TH17537Y - กระบวนการเตรียมกล้าเชื้อยีสต์ Pichia pastoris สำหรับกระบวนการหมักแบบเหลวในระดับขยายขนาด - Google Patents

Abstract

------29/01/2563------(OCR) หน้า 1 ของจำนวน 1 หน้า บทสรุปการประดิษฐ์ การประดิษฐ์นี้เกี่ยวกับการพัฒนากระบวนการการเตรียมกล้ายีสต์ Pichia postoris ด้วยวิธีการปรับกิจกรรมการเจริญเติบโตของเซลล์ ที่ประกอบด้วยขั้นตอน การเพาะเลี้ยงเซลล์ยีสต์ขั้นต้น การเพาะเลี้ยงเซลล์แบบความหนาแน่นสูง และการเตรียมคลังกล้าเชื้อที่มีความหนาแน่นของเซลล์สูงในรูปสารละลายแช่แข็ง โดยกระบวนการดังกล่าวทำให้ได้กล้าเชื้อที่มีประสิทธิภาพ โดยไม่มีระยะการปรับตัวของเซลล์ในการปลูกลงในอาหารเลี้ยงเชื้อชนิดต่างๆ ซึ่งจะช่วยลดระยะเวลาในการหมักและลดต้นทุนในส่วนค่าดำเนินการในระบบการผลิตชีวมวลเซลล์หรือสารชีวภัณฑ์ด้วยกระบวนการหมัก นอกจากนี้ กล้าเชื้อยีสต์ที่ได้จากกระบวนการดังกล่าวยังเหมาะสำหรับนำไปใช้ในการเตรียมคลังกล้าเชื้อในรูปแช่แข็งที่มีประสิทธิภาพ สำหรับเก็บไว้ใช้ในการหมักแบบเหลว หรือนำกล้าเชื้อดังกล่าวไปใช้โดยตรงในการหมักแบบเหลว อีกทั้งยังเหมาะสำหรับใช้เป็นกล้าเชื้อในการหมักยีสต์แบบความหนาแน่นเซลล์สูงในระดับขยาย และระดับอุตสาหกรรม เพื่อผลิตสารชีวภัณฑ์เป้าหมายจากยีสต์ P. postoris สำหรับใช้ในอุตสาหกรรมอาหาร อาหารสัตว์ และเอนไซม์ ------------ หน้า 1 ของจำนวน 1 หน้า บทสรุปการประดิษฐ์ การประดิษฐ์นี้เกี่ยวกับการพัฒนากระบวนการการเตรียมกล้ายีสต์ Pichia pastoris ด้วยวิธีการปรับ กิจกรรมการเจริญเติบโตของเซลล์ ที่ประกอบด้วยขั้นตอน การเพาะเลี้ยงเซลล์ยีสต์ขั้นต้น การเพาะเลี้ยงเซลล์ แบบความหนาแน่นสูง และการเตรียมคลังกล้าเชื้อที่มีความหนาแน่นของเซลล์สูงในรูปสารละลายแช่แข็ง โดย กระบวนการดังกล่าวทำให้ได้กล้าเชื้อที่มีประสิทธิภาพ โดยไม่มีระยะการปรับตัวของเซลล์ในการปลูกลงใน อาหารเลี้ยงเชื้อชนิดต่างๆ ซึ่งจะช่วยลดระยะเวลาในการหมักและลดต้นทุนในส่วนค่าดำเนินการในระบบการ ผลิตชีวมวลเซลล์หรือสารชีวภัณฑ์ด้วยกระบวนการหมัก นอกจากนี้ กล้าเชื้อยีสต์ที่ได้จากกระบวนการดังกล่าว ยังเหมาะสำหรับนำไปใช้ในการเตรียมคลังกล้าเชื้อในรูปแช่แข็งที่มีประสิทธิภาพ สำหรับเก็บไว้ใช้ในการหมัก แบบเหลว หรือนำกล้าเชื้อดังกล่าวไปใช้โดยตรงในการหมักแบบเหลว อีกทั้งยังเหมาะสำหรับใช้เป็นกล้าเชื้อใน การหมักยีสต์แบบความหนาแน่นเซลล์สูงในระดับขยาย และระดับอุตสาหกรรม เพื่อผลิตสารชีวภัณฑ์ เป้าหมายจากยีสต์ p. pastoris สำหรับใช้ในอุตสาหกรรมอาหาร อาหารสัตว์ และเอนไซม์

