TR201507566A2 - Jak2 v617f mutasyonunun altin nanoparti̇kül ajani kullanilarak tespi̇t yöntemi̇ - Google Patents

Abstract

Mevcut buluş miyeloproliferatif hastalıkların ortaya çıkmasında rol oynayan JAK2V617F mutasyonunun tespitinde kullanılan bir yönteme ilişkindir. Söz konusu yöntem dâhilinde çeşitli polinükleotitler ile yüzey fonksiyonelliği sağlanmış altın nanopartiküllerin kullanılması söz konusudur. Mevcut buluşa ait yöntem; JAK2V617F mutasyonunu içeren bölgede bir nükleotit sekansına spesifik bir dizi polinükleotidle yüzey fonksiyonelliği sağlanmış altın nanopartiküllerin sunulması; burada söz konusu polinükletitler bir ucundan nanopartikül yüzeyine bağlıdır ve bunlara tamamlayıcı olan ve bir floroforla işaretlenmiş olan bir dizi kısa polinükleotidi ihtiva eder; söz konusu nanopartiküllerin bahsi geçen hücrelerin inkübasyon ortamına dahil edilmesi, ve floresans ölçümü ile JAK2V617F mutasyonunu taşıyan hücrelerin tespit edilmesi adımlarını ihtiva etmektedir.

Description

Teknik Alan Mevcut bulus miyeloproliferatif hastaliklarin ortaya çikmasinda rol oynayan IAKZVÖÜF mutasyonunun tespitinde kullanilan bir yönteme iliskindir. Söz konusu yöntem dâhilinde çesitli polinükleotitler ile yüzey fonksiyonelligi saglanmis altin nanopartiküllerin kullanilmasi söz konusudur. Bahsedilen polinükleotidler bir ucundan nanopartikül yüzeyine baglidir. Diger yandan söz konusu nükleotidler bunlara tamamlayici ve bir floroforla isaretlenmis olan bir dizi kisa polinükleotidi ihtiva edebilir. Bulus konusu yöntemde kullanilan altin nanopartiküller bir çift Zincirli nükleotidin çoklu kopyalarinin altin nanopartiküle konjuge edilmesi ve bunlarin her birinde bir zincirin florofor tasimasi ile karakterizedir. Zincirin tasidigi florofor altin nanopartiküle olan yakinligi vasitasiyla pasif durumdadir ve bagli oldugu zincirden ayrilmadikça aktive olmaz.

Bulusun Arka Plani Miyeloproliferatif hastaliklar birincil olarak multi-potent hematopoietik kök hücre seviyesinde görülen ve bir ya da daha fazla kan hücre tipinin üretiminin artmasina sebep olan bir grup hematolojik durumdur. Bu grupta yer alan üç ana hastalik polycythaemia vera (FV), essential thrombocythaemia (ET) ve idiopathic myelofibrosis (IMF]'dir. Bu hastaliklarin görüldügü hastalardaki JAKZ geniyle ilgili moleküler bulgularin ortak oldugu görülmektedir. IAKZ, 4 Ianus kinazin (Ianus Kinaz 1, 2 ve 3 ve tirozin kinaz) olusturdugu bir ailenin üyesidir. Ianus kinazlar transkripsiyon sinyal ileticilerini aktive ederek gen transkripsiyonunu etkilemektedirler. Transkripsiyon sinyal ileticileri ve aktive edicileri ailesi (STAT/signal transducer and activator of transcription) çesitli sitokinlere, hormonlara ve büyüme faktörlerine cevap veren yedi transkripsiyon faktöründen olusmaktadir. Aktive olmus STAT dimerize olur ve yer degistirip çekirdekte hedef gen transkripsiyonunu yükseltir. STAT genel olarak Ianus kinazlar araciligiyla gerçeklesen tirozin fosforilasyonu ile aktive edilir. Yukarida bahsedilen 4 kinaz [JAK-l, IAK-Z, IAK-3 ve tirozin kinaz 2), tip 1 veya tip 2 sitokin reseptörleri (eritropoietin reseptörü, trombopoietin reseptörü ya da MPL] kendi ligandlarina [eritropoietin, trombopoietin) baglandiginda moleküller arasinda ve molekülerin kendi içinde gerçeklesen tirozin fosforilasyonu sonucunda aktive olurlar. JAK araciliginda gerçeklesen reseptör fosforilasyonu STAT'in toplanmasi ve aktivasyonu için bir baglanma bölgesi yaratir. IAK3 lenfoidte, IAKZ (V617F) ise miyeloid hücre proliferasyonu ve farklilasmasinda önemlidir. Çalismalar IAKZ katalitik aktivasyonunu ve sitokinden bagimsiz sinyal iletimini arttiran yogunlasmistir. JAKZ mutasyonu polycythemia vera (FV) hastalarinin büyük çogunlugunda, essential thrombocythemia (ET) ve primary myelofibrosis (PMF) hastalarinin yarisinda mevcuttur ve IAK2 mutasyonunun heterozigot veya homozigot olmasina bagli olarak hastaligin fenotipinde belirleyici rol oynamaktadir (Baxter, E.]., et al., Acquired mutati'on of the tyrosine kinase jAKZ in human myeloproliferative disorders.

