TH4199B - มีแนคทิวิน ที่ได้จากรีคอมบิแนนท์และกรรมวิธีการผลิตสิ่งดังกล่าว - Google Patents

Abstract

การประดิษฐ์นี้เกี่ยวข้องกับการผลิตโปรตีนชนิดใหม่ของคนคือมิแนคทิวิน โดยเทคโนโลยีของรีคอมบิแนนท์ DNA การหาลักษณะของลำดับยีน การถอดรหัสและการทำมิแนคทิวินที่มีฤทธิ์ทางชีวภาพ ปริมาณมากจากรีคอมบิแนนท์เจ้าบ้านให้บริสุทธิ์ และยังเกี่ยวข้องกับการทำมิแนคทิวินดั้งเดิมที่มีฤทธิ์ทางชีวภาพรวมทั้งเพบไทด์ที่ได้จากมิแนคทิวินและลำดับกรดอะมิโนของมันให้บริสุทธิ์

Claims (7)

1. โมเลกุลของ DNA ที่มีลำดับเป็น 1 GTCAGACAGCAACTCAGAGAATAACCAGAGAACAACCAGATTGAAACA 49 ATG GAG GAT CTT TGT GTG GCA AAC ACA CTC TTT GCC CTC AAT TTA 94 TCC AAG CAT CTG GCA AAA GCA AGC CCC ACC CAG AAC CTC TTC CTC 139 TCC CCA TGG AGC ATC TCG TCC ACC ATG GCC ATG GTC TAC ATG GCC 184 TCC AGG GGC AGC ACC GAA GAC CAG ATG GCC AAG GTG CTT CAG TTT 229 AAT GAA GTG GGA GCC AAT GCA GTT ACC CCC ATG ACT CCA GAG AAC 274 TTT ACC AGC TGT GGG TTC ATG CAG CAG ATC CAG AAG GGT AGT TAT 319 CCT GAT GCG ATT TTG CAG GCA CAA GCT GCA GAT AAA ATC CAT TCA 364 TCC TTC CGC TCT CTC AGC TCT GCA ATC AAT GCA TCC ACA GGG AAT 409 TAT TTA CTG GAA AGT GTC AAT AAG CTG TTT GGT GAG AAG TCT GCG 454 AGC TTC CGG GAA GAA TAT ATT CGA CTC TGT CAG AAA TAT TAC TCC 499 TCA GAA CCC CAG GCA GTA GAC TTC CTA GAA TGT GCA GAA GAA GCT 544 AGA AAA AAG ATT AAT TCC TGG GTC AAG ACT CAA ACC AAA GGC AAA 589 ATC CCA AAC TTG TTA CCT GAA GGT TCT GTA GAT GGG GAT ACC AGG 634 ATG GTC CTG GTG AAT GCT GTC TAC TTC AAA GGA AAG TGG AAA ACT 679 CCA TTT GAG AAG AAA CTA AAT GGG CTT TAT CCT TTC CGT GTA AAC 724 TCG GCT CAG CGC ACA CCT GTA CAG ATG ATG TAC TTG CGT GAA AAG 769 CTA AAC ATT GGA TAC ATA GAA GAC CTA AAG GCT CAG ATT CTA GGA 814 CTC CCA TAT GCT GGA GAT GTT AGC ATG TTC TTG TTG CTT CCA GAT 859 GGA ATT GCC GAT GTG TCC ACT GGC TTG GAG CTG CTG GAA AGT GAA 904 ATA ACC TAT GAC AAA CTC AAC AAG TGG ACC AGC AAA GAC AAA ATG 949 GCT GAA GAT GAA GTT GAG GTA TAC ATA CCC CAG TTC AAA TTA GAA 994 GAG CAT TAT GAA CTC AGA TCC ATT CTG AGA AGC ATG GGC ATG GAG 1039 GAC