SU546648A1

SU546648A1 - The method of obtaining the complex of proteolytic enzymes

Info

Publication number: SU546648A1
Application number: SU2173552A
Authority: SU
Inventors: Людмила Алексеевна Елякова; Эмма Павловна Козловская
Original assignee: Тихоокеанский институт биоорганической химии Дальневосточного научного центра АН СССР
Priority date: 1975-07-30
Filing date: 1975-07-30
Publication date: 1977-02-15

Description

1one

Изобретение относитс к ферментной про .мышленности.This invention relates to an enzyme enzyme.

Ближайши.м техническим решением по своей сущности и достигаемому положительному эффекту вл етс способ получени комплекса протеолитических ферментов, включающий гомогенизацию исходного сырь - гепатопанкреас криветок, осаждение комплекса ферментов сульфатом аммони и его выделение, например, путе.м гельфильтрации и ионооб.менной хроматографии, центрифугировани осадка с последующем диализом и высушиванием il.The closest technical solution in its essence and the achieved positive effect is a method of obtaining a complex of proteolytic enzymes, including the homogenization of the raw material - cryptocantic cryvatica, precipitation of the complex of ammonium sulfate and its separation, for example, by gel filtration and ion-exchange chromatography, centrifugation sediment followed by dialysis and drying il.

Однако в известиом способе получают комплекс ферментов, состо щий из трех ферментов карбоксипептидаз А и Б, а также трипоиноподобного фермента.However, a complex of enzymes consisting of three carboxypeptidase enzymes A and B, as well as a trypoin-like enzyme, is obtained in the lime process.

Цель изобретени - увеличение количества ферментов, вход щих в комплекс и обладающих широким Спектром действи на белок и белоксодержащие биополимеры, расширение сырьевой базы и утилизаци промышленных отходов.The purpose of the invention is to increase the number of enzymes that are included in the complex and have a broad spectrum of effect on protein and protein-containing biopolymers, expansion of the raw material base and utilization of industrial waste.

Дл этого в предложенном способе в качестве исходного сырь используют гепатопанкреас промысловых видов крабов Paraiithoides camtchatica или Paraiithoides platypus, или Paraiithoides brevipes, или Chionoecets opilio, или Telmessus cheiraqonus, или Erimacrus beckii.To this end, in the proposed method, the hepatopancreas of commercial crab species Paraiithoides camtchatica or Paraiithoides platypus, or Paraiithoides brevipes, or Chionoecets opilio, or Telmessus cheiraqonus, or Erimacrus beckii are used as a raw material.

гомогеиизирзют данное сырье в водном растворе при соотношении ткань;вода, равном 1 ; 3, гомогенат отстаивают и полученную при этом жидкую фазу очищают от примесей путем введени сульфата аммони до насыщени 0,3, отделени полученного при этом осадка и фильтрации жидкой фазы, после чего осаждают комплекс ферментов из очищенного раствора при его насыщении сульфатомhomogeiizyrzyut these raw materials in aqueous solution at a ratio of fabric; water, equal to 1; 3, the homogenate is defended and the liquid phase thus obtained is purified from impurities by introducing ammonium sulfate to a saturation of 0.3, separating the precipitate thus obtained and filtering the liquid phase, after which the complex of enzymes is precipitated from the purified solution when it is saturated with sulfate

аммони до 0,8.ammonium to 0.8.

Предложенный способ заключаетс в следующем .The proposed method is as follows.