Bu belgelerin tüm içerigi referans olarak mevcut tarifnameye dahil edilmistir.

JAKZVG”F mutasyonunu belirlemek için günümüzde kullanilan yöntemler ekspresyon analiz tekniklerinin hücre fonksiyonu çalismalarina entegre edilmesinde pek çok açidan yetersiz kalmaktadir. Örnegin IAK V617F mutasyonunun tespiti için yapilan bir çalisma tüm kandan ya da kemik iligi örneklerinden DNA ekstraksiyonu yapilmasina dayanmaktadir. Bu çalismada kullanilan yöntemlerden ilki izole edilen DNA'nin alel- spesifik polimeraz zincir reaksiyonu ile maksimum verimi saglayacak sekilde (% 0.01- 0.1] tasarlanmis ve bir floroforla isaretlenmis primer yardimiyla çogaltilmasini içermektedir. Üretilen PCR ürünü daha sonra kapiler elektroforez ve otomatize genetik analizleyici ile analiz edilir. Çalismada kullanilan ikinci yöntem ise kolay ve pahali olmayan, ortalama bir hassasiyete sahip (% 1-10) belirlenmesi istenen mutasyonu içeren kisa bir genomik DNA parçasinin gerçek zamanli bir PCR makinasinda çogaltilmasina dayanmaktadir. Iki floresan prob PCR reaksiyonu tamamlandiktan sonra kullanilmak üzere reaksiyon ortaminda bulunurlar ve bu problarin varliginda gerçeklestirilen reaksiyonun erime egrisi analizi üzerinden degerlendirme yapilir. Mutasyonun oldugu bölgeye baglanan prob 55°C gibi düsük bir sicaklikta ayrilirken yabani tip alele baglanan prob daha yüksek bir sicaklikta, örnegin 65°C'de ayrilarak mutasyona sahip DNA ile yabani DNA arasindaki farkin ortaya çikmasini saglar. Bu tip bir çalisma DNA üzerinden gerçeklestigi için RNA yani transkript hakkinda bilgi saglamamaktadir. Dolayisiyla ekspresyon miktari hakkinda bilgi edinmek istenildigi takdirde hücrenin lize edilmesi ve RNA izolasyonun gerçeklestirilmesini takiben ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonunun (reverse-transcriptase polymerase chain reaction-RT PCR) gerçeklestirilmesi gerekmektedir (McClure, R. Mai, M., Lasho, T., published online 3 November 2005, Validation of two clinically useful assays for evaluation of [AKZ V617F JAK2V<517F mutasyonunun tespiti amaciyla gerçeklestirilen diger bir çalismada farkli moleküler tani yöntemleri denenerek elde edilen sonuçlar karsilastirilmistir. Buna göre kalitatif olarak alel spesifik PCR yöntemiyle belirli DNA örnegi çogaltilmis ve agaroz jelde yürütülerek mutasyon varligi analiz edilmistir. PCR ürünlerinin miktarinin belirlenmesi için gerçek zamanli PCR gerçeklestirilerek arastirmacilar tarafindan tasarlanmis ve bir floresan boya ile isaretlenmis primerler üretilmistir. Son olarak da kantitatif bir yöntem olan ticari bir kit kullanilmistir. Yapilan arastirmanin sonucunda farkli moleküler teshis yöntemleriyle farkli sonuçlar elde edildigi anlasilmistir. Bu yüzden özellikle hastaligin teshisi ve tedavisi sirasinda uygulanan yöntemin ve elde edilen sonuçlarin hassasiyeti büyük önem tasimaktadir (Veneri, D., Capuzzo E., Matteis, G., Franchini, M., Baritono E., Benati,M., Soler0,G.P.,Ambrosetti,A., Quaresmini, G., Pizzolo, G., Comparison of jAKZ V617F mutatiori assessment employing dijýferentmolecular diagnostic techniques, Blood Transfus 2009; 7: 204-9).

Karsilasilan en büyük problem IAKZVGÜF mutasyonunun belirlenmesinde ve yapilacak ekspresyon çalismalarinda kullanilacak gerekli RNA eldesi için hücrenin tümünün lize edilmesi ve hücrenin canliliginin kaybedilmesidir. Çalismalardaki diger bir problem de tetkikin tek bir hücre üzerinde gerçeklestirilememesinden dolayi havuzlanmis hücre üzerinde çalisilmasi gerekliligidir. Dolayisiyla elde edilen ekspresyon sonucu hücrelerin genel ekspresyonu hakkinda fikir verip tek bir hücrenin homozigot alleli ya da yaban tip alleli tasiyip tasimadigi hakkinda kesin sonuç vermemektedir. Bu ayrimi yapabilmek adina hücre koloni deneyleri yapilmaktadir ancak hücre koloni deneyleri de sadece kan kök hücre ve progenitörler hakkinda bilgi vermekte koloni olusturma özelligini kaybetmis, farklilasmis matür hücreler üzerinde çalisma yapilmasina olanak saglamamaktadir.