GCC TTC AAC AAG GGA CGG GCC AAT TTC TCA GGG ATG TCG GAG 1084 AGG AAT GAC CTG TTT CTT TCT GAA GTG TTC CAC CAA GCC ATG GTG 1129 GAT GTG AAT GAG GAG GGC ACT GAA GCA GCC GCT GGC ACA GGA GGT 1174 GTT ATG ACA GGG AGA ACT GGA CAT GGA GGC CCA CAG TTT GTG GCA 1219 GAT CAT CCT TTT CTT TTT CTT ATT ATG CAT AAG ATA ACC AAC TGC 1264 ATT TTA TTT TTC GGC AGA TTT TCC TCA CCC TAA AAC TAA GCG TGC 1309 TGCTTCTGCAAAAGATTTTTGTAGATGAGCTGTGTGCCTCAGAATTGCTATTTCAAATTG 1369 CCAAAAATTTAGAGATGTTTTCTACATATTTCTGCTCTTCTGAACAACTTCTGCTACCCA 1429 CTAAATAAAAACACAGAAATAATTAGACAATTAGACAATTGTCTATTATAACATGACAACCCTATTAA 1489 TCATTTGGTCTTCTAAAATGGGATCATGCCCATTTAGATTTTCCTTACTATCAGTTTATT 1549 TTTATAACATTAACTTTTACTTTGTTATTTATTATTTTATATAATGGTGAGTTTTTAAAT 1609 TATTGCTCACTGCCTATTTAATGTAGCTAATAAAGTTATAGAAGCAGATGATCTGTTAAT 1669 TTCCTATCTAATAAATGCCTTTAATTGTTCTCATAATGAAGAATAAGTAGGTATCCCTCC 1729 ATGCCCTTCTGTAATAAATATCTGGAAAAAACATTAAACAATAGGCAAATATATGTTATG 1789 TGCATTCTAGAAATACATAACACATATATATGTCTGTATCTTATATTCAATTGCAAGTA 1849 TATAATGTCATAATTTCAAGACCAGCCTGGCCAACATAGCGAAACCCTACCTCCACTAAA 1909 AATACAGAAATGAGCCGGGAGTGGTGGCAAAGTGGTGAGCAVVTGTGATCCCAGCCCACTG 1969 TGGAGGCCGAGGCAGGACAATCACTTGAACCCAGGAGGCGGAGGCTGCAGTGAGCTGAGA 2029 TCGCTCCACTGCACTCCAGCCTGGGCAACAGAGCAAGATTCCATCTCAAAATACATTAAA 2089 AAAAAAAAACCTATCTGAGGACTCTGAAAAGTAAATGGTAGCAGATAGATTTGAGAAGGG 2149 ACTAGAACTTGAAGCACAATCTATCTGGTGCTCTTTCFTTACTTTTGCTTGTTTTCTCCCA 2209 ATCTTCCAGTCTGGATACAAAGGCAGCCCAATTTCTAGAAATGTATACCAGCCATGAAGA 2269 GATAAAGCTCCAAGAGGAGATTTCTCTTTCTGGTATAAGGTATGTGTGTGTGTATATGGGGG 2329 GCGATAAGGTTGGGAGTGTGCAGGAATACAGACGTCGGAGGAAATCCATTATTTCCACCCTCT 2389 CTCTTGCCATTGCAACCAGAC หรือชิ้นส่วนของมันที่ประมวลรหัสของเพบไทด์ที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพหรือทางอิมมูนได้โดยมีแอคติวิถีทางชีวภาพหรืออิมมูนของมีแนคทิวิน หรือชิ้นส่วนที่ประกอบด้วยลำดับที่เป็นลักษณะเฉพาะของมีแนคทิวิน 2. โมเลกุลรีคอมบิแนนท์ DNA ที่ประกอบด้วย โมเลกุลของ DNAตามข้อถือสิทธิที่ 1 และเวกเตอร์ดีเอนเอ 3. โมเลกุลรีคอมบิแนนท์ DNA