FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005667 attractant Substances 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004305 biphenyl Substances 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000001775 bruch membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000004709 cell invasion Effects 0.000 description 1
- 230000003822 cell turnover Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000002975 chemoattractant Substances 0.000 description 1
- 230000031902 chemoattractant activity Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000978 circular dichroism spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005253 cladding Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000000399 corneal endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000000159 corneal neovascularization Diseases 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- NJDNXYGOVLYJHP-UHFFFAOYSA-L disodium;2-(3-oxido-6-oxoxanthen-9-yl)benzoate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=CC(=O)C=C2OC2=CC([O-])=CC=C21 NJDNXYGOVLYJHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 229940096118 ella Drugs 0.000 description 1
- 238000000295 emission spectrum Methods 0.000 description 1
- 229940124642 endogenous agent Drugs 0.000 description 1
- 230000004528 endothelial cell apoptotic process Effects 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229960003943 hypromellose Drugs 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 229940096397 interleukin-8 Drugs 0.000 description 1
- XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N interleukin-8 Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@@H](NC(C)=O)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(N)=O)C1=CC=CC=C1 XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000010232 migration assay Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000012120 mounting media Substances 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- 230000035407 negative regulation of cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 201000003142 neovascular glaucoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012758 nuclear staining Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 210000001328 optic nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 108010073101 phenylalanylleucine Proteins 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 108091008695 photoreceptors Proteins 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 201000007914 proliferative diabetic retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 210000003994 retinal ganglion cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000002893 slag Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000153 supplemental effect Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000009424 thromboembolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 238000012384 transportation and delivery Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- OOLLAFOLCSJHRE-ZHAKMVSLSA-N ulipristal acetate Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1[C@@H]1C2=C3CCC(=O)C=C3CC[C@H]2[C@H](CC[C@]2(OC(C)=O)C(C)=O)[C@]2(C)C1 OOLLAFOLCSJHRE-ZHAKMVSLSA-N 0.000 description 1
- 230000004222 uncontrolled growth Effects 0.000 description 1
- 230000006444 vascular growth Effects 0.000 description 1
- 230000008728 vascular permeability Effects 0.000 description 1
- 230000007998 vessel formation Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/79—Transferrins, e.g. lactoferrins, ovotransferrins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Mevcut buluş, tumstatine veya diğer antianjiyojenik proteine bağlı transferrini içeren rekombinant proteinler ve bunların kullanılmasına ve üretilmesine yönelik yöntemler sağlamaktadır. Mevcut buluş, aynı zamanda bu tür rekombinant proteinleri eksprese etme kabiliyetine sahip bir hücre, bir plazmid, bir ekspresyon sistemi ve bunların kullanılmasına ve üretilmesine yönelik yöntemler sağlamaktadır.
Description
TEKNIK ALAN
Mevcut bulus, tumstatin veya diger antianjiyojenik proteinle baglEltransferrin içeren
rekombinant proteinlerle ve bunlari üretilmesine ve kullanilBialela yönelik yöntemlerle
ilgilidir. Mevcut bulus, aynüamanda bu tür rekombinant proteinleri eksprese etme kabiliyetine
sahip ekspresyon sistemiyle ve bunlariEi üretilmesine ve kullanilB1asiEa yönelik yöntemlerle
ÖNCEKI TEKNIK
Koroid neovaskülarizasyonu (CNV) (koroid tabakasliîija yeni damarlanma), psödoksantoma
elastikum, anjiyoid çizgileri, histoplazmoz, punktat Iç koroidopati ve yas yasa bagIEl'nakuIa
dejenerasyonu (AMD) gibi hastaliElarda ciddi görme kayb- yol açabilen koroid vaskülatürün
(damar yayIIJSLII kontrolsüz bir sekilde büyümesini ifade etmektedir. Yas AMD, drusen
(tamamlaylEElbilesenler, Iipidler ve apolipoproteinler) birikiminin hipoksiye yol açan bagIEI
iskemik bölgelere sebep olmasEldurumunda meydana gelmektedir. Hipoksinin, koroid
endotelyal hücrelerin matris metalloproteinaz (MMP) salglßmaslühktif hale getiren vasküle
endotelyal büyüme faktörünün (VEGF) salgllâmasülda bir artlgh yol açtlgl- inanllBiaktadlB
Metalloproteinazlar, hücre dlgümatrisi parçalamakta ve böylelikle endotelyal hücrelerin
proliferasyonuna ve retinaya dogru taslElnaIarI olanak saglamaktadIEl MMP etkisi,
nihayetinde yeni kan damarlarlElI veya CNV'nin gelismesine yol açmakta ve bu da retinanI
ayrllüîas- veya kanamas- ve kan ve Iipid (yag) s--an dolaylllt retinal IezyonlarI
olusumuna sebep olabilmektedir. Ortaya çüZtiEtan sonra CNV, sanayilesmis ülkelerdeki yaslEI
nüfusta ana görme kaybßebebi olmaktadlEl
CNV'nin tedavisi, halihazüia hasta popülasyonunun bir kisinlîla sIlEIlEblmakta ve vasküler
hiper-geçirgenlik ve yeni kan damarEblusumunda VEGF'nin zararlErolünün klîlfllanmas-
odaklanmaktadlEI Ancak, VEGF, aynEtamanda yara iyilesmesi, foto reseptör sag kaliÜ/e
koroid kapiler yatagI korunmaslîgibi fizyolojik aktivitelerde yaplEEbir kilit rol oynamaktadEl
Halihazüia, Ranibizumab (LucentisTM), Aflibercept (EyleaTM) ve pegaptanib (MacugenTM),
günümüze kadar CNV'nin tedavi edilmesi için onaylanmlg olan iki terapötik maddedir. Bu
maddeler, VEGF'yi inhibe etmektedir. Ranibizumab" CNV'nin tedavi edilmesi konusunda
genellikle pegaptanibten daha etkili oldugu gösterilmistir. Ranibizumab, VEGF-A'nI bütün
izoformlar- baglanmakta ve vasküler geçirgenlik ve büyüme dahil VEGF aktivitesini inhibe
etmektedir. Bahsedilen iki terapötik maddenin dEIEUa, ranibizumab. ana tam uzunluklu
antikoru olan bevacizumab (AvastinT'V') da CNV'ye iliskin ruhsat dlgiibir tedavi seklinde
kesfedilmektedir.
CNV'nin tedavi edilmesinde bu terapilerin basar- ragmen, aktif hale getirilmis endotelyal
hücrelerde apoptoz eksikligi ve yara iyilesmesi gibi VEGF ile ilgili fizyolojik aktivitelerin potansiyel
olarak bozulmaslîiahil bu terapilerin yap-a var olan dezavantajlar bulunmaktadEi Buna ek
olarak, ranibizumab kullanDÇi insanlarda intravitreal uygulamadan sonra tromboembolik
olaylarI arttlElIB1lSI hlîEldahil sistemik risklere yol açmaktadlEl AynElzamanda intravitreal
bevacizumab, iskemik atak, kan basit-aç (tansiyon) artEIJserebrovasküler kazalar ve ölümle
iliskilendirilmistir. Ilaveten, CNV'den muzdarip hastalarla yapilân bir klinik çalismada,
ranibizumaba olan yanitZl orani: CNV'ye sahip hastalarda yalnlîta ~%40 olmus ve harf
say-aki kazanç, yalnlîta 7.2 olmustur.
DolayEIîLla, azaItIIBilg yan etkilere ve/veya daha iyi terapötik etkililige sahip CNV'nIn tedavi
edilmesine yönelik yeni ve/veya daha etkili terapötik yaklasIia iliskin bir ihtiyaç bulunmaktadlEl
BULUSUN KISA AÇIKLAMASI
Mevcut bulusun bazÜ/önleri, tumstatin veya diger benzer antianjiyojenik proteinle baglantlIEEl
transferrin içeren bir rekombinant protein saglamaktadlE Bazü/apilândlüinalarda, transferrin
ve tumstatin, dogrudan birbirine baglanmaktadlü Yine diger yapilândlüinalarda, transferrin ve
tumstatin, bir baglayEElvasiüsMa birbirine esdeger bir sekilde baglanmaktadlEl Uygun
baglaylîilâr, teknikte uzman kisiler tarafIan iyi bilinmektedir.
Mevcut bulusun diger yönleri, mevcut bulusta tanIiIandigiEgibi tumstatine baglEtransferrin
içeren bir rekombinant proteini kodlayan bir nükleik asidi içeren bir plazmid saglamaktadlEI
Tipik olarak, rekombinant proteini kodlayan nükleik asit sekanslî.] ekspresyon kontrol
sekanleb faal olarak baglanmaktadE
Mevcut bulusun yine diger yönleri, mevcut bulusta tanIiIandigiügibi tumstatine baglü
transferrin içeren bir rekombinant proteini kodlayan bir nükleik asit sekansIEiçeren bir
rekombinant nükleik asit molekülü saglamaktadlE BazElyapllândlEmalarda, nükleik asit
sekanslZifaal olarak ekspresyon kontrol sekans. baglanmaktadlEl
Mevcut bulusun yine diger yönleri, mevcut bulusta tanIiIandIg'llIlgibi tumstatine bagIlII
transferrin içeren bir rekombinant proteini kodlayan bir nükleik asidi içeren rekombinant
nükleik asit molekülüyle transfekte olan ve molekülü eksprese eden rekombinant konakçEl
hücre saglamaktadlB
Mevcut bulusun diger yönleri, mevcut bulusta tanIiIandlgiEgibi tumstatine baglEtransferrin
içeren bir rekombinant proteinin üretilmesine yönelik bir yöntem saglamakta; söz konusu
yöntem, asaglühki adIiIarlIiçermektedir:
rekombinant konakçlîliiücrenin mevcut bulusta tanIiIand [gilgibi tumstatine baglEl
transferrin içeren bir rekombinant proteini kodlayan bir nükleik asidi içeren rekombinant
nükleik asit molekülüyle transfekte edilmesi;
transfekte edilmis konakçEliiücrenin, tumstatine baglEliransferrin içeren rekombinant
protein üretmek için yeterli olan kosullar aItIa kültürlenmesi; ve rekombinant proteinin
büyük ölçüde saflastülûilgrekombinant protein seklinde geri kazanüBiasEl
BazEyapllândlîilnalarda, rekombinant protein, mevcut bulusta tanIiIandlglEgibi tumstatine
dogrudan baglanan transferrin içermektedir.
Mevcut bulusun yine diger yönleri, koroid neovaskülarizasyonla (CNV) iliskilendirilmis bir klinik
durumun tedavisine kullanilBiak üzere mevcut bulusta tanllandlglügibi tumstatine baglü
transferrini içeren bir rekombinant protein saglamaktadlEl
BazEIyapilândlEinalarda, CNV ile iliskilendirilmis klinik durum, psödoksantoma elastikum,
anjiyoid çizgileri, histoplazmoz, punktat iç koroidopati ve yas yasa baglEl makula
dejenerasyonunu (AMD) içermektedir.
Mevcut bulusun bilesimleri, aynüamanda bununla sIlEliEblmamak üzere, kanser; kanserle
iliskilendirilmis neovaskülarizasyon; kornea anjiyojenezi; proliferatif diyabetik retinopati;
neovasküler glakom; gözün diger neovasküler ve vasküler proliferatif bozukluklarlüve aynEl
zamanda vücudun baska yerinde olusan diger neovasküler ve vasküler proliferatif bozukluklar
gibi diger hastaIiKlarI tedavi edilmesi için de kullaniiâbilmektedir.
Mevcut bulusun bilesimleri, bununla sIlHllZl olmamak üzere, intravitreal, intravenöz,
suprakoroid, topikal, perioküler, subkutanöz, intramüsküler, subretinal, retrobulberi,
intraskleral ve benzeri gibi teknikte uzman kisiler tarafian bilinen yöntemlerin herhangi biri
kullanllârak uygulanabilmektedir.
SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI
Sekil 1, transferrin-tumstatin, bevacizumab ve tumstatinin anti-proliferatif aktivitesini
gösteren bir grafiktir.
Sekil 2, farki[transferrin-tumstatin, bevacizumab ve tumstatin konsantrasyonlar. sahip
koroid endotelyal hücrelerde gözlemlenen endotelyal tüp olusumunun engellenmesini
gösteren bir grafiktir.
Sekil 3, BN sünlaria CNV lezyon boyutunun /n V/VO degerlendirmesini gösteren bir
çubuk grafigidir.
Sekil 4, transferrin-tumstatin ile desteklenen gen ekspresyon yap-I sematik bir
temsilidir.