Claims (3)

------29/01/2563------(OCR) หน้า 1 ของจำนวน 2 หน้า ข้อถือสิทธิ1. กระบวนการเตรียมกล้าเชื้อยีสต์ P. pastoris สำหรับกระบวนการหมักแบบเหลวในระดับขยายขนาด ประกอบด้วยขั้นตอนดังนี้ ก) การเพาะเลี้ยงเซลล์ยีสต์ขั้นต้น โดยเลี้ยงเซลล์ยีสต์ในอาหารเลี้ยงเชื้อเหลวชนิดวายพีดี ที่อุณหภูมิ 28-30 องศาเซลเซียส อัตราการเขย่า 150-250 รอบต่อนาที เป็นเวลา 14-18 ชั่วโมง จากนั้นนำเซลล์ยีสต์ที่ได้มาเลี้ยงใน อาหารเลี้ยงเชื้อสูตรดัดแปลงไฮ-อินนอค บีเอสเอ็ม ที่อุณหภูมิ 28-30 องศาเซลเซียส อัตราการเขย่า 150-250 รอบต่อนาที เป็นเวลา 72-96 ชั่วโมง หรือจนกว่าเซลล์จะเข้าสู่ระยะการเติบโตลด ข) การเพาะเลี้ยงเซลล์แบบความหนาแน่นสูง โดยนำเซลล์ยีสต์ที่ได้จากข้อ ก) มาถ่ายลงในถังปฏิกรณ์ชีวภาพที่มีอาหารเลี้ยงเชื้อสูตร ดัดแปลงไฮ-อินนอค บีเอสเอ็ม ที่อุณหภูมิ 28-30 องศาเซลเซียส อัตราการกวน 300-400 รอบต่อ นาที อัตราการให้อากาศ 1.0-1.5 ลิตรต่อลิตรต่อนาที ค่าการละลายของออกซิเจนในน้ำหมักที่ร้อยละ 15-25 ของค่าการละลายของออกซิเจนอิ่มตัว ค่าพีเอช 5.5-6.5 เป็นเวลา 16-18 ชั่วโมง จากนั้นเติม สารละลายกลูโคสเข้มข้นร้อยละ 50-70 โดยน้ำหนักต่อปริมาตร และเติมสารละลายพีทีเอ็ม1 ดัดแปลงในอัตรา 13 มิลลิลิตรต่อชั่วโมง เลี้ยงไปจนกระทั่งได้เซลล์ที่มีความเข้มข้น 35-40 กรัมเซลล์ แห้งต่อลิตร แล้วเก็บเกี่ยวเชื้อด้วยวิธีปลอดเชื้อ ค) การเตรียมคลังกล้าเชื้อยีสต์ที่มีความหนาแน่นของเซลล์สูงในรูปสารละลายแช่แข็ง ด้วยสารละลายกลี เซอรอล2. กระบวนการเตรียมกล้าเชื้อยีสต์ P. pastoris ตามข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ซึ่ง อาหารเลี้ยงเชื้อสูดดัดแปลงไอ- อินนอค บีเอสเอ็ม มีองค์ประกอบดังนี้ คือ กลูโคส 8-20 กรัม, สารละลายกรดฟอสฟอริก (ความเข้มข้น 85 เปอร์เซ็นต์ โดยน้ำหนักต่อปริมาตร) 26.7 มิลลิลิตร, แคลเซียมซัลเฟต 0.93 กรัม, โพแทสเซียมซัลเฟต 18.2 กรัม, แมกนีเซียมซัลเฟต เฮปตะซัลเฟต 14.9 กรัม, โพแทสเซียมไฮดรอกไซด์ 4.13 กรัม, กรดอะมิโนฮีสทีดีน 2.5-5.0 มิลลิกรัม, กรดอะมิโนกลูตามิก 2.5-5.0 มิลลิกรัม, กรดอะมิโนลิวซีน 2.5-5.0 มิลลิกรัม, กรดอะมิโนไอโซลิวซีน 2.5-5.0 มิลลิกรัม และสารละลายสูตรดัดแปลงพีทีเอ็ม1 6.67 มิลลิลิตร3. กระบวนการเตรียมกล้าเชื้อยีสต์ P. pastoris ตามข้อถือสิทธิที่ 2 ที่ซึ่ง สารละลายพีทีเอ็ม 1 ดัดแปลง ประกอบด้วย คอปเปอร์ซัลเฟต เพนตะไอเดรท 6.0 กรัม, โพแทสเซียมไอโดไดด์ 0.08 กรัม, แมงกานีส ซัลเฟต โมโนไฮเดรท 3.0 กรัม, โซเดียมโมลิบเดต ไดไอเดรท 0.2 กรัม, กรดบอริค 0.02 กรัม, ซิงค์คลอไรด์ 20.0 กรัม, ไอออนไตรคลอไรด์ 13.7 กรัม, โคบอลทีคลอไรด์ เอกซะไอเดรท 0.9 กรัม, สารละลายกรดซัล ฟุริก 2 มิลลิลิตร, กรดอะมิโนรีสทีดีน 0.375 กรัม, กรดอะมิโนกลูตามิก 0.375 กรัม, กรดอะมิโนลิวซีน 0.375 กรัม, กรดอะมิโนไอโซลิวซีน 0.375 กรัม และไบโอติน 0.3 กรัม และถูกปรับปริมาตรด้วยน้ำเป็น 1 ลิตร หน้า 2 ของจำนวน 2 หน้า4. กระบวนการเตรียมกล้าเชื้อยีสต์ P. pastoris ตามข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ซึ่ง กล้าเชื้อยีสต์ P. postoris ดังกล่าว ถูกเก็บในรูปสารละลายแช่แข็ง โดยผสมกับสารละลายกลีเซอรอลที่ความเข้มข้น 15-30 เปอร์เซ็นต์ โดย น้ำหนักต่อปริมาตร โดยผสมกันในอัตราส่วนระหว่างน้ำหมักที่มีเซลล์ยีสต์ ต่อสารละลายกลีเซอรอล เท่ากับ 1 ต่อ 1 ------------ หน้า 1 ของจำนวน 2 หน้า ข้อถือสิทธิ