Hastada mutasyonun tespit edilebilmesi için mutasyon varligi, mutasyon ekspresyon yogunlugu, hücre fenotiplemesi ve genotiplemesi için kullanilan yöntemlerde hücreler ya canli olarak izole edilir ve fonksiyonel testler gerçeklestirilir ya da tüm hücreler lize edilerek DNA-RNA izolasyonu yapilir. Ancak saflastirma çalismalari da dâhil olmak üzere yapilacak her islemde materyal eldeleri az oldugu için hücre elde edilmesi 3-4 kez tekrarlanir ve her defasinda elde edilen materyal bir amaç için kullanilir. Elde edilen sonuçlar her bir testten elde edilen sonuçlarin birlestirilmesiyle olusturulur. Bu durum da az sayida hücre üzerinde yapilan bu çalismalarin dogrulugunu tehlikeye atmakta, birbirleri arasindaki fark dolayisiyla hata payinin artmasina ve test sonuçlari arasinda tezatliklar dogmasina sebep olmaktadir.

Teknigin bilinen durumunda tüm bu problemler göz önüne alindiginda hem canli hücrelerin öldürülmeden canliliginin korunmasi, fonksiyonel analizlerin canli hücreler üzerinde uygulanmasi hem de mutasyonun ekspresyon sonucu hücre içerisinde canli olarak görüntülenmesini saglayan bir sisteme ihtiyaç duyulmaktadir. Söz konusu sistem mutasyonunun ekspresyonunun uygulanan kondisyona, tedaviye ve farklilasma derecesine göre degisimini takip edebilmek adina teknikte önemli gelisme saglayacaktir.

Ayrica su anki teknikte kullanilan mutasyon tespit yöntemleri zaman gerektirdiginden masraflidir ve hastaligin tespiti ve seyri açisindan gerekli bu testin maliyetini arttirmaktadir.

Sekillerin Açiklamasi Sekil - 1, Hücrelerin akim sitometrisi cihazinda okutuldugunda floresans özelliklerine göre hangi gruplara ayrilabileceginin görüntüsüdür.

Sekil - 2, Hücrelerin sirasiyla düz tabanli, U tabanli ve V tabanli kültür kaplarinda inkübe edildiklerinde akim sitometrisi cihazi ile yapilan analizde gösterdikleri dagilimin görüntüsüdür.

Sekil - 3A, Santrifüjün uygulanmadigi hücrelerde ß aktin human Cy3 probu ile boyamaya ait analiz sonucunun bir görüntüsüdür.

Sekil - 3B, Santrifüjün uygulandigi hücrelerde ß aktin human Cy3 probu ile boyamaya ait analiz sonucunun bir görüntüsüdür.

Sekil - 4A, Kuyu basina 30 000 hücre/200 ul konsantrasyonla eklenen hücrelerde ß aktin human Cy5 probu ile boyamaya ait analiz sonucunun bir görüntüsüdür.

Sekil - 4B, Kuyu basina 30 000 hücre/100 pl konsantrasyonla eklenen hücrelerde ß aktin human Cy5 probu ile boyamaya ait analiz sonucunun bir görüntüsüdür. human Cy3 probu ile boyamaya ait analiz sonucunun bir görüntüsüdür Sekil- 4D, Kuyu basina 30 000 hücre/ 100 ul konsantrasyonla eklenen hücrelerde ß aktin human Cy3 probu ile boyamaya ait analiz sonucunun bir görüntüsüdür Sekil - 5A, JAK2V617F-Mutant-Cy3 prob ile tekli boyamaya ait analiz sonucunun bir görüntüsüdür.

Sekil - SB, IAK2V617F-yabani tip-CyS prob ile tekli boyamaya ait analiz sonucunun temsili bir görüntüsüdür. boyamaya ait analiz sonucunun temsili bir görüntüsüdür.

Bulusun Detayli Açiklamasi Mevcut bulus yukarida bahsedilen ve teknigin bilinen durumunda görülen problemlerin asilmasi amaciyla JAKZVÖWF mutasyonunun tespiti ve hücre içi uygulamalar ile ekspresyonunun tespitini saglayan bir yönteme iliskin olup söz konusu yöntem asagidaki adimlari içermesi ile karakterizedir; - JAKZVÖÜF mutasyonunu içeren bölgede bir nükleotit sekansina spesifik bir dizi polinükleotidle yüzey fonksiyonelligi saglanmis altin nanopartiküllerin sunulmasi; burada söz konusu polinükletitler bir ucundan nanopartikül yüzeyine baglidir ve bunlara tamamlayici olan ve bir floroforla isaretlenmis olan bir dizi kisa polinükleotidi ihtiva eder, - söz konusu nanopartiküllerin bahsi geçen hücrelerin inkübasyon ortamina dahil edilmesi, ve - floresans ölçümü ile IAKZVÖÜF mutasyonunu tasiyan hücrelerin tespit edilmesi Söz konusu nanopartiküllerin unsurlarindan biri nanopartiküle konjuge edilmis ve hedef zincire spesifik nükleotitler içermesidir. Nanopartikülün çapi 1 ila 250 nm arasinda degisebilir.