BULUSUN AYRINTILI AÇIKLAMASI
Mevcut bulusun bazü/önleri, tumstatine bagllîldiger bir ifadeyle eklenmis) transferrin içeren
bir rekombinant protein saglamaktadlEl Transferrin, dogrudan veya dolaylEblarak (örn., bir
baglaylEEvasiEislýla) tumstatine baglanabilmektedir. Mevcut bulusun yine diger yönleri,
mevcut bulusta tanllandigiügibi tumstatine bagIEltransferrin içeren bir rekombinant proteini
kodlayan bir nükleik asit sekansIlZl içeren bir rekombinant nükleik asit molekülü
saglamaktadlB Mevcut bulusun yine diger yönleri, mevcut bulusta tanIilandigiEl gibi
tumstatine baglEtransferrin içeren bir rekombinant proteini kodlayan bir nükleik asidi içeren
rekombinant nükleik asit molekülüyle transfekte olan ve molekülü eksprese eden
rekombinant konakçlîhücre saglamaktadlîl Mevcut bulusun yine diger yönleri, tumstatine
baglütransferrin içeren bir rekombinant proteinin üretilmesine ve kullanmasi yönelik
yöntemler saglamaktadlîl
Tumstatinin CNV'nin tedavi edilmesinde terapötik olarak etkili oldugu gösterilmistir. Herhangi
bir kurama bagilEIkallEmakslîIEl, tumstatinin mevcut CNV terapilerinde eksik olan bir
özellikle olan apoptoza sebep olmak suretiyle anjiyojenezi geriletme (indirgeme) kabiliyetine
sahip olduguna inanllîhaktadlü
Tumstatin, ilk olarak bazal membranda mevcut olan Kollajen IV'nin C terminali kollajen
olmayan etki alanIan (NC1) elde edilen bir endojen anjiyojenez inhibitörüdür. Tumstatinin
aVß3 integrinlerine baglanarak, endotelyal hücrelerin proliferasyonunu engelleyerek ve aynEl
zamanda endotelyal hücre apoptozunu indükleyerek kan damarEl olusumunun inhibe
edilmesinde bir rol oynadigllEla inanilB1aktadlEl Herhangi bir patolojik durumun yoklugunda,
anjiyojenik (VEGF gibi) ve antianjiyojenik moleküller (tumstatin gibi) arasüda bir denge
korunmaktadlfl Hipoksi ve iskemi esnasIa, anjiyojenik ve antianjiyojenik moleküller
arasIaki dengenin karlgtigIEa ve böylelikle neovaskülarizasyona sebep olduguna
inanllîhaktadlEl Tumstatin gibi anjiyojenez inhibitörleri, neovaskülarizasyonla mücadele etme
konusunda vücudun yaplîlEUa var olan mekanizmanI bir parçaslîblmaktadü
Tumstatin, ranibizumab ve bevacizumab üzerinde birçok avantaja sahip olmakta ve bu
antikorlardan terapötik olarak daha iyi olduguna inanllüiaktadlü Günümüze kadar, tumstatin
reseptörü olan ocVß3 integrin, yalnlîta aktif hale getirilmis endotelyal hücrelerde bulunmakta
ve normal damarlarda bulunmamaktadlEi Buna bagllîblarak, tumstatinin yara iyilesmesi gibi
fizyolojik islemleri etkilemeksizin aktif hale getirilmis endotelyal hücrelerin hedef allEinasI
yönelik bir yolak saglamaktadß Tumstatin, endotelyal hücrelerde apoptozu tesvik etmekte ve
tumstatinin sebep oldugu apoptozun kan damarlarlElI çogalmasIa gerilemeye yol
açabildigine ve dolaylgýla normal görmenin geri kazanIIBias-a avantajIEl olduguna
inanllüiaktadE Buna baglElolarak, tumstatin, etkili bir sekilde neovaskülarizasyonu tedavi
edebilmekte ve herhangi bir belirgin anti-VEGF tedavisiyle ilgili yan etkiler olmaks- görme
kaybIInIeyebilmektedir.
SaslElilEEi/e beklenmedik bir sekilde, mevcut bulus sahipleri, CNV'de tumstatinin terapötik
etkililiginin tumstatinin diger proteine baglanmasürasitâslýla çarplîEbir sekilde arttEllâbildigini
kesfetmistir. Belirli bir yapDândHnada, tumstatin, retinal pigment epitelyumdan (RPE
hücreleri) füzyon proteinin polarize bir sekilde salgllânmalelElelde etmek için transferrine
baglanmlstlEl RPE mono katman. maruz kaldglüda, füzyon proteini, tumstatine klîlasla
tercihen bazolateral tarafa dogru salgllânmlStE Transferrin-tumstatin geniyle olan
transfeksiyon isleminden sonra, olusan transferrin-tumstatin proteini, tumstatin gen ürününe
klýhsla polarize epitelyal hücre mono katmanlarIa daha çok bazolateral yöne dogru
salgllânmlgtlü Rekombinant transferrin-tumstatin proteininin bazolateral salgllânmasü
tumstatini aktif hale getirilmis ve neovasküler koroid endotelyal hücrelerin daha yak-
getirmekte ve böylelikle tumstatinin terapötik aktivitesini arttlünaktadß Herhangi bir kurama
bagllElolmakslîlEl transferritumstatinin gelismis bazolateral salgllâmasü demir içerigi ve
transferrin reseptör aktivitesinin muhtemelen bu hastalari gözlerinde artmasIan dolayü
AMD'den muzdarip hastalar. gözlerinde belirgin olmaktadlEl Demirin ortadan kaldlEllüias-
yönelik en erisilebilir yolun koroid vaskülatür vasiiâsls-Lla olduguna inanilhiaktadB Bu yol, aynlIl
zamanda transferrinin (ve dolayElQa rekombinant transferrin-tumstatin proteininin) koroide
dogru arttlEllÜiElsalgilânmasI da yol açmaktadlEI
YukarElhkilere baglEblarak, mevcut bulus sahipleri, koroid endotelyal hücrelerin göçünün,
proliferasyonunun ve aynüamanda tüp olusumunun önlenmesindeki etkililikleri bak“an
yeni bir transferrin-tumstatin füzyon proteini (diger bir ifadeyle transferrin-tumstatin proteini)
ve aynüzamanda tumstatini incelemistir. Bu aktiviteler, bevacizumab ile klýlaslanmlgtlü
Ilaveten, mevcut bulus sahipleri, mevcut bulusun rekombinant proteininin iyi bilinen polarize
hücre modelinde (örnegin Madin-Darby köpek böbregi, diger bir ifadeyle MDCK hücreleri)
polarize bir sekilde salgüânma becerisini belirlemistir.
Burada kullanliglîgibi, “transferrin” terimi, terapötik olarak etkili transferrin fragmanlarIEl
içermektedir. BazlZyapHândlElnalarda, “transferrin" terimi, integrinlere baglanabilen en az bir
transferrin peptid fragman. sahip bir peptidi ifade etmektedir. Alternatif olarak,
bir peptidi ifade etmektedir. Yine alternatif olarak, “transferrin” terimi, fragman seçici bir
sekilde integrinlere baglanma kabiliyetine sahip oldugu sürece, tam transferrin peptid
sekansII en az %25, tipik olarak en az %50, slklüîla en az %75 ve daha leIlKla en az
etkili transferrin fragmanürekombinant proteinin neovasküler bölgelere dogru hedeflenmis
alIiElve salgllânmaslîl(örnegin koroide dogru salgüâma) için kullanüâbilmektedir. Bazi]
yapllândlElnalarda, terapötik olarak etkili transferrin fragmanütipik olarak selektif bir sekilde
integrinlere baglanabilen bir transferrin peptid fragmanliîübermektedir.
Biyolojik aktiviteye sahip bazEltransferrin fragmanlarlZl teknikte uzman kisiler tarafIan
bilinmektedir. Mevcut bulusun kapsamII bu tür rekombinant protein istenen biyolojik
aktiviteye sahip oldugu sürece tam uzunluklu transferrini içerdigi takdir edilmelidir. Belirli bir
transferrin ve/veya tumstatin fragmanlElI istenen biyolojik aktiviteye sahip olmasElveya
olmamaslZIburada açiIZIananlar gibi in vitro ve in v/vo deneyler kullanilârak teknikte uzman
kisiler tarafIan halihazlmla belirlenebilmektedir. Buna bagllîiblarak, mevcut bulusun kapsamÇi
neovasküler bozukluklar. tedavi edilmesine yönelik herhangi bir terapötik füzyon proteinini
(diger bir ifadeyle rekombinant tumstatin-transferrin proteinleri) içermekte, burada tumstatin
ve/veya transferrin, baglsîlbir sekilde bir tam protein veya bunun bir fragmanllabilmektedir.
Rekombinant proteinlerin tipik olarak ana proteinlere klýlasla terapötik olarak daha verimli
olduguna inanilBiaktadiEl Mevcut bulusun bilesimleri, ilgili hücrelerde rekombinant proteinleri
eksprese etme kabiliyetine sahip nükleik asit yapllâr- veya rekombinant proteinleri
içermektedir.
Ser/'l Peptid/eri'. Transferr/h fragmanÜ
Burada bazolateral salgilâma verme kabiliyetine sahip bazEtemsili transferrin fragmanlarÜ/e
bunlarI tan Ianmas ve üretilmesine yönelik yöntemler ele allErnaktadE
Transferrin protein sekanslSI/e aynüamanda çesitli salgilâylîlîrotein sekanslarljnaliz edilmis
ve bazolateral salgilâma/taslia kabiliyetine sahip yeni füzyon proteinlerin olusturulmasEiçin
uygun transferrin fragmanlarElianEîlilanmlgtE Interlökin 6 (Holtkamp vd., Clin Exp Immunol.,
peptid sekansII analizi, bu tür proteinlerin N-terminali amino asitlerinde sasIlEElbir
benzerligin tani-Ianmas yol açmStEl Interlökin 6, interlökin 8 ve vasküler endotelyal
büyüme faktörü A (VEGF-A) dahil proteinlerin bazolateral tarafta salgilândfgilEla ve bol
miktarda lösin amino aside sahip olduguna inanilBtaktadlEl Ilaveten, aynllamanda dilösinler
(örn., “LL”), bu proteinlerin N-terminalinin yak-a mevcut olmaktadlEI Bu anlaylglara
dayanilârak, mevcut bulus sahipleri, transferrin-tumstatinin bazolateral salgllâmasian
sorumlu olabilen transferrinde asag-ki temsili peptidleri tanllamlgtlîi MRLAVGALL (SEK KIM
NO:1); MRLAVGALLVC (SEK KIM NO:2); LLVCAVLGLCL (SEK KIM NO:3); GALLVCAVLGLCL (SEK
KIM NO:4); LLVCAVLGLCLAV (SEK KIM N; ve
MRLAVGALLVCLLVCAVLGLCLAV (SEK KIM No:7). Buna bagllîblarak, bazEyapiiândlEinalarda,
bu peptidleri içeren herhangi bir peptid veya rekombinant peptid, transferrin-tumstatinin
bazolateral olarak salgHânmasII gerçeklestirilmesi için uygundur. Bu peptidler (örn., burada
açiElanan transferrin fragmanlarD] tumstatinle veya diger herhangi bir uygun terapötik
proteinle kaynast-[glia, terapötik proteinin bazolateral olarak salgllânmas. yol
açmaktadlEl(örnegin koroide dogru retinal pigment epitelyum boyunca).
Seri ll Pept/'d/er. integrin/are bag/anma kab//i'yet/he sah/;o transferr/h pept/d/eri:
SaslilllEElve beklenmedik bir sekilde, mevcut bulus sahipleri, aynElzamanda transferrin
proteininin transferrin reseptörüyle olan beklenen etkilesimine ilaveten, ocVß3 integrin
reseptörüyle etkilesime girebildigini kesfetmistir. Mevcut bulusun rekombinant transferrin-
tumstatin proteininin tumstatin reseptörü olan dVß3 integrin reseptörüyle ve aynlîtamanda
transferrin mevcudiyetinden dolayütransferrin reseptörüyle etkilesime girdigine inanIIB1aktadlEl
Transferrin-tumstatinin ocVß3 integrin reseptörüne in sil/ko (bilgisayar ortam a) yerlestirilmesi
islemi kullanilârak, mevcut bulus sahipleri, transferrin proteininin içinde integrin reseptörüyle
etkilesime giren amino asitleri tanIilamlgtlEl Asaglki amino asitler, in 5/7/k0 yerlestirmeye
dayanarak integrinle etkilesime girdigine inan ilân bazlZliemsili peptidlerdir:
A( 168); ve
E(429).
Bu etkilesime giren amino asitlere dayanarak, asagIki transferrin peptidleri, integrin
reseptörleriyle etkilesime girme kabiliyetine sahip olanlar seklinde tasarlanmlgtß
GFQNLNIGCLKEKAVA (SEK KIM NO:8); LLCTRDEILTEKLEWCINEADLVPENY (SEK KIM NO:9);
Transferrin335-431. Burada kullanllglîgibi, Transferrinx.y terimi, amino asit “x"'te baslayan ve
amino asit “y"'de sonlanan transferrrin amino asit sekanslarlEEifade etmektedir.
Seri [II Peptid/eri. Transferr/n reseptöre bag/anma kabiliyetine sahip transferrin fragman/.Ü
Asaglfîb, transferrin reseptörüne baglanma kabiliyetine sahip oldugu kesfedilen bazEtemsiIi
transferrin fragmanlarßçllZlanmaktadlEl
Asagi transferrindeki amino asitlerin transferrin reseptörüyle etkilesime girdigine
baglEl olarak, bu transferrin fragmanlarü aynEl zamanda mevcut bulus yöntemlerinde
kullanilâbilmektedir.
