(Л
С
:о X о :о У1 Изобретение относитс к области медицины, а именно микробиологии. Известен способ получени ауксотрофных мутантов холерных вибрионов путем выращивани исходной культуры в питательной среде с последующей обработкой полученной культуры мута геном, пассированием обратанной кул туры на плотных питательных средах отбором мутантов l . Однако известный способ сложен и имеет низкую частоту выделени му тантов при проведении генетических исследований. Целью изобретени вл етс повышение частоты выделени мутантов., Эта цель достигаетс тем, что пр осуществлении способа получени ауксотрофных мутантов холерных вибрионов путем выращивани исходной культуры в питательной среде с последующей обработкой полученной культуры мутагеном, пассированием обработанной культуры на плотных питательных средах и отбором мутантов , отличительной особенностью вл етс то, что исходную культуру выращивают жидкой питательной среде , в качестве мутагена используют умеренный холерный фаг и обработку провод т в полужидком агаре. Способ осуществл ют следующим об разом. Засевают петлю суточной агаровой культуры холерного вибриона в S МП бульона Мартена (рН 7,6-7,8) инкубируют при 37°С 4 ч. Затем 0,3 мл молодой культуры перенос т в пробирку с 4 мл 0,7%-ного агара, растопленного и остуженного до 45 и высевают двухслойным методом на поверхности 1,5% агара Мартена в чашке Петри. После застывани верхнего сло на газон культуры нанос т 2 капли умеренного холерного фага в виде дорожки. Посев став т в те мостат на сутки при температуре выращивани 37°С . На следуквдий день вырезают участки вторичного роста по дорожке фагового лизиса и помеща ют в пробирку с 5 мл физиологическо раствора. Центрифугируют содержилюе пробирки 20 мин при 3000 об/мин. На садочную жидкость удал ют, затем до бавл ют к осадку физиологический раствор до первоначального объема и пробирку помещают в термостат до следующего дн . Через сутки содержи мое пробирки центрифугиру1дт при те же услови х, удал ют надосадочную жидкость, добавл ют физиологический раствор. Пбхпученную суспензию титру ют до 10 И высевают из разведений 10 , 10 , по 0,1 мл на агаровые пластинки, чтобы получить рос изолированных колоний (основной посев ,исходна чашка).Выращивают 1824 ч при 37 С .Выросшие колонии методом реплик перенос т на минимальную среду.После 4а ч инкубации при 37 С с исходной чашки петлей отбирают колонии , не выросшие на минимальном агаре , и готов т взвесь в 1 мл физиологического раствора.По 1 капле взвеси нанос т на минимальный агар,агар Мартена и среды, содержащие ростовые добавки. Устанавливают зависимость от тех или иных факторов роста по общеприн той схеме Холлиде . Минимальную ере: ду готов т на забуферном агаре с добавлением сульфата аммони (0,5мл 20%-ного раствора на 100 мп), глю. козы (0,5 мл 40%-ного раствора на 100 мл). Аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основани добавл ют после предварительной стерилизации в концентрации 100,мкг/мл среды , витамины после дробной стерилизации в концентрации от 0,001 до 0,1 мкг/мл. Изученные колонии ауксотрофов пересевают с основного посева в столбик 0,3% агара и сохран ют прикомнатной температуре. Пример. Засевают петлю суточ ной агаровой культуры штамма холерных вибрионов Эль Тор 75 в 5 мл буль она Мартена (рН 7,6 - 7,8) и выращивают -при 37°С 4 ч. Затем 0,3 мл молодой растущей культуры внос т в 4 мл 0,7%-ного агара, растопленного и остуженного до 45С, и высевают двухслойным методом на поверхность 1,5%-ного агара Мартена. Через 20 мин на газон культуры нанос т 2 капли умеренного холерного фага 8556 в виде дорожки. Умеренный фаг 8556 получают из одноименного штамма холер ных вибрионов Эль Тор. Штамм - продуцент фага 8556 (инаба) хранитс в стобике 0,3% агара Мартена под слоем вазелинового масла. Фаг получают общепри тным методом. Умеренный фаг образует мутные негативные колонии с прозрачным ободком, в диаметре 1-2 мм. Относитс по П серологичемкому типу фага. Титр фага, используемого в предлагаемом способе, может варьировать от п. 10 - п.10 фагочастиц в 1 мл. После нанесени . фага на газон культуры посев став т в термостат на сутки при . На следующий день скальпелем вырезают участки лизиса с вторичным ростом фагоустойчивости культуры и помещают в пробирку с 5 мл физиологического раствора. Содержимое пробирки центрифугируют в течение 20 мин при 3000 об/мин, надосадочную жидкость удал ют, к осадку добавл ют физиологический раствор до первоначального объема, и культуру помещают в термостат при 37°С . Через 24 ч выращивани пробирку со взвесью центрифугируют при тех же услови х, как описано выше, удал ют надосадочную жидкость , добавл ет физиологический раствор к осадку. Полученную микробную суспензию титруют до 10 и высевают 10 по из разведений Ю , 10 0,1 МП на агаровые пластинки, чтобы получить рост изолированных колоний (основной посев, исходна чашка). Выросшие колонии перенос т на минимальную среду методом реплик. Отбор ауксотрофных мутантов, не выросших на минимальной среде, ведут через 2 суток наблюдени с основного посе ва. Петлей отбирают часть колонии с исходной чашки в 1 мл физиологического раствора в пробирке. По 1 капле взвеси нанос т на минимальный агар, агар Мартена и среды, содержащие ростовые добавки, по ойцеприн той схеме Холлиде . Учитывают результат. Через 1-3 суток выращивани при 37° отмечают рост на ага ре Мартена и средах, содержащих те или иные дополнительные факторы роста. На минимальной среде рост ауксотрофных мутантов отсутствует. Колонию ауксотрофного кутанта сни-. мают петлей ц исходной чашки в столбик О,3% агара и сохран ют при комнатной температуре. Предложенный способ применен на 7 штаммсис вибрионов Эль Тор; 75, 6216, 3639, 5879, 1861-34, 757, 8860, нелизогенных, с прототрофным типом питани . Установлено,что предложенный способ прост по технике выполнени , легко осуществим, сокращение числа переносов ауксотрофов позвол ет повысить частоту выделени мутантов при проведении генетических исследований.