Nanopartiküle konjuge edilmis bu sabit zincirlerin uzunluklari 2 ila 100 nükleotit arasinda degisebilir. Bir diger yapilanmada söz konusu zincirler tercihen en fazla 20 nükleotit uzunlugunda oligonükleotitler olabilirler. Nanopartiküle sabit bu polinükleotitler hedef polinükleotide % 100 ila % 20 arasinda degisen oranlarda tamamlayici olabilir.

Bahsedilen nanopartikül, nanopartiküllere konjuge edilmis nükleotitlerin yani sira bunlari tamamlayici ve floroforla isaretlenmis kisa nükleotitler de ihtiva eder. Floroforla isaretlenmis bu kisa nükleotitlerin uzunlugu 2 ila 50 nükleotit arasinda degisebilir. Bir diger yapilanmada söz konusu zincirler tercihen en fazla 10 nükleotit uzunlugunda oligonükleotitler olabilirler. Nanopartiküle sabit polinükleotitlere tamamlayici kisa polinükleotitler bahsedilen sabitlenmis polinükleotitlere % 100 ila % 20 arasinda degisen oranlarda tamamlayici olabilir.

Hücre içinde JAK2V617F mutasyonunun tespit edilebilmesi için söz konusu nanopartiküller hücrelerin inkübasyon ortamina dâhil edilirler. Bu mutasyonun tespit edilebilmesi için altin nanopartiküle yüzey fonksiyonelligi saglayan dolayisiyla nanopartiküle sabitlenmis polinükleotit zincirinin JAK2V617F mutasyonunu içeren bölgede mutant bir nükleotit sekansini tamamlayici bir sekansa sahip olmasi gerekmektedir. Bulus konusu yöntemde kullanilan nanopartiküler, nanopartiküle sabitlenmis, JAK2V617F mutasyonunu içeren bölgede mutant bir nükleotit sekansini tamamlayici bir sekansa sahip olan polinükleotitlerin yani sira söz konusu polinükleotidleri tamamlayici sekansa sahip ve bir floroforla isaretlenmis bir dizi kisa Mevcut bulusa göre sunulan yöntemin bir yapilanmasinda söz konusu yöntemde kullanilan nanopartiküllerin diger bir özelligi altin nanopartiküle sabitlenmis zincirin bir sekansa sahip olmasidir. Ayni nanopartikül, nanopartiküle sabitlenmis zincirin JAK2V617F mutasyonunu içeren bölgede yabani tip bir nükleotit sekansini tamamlayici bir sekansa sahip olan polinükleotitlerin yani sira söz konusu polinükleotidleri tamamlayici sekansa sahip ve bir floroforla isaretlenmis bir dizi kisa polinükleotidi de ihtiva eder.

Daha önce de belirtildigi üzere, altin nanopartiküllerin kullanimini içeren mevcut bulusu konusu yöntem sadece mutasyonun varligini degil, ayni zamanda mutasyonun karakterize edilmesini de saglamaktadir. Mutasyonun homozigot veya heterozigot olarak karakterize edilmesine bagli olarak hastaligin teshisini ve seyri hakkinda yorum yapma olanagi elde edilmektedir. Daha önce de bahsedildigi üzere IAK2V617F mutasyonu polycythemia vera (PV) hastalarinin büyük çogunlugunda görülürken, essential thrombocythemia (ET) ve primary myelofibrosis (PMF) hastalarinin yarisinda yine bu mutasyona rastlanmaktadir.

Buna ek olarak, bulus konusu yöntem teknigin bilinen durumunda bilinen yöntemlerden hassasiyet açisindan da avantajlidir. Ayrica hücre canliliginin korundugu bu yöntemde ileri asamalardaki protein miktari ölçümü vb. islemlerde ayni hücre grubunun kullanilma olanaginin olmasi sayesinde farkli islemlere tabi tutulan farkli hücre gruplarindan alinan çeliskili sonuçlarin önüne geçilmis olunur. Teknikte bilinen çalismalar belirli bir hücre popülasyonunun genel ekspresyonu hakkinda bilgi verirken bulus konusu yöntem tek bir hücrenin dahi homozigot aleli ya da yabani tip aleli tasiyip tasimadigi hakkinda bilgi verir.

Sonuçlarin hassasiyeti ve ayni hücre grubu üzerinde yapilan farkli analizlerden alinan sonuçlarin birbiri ile çelismemesi hastaligin teshisini ve seyri üzerinde yorum yapmayi kolaylastirmaktadir.

Buna uygun olarak, mevcut bulusa göre sunulan yöntem mutasyon karakterizasyonunda homozigot ve heterozigot alellerin tespitinin gerçeklestirilebilmesi için ayrica yabani nanopartiküllerin sunulmasini ihtiva etmektedir; burada söz konusu polinükleotitler bir ucundan nanopartikül yüzeyine baglidir ve bunlari tamamlayici ve bir floroforla isaretlenmis olan bir dizi kisa polinükleotidi ihtiva ederler.