Seri [l/ Pept/'d/eri'. Ant/lani/'Voien/k ve/ veya anti-tümör akt/V/Iesi'ne sahip tumstatin fraqman/arÜ
kullanilEialela göre transferrin teslimatIEIarttEabilen tumstatin peptid k-i-Iarveya
fragmanlarIEiçermektedir. Buna baglEbIarak, bazlîyapilândlünalarda, “tumstatin” terimi, bu
tür bir peptide sahip olmayan transferrine göre transferrinin terapötik etkililigini arttlübilen en
az bir tumstatin peptid fragman. sahip bir peptidi ifade etmektedir. Alternatif olarak,
siElEEla en az %75 ve daha leIiEIa en az %90'. sahip bir peptidi ifade etmektedir. Biyolojik
aktiviteye (örnegin anti-anjiyojenik aktiviteye) sahip bazEltumstatin fragmanlarÇl teknikte
uzman kisiler tarafldan bilinmektedir. Mevcut bulusun kapsamlElI (ve aynEizamanda
fragmanlarIIIilçerdigi takdir edilmelidir.
Tumstatin, ocVß3 integrin reseptörüne baglanan ve tümör büyümesini bastlßn bir anjiyojenez
inhibitörüdür. Önceki delesyon mutajenez çallSlnalarEl(bkz. örnegin, Eikesdal vd., PNAS,
antianjiyojenik aktivitesine sahip asagüiaki tumstatin amino asit fragmanlarIEtanilamlgtE
Tumstatin.
Mevcut bulus sahipleri, aynElzamanda i'n sil/ko protein modellemesi vasßlea yukarIki
peptid sekans- baglEIolarak yeni peptidler tasarlamEtlE Belirli bir yapilândlEInada, D
(aspartik asit), asaglö'la gösterildigi gibi iki noktada H (histidin) ile degistirilmistir:
TMPFLFCNVNEVCNFASRNHYSYWL (SEK KIM NO:12)
H'nin D ile degistirilmesinin pozitif H yükü ile diger protein yükleri arasIa saf olumlu
elektrostatik etkilesime yol açmaktadlB Diger bazElyapHândlÜnalarda, hidrofobik kallEtllâr
alanin (A) ve Iösin (L), bir hidrofilik amino asit olan arginin (R) ile degistirilmistir. Bu modifiye
edilmis peptidlerin bazllârlZl asaglkileri içermektedir: TMPFLFCNVNDVCNFBSRNDYSYWL
(SEK KIM NO:13); TMPFLFCNVNDVCNFASRNDYSYWß (SEK KIM NO:14); CNYYSNSYS-
FWLBSLNPER (SEK KIM NO:15); ve CNYYSNSYSFWLASßNPER (SEK KIM NO:16).
Arginin, polaritesinden sorumlu olan bir guanidinyum grubunu ihtiva etmektedir. Hidrofobik
kallEtHârI hidrofobik arginin ile degistirilmesinin, solventle olusan ek hidrojen baglarIZI
vasltâlea proteinin kararllHglEI gelistirilmesine yard Icüblduguna inanllBiaktadlB ,ilaveten,
guanidinyum grubunun pH 7.4'te pozitif olarak yüklü oldugu argininin, yüzeye bir yük
getirecegine ve protein yüzeyinde ek etkilesimler için bir yol saglayacagi inanllBiaktadlEl
Yukarlîzlhki dogal sekanslarI veya modifiye edilmis fragmanlar. herhangi biri, mevcut
bulusun füzyon veya rekombinant proteinlerinin olusturulmasIa kullanllâbilmektedir. Buna
bagllîrblarak, “transferrin" ve “tumstatin" terimlerinin, bir veya daha fazla amino asit kaIlEt-
homolog amino asitler dahil yabanlEl olmayan tipteki amino asitlerle degistirildigi
modifikasyonlarüçerdigi takdir edilmelidir. Teknikte uzman kisiler, mevcut bulusu okuduktan
sonra halihazlEla uygun amino asit ikamesini belirleyebilmektedir.
YukarlElh ele alilglügibi, transferrin ve tumstatinin tam uzunluklu rekombinant proteinlerine
ek olarak, mevcut bulusun kapsamli tam uzunluklu transferrin ve/veya tumstatin
proteinlerinin biri veya her ikisinin yukar- açlKlanan herhangi bir karsIDKJ gelen klglni
peptidle degistirildigi rekombinant proteinleri içermektedir.
Buna baglEIolarak, mevcut bulusun kapsamÇl peptid/proteinin yukarlîzlhki Seri I veya III
Peptidlerde açllZlanan peptidlerden veya transferrinin kendisinden yukarIki Seri II veya IV
Peptidlerdeki peptidlerle veya tumstatinin kendisinin (örn., herhangi bir terapötik protein veya
tumstatin gibi peptid veya Seri II veya IV Peptidi gibi peptid ile kaynastElBilglSeri I Peptid; ve
Seri I Peptid ile kaynastlîllüilSlSeri II Peptid ve benzeri) herhangi bir kombinasyonunun oldugu
rekombinant proteinleri içermektedir. Buna ek olarak, Seri I Peptidleri, hedeflenmis
aIH/tasa/salgllâma için herhangi bir yeni terapötik makro molekülle birlestirilebilmektedir.
Örneklerde, yapElJbir sekilde pratige indirgenen prosedürler, genis zaman kipinde tarif
edilmekte ve laboratuvar ortamlEbla gerçeklestirilmis olan prosedürler ise geçmis zaman
kipinde tarif edilmektedir.
ÖRNEKLER
Malzemeler ve Yöntemler
Malzeme/er.' Transwell® filtreleri (0.4um gözenek boyutu), Corning Inc. sirketinden (New
York) satI allEtnIIstlB Bovin serum albumin Sigma Aldrich (M0) sirketinden satI allErnlStIEl BD
Matrigel Matrix Growth Factor Reduced, BD Biosciences (CA) sirketinden satI allEtnglEl DNA
merdiveni, Lipofectamine®
sirketinden satI allEmlSIlEI Klîlühma enzimleri, New England Biolabs (MA) sirketinden satI
allElnlStlEI QuikChange® Bölgeye Yönlendirilmis Mutajenez Kiti, Agilent Technologies (CA)
sirketinden satI aIlEmlStlEI Transferrin geni, koroid endotelyal hücreleri (RF/6A), ve RF/6A
besiyerleri, Amerikan Type Culture Collection (VA)'dan satI allEinlStlEl QIAGEN® plazmid Giga
kiti, QIAGEN Inc. (CA) sirketinden satI allElnlgtlEl TALON® metal afinite reçinesi (Katalog #
635502), Clonetech Laboratories, Inc. (CA) sirketinden satI aIlEmlgtlEI Protein içerigini
hesaplamak için kullanilân BCA® Protein Deney Kiti, Pierce Biotechnology, Inc. (IL) (Katalog
hazlîljel olan 10% Ready Gel Tris-HCI® ve Fisher Scientific (PA) sirketinden elde edilen EZ
Run® önceden boyanmlglprotein merdiveni, SDS PAGE jel elektroforez sßsia kullanilßîlgtß
BCA ® protein deney kiti, Thermo Fisher Scientific (IL) sirketinden satI allEhiIStlE]
P/azmid/erm Olusturu/masÜAsagIki cDNA'Iarüyani (a) Tumstatin; (b) Tumstatin-EGFP; (c)
Transferrin-tumstatin (transferrin-tumstatin destekli gen ekspresyon yap-[Sematik olarak
gösteren Sekil 4'e bak_ Transferrine sahip benzer bir yapü uzun vadeli tumstatin
ekspresyonu için kullanlgllâlg; ve (d) Transferrin-tumstatin-EGFP'yi içeren dört farklEiyapIIJ
inceleme için hazlEIhnmlgtlEl Primerlerin tamamlÇIbu deneyde kullan [iBiak üzere Integrated DNA
Technologies Inc. (CA) sirketinden satI allErnStlEl Tumstatin cDNA, ileri primer (5'-
CGATGGATCCGCAAC-CTGGACAACGAGAGGC'I'I'-3') (SEK KIM NO:17) ve ters primer (5'-
CGATCTCGAGAGTGTCTI'I'I'C'ITCAT-GCACACC-3') (SEK KIM NO:18) kullanllârak PCR ile
güçlendirilmis ve BamHJ ve XhoJ fragmanlîseklinde PSecTagZB vektörüne baglanmlgtlEI EGFP,
Hind [I] ve BamHJ fragmanlîseklinde, sablon olarak pEGFP vektörü (Clonetech Laboratories,
CA) kullanilârak ve Ileri primer (5'-ATCGATAAGC'ITI'GTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3') (SEK KIM
NO:19) ve ters primer (5'-ATCGATGGATCCCTI'GTACAGCTCGTCCATGC-3') (SEK KIM NO:20)
kullanilârak PSecTagZB vektörünün içine klonlanmlgtlîl
sindirilmesi vasltâslýla transferrin ile degis tokus edilmistir. Transferrin, klîlflbma bölgeleri olan
Nhe1 ve Sfil bölgelerini ihtiva eden ileri primer (5'-AGTCGCTAGCATGAG-GCTCGCCGTG
GGAGCCC-3') (SEK KIM NO:21) ve ters primerler (5'- AGTCGCGGCCGGCTGG GCCAGGTC-
TACGGAAAGTGCAGGCT-3') (SEK KIM NO:22) kullanllârak güçlendirilmis ve dogrusallastlîllüilgl
vektörün içine klonlanmlgtß Transferrin, Tumstatin ve pEGFP içeren PsecTagZB'nin içine
dahil edilmistir. PSecTagZB'nin Igk gen klýnÇlbu islem slßsia çllZlarHBilStE AynEiIeri ve ters
primerler, transferrin-tumstatin plazmidi yapmak amacMa yalnlîta Tumstatin içeren
PsecTagZB'nin içine Transferrini dahil etmek için kullanilBilgtE
Plazmidlerin tamamüEColi bakterilerinin dH50c türü kullanilârak büyütülmüs ve QIAGEN®
plasmid Giga kit kullanilarak güçlendirilmistir. %1 agaroz jeli, TAE tamponunda hazEhnmEve
cDNA yapllârIEihcelemek için kullanllB^ilgtIEI Resimler, GelDoc XR® görüntüleme sistemi (Bio-
Rad Iaboratories, Inc.CA) kullanilârak çekilmistir.
Protein/'n üretilmesi i/e saßastmasÜYukarI bahsedildigi gibi plazmidleri olusturmak için
kullanllân PSecTagZB vektörü, besiyerinde salgllânan proteinin safiastlülüîasl yardIicEl
olabilen altEihistidin etiketine sahiptir. Plazmid, olusturulan füzyon proteinlerini eksprese etmek
amacMa ARPE'de (Insan retinal pigment epitelyum) transfekte edilmistir. ARPE hücreleri, %80
hücre doluluk oranlZlalde edilene dek büyütülmüstür. ARPE hücrelerinin geçici transfeksiyonu,
Lipofectamine® 2000 reaktifi kullanllârak gerçeklestirilmistir. TALON® metal afinite reçinesi,
histidin ile etiketlenmis proteini saflastlElnak için kullanilB1lStlEl BCA® Protein Deney Kiti,
ayrlgtlEllân protein içerini hesaplamak için kullanllüilgllîl Bir protein tahmin standart egrisi,
Bovin serum Albumin (Sigma Aldrich, MO) kullanllârak yapllBilgtlEl
ARPE hücrelerin/h es odak/Ün/kroskop/si: Tumstatin-EGFP plazmidi, hücrelerde EGFP geninin
islevini görmek amaclýla ARPE hücrelerinde incelenmistir. ARPE hücreleri, %80 hücre doluluk
oranEl elde edilene dek büyütülmüstür. ARPE hücrelerinin geçici transfeksiyonu,
Lipofectamine® 2000 reaktifi kullanilârak gerçeklestirilmistir. DAPI (4',6-diamidin0-2-fenilindol,
dihidroklorür) boyasÇlhücre çekirdegi için yapllüilgtß Tumstatin-EGFP plazmidiyle transfeksiyon
yapllîhayan ve yalnlîta DAPI boyamaslîila sahip ARPE hücreleri, kontrol olarak kullanllhilgtlü
Transferrin-tumstatin-EGFP ve tumstatin-EGFP'nin içsellestirilmesini incelemek için, protein
koroid endotelyal hücreleri, transferrin-tumstatin EGFP ve tumstatin-EGFP proteinine 24 saat
boyunca maruz blBikllBilgtlEl 24 saat sonra, hücreler soguk PBS (pH 7.4) ile ylKlanmlglve bunu
takiben soguk asidik tampon (pH 5.0) ile ylKlanmlS ve %4 paraformaldehid kullanilârak
sabitlenmis ve DAPI ile boyanmlgtlü Hücreler, Nikon C1 si® es odaklEmikroskop altIda
gözlemlenmistir.
Transferr/'n-tumstat/n-EGFP füzzon grotem/n/n Qolar/'ze sa/gßânmasÜMDCK hücre hattIZl iyi
anlasllân bir polarize sistem olmasIan dolaylZfüzyon proteini polarize salgllâma incelemesi
için seçilmistir. MDCK hücreleri, membran proteinlerini apikal veya bazolateral yüzeye teslim
eden yollara sahiptir.
MDCK hücreleri, Transwell filtrelerine yerlestirilmis ve Trans epitelyal elektriksel mukavemet
(TEER), EVOM® mukavemet ölçer (World Percision Instruments, CA) kullanllârak
ölçülmüstür. TEER degerinin 300 Q'nin üzerinde olmasEdurumunda, hücreler yukar- tarif
edildigi gibi tumstatin-EGFP veya transferrin-tumstatin-EGFP plazmidiyle transfekte edilmistir.