ตามข้อถือสิทธิที่ 2 โดยที่DNA ของเวกเตอร์ประกอบด้วยพลาสมิดที่คัดเลือกจาก : pMSG,pKC, pBR322, pUC หรือระบบ pUR; zPIP Neo SV (X) ; pLK57หรือ pLK58 ตามที่กำหนดมาข้างต้นในที่นี้ 4. โมเลกุลรีคอมบิแนนท์ DNA ตามข้อถือสิทธิที่ 2 หรือข้อถือสิทธิที่ 3 โดยที่ลำดับควบคุมการแสดงลักษณะนั้นต่อกับโมเลกุลของ DNA ในลักษณะที่ทำงานได้ 5. โมเลกุลรีคอมบิแนนท์ DNA ตามข้อถือสิทธิที่ 5 โดยที่ลำดับควบคุมการแสดงลักษณะนั้นคัดเลือกจากยีน บีตา-กาแลคโทสิเดสของ E.coli โอเทอรอน trp โพรโมเตอร์ทางซ้ายของแบเทอริโอฟาจ ? ลำดับซ้ำยาวทางปลายของไวรัส Moloney Leukaemia ไวรัสเนื้องอกเต้านมของหนู และโพรโมเตอร์ระยะแรกของ SV40 6. ยีนหลอมที่ประกอบด้วยโพรโมเตอร์ที่ย้ายที่ได้ จุดเริ่มการแปลรหัส และยีนที่มีรหัสสำหรับมีแนตทิลิน 7. เจ้าบ้าน ทรานสฟอร์แมนท์ที่ทรานส์ฟอร์มด้วยโมเลกุลของรีคอมบิแนนท์ DNA อย่างน้อยหนึ่งตัวตามข้อถือสิทธิข้อใดๆ ของข้อ 2 ถึง 5 8. เจ้าบ้าน ทรานสฟอร์แมนท์ตามข้อถือสิทธิที่ 7 โดยที่เจ้าบ้านทรานสฟอร์แมนท์นั้นคัดเลือกจากแบคทีเรีย ยีสต์ ราอื่นๆหนู เจ้าบ้านที่เป็นสัตว์ เจ้าบ้านที่เป็นพืช และเซลล์เนื้อเยื่อของยูคาริโอท 9. เจ้าบ้าน ทรานสฟอร์แมนท์ตามข้อถือสิทธิที่ 8 โดยที่แบคทีเรียนั้นคัดเลือกจาก E.Coli กลุ่ม Pseudomonas และกลุ่ม Bacillus 1 0. เจ้าบ้าน ทรานสฟอร์แมนท์ตามข้อถือสิทธิที่ 8 โดยที่เซลล์เนื้อเยื่อยูคาริโอติคนั้นคัดเลือกจากเซลล์แลงเซลล์ของคนและเซลล์ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมอื่นๆ 1 1. รีคอมบิแนนท์เพบไทด์ที่ประกอบด้วยลำดับกรดอะมิโนดังที่แสดงไว้ในรูปที่ 23 หรือเป็นบางส่วนของมันที่มีแอคติวิถีทางชีวภาพและทางอิมมูนของมิแนคทิวิน 1 2. รีคอมบิแนนท์เพบไทด์ตามข้อถือสิทธิที่ 11 เมื่อได้รับการทำให้บริสุทธิ์จนเป็นเนื้อเดียวกัน 1 3. รีคอมบิแนนท์เพบไทด์ตามข้อถือสิทธิที่ 11 หรือ 12 เมื่อแสดงลักษณะโดยเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม 1 4. พอลิเพบไทด์ที่อนุพันธ์จากรีคอมบิแนนท์มิแนคทิวินบริสุทธิ์โดยที่พอลิเพบไทด์นี้มีลักษณะเฉพาะของมิแนคทิวิน 1 5. พอลิเพบไทด์ตามข้อถือสิทธิข้อใดๆ ของข้อถือสิทธิข้อ 11ถึง 14 เมื่อเตรียมโดยกรรมวิธีตามข้อถือสิทธิข้อใดๆ ของข้อ31 ถึง 46 1 6. พอลิเพบไทด์ที่เตรียมจากจุลชีพทรานสฟอร์ม ที่พอลิเพบไทด์ทั้งหมดหรือบางส่วน