Гепатопанкреас промысловых видов крабов, таких как Paraiithoides camtchatica, Paralithoides platypus, Paraiithoides brevipes, Chionoecets opilio, Telmessus cheiraqonus, Erimacrus beckii, гомогенизируют в водном растворе при соотношении ткань:вода, равном 1 : 3, затем гомогенат отстаивают и ввод т сульфат аммони до насыщени 0,3. Образовавшийс осадок отдел ют центрифугированием, а жидкую фазу фильтруют через слой ваты. После этого к полученному раствору добавл ют сульфат а.ммони до насыщени 0,8, гомогенат отстаивают и центрифуг 1руюг. Осадок, содержащий комплекс ферментов, раствор ют в дистиллированной воде, диализуют и лиофилизируют. Все оиерации осуществл ют при 4- . Комплекс ферментов, полученный по cnocoiiy, coACpi/i iiT Ть-ичс:-., карбоксниептцдазы А п Б, лейц 1иалИ1)10ие:тп1дазу, щелочные и нейтральные нротсазы. Ич 1 кг гепатонанкреа€ крабов получают 20 г ллофильного порсмика комплекса ферментов. Пример. 300 г генатонанкреас краба Pavaiiihoides canitscliaiica измельчают при 1000 об/мин в гомогенизаторе в течение 5 мин при соотно) ткань; вода, равном 1:3. Го огенат отстаивают Б течение 6 ч, затем при Hepe.MeLHiiBaHiui добав.ч ют но част м твердый сульфат а.ммоии до пасыи1енн 0,3, т. с. 158,426 г. После добавлени носледней HopiiiiH сульфата аммонии гомогеиаг оставл ют сто ть в теченне 4 ч при 4°С. Осадок отдел ют центрифугированием при 20000 об/ /М1ип в течение 1 ч. Полученную жндкую фазу фильтруют через слой ваты дл удалени нерастворимых лнпидов. К 825 мл нрозрачного раствора добавл ют но част м твердый сульфат аммони до насыщени 0,8, т. е. 270г. Гомогеиат отстаивают в течеиие 10 ч нрн 4°С и центрифугируют. Полученный осадок раствор ют в минимальном количестве дистиллированной воды (200 мл) и лталее диализуют через целлофан в течение 1 сут, нрнчем по истечении иервых 3 ч от начала диализа ировод т перемешивание на магнитной меиталке. Вначале периодически каждый час используют новую порцию дистиллированной воды. Отдиализоваииый раствор лиофильио высуHJHBEioT . Выход ирепарата по активности 68, Специфическа удельна актнвность, выраженна в едмг, равна 102,5, где за едииццу актнвиости нрнн то количество фермеитлого препарата, освобождаюп1,ее 1 мпкромопь амниокислоты в минуту (калибровочна крива иостроена по тирозину). Форм у л а изо б I) т и 1. Способ по; учеии коми.текса iipoieo.nrrjiческих ферментов, включающий гомогенизацию исходного сырь , осаждение комплекса ферментов сульфатом аммони н его выделение , отличающийс тем, что, с целью увеличени количества ферментов, вход щих в комн.текс, расншрени сырьевой базы и утнлизаднн промышленных , в качестве исходио:ч) сырь цс :ользу1от геиатоианкреас нромысл.овых видов крабов Paralithoidcs camicliatica , или Paralithoides р1а1урц8, или Рагаlilhoides brcvipes, или Chionoecels opilio, или Telrnessus cheiraqonus, или Erimacrus beekii, при этом гомогенизацию сырь осуществ-т ют в водном растворе при cooTHOHieHini ткань : : вода, равном 1:3, после чего гомогенат отетанвают н нолученную нрн этом жидкую фазу очищают от нрнмесей, а оса}кденне комплекса ферментов сульфатом ам.монн осуществл ют из очищенного раствора. 2.Способ по н. 1, отличающийс тем, что очнстку жидкой фазы от примесей осуи1ествл ют путем введенн сульфата аммонн до насыщени 0,3, отделени полученного при этом осадка н фильтрации жидкой фазы. 3.Способ по п. 1, от л и ч а ю щ н и с тем, что осаждают комнлекс ферментов из очищениого раствор-а при иасыщенпи его сульфатом аммони до 0,8. 