24 saatlik transfeksiyon isleminden sonra, MDCK hücreleri sabitlenmis ve DAPI çekirdek
boyaslIkuIlanllârak boyanmlStlB Besiyeri, ayrDayrlIhem bazolateral hem de apikal taraftan
toplanmlglve füzyon proteinleri, BCA® protein deney kiti kullanllârak ölçülmüstür.
Hücre pro/iferasyonu deneyi.' Koroid endotelyal hücreler (RF/6A), tumstatin proteini ve
transferin-tumstatin proteininin VEGF 165'in etkisi altlEUa hücrelerin proliferasyonu
üzerindeki etkisini incelemek için kullanllBilîstlEl Bir MTI' deneyi, hücre proliferasyonunu
degerlendirmek için kullanüîhlgtü
Koroid endotelyal hücreler (RF/6A, geçit#9), takriben 20,000 hücre/kuyucuk besleme
yogunlugunda 96 kuyucuklu plakaya yerlestirilmis ve 24 saat boyunca kuyucuga yaplglnaslîl
saglanmlStlEl 24 saat sonra, hücreler 50 ng/ml'lik bir konsantrasyonda VEGF 165
solüsyonlarlsîla (R&D systems, MN) inkübe edilmistir. RF/6A hücrelerinin proliferasyonu, 50
ng/mL VEGF 165 kullanllârak indüklenmistir. 96 kuyucuktan 3 kuyucuk, kontrol olarak
korunmus ve yalnlîta RF/6A hücrelerini ve 50 ng/mL VEGF 165 içermistir. Geri kalan
kuyucuklar, çesitli konsantrasyonlarda bevacizumab, tumstatin veya transferrin-tumstatin
içermistir.
Bu konsantrasyonlar, bevacizumab için kullanHBilgIE 1.5 - 500 nM. Besiyeri, dlSlarDamilmis
ve 200 ul taze serum içermeyen besiyeri, 24 saatin sonunda her bir kuyucuga ilave edilmistir.
MTT reaktifi (Sigma Aldrich, M0), örn., 3-(4,5-dimetiItiyazol-2-il)-2,5-difenil tetrasodyum
bromür), (pH her bir kuyucuga ilave edilmis
ve 3 saat boyunca 37°C'de inkübe edilmistir. Besiyeri dlglarüamilmis ve olusan formazan
kristalleri, 200 p.' DMSO içinde çözünmüstür. DMSO'nun ilave edilmesinden sonra, çözünen
kristaller ve renk absorbansÇlbir mikro plaka okuyucusu kullanllârak 570 nm'de ölçülmüstür.
Sonraki deneyde, tumstatin veya transferrin-tumstatin, asagßlaki konsantrasyonlarda
bevacizumab. yerine kullanllfhlgtE 7.8 ila 1000 nM. Yukari tarif edilenlerle aynÜ/öntemler
takip edilmistir. Transferrin-tumstatin proteini, 1.5 ila 500 nM'lik konsantrasyonlarda
kullanllüilStlEl(her bir konsantrasyon için n=3).
TÜQ o/usturma denezi: Matrigel®, gece boyunca 4°C'de eritilmistir. 48 kuyucuklu plaka, her
bir kuyucugun taban. 75 pl'llk erimis matrigel® ürününün daglülîhasüvasltâslýla tüp
olusturma deneyi için hazlElhnmlgtEl Plaka, matrige® ürününü polimerize etmek amaciyla 30
dakika boyunca 37°C'de tutulmustur. Koroid endotelyal hücreler, matrigel® içeren 48 kuyucuklu
plakaya aktarHBilgtE Her bir kuyucuk, 6x103 hücre içermektedir. Üç kuyucuk, hiç tumstatin
içermemis ve kontrol olarak tutulmustur. Ek 45 kuyucuk, proliferasyon deneyi için yukarlâb
tarif edilen konsantrasyonlarda tumstatin proteinini ihtiva etmistir. Plaka, 18 saat boyunca
37°C'de tutulmustur. Tüp olusumu, lglKl mikroskobu kullanllârak analiz edilmistir. Transferrin-
tumstatin ve bevacizumab protein deneylerini gerçeklestirmek için aynEl yöntemler
kullanHBilgtlEl 0.15 ile
kullanilüilgtE
Hücre göçü denek/1' In vitro hücre göçü deneyleri, Matrigel Istila odasEGS-pm gözenek boyutu,
Becton Dickinson, MA) kullanilârak gerçeklestirilmistir. 0.5 ml serum içermeyen besiyerindeki 5 x
105 hücrelik bir süspansiyon, Matrigel odaleb ilave edilmistir. Kuyucuklar, 1 mI'Iik 10 ng/ml
VEGF solüsyonuyla doldurulmus. Odalar, %95 hava/%5 COZ inkübatörde 24 saat boyunca
37°C'de inkübe edilmistir. MembranI alt yüzeyindeki hücreler, Haematoksilin ve Eosin
boyaslýla boyanmlgtlEI Istila eden hücreler, 40x büyütülmüs Nikon mikroskopunda
fotograflanmlgl ve her bir konsantrasyon için üç membrandan olusan bes alanda sayllüilgtlîl
Transferrin-tumstatin ve bevacizumab protein deneylerini gerçeklestirmek için aynüiöntemler
kullanilîhlstlü 0.15 ile
kullanllßilgtß
MolekÜ/er Ker/est/rme.' “Accelery's discovery visualizer v2.5.1.9167" (Accelry's, Inc.CA),
tumstatin ve transferrIn-tumstatinin ocVß3 integrin reseptörüne /n sil/'ko yerlestirilmesi için
incelenmistir. Kollajenöz olmayan kollajen IV etki alani. (PDB #1L11) kristal yapEIÇI
tumstatine iliskin bir homolog model gelistirmek için bir referans olarak kullanllfhlgtlü Iyon
içermeyen insan serum transferrinin kristal yaplgEKPDB # 2HAV), transferrine iliskin bir
homolog model gelistirmek için bir referans olarak kullanllîhlStE Proteinler hazlEllanmlg ve
enerji asgarilestirme islemi gerçeklestirilmistir. Transferrin-tumstatin füzyon proteinleri,
tumstatinin transferrin C terminaline bir peptid baglýla kaynastlülîhasü vasltâsMa
olusturulmustur. oiV|33 integrin yerlestirme incelemeleriyle birlikte tumstatine iliskin bir
tumstatin homoloji modeli, bir Iigand olarak kullanllîhlg ve ocVß3 integrinin (PDB # 1JV2)
hücre dlglîl etki alani. kristal yap_ yerlestirilmistir. aVß3 integrin yerlestirme
incelemeleriyle birlikte transferrin-tumstatine iliskin olarak, füzyon proteini, ocVß3 integrin
reseptörüne (PDB # 1JV2) yerlestirilmistir.
Agogtoz denek/1' Apoptoz islemi, DeadEnd kalorimetrik TUNEL (TdT araCHIBJUTP çentik uçlu
etiketleme) sistemi (Promega Corporation, WI) kullanilârak incelenmistir. Koroid endotelyal
hücreler (1 x 105 hücre / kuyucuk), 12 kuyucuklu plakadaki Iamele yerlestirilmis ve 24 saat
boyunca yaplgh'iaslîl saglanmlgtlEl 24 saat sonra, hücreler, farkIlZI konsantrasyonlarda
bevacizumab (1, 10 ve ve transferrin-tumstatin (1,
ve proteine maruz blßkllüilgtlîl Protein maruziyetinden 24 saat sonra, hücreler
yllZlanmlSl %4 paraformaldehid ile sabitlenmis ve fosfat tamponunda (pH 7.4) %0.2 Trit0n® X-
100 solüsyonu kullanilârak geçirgenligi saglanmlgtlEl Hücreler, DeadEndTM kolorimetrik TUNEL
deneyi sistemiyle birlikte saglanan standart protokol uyarlîita boyanmlgtlEI Hücreler, 40x
büyütülmüs bir lgllgmikroskobu altIa incelenmistir.
Kahverengi Lazim Fare/er/hde CN l/ Indüks/yonu ve koro/d düz yuva/ar.' Eriskin erkek
kahverengi lagIi fareleri (
sirketinden satI allErnlStlEl Sis-;anlara 40 ila 80 mg/ml ketamin ve 10-12 mg/kg ksilazin
karisir-nl.. intraperitoneal yolla enjekte edilmesi vasltâsüla anestezi uygulanmlStlEl Lazer
yanlKlarII indüksiyonu, asag-ki gibi gerçeklestirilmistir. Göz bebekleri, %1 tropikamid
solüsyonunun topikal yolla uygulanmasEl/aslßislýla genisletilmistir. Göz dibi, göze bir lamel
yerlestirildikten ve %25 hipromelloz solüsyonunun damlatlIB'iasIan sonra görsellestirilmistir.
Optik sinirle ortak merkezli olan sekiz lazer noktaslîdloo mm, , 532 nm diyot
lazer (Oculight Glx; Iridex Inc., Mountain View, CA, ABD) ve yarllZl lamba (Zeiss yarIEl lamba
3OSL; Carl Zeiss Meditec Inc., Dublin, CA, ABD) kullanlßrak her bir farenin sag gözüne
yerlestirilmistir. Sol göz, her bir hayvan için bir kontrol olarak kullanilßîlStIB Bruch membran
kopmaslZl"baloncuk olusumu” son noktasEl/aslüslýla dogrulanmlStIEl Lazer uygulandllîtan
sonra intraoküler (göz içi) kanama sergileyen fareler, incelemeden çlKlarilBwlgtlEl Lazer
yanlElarII indüksiyonundan sonra 14 gün boyunca CNV IezyonlarlElI gelismesine izin
verilmistir. 14 günün sonunda, slganlara asaglîlhki tedavilerin biri intravitreal yolla
uygulanmlgtlîi (a) PBS pH 7.4, (b) bevacizumab, (c) tumstatin protein ve (cl) transferrin-
tumstatin protein. Farelere 14 günlük tedavinin sonunda ötenazi uygulanmlSl ve gözler
çlKlarllBilStlEl
Koroid düz yuvaya iliskin olarak, farelere 80 mg/kg ketamin ve 10 mg/kg ksilazin karlglîihII
intraperitoneal enjeksiyonu kullanllârak anestezi uygulanmlgtlEl Farelere, 10 mI'Iik %4
paraformaldehid ile yapüân infüzyonu takiben 10 ml PBS (pH 7.4) asllânmlgtlü Son olarak 4
mI'Iik 50 mg/ml flöresin izotiyosiyanat (FITC)-dekstran solüsyonu (2x106 Da) asllânmlStEI
Daha sonra gözler yerinden çllZbrllüilglve düz yuvalar hazlElbnmlStlE Düz yuvalar, 488 ve 568
nm uyarIl dalga boylarEkullanllârak Nikon EZ-CI es odakllîilnikroskop ile görüntülenmistir. CNV
alanlarlÇIImageJ yazlIllîiiülullanllârak elde edilmistir.
Sonuçlar
tumstatin-EGFP, transferrin-tumstatin-EGFP ve transferrin-tumstatin plazmidinin %1 agaroz
jel resmi çekilmistir (gösterilmemekte). 1Kb'lik DNA merdiveni, boyut isaretleyicisi olarak
çallStlElImiStIE Tumstatin (28 kDa) ve transferrin-tumstatin-EGFP'nin ( SDS jel
elektroforez resmi de çekilmistir (gösterilmemekte). AynEl zamanda PSecTagZB'ye
yerlestirildikten sonra tumstatine iliskin baz çifti sekanslama sonucuna yönelik bir
elektroferogram da allEInlSIlÜ Sekanslama islemi, kapiler elektroforez (Applied Biosystems, CA)
kullanllârak gerçeklestirilmistir. Tumstatin-EGFP ekspresyonu, ARPE hücrelerince incelenmis ve
görüntüler çekilmistir (gösterilmemekte). Tumstatin-EGFP proteinini eksprese eden ARPE
hücrelerinin es odaklElmikroskopi resimleri (100X) de çekilmistir (gösterilmemekte). DAPI
boyamasÇl hücre çekirdegini boyamak için gerçeklestirilmistir. Hiçbir tumstatin-EGFP
transfeksiyonuna sahip ARPE hücreleri, herhangi bir arka plan floresansßm indirmek amaclýla
kontrol olarak kullanllüilgtlEl
Transferrin-tumstatin-EGFP proteininin içsellestirilmesi belirlenmistir. Yogun EGFP sinyali,
transferrin-tumstatin-EGFP proteinine olan maruziyetten sonra RF/6A hücrelerinde
gözlemlenmistir. Hücre yüzeyindeki herhangi bir proteinin asidik tampon ylElamaslZlile
çllZlarllüiasEbeklenmistir. Bu, hücre membranIEblusturan lipid fosfolipidlerinin pKa'leUan
dolayElolmustur. Fosfat gruplarII en düsük pKa degeri, ~2 olmakta ve bu da fosfat
gruplarII yüklenmemis H3P04 durumunda oldugunu veya pH 2 degerinde tek negatif yüke
(H2P04`) sahip oldugunu isaret etmektedir. ~2'den daha yüksek olan pH degerinde, iki negatif
yüke (HP04'2) sahip olma olasiIIgiEiartmaktadlEi Dolayiîlýia EGFP sinyalinin yalnlîta
içsellestirilmis proteinden dolayüolmasügerekmistîr. RF/6A hücrelerinin tumstatin-EGFP
proteinine olan maruziyeti, gözlemlenebilir hiçbir içsellestirmeye yol açmamlSIlEl
Transferr/h-tumstat/h-EGFP füzyon proteinin/n polarize sa/aßâ'masÜ
MDCK hücreleri, transferrin-tumstatin-EGFP proteininin bazolateral salgllâmasIEihcelemek için
kullanilüilgtE Bu deneyde çekilen resimler, transferrin-tumstatin-EGFP proteininin hücrelerin
bazolateral tarafiEUa salgilândiglüigöstermistir. Bazolateral tarafI es odakllîiinikroskop aItIa
incelenmesi durumunda hücre sirlîlgörünür olmamlStlEI Bu, Sigil mikroskopa geri
yansnas olanak saglamayan ve aynllamanda hücrelere giden @ElyOIunu engelleyebilen
transwell filtrelerinin gözenekli yap-I sonucu olabilmektedir. Bu, filtrenin bazolateral
tarafIan gelen hücrelerin görünebilir eksikligine iliskin olasEIbir sebep olabilmektedir.
