TH6944A3 - กรรมวิธีการผลิตกรดแลกติกด้วยระบบเซลล์ตรึง - Google Patents

Abstract

กรรมวิธีการผลิตกรดแลกติดด้วยระบบเซลล์ตรึง ประกอบด้วย การเตรียมสารแขวนลอยเซลล์ แบคทีเรียกรดแลกติก การเตรียมเซลล์ตรึงแบคทีเรยกรดแลกติดแทคนิคการตรึงเซลล์แบบชนิดโครงข่ายแอล จิเนตและเยื่อแอลจิเนต และกรรมวิธีการผลิตกรดแลกติกด้วยกรรมวิธีการหมักแบบเบ็ดเสร็จในระดับฟลาสก์ หรือแบบเบ็ดเสร็จเวียนกลับน้ำหมัก หรือ แบบเบ็ดเสร็จเวียนกลับน้ำหมักซ้ำ หรือแบบต่อเนื่องเวียนกลับน้ำ หมักในถังปฏิกรณืแบบคอลัมน์บรรจุเซลล์ตรึงเยื่อแอลจิเนตโดยใช้แบคทีเรียสายพันธ์ Lactococcus lactis IO-1 TISTR 1401 เป็นต้นแบบของกรณีศึกษา โดยมีการควบคุมการหมักภายใต้สภาวะที่เหมาะที่สุดที่ได้ จากการออกแบบการทดลองด้วยวิธีทะกุจิ(Taguchi method)

Claims (6)

