SU1737340A1 - Способ определени апопротеина А-1 в сыворотке крови - Google Patents

Abstract

Применение: в клинической диагностике и экспериментальных исследовани х биологических сред (моча, спинномозгова  жидкость). Сущность: пробу сыворотки крови подвергают химической обработке диме- тилсульфоксидом, в результате чего вы вл ютс  скрытые антигенные детерминанты апопротеина А-1 и апо-В, а затем в одних и тех же разведени х с помощью твердофазного иммуноферментного анализа определ етс  содержание апопротеинов А-1 и В.

Description

Изобретение относитс  к медицине, а именно к иммунохимическим способам определени  апопротеинов в сыворотке крови . Предложенный способ может найти применение в клинической диагностике и экспериментальных исследовани х биологических сред.

Известен способ определени  апо-А-1, при котором сыворотку крови обрабатывают тетраметилмочевиной при соотношении проба - реагент 1:1 с последующей постановкой твердофазного иммуноферментного анализа.

Однако добавление к сыворотке крови тетраметилмочевины приводит к необратимой денатурации апо-В, что не позвол ет данные образцы одновременно использовать дл  определении апо-В. Это, в свою очередь, усложн ет препаративную технику и требует дополнительного расхода времени и реактивов.

Целью изобретени   вл етс  одновременное с апопротеином А-1 определение апо-В в той же пробе, а также повышение экономичности способа.

Пример. Одну часть сыворотки крови смешивают с одной частью диметилсульфоксида . Раствор выдерживают в течение 1 ч при комнатной температуре. После этого готов т рабочие разведени  (1:2000 - 1:5000) в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,4, содержащем 0,15 М NaCI. Обработанные таким способом пробы внос т в  чейки полистироловых планшетов по 100 мкл. В качестве стандартов нанос т по 100 мкл рас- творов апо-А-1 и апо-В, содержащих 1,2,5,10, 20,50,100 мг белка в 0,01 М фос- фатно-солевом буфере (ФСБ). После инкубации планшеты трижды отмывают в ФСБ, содержащем 0,05% Tween - 20 (ФСБТ). Незан тые места сорбции блокируют 10%-ной бычьей сывороткой. В подготовленные таким образом планшеты добавл ют по 100 мкл специфических антител в разведении 1 : 3000 в 0,01 М ФСБТ. Св завшиес  с апоп- ротеинами первые антитела на следующем этапе насыщают вторыми антителами. Дл  этого используют козьи антитела против IgG кролика, меченые пероксидозой (Sigma, USA), которые добавл ют в количестве 100 мкл в каждую  чейку (разведение 1 : 1000 в ФСБТ). Планшеты инкубируют в течение 1 ч при 37°С. После 5-кратного отмывани  ФСБТ провод т ферментативную реакцию.

Ё

Х|

GJ VJ СО О

В  чейки внос т по 200 мкл свежеприготовленного субстрата о-фенилендиамина (Merk, ФРГ) в концентрации 20 мг/100 мл в 0,1 М фосфатно-цитратном буфере рН 0,5, содержащем 0,006% Н202. Через 15 мин ферментативную реакцию останавливают добавлением 50 мкл 10 N НаЗСм и измер ют экстинцию при длине волны 492 нм на многоканальном фотометре Multiscan (Англи ). В качестве отрицательного контрол  принимают значение оптической плотности в  чейках, в которые вместо антигена добавл ют по 100 мкл ФСБ.

При обработке сыворотки крови человека ДМСО вы вление апо-В не отличалось от контрольного.

Проведенное данным методом определение содержани  апо-А-1 в крови равн лось 1,05 ± 0,01 г/л. Содержание апо-В составило 0,83 ±0,01 г/л. Коэффициент апо- В/апо-А-1 равн лс  0,8. Полученные данные соответствуют литературным. В качестве стандартов использовалась сыворотка с изапо-А-1 и В

вестным содержанием (Colbiochem, США).

Предлагаемый способ, расшир   арсенал способов определени  апопротеинов,

позвол ет определить апо-А-1 и апо-В в одних и тех же пробах сыворотки крови и их разведени х, что упрощает препаративную технику этих апопротеинов. При этом способ характеризуетс  высокой эффективностью , дешевизной используемого реактива, меньшей его токсичностью дл  персонала, провод щего определени .

и

Claims (1)

1. Формула изобретени  Способ определени  апопротеина А-1 в сыворотке крови, включающий обработку пробы реагентом при соотношении его к пробе 1 : 1 и последующий твердофазный иммуноферментный анализ, отличающийс  тем, что, с целью одновременного определени  апо-В в той же пробе при повышении экономичности анализа, в качестве реагента используют диметилсульфоксид.