Hücrelerin bazolateral taraflEUan görünmemesine ragmen, DAPI boyamaslîlve salgilânan
proteinden gelen EGFP sinyali, bazolateral tarafta açiEça gözlemlenebilmektedir. Hücreler,
filtrenin apikal tarafII es odaklü mikroskop altIa incelenmesi durumunda açilîça
gözlemlenebilmektedir. Protein salgilâmasÇihücreIerin bazolateral yüzeyinde gözlemlenmistir.
Bu tür bir olusum, en az iki yolla açiEJanabilmektedir. Protein, hücre yüzeyindeki reseptörlere
baglanabilmekte veya protein nltreye (bazolateral olarak salgiiânan protein) gömülebilmektedir.
Bazolateral ve apikal besiyerinde salgüânan proteinin miktarII ölçümü, transferrin-tumstatin-
EGFP proteininin salgüâyElgiolagIIogrulamlStlEi
Apikal ve bazolateral besiyerinden toplanan transferrin-tumstatin-EGFP proteini
saflastlElIIhlStE Apikal ve bazolateral besiyerindeki protein içerigi belirlenmistir. Apikal
besiyeri %23.17 ve bazolateral taraf %76.83 oranlEtla transferrin-tumstatin-EGFP proteini
ihtiva etmistir. Her iki besiyerinde salg ilânan toplam proteinin %100 oldugu kabul edilmistir.
Tumstatin-EGFP proteini (kontrol), polarize MDCK hücresi incelemesinin tamamlanmasiihan
sonra toplanan apikal ve bazolateral besiyerinden saflastlEliIBilgtlB Apikal besiyeri %68.84 ve
bazolateral taraf ise %31.16 oranIa tumstatin-EGFP proteini ihtiva etmistir. Bu veriler,
transferrin-tumstatin füzyon proteinine sahip olunmas- füzyon proteininin bazolateral
salgllâmas- çarplED bir sekilde arttlüibildigini göstermektedir. Transferrin yoklugunda,
tumstatin, füzyon proteininde transferrin mevcudiyetinde apikal olarak salgilânan %23.17
oran. kEiasla daha fazla pikal tarafta (%68.84) salgilânmlgtß
Hücre proliferasyonu deneyi.' VEGF 165 vasitâslýla indüklenen hücre proliferasyonu, tumstatin
ve transferrin-tumstatin proteininin mevcudiyeti vaslßislýla inhibe edilmistir. Sekil 1, tumstatin,
transferrin-tumstatin ve bevacizumab proteinlerinin etkisi altIaki hücre proliferasyonunu
göstermektedir. MTI' deneyi, VEGF (50 ng/ml) ile stimüle edilen koroid endotelyal hücre
proliferasyonu üzerinde tumstatin (o), transferrin-tumstatin (A) ve bevacizumab. (i) anti-
proliferatif aktivitesini degerlendirmek için kullanilBilStE MTT reaktifiyle yapllân tedaviden
sonraki absorbans, UV-Vis spektrofotometre kullanllârak ölçülmüstür. Veriler, n = 3'e iliskin
olarak ± S.D. seklinde ifade edilmistir. Gratigin gösterdigi gibi, transferrin-tumstatin proteini,
tek bas. tumstatine klýbsla hücre proliferasyonunun indirgenmesinde oldukça etkili
olmustur. Transferrin-tumstatin proteininin ICSÜ degerinin 5.97 nM oldugu kesfedilmistir. Bu
deger, tek baslEla tumstatin proteinine iliskin 185.7 nM olmustur. Ayn Eamanda Bevacizumab,
hücre proliferasyonunun inhibisyonuna yönelik test edilmis ve etkililiginin IC50 7.78 nM oldugu
kesfedilmistir.
Transferrin-tumstatin proteini, Bevacizumaba klýlasla hücre proliferasyonunun inhibe
edilmesinde daha verimli olmustur. Transferrin-tumstatin, aynElzamanda bevacizumaba
klýhsla proteinin ICso'si Üzerinde daha büyük say. hücreyi inhibe edebilmistir. 15.6 nM'lik bir
konsantrasyonda, transferrin-tumstatin inhibisyonu neredeyse %84 olurken bevacizumab
inhibisyonu ~%63 olmustur.
TÜQ olusturma denek/2' Tüp olusumunun temsili resimleri (gösterilmemekte), farklEltumstatin,
transferrin-tumstatin ve bevacizumab konsantrasyonlarlEUa çekilmistir. Tüp olusumunun
tumstatin ve transferrin-tumstatin protein konsantrasyonundaki artSla azaldl'gilîgörülmüstür.
Hem tumstatin hem de transferrin-tumstatin proteini, tüp olusumunu inhibe edebilirken
bevacizumab etkisi alt-a dikkat edilebilir hiçbir tüp olusumu inhibisyonu gözlemlenmemistir.
Transferrin-tumstatin füzyon proteini kullanllârak gerçeklestirilen tüp olusum deneyinde
tüplerin olusumunun hemen hemen tamamen önlenmesi, 125 nM'lik konsantrasyonda
gözlemlenmistir. Sekil 2, test edilen üç proteinin tamam- çift klîl'IilEyerlestirme grafigini
göstermektedir. Tüp olusumu, 18 saat sonra degerlendirilmistir. Veriler, n = 3'e iliskin olarak
ortalama ± S.D. olarak ifade edilmektedir.
kimyasal olarak çekici maddeye dogru göç etme egiliminde olmaktadlü Resimler, tumstatin ve
transferrin-tumstatin proteininin etkisi altEUa istilacEI hücrelerin say-aki azalmayEl
göstermistir. Matrigel istila odaslîiinembran-tila eden hücrelerin say-aki çarplEÜzalma,
tumstatin proteininin konsantrasyonu besiyerinde artarken gözlemlenmistir. AynlZlzamanda
tumstatin ve transferrin-tumstatin etkisi altIa membranElstila eden hücrelerin resimleri
(gösterilmemekte) de çekilmistir. VEGF (10 ng/ml), kimyasal olarak çekici madde olarak
kullanllüilgl ve tumstatin veya transferrin-tumstatin proteini yoklugunda membran. önemli
ölçüde istila edildigi gösterilmistir. Ancak, Membran istilasII indüklenmesindeki VEGF etkisi,
VEGF'nin mevcut olmas. ragmen iki proteinin herhangi birinin mevcudiyetinde
indirgenmistir. Bu, tumstatin ve transferrin-tumstatin proteininin hücre göçünün
indirgenmesindeki etkililigini ve VEGF gibi uyarlEIErI mevcudiyetinde bile olan istilayEisaret
etmektedir.
Istila, yalnlîta tumstatin proteinine klýlasla transferrIn-tumstatin proteini vasltBislýla önemli
ölçüde azaltllüilgtlü Transferrin-tumstatin proteininin etkisi, 15 ile
konsantrasyonlarda tumstatinden çok farklüblmustur. Ancak, 250 ile 500 nM'lik daha yüksek
konsantrasyonlarda fark çok belirgin ölçüde olmamlSIB Bu, istila etme egiliminin doymus hale
geldigini (hücreler daha fazla istilaclIbImamakta ve VEGF'ye dogru çekilmekte) ve ek Istila,
daha yüksek konsantrasyonlarda etkilenmemistir. Bu etki, hücre proliferasyonunda
gözlemlenenden farklEl olmus ve tüp olusumu, iki protein kullanllârak incelenmistir.
Bevacizumab, transferrin-tumstatine iliskin 12.14 nM'ye klîbsla daha düsük olan 8.0 nM'lik IC50
degeri sergilemis ve hücre istilaslîiUa VEGF'nin önemli rolünü isaret etmistir.
Moleküler yerlestirme.' Moleküler modeller, orVß3 integrin reseptörüne yerlestirilen tumstatin
ve transferrin-tumstatine iliskin in sil/'ko olarak yapilihlStIEl Iki farkIIZl/erlestirilen proteinlere
iliskin enerji degerleri, transferrin-tumstatinin yerlestirilmesinin (-130.43 kcaI/mol'lük etkilesim
enerjisi), tek bas. tumstatinin yerlestirilmesinden (-113.28 kcal/mol'lük etkilesim enerjisi)
enerjik olarak daha uygun oldugunu isaret etmistir.
Agagtoz deneyi.' Tumstatin, transferrin-tumstatin ve bevacizumab etkisi altIaki apoptozu
sergileyen hücrelerin temsili resimleri (gösterilmemekte) çekilmistir. Tumstatin ve transferrin-
tumstatin proteini, test edilen üç konsantrasyonun tamamIa (slßsüla 100, 250 ve 500 nM
ve 1, 10 ve koroid endotelyal hücrelerde apoptozu indüklemistir. Bevacizumab (1,
ve vasüslýla hiçbir belirgin apoptoz indüklenmemis ve kontrol
PBS ile gözlemlenene benzer olmustur.
Kahverenq/ Laâß Fareler/'nde CN l/[hdL'I/(si'i/onu ve koro/d düz yuva/ar:
Transferrin-tumstatinin bevacizumab ve tumstatine (Sekil 3) klýlasla lazer ile indüklenmis CNV
lezyon alanIda daha etkili oldugu kesfedilmistir. CNV lezyon boyutu, koroid düz yuvalardaki
14 günlük tedavinin sonunda ölçülmüstür. CNV lezyon boyutunun bir kantitatif klýbslamasü
Sekil 3'te gösterilmektedir (* tumstatin tedavisine klýlasla p<0.05'i isaret etmektedir. t
bevacizumaba klýiasla p<0.05'i isaret etmektedir. Veriler, her bir gruptaki n = 42-48 Iezyona
iliskin olarak ortalama ± S.D. seklinde ifade edilmektedir). Transferrin-tumstatin ile tedavi
edilmis fareler, bevacizumab ve tumstatin ile tedavi edilmis farelere klýlasla önemli ölçüde daha
düsük lezyon boyutuna sahip olmustur.
Tartlgtna
Mevcut bulusun bazEyönleri, tumstatine baglanan transferrini içeren bir rekombinant protein
saglamaktadlEl Mevcut bulusun rekombinant proteinleri (özellikle transferrin-tumstatin
rekombinant (örnegin füzyon) proteini), OtVß3 integrine arttlElIB1lglbaglanmaya sahip olmakta
ve tek bas. tumstatine klýhsla süslîla 21, 25 ve 31 kat daha yüksek aktiviteyle tüp
olusumunu, endotelyal hücre proliferasyonunu ve göçü inhibe etmistir. Ilaveten, transferrin-
tumstatinin bevacizumaba külasla koroid endotelyal hücre proliferasyonunun ve tüp
olusumunun inhibe edilmesinde daha etkili oldugu gösterilmistir. Dahasütransferrin-tumstatin
rekombinant proteini, tek bas. transferrine klîbsla CNV'nin in Viva olarak inhibe edilmesine
yönelik üstün bir verimlilik sergilemistir. Mevcut bulusun diger yönleri, mevcut bulusta
tanIilandlglljgibi tumstatine baglEliransferrin içeren bir rekombinant proteini (diger bir ifadeyle
transferrin-tumstatin füzyon proteini) üretme kabiliyetine sahip bir plazmid ekspresyon sistemi
saglamaktadlEl Bazülapllândlülnalarda, mevcut bulusun plazmid ekspresyon sistemi, proteinin
tercihen birbirine karlgian hücre mono tabakalarII bazolateral taraf. dogru salgüânmas.