Yukarida da belirtildigi üzere, bulus konusu yöntem hücre öldürülmeden uygulanabilmektedir. Dolayisiyla bulusa uygun olarak sunulan yöntem, mutasyon analizinden sonra dahi, hücrelerin canliliginin kaybedilmemesini ve böylece ayni örnekler üzerinde farkli biyomarkerlarla analizler yapilabilmesini mümkün kilmaktadir. Ayrica heterojen bir hücre havuzu içerisinden prob kullanilarak izole edilen belli bir tip hücre toplulugu içerisindeki ekspresyon ve farkli tipler arasindaki ekspresyon farkliliklari da bu yöntem sayesinde gözlemlenebilir. Bu tip analizler genotip ile fenotip arasindaki baglantinin anlasilabilmesi açisindan çok önemlidir. Bu teknik sadece mutasyonun varliginin tespiti için degil bu mutasyonun tek hücrede karakterizasyonu yani homozigot, heterozigot veya yabani tip olmasi gibi alel farkliliklarinin da olup olmadiginin tespit edilebilmesini saglamaktadir. Bu teknigin diger bir avantaji da az sayida hücre ile sonuç alinmasini mümkün kilmasi bu nedenle de arastirmaciya düsen is yükünü azaltmasidir.

Dolayisiyla mevcut bulusa konu olan mutasyon tespit yöntemi gerçek zamanli ve canli hücrede amaca uygun veriye ulasma imkâni saglamaktadir. Hazirlanma asamasinin daha basit ve daha kisa olmasi da bu yöntemin avantajlarindan biridir. Ayrica bulus konusu sistem günümüzde hücre immünfenotiplemesi için kullanilan akim ölçme platformu ile entegre edilerek sonuçlarin daha kolay analiz edilmesi de saglanabilir. Söz konusu sistem temel deneysel çalismalarda büyük engel teskil eden hücre analizi ile mutasyon kuantifikasyonu konularinda da bilinen teknikte gelisme saglayacaktir. Gelistirilen bu teknoloji RNA amplifikasyonu yapilmadan, transfeksiyon reaktifleri kullanilmadan ve hücreler lize edilmeden toksik olmayan nanopartikül temelli ajanlar kullanilarak analiz yapilmasini saglar. Böylelikle hücreler yeniden kültür edilebilir ve fonksiyon analizlerine devam edilebilir. jAKZ V617F mutasyonunun tespitini dogru ve isabetli sekilde gerçeklestirebilmek için kullanilan yöntemdeki pek çok parametrenin bu tip mutasyonun tespiti için ayarlanmasi önem arz etmektedir. Özellikle tespitin canli hücrede gerçeklestirilmesi hücreye en az zarar vererek ayni hücre kümesinin ileri çalismalarda da kullanilmasini saglamaktir.

Dolayisiyla canli hücre açisindan pek çok faktör elde edilecek sonucun hassasiyetini degistirebilir düzeyde olacaktir.

Bulus konusu yöntemin önemli bir parçasini olusturan altin nanopartikül ajanlarinin eklendikleri hücre ile etkilesimi bu açidan büyük önem teskil etmektedir. Bu etkilesimde rol oynayan faktörlerden biri de hücrelerin bulundugu kültür kabinin tipidir. Bulusa konu olan yöntemin uygulanmasi sirasinda kültür kabi olarak düz tabanli, U tabanli ya da V tabanli kaplardan biri arasindan seçilebilir. Bulus sahipleri yaptiklari çalismalarda hücre içerisinde pozitif bir marker olarak kullanilan ve ekspresyonu kesin olarak gerçeklesen ß- aktin proteinini CY5 probu ile isaretleyerek kullanilan kültür kabinin V tabanli olmasi durumunda görülen % isimanin arttigini gözlemlemislerdir (bkz. Sekil-2). Buna göre, mevcut bulus konusu yöntemin bir yapilanmasinda, hücrelerin inkübe edildigi kültür kabi V tabanlidir.

Bulusa uygun olarak sunulan yöntemde mutasyon tespiti sürecinde kullanilan altin nanopartiküllere sabitlenmis polinükleotit Zincirlerini tamamlayici floroforla isaretlenmis kisa polinükleotit zincirlerinde kullanilan söz konusu florofor CY3 ve CY5 arasindan seçilmektedir. Bir diger yapilanmada, bahsedilen bulus konusu yöntemde florofor olarak CY3 seçilmesi durumunda, mutasyon karakterizasyonu sürecinde florofor olarak CY5 seçilmektedir.

Diger bir açidan bulus konusu yöntem içerdigi floresans Ölçümüne bagli olarak polycythaemia vera (PV), essential thrombocythaemia (ET) ve idiopathic myelofibrosis Bulusa uygun yöntemde kullanilan altin nanopartikül ajanlar hücreler ile birlikte 16 saat civarinda inkübe edilmektedir. Bu inkübasyon sirasinda rutin bir uygulama olarak hücre kültür kabi sabit hizda çalkalamaya maruz birakilabilir. Ancak bilinenin aksine, bulus sahipleri yaptiklari çalismalarda çalkalamanin bulusa uygun yöntemde kullanilan altin nanopartikül ajanlari ile hücreler arasindaki etkilesimde ve bunun bir yansimasi olan 0/o isima miktarinda belirgin bir rolü olmadigini tespit etmislerdir. Bu beklenmedik sonuç, mevcut bulus konusu yöntemde altin nanopartikül ajanlarinin çalkalama gereksinimini ortadan kaldirdigini göstermektedir.

