SU1723123A1

SU1723123A1 - Method of pepsin preparation

Info

Publication number: SU1723123A1
Application number: SU904792306A
Authority: SU
Inventors: Иван Юрьевич Сахаров; Надежда Васильевна Сухова
Original assignee: Научно-исследовательская лаборатория биологически активных веществ гидробионтов
Priority date: 1990-02-14
Filing date: 1990-02-14
Publication date: 1992-03-30

Abstract

Изобретение относитс к области биотехнологии , а именно к способу комплексного получени препарата пепсина из внутренностей рыб. Цель - повышение удельной активности целевого продукта и упрощение способа. Дл осуществлени способа всю массу внутренних органов рыб гомогенизируют в растворе с кислым значением рН и центрифугируют. К супернатанту последовательно приливают третбутиловый спирт в соотношении 1-(0,3-1), а затем сульфат аммони , осажда пепсин в интервале концентраций между 12-17% и 35-45%. Сформировавшийс осадок, содержащий пепсин, раствор ют в 5 мМ-ацетатном буфере , рН 5,0. Дл активации пепсиногена рН гомогената довод т до 2,0 и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Дл окончани реакции активации рН поднимают до 4-5 с помощью раствора ацетата натри , после чего дл отделени образовавшегос осадка раствор центрифугируют. Удельна активность пепсина по отношению к гемоглобину равна 3500-3700 ед/мг белка. Выход по активности равен 55-60%. СО СThe invention relates to the field of biotechnology, in particular to a method for the complex preparation of a pepsin preparation from fish insides. The goal is to increase the specific activity of the target product and simplify the method. To implement the method, the entire mass of the internal organs of the fish is homogenized in a solution with an acidic pH value and centrifuged. To the supernatant is sequentially poured tert-butyl alcohol in the ratio of 1- (0.3-1), and then ammonium sulfate, precipitating pepsin in the concentration range between 12-17% and 35-45%. The precipitate containing pepsin is dissolved in 5 mM acetate buffer, pH 5.0. To activate pepsinogen, the pH of the homogenate is adjusted to 2.0 and incubated for 30 minutes at room temperature. To complete the activation reaction, the pH is raised to 4-5 with sodium acetate solution, after which the solution is centrifuged to separate the precipitate formed. The specific activity of pepsin in relation to hemoglobin is 3500-3700 u / mg protein. The output activity is 55-60%. WITH S

Description

Изобретение относитс к биотехнологии , а именно к способу комплексного получени препарата пепсина из внутренних органов рыб, которые могут найти применение в научно-исследовательской де тельности , медицине, пищевой и кожевенной промышленност х.The invention relates to biotechnology, in particular, to a method for the complex preparation of a pepsin preparation from the internal organs of fish, which can be used in scientific research, medicine, food and leather industries.

Пепсин (КФ 3.4.23.1)- протеаза, эффективно гидролизующа пептидные св зи белков при кислых значени х рН. Наиболее хорошо изученными вл ютс пепсины млекопитающих . Хот активность пепсина ранее обнаружена и у рыб, фермент из данного источника изучен недостаточно.Pepsin (EC 3.4.23.1) is a protease that effectively hydrolyzes peptide bonds of proteins at acidic pH values. The mammalian pepsins are the most well studied. Although the activity of pepsin was previously found in fish, the enzyme from this source has not been studied enough.

Известны способы получени пепсина из таких рыб как треска, сельдь, анчоус, мойва , кета. В большинстве случаев в качестве сырьевого источника были использованыThere are known methods for producing pepsin from such fish as cod, herring, anchovy, capelin, chum. In most cases, as a source of raw materials were used

желудки. Выделение пепсина из этих источников включает гомогенизацию, центрифугирование , фракционирование белков сульфатом аммони , ионообменную хроматографию и гельфильтрацию в различных сочетани х и различной последовательности . К недостатку описанных методов очистки относ т ее многостадийность, что приводит к значительным потер м фермента и невысоким значени м выхода. Кроме того, недостатком вл етс использование в качестве сырь выбранных из общей массы внутренних органов желудков, что делает данный процесс нетехнологичным.stomachs. Isolation of pepsin from these sources includes homogenization, centrifugation, fractionation of proteins with ammonium sulfate, ion exchange chromatography and gel filtration in various combinations and different sequences. The disadvantage of the described purification methods is its multi-stage character, which leads to significant loss of the enzyme and low yield values. In addition, a disadvantage is the use of selected raw materials from the total mass of the internal organs of the stomachs as raw materials, which makes this process non-technological.