olanak saglamaktadEl
Deneyler, transferrin-tumstatin rekombinant proteininin slßslýla tumstatin (IC50 ve
bevacizumaba (IC50 klsîlasla 31 kat ve 1,3 kat daha büyük potansiyele sahip
endotelyal hücre proliferasyonunu (ICso inhibe etmistir. Herhangi bir kurama bagIEl
kallErnaksElEl, transferrIn-tumstatinin tumstatine klýlasla 31 kat daha büyük etkililigi ve
bevacizumaba klýlasla 1.3 kat daha iyi aktivitesinin iki olasElnekanizmanI sonucu olduguna
inanHIJ'iaktadEl Ilk olarak, transferrinin tumstatinin ocVß3 Integrin reseptörüne baglanma
etkililigini gelistirdigine inanllüiaktadE In 517170 modelleme kullanilârak, mevcut bulus sahipleri,
transferrinin (xVß3 integrinle olan baglanma etkilesimlerine sahip oldugunu belirlemistir. AynEl
zamanda in SIVI/(0 modellemesi, füzyon proteininin tek bas. tumstatine klîlasla daha iyi etkilesim
protein transferrin-tumstatinin gelismis aktivitesinin ikinci olaslîmekanizmas- füzyon proteininin
içsellestirilmesi olduguna inanilBiaktadlEl Transferrin-tumstatinin koroid endotelyal hücreler
vaslîâslüa Içsellestirildigi gözlemlenmistir. Bu içsellestirme, tumstatin için belirin olmamßtlü
Transferrin-tumstatinin aynElzamanda yalnüa içsellestirmeden sonra aktif hale getirilen bir
yolak vaslliisüla hareket etmesi mümkündür. Endostatin ve anjiyostatin gibi diger endojenöz
antianjiyojenik proteinlerinin fibronektin ve vitronektin gibi RGD ihtiva eden proteinlerle birlikte
kompleksler olusturdugu gösterilmistir. Kompleks olusumu, bu anjiyojenik proteinlerin aktivitesi
için esansiyel olmakta ve bu proteinlerin fibronektin veya vitronektinden yoksun olan farelerde
aktif olmad[gEkesfediImistir. Fibronektin, önemli miktarda (rv3.Oug/105 hücre/gün) endotelyal
hücrelerde salgllânmakta ve içsellestirildikten sonra, hücrenin sitoplazmaslüda fibronektin gibi
RGD ihtiva eden proteinlerin birikmesi, apoptozu indüklemistir. DolaylEEIa, transferrIn-tumstatin
füzyonunun fibronektin gibi RGD içeren proteinlerin sitoplazmik içerigini arttlEinasÜ/e böylelikle
hücrelerin apoptozuna sebep olmasülnümkündür. Bu olasiIJEl tumstatin için belirgin olmamakta,
çünkü tumstatin, deneylerde herhangi bir içsellestirme belirtisi sergilememistir. Tumstatin için,
ocVß3 integrine baglanmas-basllîa eylem mekanizmasliölduguna inan llüiaktadlîl
Yeniden, herhangi bir kurama baglEl kaIlEmakslîlEl, transferrin-tumstatin rekombinant
proteininin tek baslEla tumstatinle benzer sekilde protein sentezini inhibe etmek ve apoptozu
indüklemek suretiyle hücre proliferasyonunu inhibe ettigine inanUE1aktadlEl Mevcut bulus
sahipleri, tek bas. tumstatine klýlasla rekombinant transferrin-tumstatin proteinine iliskin
daha büyük anti-apoptotik aktivite gözlemlemistir. Bevacizumab, koroid endotelyal hücrelerde
herhangi bir gözlemlenebilir aktivite uygulamamlgIEl Apoptotik aktivite eksikligi, daha önceden
korneal endotelyal hücreler, retinal ganglion hücreleri ve retina-RPE-koroid kültürlerde
bevacizumaba yönelik rapor edilmistir.
Deneyler, transferrin-tumstatin rekombinant proteininin tek baslEla tumstatine klîlasla koroid
endotelyal hücrelerde tüp olusumunu 25 kat daha fazla inhibe ettigini göstermistir.
Transferrin-tumstatin rekombinant proteininin içsellestirilmesinin diger aktif hale getirilmis
endotelyal hücrelere daha güçlü bir sekilde baglanabilen ve tüp olusumunu önleyebilen
fibronektin ve transferrin-tumstatin kompleksine yol açtglüa inanllü1aktadlü Bevacizumab,
koroid endotelyal hücrelerde tüp olusumunun fark edilebilir herhangi bir sekilde inhibe
edildigini sergilememistir. Genellikle, tüp olusumunun bazal membranda mevcut olan kollajen
bilesenler, endotelyal hücrelerin kararllDglEIZIyaplgnaleEh/e göçünü tesvik etme egiliminde
olmaktadE AynEzamanda VEGF gibi büyüme faktörleri, bazal membran matrisinde mevcut
olmaktadlEl Ancak, VEGF, tüp olusumunun hücre dlgünatrisindeki VEGF'yi nötr hale getirmek
suretiyle hareket ettigi bilinen bevacizumab. mevcudiyetinde bile yüksek verimlilikte meydana
gelmesinden dolaylitiüp olusumunda önemli bir rol oynar gibi görünmemektedir.
Anjiyojenez süsia, bazal membran. bozulmaslTiL'lan sonra, endotelyal hücrelerin, geçici
bazal membran benzeri matrise göçtügüne inanüßiaktadlEl VEGF'nin endotelyal hücrelerin
göçünde önemli bir rol oynadlgllîbilinmekte ve mevcut bulus sahipleri, Boyden odaslZhücre
göçü deneyi kullanilârak bu islemi incelemistir. Bu deneyin amaçlarlEllEl biri, ilaveten kan
damarlarlIlolusturan endotelyal hücreler vasltâsls-Lla bazal membranI istilaslIlüzerinde
VEGF'nin etkisinin degerlendirilmesi. 10 ng/ml VEGF'nin etkisi altIaki hücre göçü, tek bas-
tumstatinin kullanilE1asI klýbsla rekombinant protein transferrin-tumstatinin kullanllüiaslîl
durumunda çarplEElbir sekilde daha düsük olmustur. Tumstatinin odaksal adezyon kinaz (FAK)
fosforlanmas-inhibe ettigi gösterilmistir. FAK aktivasyonunun olmamasElhücre göçünün
inhibisyonuna yol açmaktadlEl Rekombinant protein transferrin-tumstatinin daha büyük bir
ölçüde olmas. ragmen benzer etkiler uygulad[g]Ela inanlanaktadlEl
Transferrinin tumstatine kaynastlEIIB1as- diger ana avantajÇlfüzyon proteininin ayrlElalElZlEI
bazolateral salgllâmaslm Rekombinant protein transferrin-tumstatinin yaklasllîl %75'i, tek
bas. tumstatinin yalnlîta ~%35'ine külasla hücrenin bazolateral taraf. dogru salgllânmlgtlîl
Bu, rekombinant protein transferrin-tumstatine intravitreal ilaç teslimatIDtakiben çogalan
koroid endotelyal hücrelerini hedef alma kabiliyetini saglamaktadlîl Terapötik maddelerin
intravitreal teslimatIan sonra, RPE hücreleri, bu hücrelerin silZIZbirlesme yeri yap-an
dolaylZlterapötik maddelerin daha fazla hareket etmemesi için bir bariyer olarak hareket
etmektedir. Transferrin-tumstatin, bazolateral olarak salgllâma yapan yaplglîlsayesinde
tumstatin veya bevacizumab üzerinde avantajlElolmaktadlB Intravitreal yolla uygulanan
transferrin-tumstatin, tumstatini koroid endotelyal hücrelere dogru ve hastalllZl bölgesinin
yak.. yerlestirmektedir.
In l//VO incelemeler, transferrin-tumstatinin koroid neovaskülarizasyonun inhibe edilmesindeki
üstün verimliligini isaret etmistir. Transferrin-tumstatinle tedavi edilen BN fare gözlerindeki
lezyon boyutu, bevacizumab veya tumstatin ile tedavi edilen farelere klýlasla çarplîlîlhir sekilde
daha düsük olmustur.
Bu sonuçlar, diger hususlar. yan-a (a) transferrin-tumstatinin bevacizumabdan daha iyi
hücre proliferasyonu inhibitörü olmasÇl(b) transferrin-tumstatinin bevacizumabda mevcut
olmayan bir sekilde koroid endotelyal hücrelerde hücre apoptozunu indüklemesi, (c)
transferrin-tumstatinin tüp olusumunu inhibe ederken bevacizumab. tüp olusumunun inhibe
edilmesinde etkisiz olmasElsayesinde transferrin-tumstatinin bevacizumabdan daha iyi bir
terapötik madde oldugunu isaret etmektedir. Tek bas. tumstatine klýlasla, transferrin-
tumstatin, neovaskülarizasyonu degerlendirmek için kullanilan in vitro deneylerin tamamIa 2
kat potansiyel uygulamaktadlEl Daha çarplEJEIanEise, transferrin-tumstatinin bevacizumab
ve tumstatine klýlasla lazerle indüklenmis CNV'nin indirgenmesinde in V/VO olarak daha etkili
olmasIE
TFTprote/n/h/'n Üretim/ ve saßastmasÜPlazmidleri olusturmak için kullanliân PSecTagZB
vektörü, besiyerinde salgllânan proteinin saflastlEllEnalela yardlchlan altEhistidin etiketine
sahiptir. ARPE hücreleri (geçit # 24), %80 hücre doluluk orani gelene kadar 12 kuyucuklu
plakada büyütülmüstür. Güçlendirilmis Tf-T (transferrin-tumstatin) plasmid (PSecTagZB
vektöründe klonlanmlg, DMEM/F12 besiyerinde seyreltilmis ve Iipofektamin reaktifiyle
karlStlEllBrlStlE Plazmid ve Iipofektamin kompleksi, hücreleri ve besiyerlerini ihtiva eden her
bir kuyucuga ilave edilmistir. Hücreler, 24 saat boyunca %5 COZ inkübatöründe 37°C'de
inkübe edilmistir. 24 saatin sonunda, besiyeri toplanmlglve safiastlElanlgtlE TALON® metal afinite
reçinesi, füzyon proteinini saflastlünak için kullanHBilSllEl Hücrelerden toplanan besiyeri, reçine
ile karlgtlEEhE ve hafif karlgtlBlârak oda lelaklgIa 20 dakika boyunca inkübe edilmistir.
Reçineye baglanmiglprotein, pH 7.0 degerinde 50 mM sodyum fosfat, 300 mM sodyum klorür
ve 150 mM imidazol sulu solüsyonu kullanilârak ayrlStElIh Etli] Daha sonra, imidazol, imidazol
olmaks- daha küçük bir tampona karsthliyaliz uygulanmasE(2000 MWCO diyaliz torbasEI
kullanilârak) vasißslýla protein solüsyonundan çilZhrilüilStlEl BCA® Protein Deney Kiti, protein
içerigini tahmin etmek için kullanilBilStiEl Üç ayrlîibarti, tarif edildigi gibi saflastlEllEiEve SDS
jel elektroforez (PAGE), floresans spektroskopi ve dairesel dikroizm kullanilarak çogalabilirlik
bakIilTitlan degerlendirilmistir.
Jel elektroforezi için, 5 ug protein, 4x yükleme boyaslgla karlgtlüli'ilgl ve 5 dakika boyunca
kaynatllBilstlB Numuneler, %
yerlestirilmistir. Uzak UV spektral bölgedeki (190-250 nm) dairesel dikroizm (CD), Tf-T ve
tumstatin ikincil yap-Dncelemek için kullanllüîlStlE CD spektrumlarÇlAVIV modeli 62 DS
spektropolarimetrede (AVIV Biomedical, Inc., NJ) elde edilmistir. Protein solüsyonu, 1 mm
yolak uzunluklu kuvars hücresine aktarlli1lg ve termostatik hücre tutucusuna yerlestirilmistir.
Veriler, 2 nrn bant genisligi kullanllârak 0.25 nm'lik arallKlarda toplanmlStlEl 100 nM'Iik
tumstatin ve Tf-T solüsyonu, 5 mM fosfat tamponunda (pH 7.4) hazlEllanmlStlEl Floresans
spektroskopi islemi, proteinin 280 nm'de uyarüBiasÜ/asßslîla gerçeklestirilmistir. Emisyon
spektrumu, 300-400 nm dalga boylarIan toplanmlStE Deney, Spectramax M5 mikro plaka
okuyucusunda (Molecular Devices, LLC) gerçeklestirilmistir.
Tumstat/'n ve Tf-7' grote/'ni'nin karakten'zaszonu.' Tf-T'nin karakterizasyonu, SDS jel
elektroforezi (PAGE), boyut dlglama kromatografisi (SEC), dairesel dikroizim ve dinamik [ilk]
saçllllîfilîlkullanllârak gerçeklestirilmistir. Jel elektroforezi için, 5 pg protein, 4x yükleme
boyaslýla karlgtlEllîhISlve 5 dakika boyunca kaynatllEilStlEl Numuneler, %4 ila %20 gradyan SDS-
PAGE jeline (Bio-Rad, Hercules, CA) yerlestirilmistir. SEC, Agilent SEÇ-3 kolonu (I.D. 7.8 mm
ve uzunluk 300 mm) kullanüârak gerçeklestirilmistir. Enjekte edilen numunelere iliskin aklghlîlîl
2 ml/dakika olmustur. Enjekte edilen numune hacmi, 25 pl olmustur. SEC için kullanllân mobil
faz, fosfat tampon salin (PBS) pH 7.4 olmustur.
