SU1733470A1

SU1733470A1 - Способ получени гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к рекомбинантным белкам

Info

Publication number: SU1733470A1
Application number: SU894800444A
Authority: SU
Inventors: Александр Васильевич Панютич; Елена Александровна Шидловская; Николай Николаевич Войтенок; Владимир Сергеевич Прасолов; Петр Михайлович Чумаков; Михаил Владимирович Резников
Original assignee: Институт Молекулярной Биологии Им.В.А.Энгельгардта; Научно-Производственное Объединение Белорусского Научно-Исследовательского Института Переливания Крови; Всесоюзный гематологический научный центр
Priority date: 1989-11-20
Filing date: 1989-11-20
Publication date: 1992-05-15

Abstract

Изобретение относитс к биотехнологии и может быть использовано в гибридомной технологии дл получени антител против рекомбинантных антигенов, экспресси- рованных в клетках мыши. Изобретение состоит в иммунизации мышей непосредственно трансфектированными сингенными клетками (СЭКП). Таким образом, исключаетс необходимость очистки рекомбинантного антигена. При внутриселезеночном способе введени СЭКП образуютс штаммы гибридом, продуцирующие антитела класса IgM. Обща продолжительность от начала иммунизации до получени штаммов гибридом составл ет3-4 недели. При комбинированном внутрибрюшинном и внутриселезеночном способе введени СЭКП образуютс штаммы гибридом, продуцирующие антитела классов IgM и IgG.Обща продолжительность от начала иммунизации до получени штаммов гибридом составл ет 5-6 недель. Способ апробирован на антигене-гормоне роста человека. Ген гормона роста трансфектирован в мышиные фибробласты линии Balb/ЗТЗ. З табл. СП С

Description

Изобретение относитс к биотехнологии и может быть использовано в процессе получени моноклинальных антител (МКА) к рекомбинантным белкам.

Традиционный путь получени МКА к рекомбинантным белкам включает р д этапов: 1) клонирование гена белка; 2) получение варианта гена, пригодного дл экспрессии в клеточной системе; 3) экспресси гена; 4) наращивание культуры клеток, продуцирующих рекомбинантный белок; 5) очистка рекомбинантного белка, часто сопр женна с его денатурацией и последующим восстановлением пространственной структуры; 6) иммунизаци животных путем последовательных введений рекомбинантного белка в смеси с адъювантом; 7) получение штаммов гибридом, продуцирующих МКА к рекомбинантному белку путем сли ни иммунных сленоцитов и клеток родительской миеломы.

Такой способ вл етс достаточно сложным в св зи с большим количеством трудоемких этапов. Кроме того, полученные

со со

1

-ч

О

МКА могут не распознавать природные белки , что может быть св зано с отсутствием углеводных остатков у рекомбинантных белков, изменени ми их первичной или третичной структуры. Вместе с тем, МКА.рас- познающие природные и рекомбинантные белки вл ютс основой дл получени стандартных и абсолютно воспроизводимых реагентов со строго определенной специфичностью , использование которых в экспериментах и разных вариантах иммунного анализа возрастает в геометрической прогрессии.

Целью изобретени вл етс повышение надежности способа получени гибридом , продуцирующих моноклональные °нтитела к рекомбинантным белкам.

Поставленна цель достигаетс за счет того, что экспрессию гена белка осуществл ют в сингенных эукариотических клетках- продуцентах, которыми провод т иммунизацию сингенных животных.

Предлагаемый способ включает следующие этапы: 1) клонирование гена белка; 2 -экспресси гена в сингенных эукариотических клетках-продуцентах (СЭКП); 3) иммунизаци животных СЭКП; 4) получение штаммов гибридом, продуцирующих МКА к рекомбинантному белку путем сли ни иммунных спленоцитов и клеток миеломы. При этом исключаютс такие операции, как получение варианта гена, пригодного дл экспрессии в прокариотической клеточной системе; наращивание культуры клеток, продуцирующих рекомбинантный белок; очистка рекомбинантного белка. Дополнительным преимуществом предлагаемого способа вл етс то, что в клетках млекопитающих происходит гликозилирование рекомбинантного продукта и его пространственна структура формируетс в услови х, близких к физиологичным. Это позвол ет получить МКА, распознающие ре- комбинантиый и натуральный белки в равной степени. Кроме того, использование дл иммунизации мышей СЭКП вместо растворимых рекомбинантных белковых антигенов не требует применени адъювантов.