1. กรรมวิธีการผลิตกรดแลคติกด้วยระบบเซลล์ตรึง ซึ่งประกอบด้วย 1.1 การเตรียมสารแขวนลอยเซลล์แบคทีเรีย โดยใช้สายพันธุ์ต้นแบบคือแบคทีเรียใน กลุ่ม Lactococcus sp p. มีขั้นตอนดังนี้ ก. นำกล้าเชื้อเริ่มต้น (stock culture) ใส่ลงในหลอดทดสอบที่มีอาหารเพาะเลี้ยง เชื้อเหลวเอ็มอาร์เอส (De Man-Rogosa-Sharps: MRS) บ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ข. ทำการถ่ายกล้าเชื้อลงในหลอดทดสอบที่มีอาหารเพาะเลี้ยงเชื้อเหลว MRS อีก ครั้ง บ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 24 ชั่วโมง เพื่อใช้เป็นกล้าเชื่อการเพาะเลี้ยงเซลล์ใน ระดับฟลาสก์ ค. นำกล้าเชื้อที่เตรียมได้จากข้อ ข. ขนาด 5 เปอร์เซ็นต์ ปริมาตร /ปริมาตร เติมลง ในฟลานส์ จำนวน 2 ฟลาสก์ ที่มีอาหารเพาะเลี้ยงเชือเหลว MRS ง. นำไปบ่มแบบนิ่งที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 6 ชั่วโมงและนำไปแยก เซลล์ด้วยเครื่องหมุนเหวี่ยงอุณหภูมิต่ำที่ความเร็วรอบ 9,000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 10 นาที จ. นำเซลล์เปียกที่ได้จากข้อ ง. ล้างด้วยน้ำกลั่นมาเชื้อ 1 ครั้ง จากนั้นเติมน้ำกลั่นฆ่า เชื้อ ทำเป็นสารแขวนลอยเซลล์เพื่อใช้ในการตรึงเซลล์แบบชนิดโครงข่ายแอลจิเนต (alginate entrapment) และแบบชนิดเยื้อแอลจิเนต (alginate-membrane encapsulation) 1.2 การเตรียมเซลล์ตรึงแบคทีเรียกรดแลกติก ซึ่งเลือกได้จากวิธีใดวิธีหนึ่ง ดังนี้ 1.2.1 เซลล์ตรึงแบคทีเรียแลคติกแบบ "โครงข่ายแอลจิเนต" (alginate entrapment) มีขั้นตอนดังนี้ ก. นำสารแขวนลอยที่ได้จากข้อ 1.1(จ) ผสมกับสารละลายโซเดียมแอลจิ เนต (NaC6H7O6) เปอร์เซ็นต์ ข. นำสารผสมแขวนลอยเซลล์ที่ได้ใส่ลงในสารละลายเคลเซียมคลอไรด์ (CaCl2)3 เปอร์เซ็นต์ ด้วยสายยางซิลิโคนและเข็มฉีก โดยใช้ปั๊มควบคุมอัตราการไหลของสาร แขวนลอยเซลล์ให้คงที่เท่ากับ 0.06 ลิตร / ชั่วโมง ค. นำเม็ดเจลเซลล์ตรึงที่ได้จากข้อ ข. ในสารละลายแคลเซียมคอลไรด์ (CaCl2)3 เปอร์เซ็นต์ไปบ่มนาน 2 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิห้อง 30 องศาเซลเซียส จากนั้นกรองผ่าน ตะแกรง ง. นำเม็ดเจลเซลล์ตรึ่งที่ได้จากข้อ ค. ล้างด้วยน้ำกลั่นฆ่าเชื้อ 1 ครั้ง ทิ้งไว้ ประมาณ 10 นาที ที่อุณหภูมิห้อง 30 องศาเซลเซียส จ. นำเม็ดเจลเซลล์ตรึ่งที่ได้จากข้อ ง. ไปชั่งน้ำหนักเปียกโดยทุกขั้นตอน กระทำภายใต้สภาวะปลอดเชื้อ นำเซลล์ตรึงที่ได้ในโครงข่ายแอลจิเนตไปใช้ในการผลิต กรดแลคติก 1.2.2 เซลล์ตรึงแบคทีเรียกรดแลกติดแบบ " เยื่อแอลจิเนต " (alginate-membranc encapsulation) มีขั้นตอนดังนี้ ก. นำเซลล์เปียกในข้อ 1.1(จ) มาผสมกับสารละลายที่มีพอลิเอทิลีนไกล คอล (polyethylene glycol:PEG 6000) 20 เปอร์เซนต์ (น้ำหนัก /ปริมาตร ) และแคลเซียมคลอไรด์ CaCl2) 2 เปอร์เซ็นต์ ข. นำสารผสมแขวนลอยเซลล์ที่ได้จากข้อ ก. ผสมลงในสารละลาย โซเดียม แอลจิเนต (NaC6H7O6) 0.5 เปอร์เซ็นต์ ที่มีพอลิซอร์เบต 80 (tween 80) 0.1 เปอร์เซ็นต์ (น้ำหนัก /ปริมาตร ) ด้วยสายยางซิลิโคน และเข็มโดยใช้ปั๊มควบคุมอัตราการไหลของสารผสม แขวนลอยเซลล์ให้คงที่เท่ากับ 0.06 ลิตร /ชั่วโมง ค. นำน้ำกลั่นเติมลงในสารผสมแขวนลอยในข้อ ข. เพื่อฆ่าเชื้อลงไปเพื่อ เจือจางความเข้มข้นของสารละลายโซเดียมแอลจิเนต ง. นำแคปซูลเซลล์ตรึงที่ไดจากข้อ ค. กรองผ่านตะแกรงและล้างแคปซูล เซลล์ตรึงด้วยน้ำกลั่นฆ่าเชื้อ จ. นำแคปซูลเซลล์ตรึงที่ไดจากข้อ ง. แช่ในสารละลายแคลเซียมคลอไรด์ CaCl2)1 เปอร์เซ็นต์ นาน 30 นาที เพื่อทำให้แคปซูลเซลล์ตรึงตัวแข็ง กรองแคปซูลเซลล์ตรึงผ่าน ตะแกรงและล้างด้วยน้ำกลั่นฆ่าเชื้ออีกครั้ง ทิ้งไว้ 10 นาที ฉ.