Uzak UV spektral bölgedeki CD, Tf-T ve tumstatin ikincil yap-[ihcelemek için kullanllîhlgtlü
CD spektrumlarÇlAVIV modeli 62 DS spektropolarimetrede (AVIV Biomedical, Inc., NJ) elde
edilmistir. Protein solüsyonu, 1 mm yolak uzunluklu kuvars hücresine aktarlliilgve termostatik
hücre tutucusuna yerlestirilmistir. Veriler, 2 nm bant genisligi kullanilârak 0.25 nm'lik
aralllZIarda toplanmlgtlE Malvern Nanosizer, 1 mg/ml tumstatin ve Tf-T solüsyonunun partikül
boyutunu degerlendirmek için kullanllBHStlEl
Tumstat/'n ve Tf-T füzyon proteinin/77 sa/aßânmaSÜProtein salgllâma incelemesi için, RPE
hücre monokatmanÇlTf-T'nin salgllâma desenini degerlendirmek için seçilmistir. Ilk olarak
hücreler, elektriksel mukavemet, sllZElbirlesme yeri olusumu ve nükleer boyama deseni
bakIiIan karakterize edilmistir. RPE hücreleri, Transwell filtrelerine yerlestirilmis ve
transepitelyal elektriksel mukavemet (TEER), EVOM® mukavemet ölçer (World Precision
birlesme yeri olusumu da ZO-1 boyamasEiIe dogrulanmlstEl TEER >200 Q.cm2 degerine sahip
hücrelere sahip filtreler, %10 formalinin (0.5 ml apikal tarafta ve 1.5 ml bazolateral tarafta)
ilave edilmesi vaslüslýla oda letikIlglEda 30 dakika boyunca sabitlenmistir. Hücreler, ilaveten
oda lethlglEUa 1 saat boyunca %5 keçi serumu (0.5 ml apikal tarafta) içeren %01 triton X
100 ilave edilerek daha geçirgen hale getirilmistir. 1: 100 dilüsyonlar halinde seyreltilmis Birincil
ZOl antikoru (0.5 apikal tarafta), hücrelere ilave edilmis ve oda slîakllglEUa 1 saat boyunca
inkübe edilmistir. 1: 100 dilüsyonlar halinde seyreltilmis ikincil FITC ile etiketlenmis antikor
(0.5 apikal tarafta), hücrelere ilave edilmis ve oda lebkIIgIIa 1 saat boyunca inkübe
edilmistir. Hücreler, çekirdekleri boyamak amacMa 5 dakika boyunca 3 pg/ml DAPI (4',6-
diamidino-Z-fenilindol) ile inkübe edilmistir. Filtreler, keskin bir blgakla kesilmis ve Iamele
aktariiBiEve SuperMount yerlestirme besiyeri (BioGenex, CA) ilave edilerek sabitlenmis ve es
odaklünikroskop altia görüntülenmistir.
Salgllâma desenini degerlendirmek için, hücreler, apikal tarafta 200 ;19 tumstatin veya Tf-T
proteini ile inkübe edilmistir. 24 saatlik transfeksiyondan sonra, besiyeri, ayrEIayrDhem
bazolateral hem de apikal taraftan toplanmlgl ve TALON metal afinite reçinesi kullanilarak
saflastlîilîhlgtlîl Tumstatin ve Tf-T proteinleri, BCA® protein deney kiti kullaniiârak
ölçülmüstür.
Tf-T Qrotemm/n karar/MHf-T proteini, (a) pH 4.0 ve 8.0 tamponlarIa, (b) pH 7.0'da
tris(hidroksimetil)amin0metan (TRIS) ve fosfat sitrat tamponda, ve (c) pH 7.0'de 10 mM ile
250 mM araIIgIIaki iyonik güçlü sodyum kiorürde kararilüglüb iliskin olarak
degerlendirilmistir. Protein solüsyonlarü48 saat boyunca yukarlah bahsedilen kosullara maruz
büklßig ve dairesel dikroizim ve floresans spektroskopisi kullanilarak kararliülîl
degerlendirilmistir. SDS PAGE, pH kararliIigilEiEldegerlendirmek için dairesel dikroizm ve
floresans spekstroskopisine ek olarak kullanHIhlStlB
CN V /7e indük/enmis Kahverengi Lag"El Fareler/nde erken zaman nokta/EtkW/k ga/@a/arlg
Eriskin erkek kahverengi IagIi fareleri (150-1809), Harlan Sprague Dawley Inc. (Indianapolis,
karisimi. intraperitoneal yolla enjekte edilmesi vasitzisüla anestezi uygulanmlStE Lazer
yanlKlarII indüksiyonu, Örnek 1'de tarif edildigi gibi gerçeklestirilmistir. Lazer yanilZJariEIiEl
indüksiyonundan sonra 7 gün boyunca CNV IezyonlarII gelismesine izin verilmistir. 7 günün
sonunda slghnlara intravitreal yolla asagliibki tedavilerin biri uygulanmigtlîi (a) PBS pH 7.4,
(b) bevacizumab veya (c) Tf-T proteini. Tedaviden önceki ve sonraki CNV lezyonlarII
gelisimi, fiöresin anjiyografi kullanilârak izlenmistir. Floresin anjiyografiye iliskin olarak farelere
anestezi uygulanmlgl göz bebekleri %1 tropikamid solüsyonunun topikal yolla uygulanmaslîl
vasliîisüla genisletilmis ve 200 pl %1 sodyum fiöresin, kuyruk damarlarlZi/asißsiýia farelere
uygulanmlSIlEI Lezyonlardan olan s-Ühemen Genesis Df göz dibi kameraslîiKowa Optimed
Sonuçlar
TFTQrote/n/'n/n Üretimi ve saûastmasßl' ek bant 100 Kda Tf-T proteini, hazIEIlanan ve test
edilen üç Tf-T partisinde elde edilmistir. Tarif edilen yöntem vaslßslýla üretilen Tf-T, benzer
floresansa ve dairesel dikroizm spektrumlar- sahip olmustur.
Tumstatin ve TFTprote/'n/'nin karakteri'zasyonu.' SDS PAGE'de 100 kDa ve 28 kDa'daki tek bant
ve SEC'teki tek zirve alanlZITf-T ve tumstatin safllglElEgöstermistir. Tf-T'ye iliskin partikül
boyutu, ise 0.414 olmustur. Tumstatin partikül boyutu
3.9 nm ve PDI ise 0.359 olmustur. Tf-T dairesel dikroizm spektrumlar- CD taramaslÇlTf-T'nin
çogunlukla ß yapraklarlüla sahip oldugunu ve (NO/060) oi-sarmallarII mevcudiyetiyle (~%32)
birlikte döndügünü isaret etmistir. AynlZlzamanda Tumstatinin yapEZIda ß yapraklar!]
baklEJllEUan zengin olmakta ve dönmektedir (~%50). Ancak, tumstatin, daha az ci-
sarmallar. sahip olmakta (~%16) ve daha rastgele sarmal yaplýh sahip olmaktadE
(~%40). Dolaylglîla, dairesel dikroizm spektrumlarÇIher iki protein için farkllîcblmaktadlîl
Tf-T füzyon protein/77177 sa/aßnmasÜRPE hücreleri, 4 hafta boyunca Transwell filtresinde
büyütüldügünde leElbirlesme yerleri olusturmustur. SlEÜbirIesme yeri olusumu, aynlîamanda
ZO-1 proteininin boyanmasDvasHBislîLla da dogrulanmlgtlü RPE hücreleri, ZO-1 için açlK]
boyama deseni sergilemis ve monokatman içindeki RPE hücrelerinin tekdüze çokgensel
seklinin hatlarIIZI belirlemistir. Proteinlerin apikal maruziyetini takiben, RPE hücreleri,
bazolateral tarafa 126.8 tig/ml Tf-T proteini salgüâmlgtü Bunun aksine, bazolateral tarafa
dogru yalnlîta 12.3 ug/ml tumstatin salgüânmlgtlü
7'f-7' grote/h/'n/'n karar/@Tf-T'nin pH 7.0'da en kararIEbldugu kesfedilmistir. SDS PAGE,
kontrol Tf-T'ye klýlasla pH 4-6'da bant yogunlugunun azaldlgIEgöstermis ve bu da proteinin
bozulmasIIZIisaret etmistir. Ilaveten, floresans ve dairesel dikroizm, pH 7.0 dlglîida pH
degerlerinin tamamIa sinyalde bir azalmaylîlsaret etmistir. Proteinin pH 7.0'da en kararli]
oldugunun kesfedilmesi sayesinde, ilave kararIlIJIZJ incelemeleri (iyonik güç ve tampon), pH
7.0'da gerçeklestirilmistir.
Fosfat sitrat ve TRIS tamponda 10 mM ila 250 mM NaCI'ye maruz kalmlgTf-T'nin floresanslîl'e
dairesel dikroizm spektrumlarlîblde edilmistir. Tf-T, fosfat sitrat tamponunun mevcudiyetinde
hiçbir iyonik güç degisim etkisi sergilememistir. Tf-T sinyali, NaCl 250 nM ve TRIS tamponunun
mevcudiyetinde indirgenmistir. Dolaylglýla, fosfat sitrat tamponu, protein için daha uygundur.
CNl/ ile /hdL'ik/enmis Kah vere/?af Lagß) Fareler/'nde erken zaman nokta/EtkIYI//k ca/Zgna/arl.?
Tedavinin daha erken bir zaman noktasIa (CNV indüksiyonundan 7 gün sonra) baslatUBiasEl
durumunda, Tf-T ile tedavi edilen fareler, bevacizumab ile tedavi edilmis farelere klýasla daha
küçük lezyon boyutuna sahip olmustur. Bu, Tf-T'nin koroid neovaskülarizasyona iliskin bir
önleyici tedavi olarak etkili oldugunu isaret etmektedir.
SEKANS LISTESI
<110> Kompella, Uday B Scheinman, Robert I Tyagi, Puneet olan bir kurum
olan Kolorado Üniversitesi Mütevelli Heyeti
<120> TRANSFERRIN-TÜMSTATIN FÜZYON PROTEINI VE BU PROTEININ ÜRETILMESINE
VE KULLANILMASINA YÖNELIK YÖNTEMLER
<130> CU-006910PC
<160> 22
<170> Patentln versiyon 3.5
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> Yapay Sekans
<220>
<223> Transferrin fragmenti
<400>
Met Arg Leu Ala Val Gly Ala Leu Leu
<210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>
Yapay Sekans
Transferrin Fragmenti
Met Arg Leu Ala Val Gly Ala Leu Leu Val Cys
<210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>
Yapay Sekans
Transferrin Fragmenti
Leu Leu Val Cys Ala Val Leu Gly Leu Cys Leu
<210> 4
<2ll> 13
<212> PRT
<213> Yapay Sekans
<220>
<223> Transferrin Fragmenti
<400> 4
Gly Ala Leu Leu Val Cys Ala Val Leu Gly Leu Cys Leu
<210> 5
<2ll> 13
<212> PRT
<2l3> Yapay Sekans
<220>
<223> Transferrin Fragmenti
<400> 5
Leu Leu Val Cys Ala Val Leu Gly Leu Cys Leu Ala Val
<210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>
Gly Ala Leu Leu Val Cys Ala Val Leu Gly Leu Cys Leu Ala Val
<210>
<2ll>
<212>
<2l3>
<220>
<223>
<400>
Met Arg Leu Ala Val Gly Ala Leu Leu Val Cys Leu Leu Val Cys Ala
Yapay Sekans
Transferrin Fragmenti
Yapay Sekans
Transferrin Fragmenti
Val Leu Gly Leu Cys Leu Ala Val
<210> 8
<2ll> 16
<212> PRT
<213> Yapay Sekans
<220>
<223> Transferrin Fragmenti
<400> 8
Gly Phe Gln Asn Leu Asn Ile Gly Cys Leu Lys Glu Lys Ala Val Ala
<210> 9
<2ll> 27
<212> PRT
<2l3> Yapay Sekans
<220>
<223> Transferrin Bölümü
<400> 9
Leu Leu Cys Thr Arg Asp Glu Ile Leu Thr Glu Lys Leu Glu Trp Cys
1 5 10 15
<210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>
Yapay Sekans
Transferrin Bölümü
Pro Arg Lys Pro Leu Glu Lys Ala Val
<210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>
Yapay Sekans
Tumstatin Bölümü
<210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>
Yapay Sekans
Yapay Peptit
<210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>
Yapay Sekans
Yapay Peptit
Phe Cys Asn Val Asn His Val Cys Asn Phe Ala
Thr Met Pro Phe Leu Phe Cys Asn Val Asn Asp Val Cys Asn Phe Arg
Ser Arg Asn Asp Tyr Ser Tyr Trp Leu
<210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>
Yapay Sekans
Yapay Peptit
<210>
<211>
<212>
Phe Cys Asn Val Asn Asp Val Cys Asn Phe Ala
<213>
<220>
<223>
<400>
Cys Asn Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Ser Phe Trp Leu Arg Ser Leu Asn
Yapay Sekans
Yapay Peptit
<210>
(211›
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>
Cys Asn Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Ser Phe Trp Leu Ala Ser Arg Asn
Yapay Sekans
Yapay Peptit
<210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>
Yapay Sekans
Yapay Oligonükleotit
<210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>
Yapay Sekans
Yapay Oligonükleotit
<210>
<211>
<212>
<213>
Yapay Sekans
<220>
<223>
<400>
Yapay Oligonükleotit
<210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>
Yapay Sekans
Yapay Oligonükleotit
<210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>
Yapay Sekans
Yapay Oligonükleotit
<210>
<2ll>
<212>
<213>
<220>
<223>
<400>
Claims (12)
- . Tumstatine baglEliransferrin içeren bir rekombinant protein.