Hücreler ile altin nanopartikül ajanlarin arasindaki etkilesimin iyilestirilmesi ve söz konusu ajanlarin hücre içine girerek etkin isima saglamasi amaciyla yapilan çalismalarda nanopartiküllerin eklenmesinden sonra hücrelerin santrifüj edilmesinin etkisi sorgulanmistir. Bu amaçla pozitif kontrol olarak kullanilan ß-aktin proteinini Cy3 probu ile isaretlemis ve akim ölçer cihazla hücrelerin isimalari analiz edilmistir. Elde edilen görüntülerde X ekseni yönünde yer degistirenler Cy5, y ekseni yönünde yer degistirenler ise Cy3 isima yapan hücrelerdir. ß aktin human Cy3 probu kullanildigi için hücreler y ekseni yönünde yer degistirmistir. Sonuçta bulus sahipleri, sanilanin aksine, santrifüj isleminin isimayi olumsuz etkiledigini ve santrifüj isleminin uygulandigi hücre kültürünün uygulanmayana kiyasla daha fazla oranda isima gösterdigini tespit etmistir (bkz. Sekil- 3A ve 3B). Buna uygun olarak bir diger yapilanmasinda mevcut bulus konusu yöntem hücre kültür kaplarinda bulunan hücrelere prob eklendikten sonra santrifüj uygulanma gereksinimini ortadan kaldirmasi nedeniyle avantajlidir.

Altin nanopartikül ajanlarla hücreler arasindaki etkilesimde rol oynayabilecegi düsünülen diger bir parametre de kuyucuk basina düsen hücre yogunlugudur. Iki farkli prob ve iki farkli konsantrasyonla yapilan çalismalarda hücre yogunlugunun akim ölçer cihazinda elde edilen görüntüler isiginda isima üzerindeki etkisi arastirilmistir. Analiz sonuçlarinda elde edilen görüntülere göre X ekseni CyS, y ekseni ise Cy3 isima yapan hücreleri gösterir. A ve B grafiklerinde “ß Actin Human Cy5" probu kullanildigi için hücreler x ekseni yönünde yer degistirmistir. C ve D grafiklerinde “ß Actin Human Cy3” probu kullanildigi için hücreler y ekseni yönünde yer degistirmistir (bkz. Sekil 4A, 4B, 4G ve 4D) Asagida verilen örnek, bulus konusu yöntemin uygulanmasini detaylandirma amaciyla verilmistir ancak bulus konusu bu örnek ile sinirlandirilamaz. Örnek - Altin Nanopartikül Yöntemi kullanilarak IAKZVÖÜF mutasyonunun analizi A. Deney Düzeneginin Hazirlanmasi 1. SmartFlareTM Reaktifinin Sulandirilmasi Deneyde kullanilmak üzere asagida verilen 7 tip prob üretici firmadan temin edildi. Her bir prob için 96 kuyulu kültür kabi için belirlenmis optimal prob miktari belirlendi.

Asagida verilen tabloda bu miktarlarin yani sira her bir probun deneyde kullanim amaçlari da açiklanmistir. Yapilan çalismada deney sonuçlarinin güvenilirliliginden emin olmak için gerekli negatif ve pozitif kontroller bulunmaktadir. Pozitif kontrol olarak genelde eksprese olan genler seçilir. Bu deneyde pozitif kontrol olarak beta aktin seçilmistir ve her iki floroforla isaretli beta aktin probleri hücreler üzerinde denenmistir.

Diger bir kontrol ise “uptake” adi verilen ve altin nanopartikülü de dahil herhangi bir hedefe baglanmadigi için sürekli olarak isiyan bir probdur. Bu sayede probun hücre içine alinip alinmadigi kontrol edilmis olur. Bu probe da “Cy3” ile isaretlenerek hücrelerde uygunanmistir. Deneyde kullanilan bir baska kontrol de “scramble” sekansa yani karistirilmis bir sekansa sahip dolayisiyla herhangi bir transkripte baglanma özelligine sahip olmayan bir probtur. “Cy3" floroforuyla isaretlenmis bu prob spesifik olmayan isimanin varliginin test edilmesi, diger bir deyisle "background” isimanin tespiti amaciyla kullanilmaktadir. Ayrica “scramble” ve “uptake” problari farkli floroforlarla isaretlenerek birbirleri arasinda herhangi bir etkilesim olup olmadigi da kontrol edilir. Bu kontroller isiginda JAKZ WT'a spesifik ve “Cy5” ile isaretli, IAK2V617F mutantina spesifik ve “Cy3" ile isaretli prob kullanilarak söz konusu proteinin yabani tipinin ve mutant tipinin canli hücre içinde tespiti saglanmistir.