Дл получени моноклональных антител к рекомбинатным белкам на основе клеток млекопитающих, продуцирующих чужеродные белки, использованы фиброб- ласты Balb/ЗТЗ, сингенные мышам линии Balb/c, синтезирующие рекомбинантный гормон роста человека.

Пример 1. Специфический иммунный ответ у мышей Balb/c, иммунизированных клетками Balb/ЗТЗ, продуцирующими рекомбинантный гормон (ГР) человека.

Важным моментом гибридомной технологии вл етс иммунизаци животных. Оценка иммунного ответа перед сли нием клеток позвол ет прогнозировать получение специфических моноклональных антител . Этот пример иллюстрирует индукцию иммунного ответа у мышей после введени сингенных эукариотических клеток-продуцентов .

0 Дл получени СЭКП, синтезирующих ГР человека, был создан ретровирусный вектор pPS-neo-hSTH, содержащий безинт- ронный ген ГР человека в полилинкерном регионе оригинального вектора, несущего

5 устойчивость к неомицину. Первоначально была проведена трансфекци 2(5) клеток , которые в итоге содержали интегрированный рекомбинантный провирус (вектор) pHS-neo- hSTH и продуцировали икфекци0 онный ретровирус, несущий pPS-neo-hSTH РНК. Этот рекомбинантный ретровирус был использован дл инфицировани фибробла- стов Balb/ЗТЗ, сингенных мышам линии Balb/c. Клонированные клетки Balb/ЗТЗ,

5 продуцирующие рекомбинантный гормон роста человека, были выделены посла двухнедельной селекции в присутствии неоми- цина.

Фибробласты Balb/ЗТЗ, продуцирую0 щие ГР, культивировали в среде IMDM (модифицированна Iscove s среда Дульбекко) с 10% эмбриональной тел чьей сыворотки (ЗТС), 2 мМ L-глютамина, 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина. 0,05 мМ меркап5 тоэтанола. Монослой клеток отмывали средой без сыворотки, инкубировали в IMDM с 1 % сыворотки мышей Balb/c 1 ч при 37°С и снимали раствором трипсина в вер- сене. После трехкратной отмывки средой

0 без сыворотки клетки ресуспендировали в 0,02 М фосфатном буферном растворе с 0,15 М NaCI, Клетки вводили внутрибрю- шинно (в/б) по 10-20 млн, на мышь, что соответствует оптимальному количеству

5 клеток дл получени МКА к корпускул рным антигенам и/или внутриселезеночно (в/с) по 200-400 тыс. клеток на мышь, как описано Spitz et al. При комбинированном способе иммунизации клетки вводили в/с

0 через 21 сут после иммунизации в/б.

Дл оценки индукции иммунного ответа спленоциты культивировали в IMDM с 10% ЭТС в концентрации 3-5 млн/мл в течение 5 сут супернатанты тестировали методом

5 иммуноферментного анализа (ИФА) по следующей схеме. Рекомбинантный ГР или бычий сывороточный альбумин (БСА) сорбировали в лунках микроплат (Nunc Immunoplate 1) (500 нг/лунку в 0,1М карбонатном буфере, рН 9,5, 16 ч при 4°С). После

отмывки в лунки вносили по 50 мкл супер- натанта иммунных спленоцитов (последовательные двухкратные разведени ) в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,4, 0,15 М NaCi, 1 % БСА (ЗФР-БСА) и инкубировали 1 ч при 20°С. Отмывали 5 раз бидистиллированной водой и вносили кроличьи противомыши- ные антитела (Lymed), разведенные 1 /2000 в ЗФР-БСА, по 50 мкл/лунку. После инкубации 1 ч при 20°С плату отмывали и вносили субстрат - ортофениленлиамин гидрохлорид (Sigma), 0.6 мг/мл в цитратном буфере, рН 4,7 с 0,03% На02. Через 10 мин останавливали реакцию 1 М серной кислотой и учитывалинаспектрофотометре EUSA-Processop II ( Boehring) при длине волны 492 нм. Результаты опыта представлены в табл. 1.

Из данных табл. 1 следует, что специфический иммунный ответ у мышей Balb/c существенно выше при комбинированном способе иммунизации СЭКП; не наблюдаетс образовани значительного количества антител к БСА, несмотр на культивирование сингенных эукариотических клеток-продуцентов в среде, содержащей 10% ЭТС.

Результаты табл. 1 свидетельствуют. что иммунизаци мышей сингенными эука- риотическими клетками-продуцентами, синтезирующими чужеродный рекомбинан- тный белок, может быть использована дл индукции специфического иммунного ответа и, следовательно, получени гибридом, продуцирующих МКА к рекомбинантному белку.