นำแคปซูลเซลล์ตรึงที่ไดจากข้อ จ. ไปชั่งน้ำหนักเปียก นำแคปซูลเซลล์ ตรึงที่ได้บรรจุในเยื้อแอลจิเนตที่ได้ลงในคอลัมน์แก้ว เพื่อนำไปใช้ในการผลิตกรดแลกติกต่อไป 1.3 การผลิตกรดแลกติก ซึ่งเลือกได้จากวิธีใดวิถีหนึ่ง ดังนี้ 1.3.1 การผลิตกรดแลกติกด้วยกรรมวิธีการหมักแบบเบ็ดเสร็จ (batch fermentation) ในระดับฟลาสก์ มีขั้นตอนดังนี้ ก. นำเซลล์ตรึงแบคทีเรียกรดแลคติดแบบ " เยื่อแอลจิเนต" (alginate- membrane encapsulation) ที่ได้จากข้อ 1.2.2 ข. นำมาใส่ลงในฟลาสก็ที่มีอาหารเพาะเลี้ยงเชื้อเหลว MRS โดยควบคุม สภาวะการหมักที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสและอัตราเขย่า 100 รอบ /นาที 1.3.2 การผลิตกรดแลกติกด้วยกรรมวิธีการหมักแบบเบ็ดเสร็จเวียนกลับน้ำหนัก (batch fermentation process with broth recycle) ก. นำเซลล์ตรึงแบคทีเรียงกรดแลคติดแบบ "เยื่อแอลจิเนต " (alginate- membrane encapsulation) ที่ได้จากข้อ 1.2.2 ข. นำมาทำการผลิตกรดแลคติกแบบเบ็ดเสร็จเวียนกับน้ำหนัก โดยใช้ถัง ปฏิกรณ์แบบคอลัมน์บรรจุเซลล์ตรึงเยื่อแอลจิเนตต่อเข้ากับถังหมักแบบกวน (stirred tank fermentation) ที่มีอาหารเพาะเลี้ยงเชื้อเหลว MRS โดยควบคุมสภาวะการหมักที่อุณหภุมิ 37 องศา เซลเซียส อัตราการกวน 400 รอบ/นาที และปรับค่าความเป็นกรด-ด่าง 6.85 ค. ทำการหมักโดยปั๊มอาหารเพาะเลี้ยงเชื้อ MRS จากถังหมักแบบกวน ด้วยอัตราการไหลเท่ากับ 16 มิลลิลิตร/นาที เข้าสู่ปฏิกรณ์ทางด้านบนและปั๊มน้ำหมักออก ทางด้านล่างถังปฏิกรณ์แบบคอลัมน์ของเซลล์ตรึงเยื่อแอลจิเนต เพื่อเวียนกลับน้ำหนักเข้าสู่ถังหมัก แบบกาว ง. ทำการผลิตกรดแลกติกแบบเบ็ดเสร็จกลับน้ำหมักด้วยเซลล์ตรึง เยื่อแอลจิเนตนี้ 2 ครั้ง ในถังปฏิกรณ์คอลัมน์บรรจุเซลล์ตรึงเยื่อแอลจิเนต ฉ. ทำการผลิตกรดแลกติดครั้งที่ 2 โดยการเติมอาหารเพาะเลี้ยงเชื้อใหม่ และควบคุมการทำงานของระบบการหมักแบบเบ็ดเสร็จเวียนกลับน้ำหนักหมักตามข้อ ข. 1.3.3 การผลิตกรดแลคติกด้วยกรรมวิธีการหมักแบบเบ็ดเสร็จเวียนกลับน้ำหมักซ้ำ (repeated batch fermentation precess with broth recycle) ก. นำเซลล์ตรึงแบบทีเรียกรดแลกติดแบบ " เยื่อแอลจิเนต" (alginate- membrane encapsulation) ที่ได้จากข้อ 1.2.2 ข. ทำการผลิตกรดแลกติกแบบเบ็ดเสร็จเวียนกลับน้ำหมักซ้ำ ในถัง ปฏิกรณ์แบบคอลัมน์บรรจุเซลล์ตรึงเยื่อแอลจิเนตจำนวนซ้ำรวม 3 ครั้ง โดยควบคุมสภาวะการหมัก ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส อัตราการกวน 400 รอบ /นาที และปรับค่าความเป็นกรด-ด่าง 6.85 ค. เมื่อดำเนินการหมักครั้งที่ 1 เสร็จสิ้นให้ถ่ายน้ำหมักออกจากระบบ ทั้งหมด จากนั้นเริ่มทำการหมักไหม่โดยเติมอาหารเพาะเลี้ยงเชื้อเใหม่ และควบคุมการทำงานของ ระบบหมักแบบเบ็ดเสร็จเวียนกลับน้ำหมักตามข้อ ข. 1.3.4 การผลิตกรดแลคติกด้วยกรรมวิธีการหมักแบบต่อเนื่องเวียนกลับน้ำหมัก (comtinuous fermentation process with broth recvcle) ก. นำเซลล์ตรึ่งแบคที่เรียกรดแลกติกแบบ "เยื่อแอลจิเนต" (alginate- membrane encapsulation) ที่ได้จากข้อ 1.2.2 ข. การผลตกรดแลกติกแบบต่อเนื่องเวียนกลับน้ำหมัก ดำเนินการโดยน้ำ ถังปฏิกรณ์แบบคอลัมน์บรรจุเซลล์ตรึงเยื่อแอลจิเนต ต่อเข้ากับถังหมักแบบกวน (stirred tank fermenter) เพื่อให้เป็นถังพักน้ำหมัก โดยควบคุมสภาวะการหมักที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส อัตรา การกวน 400 รอบ/นาที และค่าความเป็นกรด -ด่าง 6.85 ค. เริ่มทำกาหมักโดยปั๊มอาหารเพาะเลี้ยงเชื้อ MRS จากถังหมักแบบกาวน ด้วยอัตราการไหลเท่ากับ 16 มิลลิลิต /นาที เข้าสู่ถังปฏิกรณ์ทางด้านล่างถังปฏิกรณ์แบบคอลัมน์ของเซลล์ตรึงเยื่อแอลจิเนต ง. ทำการหมักจนความเข้มข้นของกลูโคสถึงระยะคงที่ (stationary state) จึงเปลี่ยนการหมักแบบเบ็ดเสร็จเป็นการหมักแบบต่อเนื่องที่ควบคุมอัตราเจือจาง (dilution rate,D) 0.5 ชั่วโมง จ. ทำการเติมอาหารเพาะเลี้ยงเชื้อ (MRS) ใหม่เข้าสู่ถังหมักแบบกาวนที่ใช้ เป็นถังพักของน้ำหมัก ด้วยอัตราการไหลเท่ากับ 8.33X60 มิลลิลิตร /ชั่วโมง ซึ่งควบคุมการทำงาน ด้วยปั๊ม เพื่อทำให้ปริมาณทำงานของการหมักแบบต่อเนื่องคงที่ ภายใต้สภาวะคงตัว (steady state)