Наиболее близким к предлагаемому вл етс способ выделени пепсина рыб. Всю массу внутренних органов гомогенизируют в растворе рН 2-6, инкубируют 3-20 ч приClosest to the present invention is a method for isolating pepsin in fish. The whole mass of internal organs is homogenized in a solution of pH 2-6, incubated for 3-20 hours at

VIVI

ю соyu so

юYu

CJCJ

комнатной температуре и центрифугируют 30 мин при 19000д, 4°С. Дл активации пеп- синогена рН гомогената довод т до 1,7-2,4 и инкубируют 15-300 мин при комнатной температуре. Дл окончани реакции активации рН поднимают до 4,4 с помощью 4 М раствора ацетата натри . Дл отделени образовавшегос осадка раствор центрифугируют при 19000д 40 мин. Супернатант диализуют против 5 мМ ацетатного буфера, рН 5, а впоследствии нанос т на колонку с ДЭАЭ-носителем, уравновешенным тем же буфером. Ферментативную активность элю- ируют тем же буфером. Удельна активность пепсина по отношению к гемоглобину равна 1400-2800 ед/мг белка. Выход по активности равен 30-87%.room temperature and centrifuged for 30 min at 19000 g, 4 ° C. To activate the pepsinogen, the pH of the homogenate is adjusted to 1.7-2.4 and incubated for 15-300 minutes at room temperature. To complete the activation reaction, the pH is raised to 4.4 with 4 M sodium acetate solution. To separate the precipitate formed, the solution is centrifuged at 19000D 40 min. The supernatant is dialyzed against 5 mM acetate buffer, pH 5, and subsequently applied to a column with a DEAE carrier equilibrated with the same buffer. The enzymatic activity is eluted with the same buffer. The specific activity of pepsin in relation to hemoglobin is 1400-2800 u / mg protein. The output activity is 30-87%.

Недостатками вл ютс невысока удельна активность пепсина, низка технологичность процесса за счет применени стадии ионообменной хроматографии.The disadvantages are the low specific activity of pepsin, the low processability of the process due to the use of the ion-exchange chromatography stage.

Цель изобретени - повышение удельной активности пепсина и упрощение его технологического процесса. .The purpose of the invention is to increase the specific activity of pepsin and simplify its technological process. .

Поставленна цель достигаетс тем, что всю массу внутренних органов гомогенизируют в растворе с кислым значением рН и центрифугируют, после чего супернатант используют дл получени пепсина. К су- пернатанту приливают трет-бутиловый спирт в соотношений I - (0,3-1), а затем добавл ют сульфат аммони , осажда сначала балластные вещества при концентрации 12-17%, а затем высалива пепсин при концентрации 35-45%. Сформировавшийс осадок, содержащий пепсин, раствор ют в 5 мМ ацетатном буфере, рН 5,0. Дл активации пепсиногена рН гомогената довод т до 2,0 и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Дл окончани реакции активации рН поднимают до 4-5 с помощью раствора ацетата натри , после чего дл отделени образовавшегос осадка раствор центрифугируют. Удельна активность пепсина по отношению к гемоглобину равна 3500-3700 ед/мг белка. Выход по активности равен 55-60%.This goal is achieved by homogenizing the whole mass of internal organs in a solution with an acidic pH value and centrifuging, after which the supernatant is used to obtain pepsin. Tert-butyl alcohol is added to the supernatant in the ratios I - (0.3-1), and then ammonium sulfate is added, first precipitating the ballast substances at a concentration of 12-17%, and then salting out pepsin at a concentration of 35-45%. The precipitate containing pepsin is dissolved in 5 mM acetate buffer, pH 5.0. To activate pepsinogen, the pH of the homogenate is adjusted to 2.0 and incubated for 30 minutes at room temperature. To complete the activation reaction, the pH is raised to 4-5 with sodium acetate solution, after which the solution is centrifuged to separate the precipitate formed. The specific activity of pepsin in relation to hemoglobin is 3500-3700 u / mg protein. The output activity is 55-60%.

В предложенном способе активность целевого препарата пепсина увеличиваетс до 3500-3700 единиц на 1 мг белка, упрощаетс способ очистки за счет удалени стадии ионообменной хроматографии.In the proposed method, the activity of the target pepsin preparation is increased to 3500-3700 units per 1 mg of protein, the purification method is simplified by removing the ion-exchange chromatography step.