- Transferrin ve tumstatinin dogrudan birbirine baglandlglîistem 1'e göre rekombinant protein.
- . Transferrin ve tumstatinin bir baglayEEl/asltâsüla birbirine es degerli bir sekilde baglandlgllîl istem 1'e göre rekombinant protein.
- . Istem 1'e göre tumstatine baglEtransferrini içeren bir rekombinant proteini kodlayan bir nükleik asit sekansIEiçeren bir plazmid.
- . Rekombinant proteini kodlayan nükleik asit sekansII faal olarak ekspresyon kontrol sekans. baglandlglliilstem 4'e göre plazmid.
- . Istem 1'e göre tumstatine bagllîtransferrini içeren bir rekombinant proteini kodlayan bir nükleik asit sekanlelIiçeren bir rekombinant nükleik asit molekülü.
- . Nükleik asit sekansII faal olarak ekspresyon kontrol sekans. baglandlglüstem 6'ya göre rekombinant nükleik asit molekülü.
- . Istem 6'ya göre tumstatinle baglEllransferrini içeren bir rekombinant proteini kodlayan bir nükleik asit sekansIEiçeren rekombinant nükleik asit molekülüyle transfekte olan ve bu molekülü eksprese eden bir rekombinant konakçEEiücresi.
- . Istem 1'e göre tumstatinle bagIEltransferrini içeren bir rekombinant proteinin üretilmesine yönelik bir yöntem olup, söz konusu yöntem, asaglki adilarüçermektedir: rekombinant konakçEhücrenin Istem 6'ya göre tumstatine baglEtransferrin içeren bir rekombinant proteini kodlayan bir nükleik asidi içeren rekombinant nükleik asit molekülüyle transfekte edilmesi; transfekte edilmis konakçEhücrenin, tumstatine baglEtransferrin içeren rekombinant protein üretmek Için yeterli olan kosullar altIa kültürlenmesi; ve rekombinant proteinin büyük ölçüde saflastlülîhlgrekombinant protein seklinde geri kazanllE'iasIZl
- 10. Rekombinant proteinin istem Z'ye göre dogrudan tumstatine baglanan transferrini içerdigi istem 9'a göre yöntem.
- 11.K0roid neovaskülarizasyonla (CNV) iliskilendirilmis bir klinik durumun tedavisinde kullanilâcak istem 1'e göre tumstatine baglanan transferrini içeren bir rekombinant protein.
- 12.CNV ile iliskilendirilmis klinik durumun, psödoksantoma elastikum, anjiyoid çizgileri, histoplazmoz, punktat iç koroidopati ve yas yasa baglünakula dejenerasyonunu içerdigi istem 11'de tanIiIandEggibi kullanIi için istem 1'e göre rekombinant protein.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201161524508P | 2011-08-17 | 2011-08-17 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TR201802686T4 true TR201802686T4 (tr) | 2018-03-21 |
Family
ID=47715692
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TR2018/02686T TR201802686T4 (tr) | 2011-08-17 | 2012-08-15 | Transferrin-tumstatin füzyon proteini ve bu proteinin üretilmesine ve kullanılmasına yönelik yöntemler. |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9290562B2 (tr) |
| EP (1) | EP2744831B1 (tr) |
| JP (1) | JP6073888B2 (tr) |
| CN (2) | CN103998470A (tr) |
| AU (1) | AU2012296588B2 (tr) |
| BR (1) | BR112014008680A2 (tr) |
| CA (1) | CA2849015C (tr) |
| DK (1) | DK2744831T3 (tr) |
| ES (1) | ES2659161T3 (tr) |
| NO (1) | NO2820418T3 (tr) |
| PL (1) | PL2744831T3 (tr) |
| PT (1) | PT2744831T (tr) |
| SI (1) | SI2744831T1 (tr) |
| TR (1) | TR201802686T4 (tr) |
| WO (1) | WO2013025846A2 (tr) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016520053A (ja) * | 2013-05-06 | 2016-07-11 | 中国▲薬▼科大学Ｃｈｉｎａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ | 腫瘍微小環境における血管再生の抑制及び適応免疫応答の活性化を有する二機能の融合タンパク質及びその遺伝子並びに使用 |
| JP2016522249A (ja) * | 2013-06-20 | 2016-07-28 | ノバルティス アーゲー | 脈絡膜血管新生の治療におけるｖｅｇｆアンタゴニストの使用 |
| US11058750B2 (en) | 2015-12-03 | 2021-07-13 | Mor Research Applications Ltd. | Compositions and methods for treatment of ocular diseases |
| KR101818151B1 (ko) | 2016-03-25 | 2018-01-16 | 한국과학기술원 | 트렌스페린을 포함하는 허혈성망막병증 예방 및 치료용 조성물 |
| CN109053899B (zh) * | 2017-12-22 | 2021-11-16 | 湖南远泰生物技术有限公司 | 一种含人转铁蛋白抗原表位序列的嵌合体抗原受体 |
Family Cites Families (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5672683A (en) | 1989-09-07 | 1997-09-30 | Alkermes, Inc. | Transferrin neuropharmaceutical agent fusion protein |
| US20050192242A1 (en) | 1995-10-11 | 2005-09-01 | Neal Zane C. | Therapeutic fusion protein transgenes |
| KR100682666B1 (ko) * | 1998-06-17 | 2007-02-15 | 베쓰 이스라엘 디코니스 메디칼 센터 인크 | 항혈관형성 단백질 및 이들을 사용하는 방법 |
| AU3075801A (en) | 1999-12-23 | 2001-07-03 | Human Genome Sciences, Inc. | Transferrin polynucleotides, polypeptides, and antibodies |
| AU2002323501C1 (en) | 2001-08-30 | 2010-04-29 | Biorexis Technology, Inc | Modified transferrin fusion proteins |
| US8129504B2 (en) * | 2001-08-30 | 2012-03-06 | Biorexis Technology, Inc. | Oral delivery of modified transferrin fusion proteins |
| DK1463751T3 (da) | 2001-12-21 | 2013-08-26 | Human Genome Sciences Inc | Albuminfusionsproteiner. |
| WO2003066085A1 (en) * | 2002-02-07 | 2003-08-14 | Delta Biotechnology Limited | Albumin-fused anti-angiogenesis peptides |
| WO2005034877A2 (en) | 2003-10-10 | 2005-04-21 | University Of Southern California | G-csf transferrin fusion proteins |
| EP1722762A2 (en) * | 2004-03-02 | 2006-11-22 | Massachusetts Institute of Technology | Nanocell drug delivery system |
| CA2583399A1 (en) * | 2004-10-14 | 2006-04-27 | Sopherion Therapeutics, Inc. | Anti-angiogenic peptides and methods of use thereof |
| WO2006049983A2 (en) | 2004-10-27 | 2006-05-11 | Biorexis Pharmaceutical Corporation | Peptide yy modified transferrin fusion proteins |
| US20070025957A1 (en) * | 2005-04-29 | 2007-02-01 | Rosenblum Michael G | Vascular targeting of ocular neovascularization |
| AU2007211846B2 (en) | 2006-02-03 | 2013-05-23 | The University Of Sydney | A method of modulating cellular activity and agents for use therein |
| CN101070349B (zh) * | 2007-05-22 | 2010-10-13 | 山西康宝生物制品股份有限公司 | 具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的融合蛋白与应用 |
| CN101092452A (zh) * | 2007-05-23 | 2007-12-26 | 哈尔滨医科大学 | 肿瘤抑素抗血管生成小分子多肽、融合蛋白及两者制备方法 |
| WO2009086132A2 (en) * | 2007-12-20 | 2009-07-09 | University Of Southern California | Design of spacers to increase the expression of recombinant fusion proteins |
| AU2012222833B2 (en) | 2011-03-03 | 2017-03-16 | Zymeworks Inc. | Multivalent heteromultimer scaffold design and constructs |
-
2012
- 2012-08-15 DK DK12824616.2T patent/DK2744831T3/en active
- 2012-08-15 CN CN201280051256.4A patent/CN103998470A/zh active Pending
- 2012-08-15 US US14/239,176 patent/US9290562B2/en active Active
- 2012-08-15 PL PL12824616T patent/PL2744831T3/pl unknown
- 2012-08-15 CN CN201910156923.9A patent/CN110105453A/zh active Pending
- 2012-08-15 PT PT128246162T patent/PT2744831T/pt unknown
- 2012-08-15 CA CA2849015A patent/CA2849015C/en active Active
- 2012-08-15 AU AU2012296588A patent/AU2012296588B2/en active Active
- 2012-08-15 BR BR112014008680A patent/BR112014008680A2/pt unknown
- 2012-08-15 WO PCT/US2012/051013 patent/WO2013025846A2/en active Application Filing
- 2012-08-15 JP JP2014526189A patent/JP6073888B2/ja active Active
- 2012-08-15 ES ES12824616.2T patent/ES2659161T3/es active Active
- 2012-08-15 SI SI201231232T patent/SI2744831T1/en unknown
- 2012-08-15 TR TR2018/02686T patent/TR201802686T4/tr unknown
- 2012-08-15 EP EP12824616.2A patent/EP2744831B1/en active Active
-
2013
- 2013-07-22 NO NO13745268A patent/NO2820418T3/no unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2012296588A1 (en) | 2014-04-03 |
| EP2744831B1 (en) | 2017-12-06 |
| WO2013025846A3 (en) | 2013-05-02 |
| CN110105453A (zh) | 2019-08-09 |
| CA2849015C (en) | 2017-08-08 |
| WO2013025846A2 (en) | 2013-02-21 |
| US9290562B2 (en) | 2016-03-22 |
| NO2820418T3 (tr) | 2018-05-05 |
| JP6073888B2 (ja) | 2017-02-01 |
| AU2012296588B2 (en) | 2017-07-27 |
| JP2014526890A (ja) | 2014-10-09 |
| EP2744831A2 (en) | 2014-06-25 |
| EP2744831A4 (en) | 2015-03-11 |
| DK2744831T3 (en) | 2018-03-05 |
| ES2659161T3 (es) | 2018-03-14 |
| PT2744831T (pt) | 2018-03-05 |
| PL2744831T3 (pl) | 2018-05-30 |
| SI2744831T1 (en) | 2018-04-30 |
| CN103998470A (zh) | 2014-08-20 |
| US20140179612A1 (en) | 2014-06-26 |
| CA2849015A1 (en) | 2013-02-21 |
| BR112014008680A2 (pt) | 2017-06-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6272853B2 (ja) | 細胞透過性ペプチド、それを含んだコンジュゲート、及びそれを含んだ組成物 | |
| CN103781798B (zh) | 内皮糖蛋白多肽及其用途 | |
| Wang et al. | A thermo-responsive protein treatment for dry eyes | |
| CN107207577B (zh) | 用于治疗和预防炎症的组合物和方法 | |
| Sidman et al. | The peptidomimetic Vasotide targets two retinal VEGF receptors and reduces pathological angiogenesis in murine and nonhuman primate models of retinal disease | |
| US9969774B2 (en) | Cell penetrating peptide and method for delivering biologically active substance using same | |
| KR101258279B1 (ko) | 세포 투과능을 개선한 개량형 신규 거대 분자 전달 도메인 개발 및 이의 이용방법 | |
| CN102369220A (zh) | 用于不渗透化合物策略的靶向激活的细胞/组织转位肽及其应用 | |
| TR201802686T4 (tr) | Transferrin-tumstatin füzyon proteini ve bu proteinin üretilmesine ve kullanılmasına yönelik yöntemler. | |
| KR20230074076A (ko) | 개질된 미토콘드리아 및 이의 용도 | |
| ES2621337T3 (es) | Desarrollo de nuevo dominio de transducción macromolecular con mejor permeabilidad celular y método de uso del mismo | |
| JP2020122025A (ja) | 血液脳関門を通過して輸送するための組成物及び方法 | |
| JP2019196364A (ja) | 線維性疾患を処置するためのエンドグリンポリペプチド | |
| Ueyama et al. | Semaphorin 3A lytic hybrid peptide binding to neuropilin-1 as a novel anti-cancer agent in pancreatic cancer | |
| Yue et al. | Oocyte-specific H2A variant H2af1o is required for cell synchrony before midblastula transition in early zebrafish embryos | |
| JP2024056702A (ja) | 遺伝子操作した成長因子変異体 | |
| JP2003518929A (ja) | 基底側部選別シグナル、およびその阻害物質 | |
| Talreja et al. | G-quartet oligonucleotide mediated delivery of functional X-linked inhibitor of apoptosis protein into retinal cells following intravitreal injection | |
| US20230128981A1 (en) | Cd24-loaded vesicles for treatment of cytokine storm and other conditions | |
| Kumar-Singh et al. | Platform for Rapid Delivery of Biologics and Drugs to Ocular Cells and Tissues Following Combat Associated Trauma | |
| CN117510642A (zh) | 一种全基因编码的双靶向嵌合体及其应用 | |
| Cirillo | Short cationic peptides for gene delivery into cancer cells | |
| WO2015110701A1 (en) | Therapeutic use of vegfr-3 ligands |