SU1740419A1 - Способ выделени глутамина - Google Patents

Abstract

Использование: в биотехнологии при получении глутамина, примен емого в пищевой и медицинской промышленности. Сущность изобретени : культуральную жидкость нейтрализуют при перемешивании фосфорной кислотой и фильтруют. Обессоленный фильтрат пропускают через колонку , заполненную катионитом КУ 2x8 в Н+-форме. Отсорбированный глутамин элю- ируют с колонки раствором щелочи и затем выдел ют его кристаллизацией из щелочного элюата. Выход продукта 75 - 80%, чистота не менее 98,5%.

Description

(Л

С

Изобретение относитс  к биотехнологии и касаетс  получени  глутамина, исполь- зуемого в пищев.ой и медицинской промышленности, конкретно выделени  его из кулътуральной жидкости.

Известен способ ионообменного выделени  глутамина, заключающийс  в том, что культуральную жидкость подкисл ют HCI до рН 3,5 и фильтруют. Фильтрат пропускают через колонну с сильнокислотным катио- нйтом дл  сорбции глутамина, последний элюируют слабым раствором аммиака, который отпаривают под вакуумом; раствор концентрируют при дальнейшем упаривании , очищают углем и дважды кристаллизуют из спирта.

Недостатки этого способа состо т в том, что будучи неустойчивым в кислой среде глу- тамин частично разлагаетс  в процессе сорбции , так как рН в фазе сильнокислотного катиона достигает0,5 - 0,7. Упаривание раствора также приводит к частичному разложению глутамина. В результате перечисленных факторов в процессе очистки тер ют 30-40% препарата.

Известен способ выделени  глутамина- та из растворов, состо щий в том, что раствор глутамина очищают от неорганических солей в электродиализаторе при рН 5,5 - 5,6 и затем кристаллизуют.

Однако электродиализ не освобождает глутамин от органических и пигментных примесей культуральной жидкости, которые преп тствуют кристаллизации. Поэтому данный метод не может самосто тельно быть использован в качестве промышленного способа производства глутамина.

Наиболее близким к предлагаемому  вл етс  способ выделени  глутамина, предусматривающийионообменную колоночную хроматографию фильтрата культуральной жидкости, очистку от примеVI

4 О ю

сей полученного глутаминсодержащего элюата и кристаллизацию целевого продукта .

Основной недостаток способа состоит в многостадийности процесса и больших по- тер х целевого продукта вследствие разложени  в процессе сорбции на катионите и выпарки.

Целью изобретени   вл етс  упрощение способа и повышение выхода целевого продукта.

Поставленна  цель достигаетс  тем, что согласно способу выделени  глутамина, предусматривающему ионообменную колоночную хроматографию фильтрата культу- ральной жидкости, очистку от примесей полученного глутаминсодержащего элюата и кристаллизацию целевого продукта, после очистки из глутаминсодержащего элюата сорбируют глутамин на смоле Ку 2x8 в Н+- форме и элюируют его раствором щелочи, а кристаллизацию провод т непосредственно из щелочного элюата.

Сущность предложенного способа состоит в следующем.

Культура л ьную жидкость нейтрализуют при перемешивании фосфорной кислотой до рН 5,5 - 6. При этом суспензи  расслаиваетс  и ее фильтруют. Фильтрат пропускают через колонну с катионитом в Н+-форме и глутамин сорбируетс  вместе с посторонними катионами. Затем через колонну пропускают 2,5 - 3,5%-ный аммиак и получают элюат глутамина, не содержащий солей. Аммиак отпаривают под вакуумом. Нативный раствор можно обессолить другим методом - пропуска  его с высокой скоростью через р д последовательно соединенных пар: ка- тионит Ку 2x20 в Н+-форме и анионит ЭДЕ- 10 п в ОНГформе. В этом случае происходит и частичное осветление нативного раствора . Расход смолы в обоих вариантах обессо- ливани  почти одинаков. Обессоленный раствор пропускают через осветл ющую колонну с ионитом ИА-1 и затем через колонну с катионитом Ку 2x8 в Н+-форме, который полностью насыщаетс  глутамином. Последний элюируют 1 - 2 н.щелочью, причем рН элюата держитс  на уровне 5,6 - 6,0, что соответствует изоэлектрической точке глу- тамина. Поскольку концентраци  глутамина в элюате превышает в 6 - 8 раз его растворимость , а раствор не содержит посторонних примесей, начинаетс  кристаллизаци . Выпавшие белые иглообразные кристаллы центрифугируют до влажности 18 - 20%. Чистота продукта не менее 98,5%. Конец сбора глутамина при элюции - бедную фракцию вместе с маточником присоедин ют к обессоленному раствору перед осветлением . Общий выход продукта 75 - 80%.

