JPH01167667A - 多糖抗原の免疫学的測定法 - Google Patents

多糖抗原の免疫学的測定法

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JPH01167667A
JPH01167667A JP63297993A JP29799388A JPH01167667A JP H01167667 A JPH01167667 A JP H01167667A JP 63297993 A JP63297993 A JP 63297993A JP 29799388 A JP29799388 A JP 29799388A JP H01167667 A JPH01167667 A JP H01167667A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 生物試料中或いはそれらの培養物中に存在する細菌類ま
たは真菌類の多糖抗原を免疫学的に測定するKは、はと
んどの場合抗原を遊離するための前処理が必要である。
実際には、抗原を遊離するために種々の方法、具体的に
は100℃での加熱、37℃に於ける酵素処理、或いは
二段階操作での亜硝酸ナトリウムによる抽出、などが使
用されている。
これらの抗原を抽出する他の公知の方法は、高濃度のフ
ェノール、例えば90%飽和フェノール(90%フェノ
ール/10%水)、によりロ0°0での処理である。
抗原遊離のために100℃に加熱したシ、酵素処理をす
る方法は特異抗体の存在下ではそれらが変性するため使
用できない。再度のピペット測量もしなければならない
。高濃度のフェノール抽出でも同じで、さらに遠心分離
操作が必要となる。
亜硝酸ナトリウムによる抽出では二種の異なる試薬を用
い、トリス緩衝液での後処理が必要である。
以上のよ51C,これらの公知の操作は非常に状況によ
ってお)、時間がか\るものであって実際の使用に適し
たものではない。
本発明の範囲で、多糖抗原を免疫学的に測定するため、
生物試料或いはその培養物中の細菌類または真菌類の多
糖抗原を遊離する方法が見っかシ、その方法は生物試料
或いはその培養物をフェノール水溶液で処理することよ
勺成る。
本発明による方法では、1−10%の7エノール水溶液
を使用し、2〜5%のフェノール水溶液が好ましく、2
%フェノール水溶液が特に好ましい。
本発明による方法では、血液、血清、血漿、尿、糞便或
いは痰が適当な生物試料である。
本発明により提供される方法によると、5容址の生物試
料或いはその培養物に対して1容量のフェノール水溶液
を使用することが発見された。
本発明によ右方法では、フェノール水溶液は生物試料ま
たは培養物に5−50分間、好ましくは15分間作用さ
せる。
前処理を行なう温度は重要ではない。前処理は通常15
℃から反応液が沸とうする直前の温度までy実施され、
室温が特に好ましい。続く多糖抗原の免疫学的測定のた
めに抽出を行なう必要はなく、従って、免疫的検出は抗
原の遊離を行なった反応液中で実施するこりが出来る。
上述の免疫学的検出法はそれ自体公知の方法、特にいわ
ゆるRLISA法に従って実施できる。
本発明による方法は連鎖球菌、特に8trepto−c
occus pneumonias、抗酸@(マイコバ
クテリウム)、特にmycobacterium tu
berculoai8或いは腸内細菌、特にKache
richia coliからの多糖抗原の検出に非常に
適している。
本発明の範囲に於いて、本発明による方法は作業が少な
いはか)でなく、多糖抗原の測定に関して多く場合よシ
高い感度を示すことがさらにわかった。
以下の例で本発明を例示する。
例  1 A、1)ウサギの抗酸菌抗体を用いた培養生育細菌必要
な本数の試験管(10X25m+1)に0.25−の試
料(細菌けん濁液、血清、液状にした痰、尿)t−ピペ
ットで秤量し、これに0.05−の反応試薬(フェノー
ルまたはNaNO2+酢酸+トリス緩衝液)或いは水を
添加する。各試験管に抗−抗酸菌感作ポリスチレンピー
ズ(径=6.5m)10えた後、反応液を室温にて60
分間インキュベートする。続いて、洗滌せずに0.25