Tablo 1. 96 kuyulu kültür kabi için belirlenmis optimal prob miktarlari Optimum Problarin kullanim amaci Prob Prob Miktari Cy3 floroforu ile isaretlenmis beta aktin Beta Actin Human Cy3 32 transktiptine spesifik pozitif kontrol Cy3 floroforu ile isaretlenmis beta aktin Beta Actin Human Cy5 4 transktiptine spesifik pozitif kontrol Herhangi bir sekansa baglanmayacak sekilde tasarlanmis ve sürekli isima saglayarak sadece probun hücre tarafindan alimini dogrulayan kontrol Uptake Cy3 16 Hedef bir sekansa baglanmayan ancak Scramble Cy3 4 nanopartiküle bagli kalarak isimayan ve arkaplan isimasini gösteren negatif kontrol Scramble Cy3 + Uptake Farkli floroforlarla isaretli problerin birbiri Cy5 8 arasindaki etkilesimi test eden kontrol Üretici firmadan liyofilize halde gelen altin nanoflares problari su ile sulandirilarak stok solüsyon hazirlanir. Sulandirma islemi su sekilde yapildi: 50 ul nükleaz içermeyen steril su, yavasça damlatilarak tüpe eklenir. Birkaç parmak vurusuyla liyofilize malzemenin çözülmesi saglanir. Ardindan 5-10 sn vorteks yapilir.

Sulandirma isleminden sonra, bir yil süreyle oda sicakliginda ve isiksiz ortamda saklanabilir. Ürün eldiven kullanilarak tutulmalidir, deri araciligiyla absorblanabilir. 2. Hücre Test Protokolü 1.] Prob deneyleri 96 kuyulu hücre kültürü kaplarinda gerçeklestirildi. 96 kuyulu kültür kabi için her kuyuya 30 000 hücre/200 ul ortam olacak sekilde hücreler 2.] SmartFlareTM reaktifi 1:20 oraninda steril fosfat tampon solüsyonu ile seyreltilerek kullanilir. Reaktif stogundan 10 ul alinarak steril fosfat tampon solüsyonu ile 200 ul ye tamamlandi. 3.) 96 kuyulu hücre kültürü kabinin her bir kuyucuguna SmartFlareTM reaktif solüsyonu eklendi. Reaktif miktari probun çesidine ve hücre tipine göre çok farklilik göstermektedir. Her bir prob için kuyu basina eklenmesi gereken reaktif miktarlari bulgular bölümündeki Tablo 1'de gösterilmektedir. Bu miktarlar yapilan denemeler sonucu optimize edilmis degerlerdir. 4.] Bir gece boyunca (16 saat) inkübasyona birakildi. [37 °C, COz (5%), bagil nem] Inkübasyonun ardindan hücreler toplanarak hücre akim ölçer cihazi ile floresans ölçümü yapildi. 3. Deney Optimizasyonu Bölüm 1'de anlatilan hücre test protokolü standart deney protokolüdür. Ancak yapilan denemeler deney parametrelerinin optimize edilmesi gerektigini göstermistir. Bu amaçla asagidaki parametreler 18 farkli deney seti kurularak optimize edilmistir. Optimizasyon deneylerinde K562 hücre soyu kullanilmistir. o 96 kuyulu hücre kültür kabinin türü (Düz tabanli, U tabanli, V tababli) o Kuyu basina eklenen prob miktari 0 Kuyu basina toplam hücre süspansiyonu hacmi 0 Inkübasyon sirasinda kültür kabini çok düsük hizda çalkalama o Prob eklendikten sonra hücre kültür kabina santrifüj (300 g X 10 dk) 4-. Floresan Tespit Parametreleri Probla inkübe edilmis hücrelerdeki sinyalleri tespit etmek amaciyla floresan tespit platformu olarak hücre akimölçer cihazi kullanilmistir. Maksimum dalga boyundaki uyari Tablo 2. Floroforlarin fiziksel özellikleri Florofor Uyari Sinyali Emisyon Guava Guava Mikroskop Boya (lamda, nm) (lamda, nm] (PMT) (Lazer) Filtresi CYS 650 670 Kirmizi 2 Kirmizi CY5 uyumlu filtre CY3 550 570 Sari Mavi CY3 uyumlu filtre Hücre akimölçer cihazindaki analizlerin ilk asamasinda SSC (Side-scattered lightJ/FSC hücre grubu kapilanarak seçilmistir. Floresans özelliklerine göre hücre ayrimi, kapilanan bu hücre grubu üzerinden yapilmistir.

B. Hücre Ayirimi (Sorting) SmartFlareTM problarinin eklenmesinin ardindan 16 saatlik inkübasyona birakilan hücreler toplanarak akim sitometrisi cihazi ile floresans ölçümü yapildi. Birbirinden farkli oldugu belirlenen hücre gruplari hücre ayirim ünitesi (FACSAria Akim Sitometri Cihazi, BD Bioscience] ile ayrimlanarak RNA izolasyon asamasina geçildi.

Hücrelerin akim sitometrisi cihazinda okutuldugunda floresans özelliklerine göre hangi gruplara ayrilabileceginin temsili bir sekli verilmistir (Sekil 1). Burada görülecegi üzere CY3 (IAKZ mutant spesifik proba bagli florofor) ve/veya CY5 [[AKZ yabani tip spesifik proba bagli florofor) isimasina göre 4 farkli hücre grubu olusma ihtimali vardir.