มีลำดับกรดอะมิโนของมิแนคทิวิน 1 7. โพรบ (probe) โอลิโกนิวคลีโอไทด์สังเคราะห์ โพรบจะประกอบด้วยโมเลกุลนิวคลีโอไทด์ที่แปลรหัสและแสดงรหัสสำหรับลำดับกรดอะมิโนของพอลิเพบไทด์ตามข้อถือสิทธิข้อใดๆ ของข้อ11 ถึง 16 1 8. กรรมวิธีสำหรับผลิตโมเลกุล CDNA ที่ทำหน้าที่เป็นลำดับที่มีรหัสของลำดับกรดอะมิโนของมิแนคทิวิน ซึ่งกรรมวิธีประกอบด้วย แยก RNA จากเซลล์ยูคาริโอท (eukaryotic cells) ที่แสดงลักษณะของมิแนคทิวิน แยก mRNA ของมัน สังเคราะห์โมเลกุลของDNA สายคู่ที่เป็นคู่สมกับโมเลกุล mRNA สอดใส่โมเลกุลของDNA เข้าไปในพาหะของการโคลนที่ขยายพันธ์ได้เอง ทรานสฟอร์มเซลล์เจ้าบ้านด้วยพาหะรีคอมบิแนนท์โคลนนิ่งเลือกเซลล์เจ้าบ้านที่ได้รับการทรานสฟอร์ม โดยที่โมเลกุลของ DNA ที่สอดใส่รหัสสำหรับมิแนคทิวิน หรือส่วนของมิแนคทิวิน และแสดงลักษณะของโมเลกุลDNA ที่สอดใส่ซึ่งอยู่ภายในพาหะโคลนนิงของเซลล์เจ้าบ้านที่ได้รับการทรานสฟอร์ม 1 9. กรรมวิธีสำหรับผลิต eDNA ที่มีรหัสของมิแนคทิวิน หรือส่วนของมิแนคทิวินที่มีลักษณะเฉพาะของมิแนคทิวิน หรือส่วนของมิแนคทิวินที่แสดงแอคติวิถีทางอิมมูนหรือชีวภาพของมิแนคทิวินและแสดงลักษณะของโมเลกุลนั้นในเจ้าบ้านรีคอมบิแ นนท์ที่มีกรรมวิธีอันประกอบด้วย a. แยก mRNA จากเซลล์สายพันธุ์ที่เหมาะสม b. สร้างกลุ่ม cDNA จาก mRNA c. ทำการโคลนกลุ่ม cDNA จาก (b) เข้าไปในเจ้าบ้านที่เหมาะสม และ d. ตรวจหาโคลนที่มียีนมิแนคทิวินทั้งหมดหรือบางส่วนของยีนมิแนคทิวินเป็นอนุพันธ์ของมันหรือผสมกันของข้างต้น 2 0. กรรมวิธีตามข้อถือสิทธิที่ 19 โดยที่เจ้าบ้านที่เหมาะสมคือ E.Coli หรือแบคเทอร์โอฟาจ แลมดา 2 1. กรรมวิธีตามข้อถือสิทธิที่ 19 หรือ 20 โดยตรวจเอกลักษณ์ของโคลนดังนี้ a) เลือกไฮบริคและถอดรหัส b) ทำไฮบริคเซชันกับลำดับ DNA ตัวตามที่ได้จากการสังเคราะห์ทางเคมี โดยเฉพาะอย่างยิ่งตัวตามที่ประกอบด้วยตัวตามสังเคราะห์โอลิโกนิวคลีโอไทด์ตามการประดิษฐ์นี้ c) ทำการไฮบริไดส์จำแนกโดยใช้ cDNA ที่ติดฉลากซึ่งสังเคราะห์จาก mRNA ที่ถูกชักนำและไม่ถูกชักนำ d) ทำการคัดเลือกกลุ่ม cDNA ที่ถอดรหัสได้โดยใช้วิธีทางภูมิคุ้มกันตือใช้แอนติบอดีต่อมิแนคทิวินหรอโมเลกุลอื่นที่มีความคล้ายคลึงทางภูมิคุ้มกัน และ/หรือ e) ตรวจหากลุ่ม cDNA ที่ถอดรหัสให้สารที่มีฤทธิ์ทางชีวภาพโดยใช้ยูโรไคเนสที่ติดฉลากหรือยูโรไคเนสและแอนติบอดีต่อยูโรไคเนส 