−のウサギ抗−抗酸菌−ペルオキシダーゼ結合体(20
%仔ウシつ児血清で不活化した0、1M−トリス−ヒド
ロキシメゾルアミノメタン、−7,0,0,05%Tw
e en20および5Mg/−のウサヤ抗−抗酸菌−ペ
ルオキシダーゼ結合体)を添加する。その後、反応液を
室温で4時間インキエペートする。インキュベーション
彼、ポリスチレンビーズtExA洗滌m(Roche 
)で、各5Tnlの蒸溜水中で2回洗滌する。
次にペルオキシダーゼ活性を測定するために各試験管に
0.25−の基質緩衝液(0,1mol / Lクエン
酸カリ緩衝液、−5,2、Om mol / L  H
2O2およCF 20 m mol / L  O−フ
ェニレンジアミン)を添加し、室温で15分間インキュ
ベートする。
ペルオキシダーゼ活性を停止し、発色を強めるために1
.0−のi N −H,So、を添加して30分間以内
に492 nmの波長における吸光を、例えばEIA光
度計(Roche )を用いて測定する。
必要な本数の試験管(10×25IIIIm)に0.2
5−の試料(細菌けん濁液、血清、液状にした痰、尿)
またはPH1(ブランク)をピペットで秤量し、これに
0.051dの反応試薬(フェノールまたはNaN02
+酢酸+トリス緩衝液)或いは水を加える。
各試験管に抗−肺炎菌一感作一すスチレンビーズ(径=
 6.5 rsw、 )を添加した後、反応液を室温に
て15分間インキュベートする。続いて、洗滌操作を行
なわずに0.251dのウサギ抗−肺炎菌−ペルオキシ
ダーゼ結合体(20%仔ウシつ児血清で不活化した0、
1 M −)リス−ヒドロキシメチルアミノメタン、−
7,0,0,05%Tvreen 80および0.7μ
g/ゴのウサイ抗−肺炎菌−ペルオキシダーゼ結合体)
を添加する。その後、反応液を室温で60分間インキュ
ベートする。インキュベーション後にポリスチレンビー
ズをEIA洗滌機(Roche)を用いて各5TILl
の蒸溜水中で2回洗滌する。次にベルオキシダーぜ活性
を測定するために各試験管に0.251117の基質緩
衝液(80mmol/Lクエン酸カリ緩衝液、pH4−
25,1−6m mol / L H2O5およびi 
mmol/ L  5 、5’= 5 、5’−テトラ
メチルベジジンを6.6%2−fロバノール加16.4
%DMSOに溶解)を添加し、試験管を室温で5分間放
置する。ペルオキシダーゼ活性を停止し、発色を強める
ために1.0−のI N −u2so、を添加して60
分間以内に450 nmの波長における吸光を、例えば
BmIA光度計<ROChe)を用いて測定する。
必要な本数の試験管(10X25驕)に0.25−の試
料(細菌けん濁液、血清、尿)或いはPH1(ブランク
)をピペットにて秤量し、0.05−の反応試薬(フェ
ノールまたはNaNO2+酢酸+トリス緩衝液)或いは
pBs t−添加する。各試験管に抗−E、 coli
−感作ポリスチレンビーズ(径=6.5rnra )を
加えた後、反応液を室温で15分間インキュベートする
。続いて、洗滌操作なしで、0.25−のウサギ−抗−
E、 coli−ペルオキシダーゼ結合体(20%仔ウ
シつ児血清で不活化した0、1Mトリスヒドロキシメチ
ルアミノメタン、p’7−0.0−05 % Twee
n 20および1μg/mA!のウサイー抗−E、co
li−ペルオキシダーゼ結合体)を添加する。その後、
反応液を室温で60分間インキュヘートスーる。インキ
ュベーション後、ポリスチレンビーズをEIA洗滌機(
Ro c he)で、各5 rrtlの蒸溜水中で2回
洗滌する一0次にペルオキシダーゼ活性を測定するため
に各試験管に0.25mの基質緩衝液(0−1mol 
/ Lクエン酸カリ緩衝液、…5.2.6m mol 
/ L H2O2および20 m mol / L O
−フェニレンジアミン)を添加し、室温で15分間イン
キュベートする。ペルオキシダーゼ活性を停止し、発色
を強めるために1.Odのi N −a、so、を添加
して60分間以内に492 mmの波長における吸光を
、例えば1nIA光度計(RoChe)を用いて測定す
る。