Prob eklenmemis kontrol grubu hücrelerde sadece P3 (CY3' / CYS'] bölgesinde hücre görülmesi beklenir. Diger taraftan farkli boyamalar için farkli akim sitometri grafik görüntüsü ihtimalleri su sekildedir: o IAK2V617F (CY3): Eger hücreler mutant allel spesifik prob ile inkübe edilirse hücrenin ilgili mutasyon bakimindan mutant ve/Veya yabani tip olmasina göre P2 ve/veya P3 bölgelerinde hücre gruplari olusabilir. o IAKZ Yabani Tip [CY5): Eger hücreler yabani tip allel spesifik prob ile inkübe edilirse hücrenin ilgili mutasyon bakimindan mutant ve/veya yabani tip olmasina göre P3 ve/veya PS bölgelerinde hücre gruplari olusabilir. o Ikili Boyama (CY3+CY5): Bir diger seçenek de hücrelere iki farkli prob ekleyerek inkübe etmektir. Bu islem iki alleli birlikte tasiyan hücrelerin belirlenebilmesini saglar. Hücrelerin ilgili mutasyon bakimindan mutant ve/veya yabani tip olmasina göre her grupta (PZ, P3, P4, PS) hücre görülme ihtimali vardir.

CY3 ve/veya CY5 floroforlari ile isaretli problari kullanarak yapilan bir deneyde, akim sitometri cihazinda 4 farkli hücre grubu görülme ihtimali vardir. P3 bölgesinde görülen hücreler her iki prob için de negatiftir. P4 bölgesinde ise her iki prob için de pozitif olan hücreler yer alir. P2 bölgesi CY3 için pozitifken, PS ise CY5 için pozitiftir.

Yapilan deneyin sonucunda IAK2V617F-Mutant-Cy3 prob ile tekli boyamaya ait analiz sonuçlari Sekil 5A'da verilmistir. Bu sonuçlara göre y ekseni yönünde hareket eden ve P2 ile kapilanan hücreler IAK2V617F mutant hücrelerdir. P2 grubu sekildeki gibi kapilanarak sort edilmistir. Diger tekli boyama IAK2V617F-yabani tip-CyS ile gerçeklestirilmistir ve x ekseni yönünde hareket eden ve PZ ile kapilanan hücreler IAKZ yabani tip hücrelerdir. PZ grubu sekildeki gibi kapilanarak sort edilmistir (bkz. Sekil SB).

Son olarak gerçeklestirilen analizde ikili boyama uygulanmis hem mutant hem de yabani tip hücrelerin tespit edilmesi hedeflenmistir. Buna göre ikili boyamanin sonucunda P4 ile kapilanan hücrelerin her iki boyama için de pozitif olduklarini görülmüstür. Dolayisiyla alinan örnegin IAK2V617F heterozigot mutant oldugu sonucuna varilir (bkz. Sekil SC). Bu hücre gruplari PZ, P3, P4, P5 kapilanarak sort edilmistir.

Claims (1)

1. ISTEMLER . Bir hücrede IAKZVÖÜF mutasyonunun tespiti için bir yöntem olup, özelligi söz konusu yöntemin asagidaki adimlari ihtiva etmesidir; - IAKZVÖÜF mutasyonunu içeren bölgede bir nükleotit sekansina spesifik bir dizi polinükleotidle yüzey fonksiyonelligi saglanmis altin nanopartiküllerin sunulmasi; burada söz konusu polinükleotidler bir ucundan nanopartikül yüzeyine baglidir ve bunlari tamamlayici olan ve bir floroforla isaretlenmis olan bir dizi kisa polinükleotidi ihtiva eder, - söz konusu nanopartiküllerin bahsi geçen hücrelerin inkübasyon ortamina dahil edilmesi, ve - floresans ölçümü ile IAKZVÖÜF mutasyonunu tasiyan hücrelerin tespit edilmesi. . Istem 1'e göre sunulan bir yöntem olup, özelligi söz konusu yöntemin mutasyon karakterizasyonunda homozigot ve heterozigot alellerin tespiti için ayrica yabani altin nanopartiküllerin sunulmasini ihtiva etmesidir; burada söz konusu polinükleotidler bir ucundan nanopartikül yüzeyine baglidir ve bunlari tamamlayici olan ve bir floroforla isaretlenmis olan bir dizi kisa polinükleotidi ihtiva eder. . istem l'e göre sunulan bir yöntem olup, özelligi yöntemde kullanilacak hücre kültürü kaplarinin düz tabanli, U tabanli ya da V tabanli olanlar arasindan seçilmis olmasidir. . Istem 3'e göre bir yöntem olup, özelligi söz konusu hücre kültürü kabinin V tabanli olmasidir. . istem 1 veya Z'ye göre olan bir yöntem olup, özelligi söz konusu floroforun CY3 ve CY5 arasindan seçilmis olmasidir. . Istem 2'ye göre olan bir yöntem olup, özelligi istem 1'de sözü edilen floroforun CY3, istem 2'de sözü edilen floroforun CYS olmasidir. 7. Istem 1 veya Z'ye göre sunulan yöntem olup özelligi, söz konusu yöntemin bahsi geçen floresans ölçümüne bagli olarak polycythaemia vera (FV), essential thrombocythaemia (ET) ve idiopathic myelofibrosis (lMF)'den olusan bir gruptan seçilen hastaligin teshisi fazini ihtiva etmedir.