2 2. กรรมวิธีตามข้อถือสิทธิที่ 21 โดยที่ทีเอนเอโพรบดังกล่าวเป็นโพรบโอลิโกนิวคลีโอไทด์สังเคราะห์ ตามข้อถือสิทธิที่ 17 2 3. กรรมวิธีตามข้อถือสิทธิข้อใดๆ ของข้อถือสิทธิ 19 ถึง22 ซึ่งกรรมวิธีประกอบด้วยการเพิ่มเติมของการคัดแยกโคลนของcDNA ที่ให้ผลบวกโดยใช้ไพร์มเมอร์จำเพาะเพื่อให้ได้ลำดับทางปลายที่จำเป็นต่อการที่จะได้ยีนมิแนคทิวินที่สมบูรณ์ 2 4. กรรมวิธีสำหรับให้ได้ cDNA ที่มีรหัสมิแนคทิวิน และแสดงลักษณะโมเลกุลนั้นในเจ้าบ้านรีคอมบิแนนท์โดยที่กรรมวิธีนั้นประกอบด้วย A. ชักนำให้เซลล์กระตุ้นการสร้างและถอดรหัสให้มิแนคทิวิน B. แยก mRNA จากเซลล์สายพันธุ์ที่เหมาสม C. ถอดรหัส mRNA แบบอินวิโทร และตกตะกอนผลิตภัณฑ์ที่ได้แบบภูมิคุ้มกันโดยให้เกิดสารประกอบเชิงซ้อนกับยูโรไคเนส D. แยกลำดับส่วน mRNA จาก (B) แล้วตรวจหาลำดับส่วนที่มีแอคติวิถีในการถอดรหัสให้มิแนคทิวิน E. สร้างกลุ่ม cDNA จาก mRNA จาก (B) และ (D) F. โคลนกลุ่ม cDNA จาก (E) เข้าไปในเซลล์เจ้าบ้านที่เหมาะสมเช่น E.Coli หรือแบคเทอร์โอฟาจ แลมป์ ดา G. ตรวจหาโคลนที่มียีนของมิแนคทิวิน โดย a) ทำการเลือกไฮบริคและทำทรานสเลชันโดยใช้ (C) b) ทำไฮบริไดเซชันกับตัวตามลำดับ DNA ที่สังเคราะห์ทางเคมีโดยเฉพาะตัวตามที่ประกอบด้วยตัวตามโอลิโกนิวคลีโอไทด์สังเคราะห์ตามการประดิษฐ์นี้ c) ทำการไฮบริไดส์จำแนกโดยใช้ eDNA ติดฉลากซึ่งสังเคราะห์จาก mRNA ที่ถูกชักนำและไม่ถูกชักนำ d) ตรวจหากลุ่ม cDNA ที่ถอดรหัสด้วยวิธีทางภูมิคุ้มกันโดยใช้ แอนติบอดีต่อมิแนคทิวินหรือโมเลกุลที่มีความคล้ายคลึงทางภูมิคุ้มกัน e) ตรวจหากลุ่ม cDNA ที่ถอดรหัสให้สารที่มีฤทธิ์ทางชีวภาพโดยใช้ยูโรไคเนสที่ติดฉลากหรือยูโรไคเนสและแอนติบอดีต่อยูโรไคเนส H. ต่อสายยีนที่โคลน โดยทำจากกลุ่ม cDNA โดยใช้โอลิโกนิวคลีโอไทด์ไพรเมอร์ที่ได้จากลำดับยีนมิแนคทิวินบางส่วน โดยเฉพาะลำดับไฮลิโกนิวคลีโอไทด์ที่เปิดเผยในขอบเขตของการประดิษฐ์นี้ I. หาลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีนมิแนคทิวิน J. ถอดรหัสยีนมิแนคทิวินใน E. coli K. ถอดรหัสรีคอมบิแนนท์มิแนคทิวินที่มีฤทธิ์ทางชีวภาพโดยการโคลนในเซลล์เจ้าบ้านชนิดอื่น เช่น เซลล์สัตว์หลายเซลล์และ/หรือ L. ทำรีคอมบิแนนท์มิแนคทิวินให้บริสุทธิ์แล้วหาสมบัติทางชีวภาพต่อการนำไปใช้รักษา 2 