1. กระบวนการเตรียมกล้าเชื้อยีสต์ p. pastoris สำหรับกระบวนการหมักแบบเหลวในระดับขยายขนาด ประกอบด้วยขั้นตอนดังนี้ ก) การเพาะเลี้ยงเซลล์ยีสต์ขั้นต้น โดยเลี้ยงเซลล์ยีสต์ในอาหารเลี้ยงเชื้อเหลวชนิดวายพีดี ที่อุณหภูมิ 28-30 องศาเซลเซียส อัตราการเขย่า 150-250 รอบต่อนาที เป็นเวลา 14-18 ชั่วโมง จากนั้นนำเซลล์ยีสต์ที่ได้มาเลี้ยงใน อาหารเลี้ยงเชื้อสูตรดัดแปลงไฮ-อินนอค บีเอสเอ็ม ที่อุณหภูมิ 28-30 องศาเซลเซียส อัตราการเขย่า 150-250 รอบต่อนาที เป็นเวลา 72-96 ชั่วโมง หรือจนกว่าเซลล์จะเข้าสู่ระยะการเติบโตลด ข) การเพาะเลี้ยงเซลล์แบบความหนาแน่นสูง โดยนำเซลล์ยีสต์ที่ได้จากข้อ ก) มาถ่ายลงในถังปฏิกรณ์ชีวภาพที่มีอาหารเลี้ยงเชื้อสูตร ดัดแปลงโฮ-อินนอค บีเอสเอ็น ที่อุณหภูมิ 28-30 องศาเซลเซียส อัตราการกวน 300-400 รอบต่อ นาที อัตราการให้อากาศ 1.0-1.5 ลิตรต่อลิตรต่อนาที ค่าการละลายของออกซิเจนในน้ำหมักที่ร้อยละ 15-25 ของค่าการละลายของออกซิเจนอิ่มตัว ค่าพีเอซ 5.5-6.5 เป็นเวลา 16-18 ชั่วโมง จากนั้นเติม สารละลายกลูโคสเข้มข้นร้อยละ 50-70โดยน้ำหนักต่อปริมาตร และเติมสารละลายพีทีเอ็ม 1 ดัดแปลง ในอัตรา 13 มิลลิลิตรต่อชั่วโมง เลี้ยงไปจนกระทั่งได้เซลล์ที่มีความเข้มข้น 35-40 กรัมเซลล์ แห้งต่อลิตร แล้วเก็บเกี่ยวเชื้อด้วยวิธีปลอดเชื้อ ค) การเตรียมคลังกล้าเชื้อที่มีความหนาแน่นของเซลล์สูงในรูปสารละลายแช่แข็ง นำน้ำหมักที่มีเซลล์ยีสต์ที่ได้จากข้อ ข) มาผสมกับสารละลายกลีเซอรอลที่ความเข้มข้น 15- 30 เปอร์เซ็นต์ โดยน้ำหนักต่อปริมาตร โดยผสมถันในอัตราส่วนระหว่างน้ำหมักที่มีเซลล์ยีสต์ ต่อ สารละลายกลีเซอรอล เท่ากับ 1 ต่อ 1

2. กระบวนการเตรียมกล้าเชื้อยีสต์ p. pastoris ตามข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ซึ่ง อาหารเลี้ยงเชื้อสูดดัดแปลงไฮ-อิน นอค บีเอสเอ็ม มีองค์ประกอบดังนี้ คือ กลูโคส 8-20 กรัม, สารละลายกรดฟอสฟอริก (ความเข้มข้น 85 เปอร์เซ็นต์ โดยน้ำหนักต่อปริมาตร) 26.7 มิลลิลิตร, แคลเซียมซัลเฟต 0.93 กรัม, โพแทสเซียมซัลเฟต 18.2 กรัม, แมกนีเซียมซัลเฟต เฮปตะซัลเฟต 14.9 กรัม,โพแทสเซียมไฮดรอกไซด์ 4.13 กรัม, กรดอะมิโนฮีสทิตีน 2.5-5.0 มิลลิกรัม, กรดอะมิโนกลูตามิก 2.5-5.0 มิลลิกรัม, กรดอะมิโนลิวซีน 2.5-5.0 มิลลิกรัม, กรดอะมิโนโอโซลิวซีน 2.5-5.0 มิลลิกรัม และสารละลายสูตรดัดแปลงพีทีเอ็ม1 6.67 มิลลิลิตร หน้า 2 ของจำนวน 2 หน้า

3. กระบวนการเตรียมกล้าเชื้อยีสต์ p. pastoris ตามข้อถือสิทธิที่ 2 ที่ซึ่ง สารละลายพีทีเอ็ม 1 ดัดแปลง ประกอบด้วย คอปเปอร์ซัลเฟต เพนตะไฮเดรท 6.0 กรัม, โพแทสเซียมไอโดไดด์ 0.08 กรัม, แมงกานีส ซัลเฟต โมโนไฮเดรท 3.0 กรัม, โซเดียมโมสิบเดต ไดไฮเดรท 0.2 กรัม, กรดบอริค 0.02 กรัม, ซิงค์คลอไรต์ 20.0 กรัม, ไอออนไตรคลอไรต์ 13.7 กรัม, โคบอลท์คลอไรต์ เฮกซะไฮเดรท 0.9 กรัม, สารละลายกรดซีล ฟุริก 2 มิลลิลิตร, กรดอะมิโนรีสทิดีน 0.375 กรัม, กรดอะมิโนกลูตามิก 0.375 กรัม, กรดอะมิโนสิลิซีน 0.375 กรัม, กรดอะมิโนไอโซลิวซีน 0.375 กรัม และไบโอติน 0.3 กรัม และถูกปรับปริมาตรด้วยน้ำเป็น 1 ลิตร