Пример1.5л культуральнойжидкости с концентрацией глутамина 38 г/л заливают в емкость с мешалкой и постепенно ввод т концентрированную фосфорную кислоту (55 мл) до рН 6,0. В результате суспензи  расслаиваетс  за счет превращени  мела в фосфат кальци . Суспензию фильтруют на нутч-фильтре и промывают осадок 200 мл воды. Получают 320 г осадка влажностью 62% и 4,9 л фильтрата с концентрацией глутамина 35 г/л и содержанием посторонних катионов 700 мг-экв/л. Дл  обессоливани  используют систему последовательно соединенных стекл нных колонн емкостью 10 мл кажда . Соедин лись последовательно пары: катионит Ку 2x20 в Н+-фрме - анионит ЭДЕ-10 п в форме. Скорость раствора в системе 5,0 л/ч. Глутамин не сорбируетс  на смоле Ку 2x20 и, учитыва  малое врем  контакта (3-4 мин) не разлагаетс  в зоне ионита. Сохранность глутамина подтверждаетс  методом тонкослойной хроматографии . Раствор с колонн вытесн етс  водой. Начало и конец сбора обессоленного нативного раствора согласуют с коэффициентом рефракции, который должен в начале достигать значени  1,334 и в конце опускатьс  до 1,335. После обессоливани  получают 6,1 л раствора с концентрацией глутамина 26,6 г/л и солей 25 мг-экв/л. Затем его пропускают со скоростью 4 объема через стекл нную колонну емкостью 4 мл со смолой ИА-1 в С :форме. Сбор осветленного раствора контролируют также как при обессолива- нии.Получают 6,5 л бесцветного раствора с концентрацией глутамина 24,2 г/л. Раствор пропускают через ионообменную колонну емкостью 600 мл со смолой Ку 2x8 в Н+-фор- ме. Глутамин на выходе с колонны контролируют количественно методом ТСХ. В процессе сорбции глутамин полностью заполн ет колонну без проскока в фильтрат. Колонну промывают одним объемом воды и элюируют 1 л 1 н. раствора щелочи. Сбор богатой фракции начинают при значении коэффициента рефракции 1,335 и заканчивают при значении 1,338. Получают 930 м раствора глутамина с рН 6,1 и концентрацией 158 г/л. Далее отбирают бедную фракцию до значени  1,334. Всего собирают 170 мл бедной фракции с концентрацией глутамина 35 г/л. Богата  фракци  охлаждаетс  до +5°С и через 10 ч из нее выпадают кристаллы . Их отжимают на центрифуге. Получают 160 г кристаллов с влажностью 190. Продукт подсушивают при 30°С под вакуумом до влажности 1 %. В итоге получают 131 г препарата с содержанием глутамина

98,5%. Продукт мало отличаетс  по внешнему виду, физико-механическим и химическим характеристикам от препарата фирмы Серва. Выход от исходного количества глутамина 70%. Но поскольку 780 мл маточ- ника с концентрацией глутамина 22 г/л и 170 мл бедной фракции направл ютс  снова в процесс на стадии осветлени  нативно- го раствора и не  вл ютс  потер ми, реальный выход продукта составл ет 80%.

Пример2.5л культуральной жидкости с активностью 36 г/л обрабатывают и фильтруют как в примере 1, получив 4,8 л натив- ного раствора с концентрацией глутамина 34 г/л. Раствор пропускают со скоростью 2,5 л/ч через стекл нную колонну диаметром 7 см, высотой 65 см, в КОТОРУЮ было загружено 2,5 л смолы Ку 2x8 в форме. В фильтрате глутамина не обнаружено. Элюцию глутамина осуществл ют 2,5%- ным раствором аммиака в количестве 3 л. Получают 2,6 л раствора с рН 10,8, концентрацией глутамина 46 г/л и содержанием посторонних катионов 20 мг-экв/л. Раствор упаривают до 1,5 л и концентрации 92 г/л и пропускают через колонну емкостью 400 мл со смолой ИА-1 в Cl-форме, Получают 1,8 л полностью обесцвеченного раствора с концентрацией глутамина 74 г/л. Осветленный

раствор пропускают до полного поглощени  глутамина через колонну с 600 мл смолы Ку 2x8 в Н+-форме. Глутамин элюируют 0,9 л 1 н.раствора щелочи. Собирают 780 мл богатой фракции с концентрацией 155 г/л и 220 мл бедной фракции с концентрацией 36 г/л. После кристаллизации глутамина из богатой фракции получают 103 г сухих кристаллов чистоты 98,5% с выходом 57% от исходного количества. 280 мл бедной фракции с концентрацией 38 г/л и 67 мл маточника с концентрацией 27,8 г/л возвращают в процесс. Таким образом, полный выход продукта 72%.

Claims (1)

1. Формула изобретени  Способ выделени  глутамина, предусматривающий ионообменную колоночную хроматографию фильтрата культуральной жидкости, очистку от примесей полученного глутаминсодержащего элюата и кристаллизацию целевого продукта, отличающий- с   тем, что, с целью упрощени  способа и повышени  выхода целевого продукта, после очистки из глутаминсодержащего элюата сорбируют глутамин на смоле Ку 2x8 в Н+-форме и элюируют его раствором щелочи , а кристаллизацию провод т непосредственно из щелочного элюата.