例・2 グラン(BC()) Difco社のミドルデルツク寒天を含む試験管数本に
Serum In5titute Berne (ベル
ン血清研究所)から入手したBCGワクチンの開封した
ばかりのアンプルを植菌し尼。およそ1週間インキュベ
ーションした後、コロニーを生理NaCl溶液で洗滌し
、マクファランド濃度を約0.5に調整した。
けん濁液を5等分し、各種前処理を行なった。
その後、−段階酵素免疫アッセイを各処理について実施
した。試験の方法は例1に従った。
次のような結果が得られた。
8.2)肺炎菌 8treptococcua pneumoniaeを
血液平板上で一晩培養した。その後、マクファランド濃
度が1.0となるように生理的Nac j溶液中にコロ
ニーをけん濁した。けん濁液を5等分し、各種前処理を
行なった。続いて一段階の酵素免疫アッセイを実施し九
。試験操作は実施例1に従った。
次の結果が得られた。
B、5)Racherichia coliLcoli
 ATCC19110を血液平板上で一晩培養した。そ
の後、コロニーを生理的NaC#溶液にけん濁してマク
ファランド濃度1.0となるよう調整した。けん濁液′
t−4等分し、各種処理を行なった。それぞれについて
続いて一段階酵素免疫アツセイを実施した。試験の実施
は方法の部を参照のこと。
次のような結果が得られた。
例  6 患者からの試料を用いてさらに調査を行なった。
実施例1に従って一段階RIA試験を実施した。前処理
は添付の衣に従って行なった。
次の結果が得られた。

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)多糖抗原の免疫学的測定のための生物試料中のま
    たは同試料の培養物中の細菌類或いは真菌類からの多糖
    抗原の遊離方法において、生物試料または培養物を水性
    フェノール溶液で処理することを特徴とする方法。
  2. (2)1−10%のフェノール水溶液を使用する特許請
    求の範囲第(1)項記載の方法。
  3. (3)2−5%のフェノール水溶液を使用する特許請求
    の範囲第(1)項または(2)項記載のいずれか一つの
    方法。
  4. (4)生物試料が血液、血清、血漿、尿、糞便または痰
    である特許請求の範囲第(1)項〜(3)項のいずれか
    一つに記載の方法。
  5. (5)2%のフェノール水溶液を使用する特許請求の範
    囲第(1)項〜(4)項のいずれか一つに記載の方法。
  6. (6)生物試料または培養物5部に対して1部の水性フ
    ェノール溶液を使用する特許請求の範囲第(1)項〜(
    5)項のいずれか一つに記載の方法。
  7. (7)水性フェノール溶液を試料または培養物に5〜3
    0分間作用させる特許請求の範囲第(1)項〜(6)項
    のいずれか一つに記載の方法。
  8. (8)水性フェノール溶液を試料または培養物に15分
    間作用させる特許請求の範囲第(7)項記載の方法。
  9. (9)生物試料またはその培養物を特許請求の範囲第(
    1)項〜(8)項のいずれか一つに記載の方法により前
    処理し、続いてそれ自体公知の方法によつて多糖抗原を
    免疫学的に検出することより成る、生物試料またはそれ
    より得られる培養物中の細菌類または真菌類からの多糖
    抗原の免疫学的測定方法。
  10. (10)連鎖球菌、抗酸菌または腸内細菌からの多糖抗
    原を検出する特許請求の範囲第(9)項記載の方法。
  11. (11)Streptococcuspneumoni
    ae、mycobacterinmtuberculo
    sisまたはEscherichiacoliからの多
    糖抗原を検出する特許請求の範囲第(10)項に記載の
    方法。
JP63297993A 1987-11-27 1988-11-25 多糖抗原の免疫学的測定法 Pending JPH01167667A (ja)

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