Верхн граница величины объемного отношени гомогената к трет-бутиловому спирту обусловлена тем, что при соотношении выше 1:1 наблюдаетс инактиваци фермента в присутствии органического растворител .The upper limit of the volume ratio of the homogenate to the tert-butyl alcohol is due to the fact that when the ratio is above 1: 1, the enzyme is inactivated in the presence of an organic solvent.

Нижн граница величины объемного отношени гомогената к трет-бутиловомуThe lower limit of the volume ratio of the homogenate to the tert-butyl

спирту обусловлена тем, что при соотношении ниже 1:0,3 наблюдаетс понижение выхода очистки и не удаетс полностью освободитьс от липидов.alcohol is due to the fact that when the ratio is below 1: 0.3, a decrease in the purification yield is observed and it is not possible to completely get rid of lipids.

Верхн граница концентрации сульфата аммони при осаждении пепсина обусловлена тем, что при концентрации выше 45% наблюдаетс дополнительное соосаж- дение балластных белков, что приводит кThe upper limit of the concentration of ammonium sulfate during the precipitation of pepsin is due to the fact that, at a concentration above 45%, additional co-precipitation of ballast proteins is observed, which leads

0 понижению удельной активности целевого продукта.0 lowering the specific activity of the target product.

Нижн граница концентрации сульфата аммони при осаждении пепсина обусловлена тем, что при концентрации нижеThe lower limit of the concentration of ammonium sulfate during the precipitation of pepsin is due to the fact that at a concentration below

5 35% не удаетс количественно выделить пепсин.5 35%, it is not possible to quantify pepsin.

Верхн граница концентрации сульфата аммони при осаждении балластных веществ обусловлена тем, что при концент0 рации выше 17% наблюдаетс дополнительное соосаждение пепсина, что приводит к понижению выхода целевого продукта.The upper limit of the concentration of ammonium sulfate during the deposition of ballast substances is due to the fact that, at a concentration above 17%, additional co-precipitation of pepsin is observed, which leads to a decrease in the yield of the target product.

Нижн граница концентрации суль5 фата аммони при осаждении балластных веществ обусловлена тем, что при концентрации ниже 12% не удаетс полностью отделитьс от примесных веществ.The lower limit of the concentration of ammonium sulfate during the deposition of ballast substances is due to the fact that at a concentration below 12% it is not possible to completely separate from impurity substances.

Предлагаемый способ заключаетс вThe proposed method is

0 следующем. 200 г внутренних органов рыб гомогенизируют в 600 мл 5 мМ ацетатного буфера, рН 5, а затем центрифугируют в 40 мин при 5000 об/мин, 4°С. К 650 мл супер- натанта приливают трет-бутиловый спирт0 next. 200 g of the internal organs of fish are homogenized in 600 ml of 5 mM acetate buffer, pH 5, and then centrifuged in 40 min at 5000 rpm, 4 ° C. Tert-butyl alcohol is added to 650 ml of supernatant

5 (соотношение 1:0,3-1), а затем добавл ют сульфат аммони до концентрации 12-15%, раствор его при перемешивании. После центрифугировани 15 мин при 3000 об/мин сформировавшийс осадок отбра0 сывают, а в водноорганическую смесь вновь добавл ют сульфат аммони до концентрации 35-45%, перемешива до полного растворени и центрифугиру вслед за этим 15 мин при 3000 об/мин. Осадок раствор ют в5 (ratio 1: 0.3-1), and then ammonium sulfate is added to a concentration of 12-15%, its solution with stirring. After centrifuging for 15 minutes at 3000 rpm, the precipitate formed is removed, and ammonium sulphate is again added to the water-organic mixture to a concentration of 35-45%, stirring until complete dissolution and the centrifuge is followed by 15 minutes at 3000 rpm. The precipitate is dissolved in

5 300 мл 5 мМ ацетатного буфера, рН 5,0. Дл активации пепсиногена раствор довод т до рН 2 с помощью 2 н HCI и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Дл окончани реакции активации рН поднимают до5 300 ml 5 mM acetate buffer, pH 5.0. To activate the pepsinogen, the solution is adjusted to pH 2 with 2N HCl and incubated for 30 minutes at room temperature. To complete the activation reaction, the pH is raised to

0 4,4 с помощью 4 М раствора ацетата натри . Дл отделени образовавшегос осадка раствор центрифугируют при 5000 об/мин 40 мин, 4°С. Удельна активность пепсина по отношению к гемоглобину 3500-37000 4.4 with 4 M sodium acetate solution. To separate the precipitate that forms, the solution is centrifuged at 5000 rpm for 40 minutes, 4 ° C. Pepsin specific activity in relation to hemoglobin 3500-3700