5. กรรมวิธีตามข้อถือสิทธิที่ 24 โดยที่เจ้าบ้านที่เหมาะสมคือ E. coli หรือแบคเทอริโอฟาจแลมดา 2 6. กรรมวิธีตามข้อถือสิทธิที่ 24 หรือ 25 โดยที่ DNA โพรบเป็นโพรบโอลิโกนิวคลีโอไทด์สังเคราะห์ตามข้อถือสิทธิที่ 17 2 7. กรรมวิธีตามข้อถือสิทธิข้อใดข้อหนึ่งของข้อถือสิทธิที่24 ถึง 26 โดยที่เจ้าบ้านในทางเลือกอื่นเป็นเซลล์ยูคาริโอท 2 8. กรรมวิธีการเตรียมโมเลกุลของรีคอมบิแนนท์ DNA ตามข้อถือสิทธิใดๆ จากข้อ 2 ถึง 5 ซึ่งประกอบด้วยการรวมพาหะ DNAกับลำดับ DNA ตามข้อถือสิทธิที่ 1 2 9. กรรมวิธีตามข้อถือสิทธิที่ 28 ซึ่งในกระบวนกรารจะเติมการสอดใส่ลำดับควบคุมการถอดรหัสเข้าไปใน DNA พาหะ 3 0. กรรมวิธีในการทรานสฟอร์มเจ้าบ้าน ซึ่งประกอบด้วยนำโมเลกุลของรีคอมบิแนนท์ DNA เข้าไปในเซลล์เจ้าบ้านตามข้อถือสิทธิข้อใดข้อหนึ่งจาก 2 ถึง 5 กรรมวิธีในการเตรียมเพบไทด์ที่ได้มาจากมิแนคทิวินบริสุทธิ์ซึ่งประกอบด้วยการทำมิแนคทิวินให้บริสุทธิ์เป็นเอกพันธ์แล้วหาลำดับกรดอะมิโนที่เป็นเอกลักษณ์ของมิแนคทิวิน 3 1. กรรมวิธีสำหรับการเตรียมเพบไทด์ที่อนุพันธ์จากรีคอมบิแนนท์มิแนคทิวินบริสุทธิ์ที่กรรมวิธีประกอบด้วยการทำให้รีคอมบิแนนท์มิแนคทิวินบริสุทธิ์เป็นเนื้อเดียวกันแล้วได้ลำดับกรดอะมิโนที่มีลักษณะเฉพาะของมิแนคทิวินโดยการตัดรีคอม บิแนนท์มิแนคทิวินที่บริสุทธิ์ 3 2. กรรมวิธีตามข้อถือสิทธิที่ 31 ซึ่งประกอบด้วย a) เพาะเลี้ยงเซลล์สายพันธ์ที่สามารถถอดรหัสให้มิแนคทิวิน b) เก็บน้ำเลี้ยงเซลล์ c) แยกลำดับส่วนน้ำเลี้ยงเซลล์โดยการทำโครมาโตกราฟีและอีเลกโทรโฟรีลีส d) วิเคราะห์ลำดับส่วนที่มีแอคติวิถีของมิแนคทิวินและ/หรือ e) หาลำดับกรดอะมิโนที่เป็นเอกลักษณ์ของมิแนคทิวิน 3 3. กรรมวิธีตามข้อถือสิทธิ 32 ซึ่งประกอบด้วย a) เพาะเลี้ยงเซลล์สายพันธ์ที่ผลิตมิแนคทิวิน b) เก็บน้ำเลี้ยงเชื้อที่มีมิแนคทิวินนำมาทำให้เข้มข้น c) แยกลำดับส่วนของของเหลวที่ได้โดยการทำโครมาโตกราฟีด้วยตัวกลางเป็นไฮโดรโฟบิค และ/หรือ ตัวกลางแลกเปลี่ยนประจุ d) นำมิแนคทิวินที่เตรียมได้แยกลำดับส่วนโดยการทำโครมาโตกราฟีบนเจล e) นำของเหลวส่วนที่มีมิแนคทิวินมาทำไอโซอีเลคโทรโฟคัสซิงและ/หรือ f) นำลำดับส่วนที่มีมิแนคทิวินมาแยกลำดับส่วนโดยพาร์ทิชันโครมาโตกราฟี 3 4. กรรมวิธีตามข้อถือสิทธิที่ 32 หรือ 33 โดยที่เซลล์เพาะเลี้ยงได้รับการเลี้ยงโดยไม่มีซีรัม และ/หรือ มีสารหนึ่งหรือมากกว่าหนึ่งตัวในปริมาณที่เพียงพอสำหรับยับยั้งการสร้างยูโรไคเนส หรือชักนำการสร้างมิแนคทิวินอย่างต่อเนื่อง 3 5. กรรมวิธีตามข้อถือสิทธิ 34 โดยที่สารนั้นคือเดกซาเมธาโซน 3 6. กรรมวิธีตามข้อถือสิทธิข้อใดข้อหนึ่งจาก 32 ถึง 35 โดยการเลี้ยงเซลล์เมื่อมี PMA 3 7. กรรมวิธีตามข้อถือสิทธิข้อใดข้อหนึ่งจาก 32 ถึง 36 โดยที่การทำให้เข้มข้นขึ้นเริ่มต้นทำโดยใช้ hollow fibre dialysis/concentration unit ที่มีคาร์ทริดจ์ซึ่งมีเมมเบรนที่มีรูขนาดเหมาะสม 3 8. กรรมวิธีตามข้อถือสิทธิข้อใดข้อหนึ่งจากข้อ 33 ถึง 37โดยการทำโครมาโตกราฟีแบบไฮโดรโฟบิค และ/หรือ การแลกเปลี่ยนประจุ ใช้คอลัมน์ของเฟนิล-เซฟาโรส 3 9. กรรมวิธีตามข้อถือสิทธิ 38 โดยการฃะคอลัมน์นั้นซะด้วยpH เป็นขั้นๆ อีเลคโทรโฟลัสซิงเจลด้วย 1 โมลาร์ไกลซีน ที่มี 1 มิลลิโมลาร์ EDTA pH 9.0 4

1. กรรมวิธีตามข้อถือสิทธิข้อใดข้อหนึ่งจากข้อ 33 ถึง 39โดยการติดตามลำดับส่วนของการทำอีเลคโทรโฟลัสซิงด้วยแอนติบอดีเพื่อหาแถบมิแนคทิวิน 4

2. กรรมวิธีตามข้อถือสิทธิข้อใดข้อหนึ่งจากข้อ 33 ถึง 41โดยขั้นตอนของพาร์ทิชันโครมาโตกราฟีคือ HPLC 4

3. กรรมวิธีตามข้อถือสิทธิข้อใดข้อหนึ่งจากข้อ 33 ถึง 42โดยย่อยมิแนคทิวนบริสุทธิ์ด้วยเอนโดโปรตีเนส LysC 4

4. กรรมวิธีตามข้อถือสิทธิข้อใดข้อหนึ่งจากข้อ 33 ถึง 43โดยแยกเพบไทด์ที่ได้โดย HPLC 4

5. กรรมวิธีการผลิตมิแนคทิวินที่ไม่ได้เติมหมู่ไกลโคไซด์ซึ่งประกอบด้วย เตรียมยีนที่เป็นรหัสของมิแนคทิวินจาก mRNA ที่ได้จากเซลล์ไลน์โมโนไซท์ ใส่ยีนที่ได้เข้าไปในจุลชีพโปรคาริโอทคัดเลือกและเลี้ยงจุลชีพนั้นให้ผลิตมิแนคทิวินที่ไม่มีการ เติมไกลโคไซด์และเก็บมิแนคทิวินที่ไม่มีการเติมไกลโคไซด์ดังกล่าว 4

6. กรรมวิธีสารผลิตพอลิเพบไทด์ที่ประกอบด้วยส่วนของมิแนคทิวินที่มีลักษณะเฉพาะของมิแนคทิวินโดยกรรมวิธีประกอบด้วย เลี้ยงเจ้าบ้านที่ได้รับการทรานสฟอร์มด้วยโมเลกุลของรีคอมบิแนนท์ดีเอนเอ ซึ่งรวมถึงโมเลกุลของดีเอนเอที่ทำหน้าที่เป็นลำดับที่มีรหัสของลำดับกรดอะมิโนของมิแนคทิวินและเก็บพอลิเพบไทด์ดังกล่าว 4

7. กรรมวิธีสำหรับผลิตโอลิโกนิวคลีโอไทด์โพรบสังเคราะห์ตามข้อถือสิทธิที่ 17 โดยกรรมวิธีประกอบด้วยการหาลำดับกรดอะมิโนของชิ้นส่วนเพบไทด์ที่อนุพันธ์จากมิแนคทิวินบริสุทธิ์ และสังเคราะห์โอลิโกนิวคลีโอไทด์ที่สอดคล้องด้วย