11сточники информации, нри)1 тые во внимание ири экспертизе 1. Gates В. and Travis 1 Purification and Characterization of Carboxypeptidases A and В from u tiie white Shrimp Penqens setiferus cBiochemistry, 1973, 1 r, N° 10, 1867-1874.Hepatopancreas of commercial crab species, such as Paraiithoides camtchatica, Paralithoides platypus, Paraiithoides brevipes, Chionoecets opilio, Telmessus cheiraqonus, Erimacrus beckii, are homogenized in an aqueous solution at a ratio of cloth: water, 0%, and a number of 201, and is at a 31%, and is at a 31%, and you will be at the same time, and you will be at the same time, and you will be at a of 3), for a ratio of fabric, water, 0%, for a ratio of fabric, water, 0%, for a ratio of fabric, water, 0, 20% 0.3. The precipitate formed is separated by centrifugation, and the liquid phase is filtered through a layer of cotton wool. Thereafter, ammonium sulphate is added to the obtained solution to saturation of 0.8, the homogenate is settled and the centrifuges are poured. The precipitate containing the enzyme complex is dissolved in distilled water, dialyzed and lyophilized. All interactions are performed at 4-. The complex of enzymes obtained by cnocoiiy, coACpi / i iiT T-ichs: -., Carboxnieptzdase A p B, leuc 1 iAL I 1) 10: tp1 dazu, alkaline and neutral nrotsase. Ich 1 kg of hepatonancreatic crabs get 20 g llofilnogo porsmika complex enzymes. Example. 300 g of the crab Pavaiiihoides canitscliaiica crab genatonacreas are ground at 1000 rpm in a homogenizer for 5 minutes at a ratio of) fabric; water is 1: 3. The fire extinguish is defended for 6 hours, then with Hepe.MeLHiiBaHiui, but a portion of the solid ammonium sulphate is added to passive1,3, t. 158.426 g. After the addition of the lowermost HopiiiiH ammonium sulfate, the homogated is left to stand for 4 hours at 4 ° C. The precipitate was separated by centrifugation at 20,000 rpm for 1 hour. The resulting phase was filtered through a layer of cotton to remove insoluble lnpids. To 825 ml of the clear solution is added but parts of solid ammonium sulfate to a saturation of 0.8, i.e. 270 g. Homogeiatis is defended for 10 hours in a nrn of 4 ° С and centrifuged. The precipitate obtained is dissolved in a minimum amount of distilled water (200 ml) and then dialyzed through cellophane for 1 day, after a time interval of 3 hours from the start of dialysis, and conducting the stirring on a magnetic stirrer. Initially, periodically every hour use a new portion of distilled water. Liofilio solution dried out vialHJHBEioT. The output of the drug by activity 68, Specific specificity, expressed in mg, is equal to 102.5, where the amount of the pharmaceutical preparation is released per unit of amnioacid per minute (calibration curve and tyrosine). The forms of ala iso b I) t and 1. The method according to; teaching komi.teks iipoieo.nrrji enzymes, including the homogenization of the raw material, the precipitation of a complex of enzymes with ammonium sulfate and its isolation, characterized in that outcome: h) raw materials: use of geathoiancreas of nromuscular species of crabs; ini fabric:: water, equal to 1: 3, after which the homogenate is extruded into the resulting liquid phase; this liquid phase is purified from the mixtures, and the wasp of the complex of the enzyme complex with ammonium sulfate is made from the purified solution. 2. Method according to n. 1, characterized in that the cleaning of the liquid phase from the impurities of the sludge is introduced by introducing ammonium sulfate to a saturation of 0.3, separating the precipitate thus obtained and filtering the liquid phase. 3. The method according to claim 1, which is based on the fact that the complex of enzymes from the purification solution is precipitated with its ammonium sulphate up to 0.8 when saturated with ammonium sulphate. 11 sources of information, nr) 1 ts into account for examination 1. Gates B. and Travis 1 Purification and Characterization of Carboxy Peptidases A and B from white Shrimp Penqens setiferus cBiochemistry, 1973, 1 r, N ° 10, 1867-1874.