Пример 2. Получение гибридом, продуцирующих МКА к рекомбинантному белку, при иммунизации СЭКП путем в/с введени .

Мышей Balb/c иммунизировали в/с как описано в примере 1. Спуст 4 сут проводили гибридизацию 1,4х 10 иммунных спленоцитов и 3,5x10 клеток миеломы мыши Х63-Ад8-653 50%-ным раствором полиэти- ленгликол мол. массы 4000 (Merck), содержащим 5% диметилсульфоксида, в течение 1,5 мин. После гибридизации и отмывки от полиэтиленгликол клетки высевали в 96-лу- ночные платы по 1x105 спленоцитов/лунку. Дл культивировани и селекции гибридом использовали среду IMDM с 10% ЭТС, 10 М гипоксантина, М аминоптерина, 1, М тимидина. Скрининг положительных гибридом к ГР человека проводили методом ИФА как описано в примере 1.

После гибридизации клетки культивировали в трех микроплатах. Через 14 сут клоны гибридом выросли в 255 лунках, из них 20 оказались положительными в ИФА с гормоном роста в качестве антигена. Получение 20 гибридом, синтезирующих МКА к ГР человека, на 1, иммунных спленоцитов свидетельствует о значительной имму- ногенностиСЭКПприих

внутриселезеночном введении.

Супернатанты культур положительных гибридом были повторно тестированы в ИФА с использованием в качестве антигена рекомбинантного ГР и БСА.

0 Результаты опыта приведены в табл. 2, Из данных табл. 2 следует, что при внутриселезеночном введении СЭКП образуют- с антитела с изотипом IgM , взаимодействующие в ИФА с гормоном ро5 ста в большей степени, чем с БСА, т.е. специфичные к рекомбинантному белку.

Таким образом, при внутриселезеноч- ной иммунизации сингенными эукариотиче- скимиклетками-продуцентами

0 чужеродного рекомбинантного белка можно в течение 2-3 недель получить монокло- нальные антитела с изотипом IgM к рекомбинантному белку. Врем от начала иммунизации до получени штаммов поло5 жительных гибридом существенно сокращаетс по сравнению с традиционными трем -четырьм мес цами.

П р и м е р 3. Получение гибридом. продуцирующих МКА к рекомбинантному

0 белку, при комбинированном способе иммунизации сингенными эукариотическими клетками-продуцентами.

Мышей Balb/c иммунизировали последовательно в/б и в/с как описано в примере

5 1. Спуст 4 сут после иммунизации в/с проводили гибридизацию 1,2xtO иммунных спленоцитов и 3x10 клеток миеломы мыши ХбЗ-А 8-653 как описано в примере 2. После гибридизации клетки культивировали в G

О микроплатах. Через 14 сут рост клонов гибридом наблюдалс во всех 480 лунках, из них 53 оказались положительными. Супернатанты культур положительных гибридом были повторно тестированы с использова5 нием рекомбинантного ГР и БСА,

Результаты представлены в табл 3. Приведенные в табл. 3 данные свидетельствуют о специфичности МКА к ГР человека Среди полученных гибридом имелись штам0 мы, продуцирующие МКА igM и gG классов .

Таким образом, данные, представленные в примере 3, свидетельствуют о возможности применени 3-недельного

5 комбинированного внутрибрюшинного и внутриселезеночного способа иммунизации СЭКП дл получени моноклональных антител IgM и IgG классов к рекомбинантному белку. Обща продолжительность получени штаммов гибридом, продуцирующих

МКА к рекомбинантному белку, составл ет при этом 5-6 недель.

Claims

Формула изобретени Способ получени гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к реком- бинантным белкам, включающий клонирование и экспрессию генов белка,

иммунизацию животных и получение штаммов гибридом, отличающийс том, что, с целью повышени надежности, экспрессию гена белка осуществл ют в сингенных эукариотических клетках-продуцентах, которыми провод т иммунизацию сингенных животных.

юны гибридом,

Оптическа плотность при 492 х 10 м, антиген в И ФА

1054

364

812

354

346

499

491

1045

703

848

728

794

6«б

339

447

311

737

642

374

329

875

842

393

Таблица 1

5

ть при 492 х 10 м, в И ФА

1054

364

812

354

346

499

491

1045

703

848

728

794

6«б

339

447

311

737

642

374

Таблица 2 Изотип МКА

М М

М VI М fvi М М М

IV

М .V

М

М

ТаблицаЗ