2. กรรมวิธีการผลิตกรดแลกติกด้วยระบบเซลล์ตรึงตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งมีส่วนประกอบ ของอาหารเลี้ยงเชื้อเหลวเอ็มอาร์เอส (De Man-Rogosa - Sharpe:MRS) ได้แก่ ความเข้มข้นกลูโคส (glucose) เริ่มต้น 45 กรัม /ลิตร, ความเข้มข้นยีสต์สกัด (yeast extract) 10 กรัม/ลิตร , ความเข้มข้นบีฟ สกัด (beef extract) 10 กรัม/ลิตร , ค่าความเป็นกรด-ด่างเริ่มต้น 6.85, ความเข้มข้นแคลเซียมคลอไรด์ (Cacl2)10 กรัม/ลิตร ,และความเข้มข้นเพปโทน (peptone) 7.5 กรัม /ลิตร

3. กรรมวิธีการผลิตกรดแลกติกด้วยระบบเซลล์ตรึงตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งมีการผลิตกรด แลกติกด้วยเซลล์ตรึงเยื่อแอลจิเนตแบบเบ็ดเสร็จ โดยควบคุมสภาวะการหมักที่อุณหภูมิ 37 องศา เซลเซียส และอัตราเขย่า 100 รอบ/นาที

4. กรรมวิธีการผลิตกรดแลกติกด้วยระบบเซลล์ตรึงตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งการผลิตกรด แลกติกด้วยเซลล์ตรึงเยื่อแอลจิเนตแบบเบ็ดเสร็จเวียนกลับน้ำหมัก โดยควบคุมสภาวะการหมักที่ 37 องศาเซลเซียส อัตราการกวน 400 รอบ/นาที และค่าความเป็นกรด -ด่าง 6.85 อัตราการไหลของ อาหารเลี้ยงเชื้อจากถังหมักแบบกาวนไปสู่ถังปฏิกรณ์แบบคอลัมน์ของเซลล์ตรึงเยื่อแอลจิเนต 16 มิลลิลิตร / นาที

5. กรรมวิธีการผลิตกรดแลกติกด้วยระบบเซลล์ตรึงตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งการผลิตกรด แลกติกด้วยเซลล์ตรึงเยื่อแอลจิเนตแบบเบ็ดเสร็จเวียนกลับน้ำหมักซ้ำ โดยควบคุมสภาวะการหมักที่ 37 องศาเซลเซียส อัตราการกวน 400 รอบ / นาที และค่าความเป็นกรด -ด่าง 6.85

6. กรรมวิธีการผลิตกรดแลกติกด้วยระบบเซลล์ตรึงตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่งการผลิตกรด แลกติกด้วยเซลล์ตรึงเยื่อแอลจิเนตแบบต่อเนื่องเวียนกลับน้ำหมัก โดยควบคุมสภาวะการหมักที่ 37 องศาเซลเซียส อัตราการกวน 400 รอบ/นาที และค่าความเป็นกรด-ด่าง 6.85 อัตราการไหลของ อาหารเลี้ยงเชื้อจากถังหมักแบบกวนไปสู่ถังปฏิกรณ์คอลัมน์ของเซลล์ตรึงเยื่อแอลจิเนต 16 มิลลิลิตร /นาที และอัตราการไหลของอาหารเลี้ยงเชื้อการหมักแบบต่อเนื่องเท่ากับ 8.33x60 มิลลิลิตร/นาที โดยควบคุมอัตราเจือจาง 0.5 ต่อชั่วโมง ภายใต้สภาวะคงตัว (steady state)