5 ед/мг белка. Выход по активности 55-60%. Пример 200 г внутренних органов сельди гомогенизируют в 600 мл 5 мМ ацетатного буфера, рН 5, а затем центрифугируют 40 мин при 5000 об/мин, 4°С. К 650 мл супернатанта приливают 200 мл трет-бутилевого спирта (соотношение 1:0,3), Ј затем добавл ют 102 г сульфата аммони (концентраци 12%), раствор его при перемешивании . После центрифугировани 15 мин при 3000 об/мин сформировавшийс осадок отбрасывают, а в водноорганическую смесь добавл ют еще 195,5 г сульфата аммони (концентраци 35%), перемешива до полного растворени и центрифугиру вслед за этим 15 мин при 3000 об/мин. Осадок раствор ют в 300 мл 5 мМ ацетатного буфера, рН 5,0. Дл активации пепсино- гена рН раствора довод т до 2 с помощью 2 н HCI и инкубируют30 мин при комнатной температуре. Дл окончани реакции активации рН поднимают до 4,4 с помощью 4 М раствора ацетата натри . Дл отделени образовавшегос осадка раствор центрифугируют при 5000 об/мин 40 мин, 4°С, Удельна активность пепсина по отношению к гемоглобину равна 3700 ед/мг белка. Выход по активности 59%.5 u / mg protein. The yield on the activity of 55-60%. Example 200 g of herring's internal organs are homogenized in 600 ml of 5 mM acetate buffer, pH 5, and then centrifuged for 40 minutes at 5000 rpm, 4 ° C. 200 ml of tert-butyl alcohol (1: 0.3 ratio) are added to 650 ml of the supernatant, Ј then 102 g of ammonium sulfate (concentration 12%) are added, and the solution is added with stirring. After centrifuging for 15 minutes at 3000 rpm, the precipitate formed is discarded, and an additional 195.5 g of ammonium sulfate (concentration 35%) is added to the water-organic mixture, stirring until complete dissolution and the centrifuge is followed by 15 minutes at 3000 rpm. The precipitate is dissolved in 300 ml of 5 mM acetate buffer, pH 5.0. To activate the pepsinogen, the pH of the solution is adjusted to 2 with 2 n HCl and incubated for 30 minutes at room temperature. To complete the activation reaction, the pH is raised to 4.4 with 4 M sodium acetate solution. To separate the precipitate formed, the solution is centrifuged at 5000 rpm for 40 minutes, 4 ° C. The specific activity of pepsin with respect to hemoglobin is 3,700 units / mg protein. The yield on the activity of 59%.

П р и м е р 2. 200 г внутренних органов трески гомогенизируют в 600 мл 5 мМ ацетатного буфера, рН 5, а затем центрифугируют 40 мин при 5000 об/мин, 4°С. К 650 мл супернатанта приливают 650 мл трет-бути- лового спирта (соотношение 1:1), а затем добавл ют 195,0 г сульфата аммони (концентраци 15%), раствор его при перемешивании . После центрифугировани 15 мин при 3000 об/мин сформировавшийс осадок отбрасывают, а в водноорганическую смесь добавл ют еще 325,0 г сульфата аммони (концентраци 40%), перемешива до полного растворени и центрифугиру вслед за этим 15 мин при 3000 об/мин. Осадок раствор ют в 300 мл 5 мМ ацетатного буфера, рН 5,0. Дл активации пепсино- гена раствор довод т до рН 2 с помощью 2 н. HCI и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. Дл окончани реакции активации рН поднимают до 5,0 с помощью 4 М раствора ацетата натри . Дл отделени образовавшегос осадка раствор центрифугируют при 5000 об/мин 40 мин, 4°С. Удельна активность пепсина по отношению к гемоглобину равна 3500 ед/мг белка. Выход по активности равен 60%.PRI mme R 2. 200 g of the internal organs of cod are homogenized in 600 ml of 5 mM acetate buffer, pH 5, and then centrifuged for 40 minutes at 5000 rpm, 4 ° C. 650 ml of tert-butyl alcohol (1: 1 ratio) are added to 650 ml of the supernatant, and then 195.0 g of ammonium sulfate (concentration 15%) is added, the solution is added with stirring. After centrifuging for 15 minutes at 3000 rpm, the precipitate formed is discarded, and another 325.0 g of ammonium sulfate (concentration 40%) is added to the water-organic mixture, stirring until complete dissolution and the centrifuge is followed by 15 minutes at 3000 rpm. The precipitate is dissolved in 300 ml of 5 mM acetate buffer, pH 5.0. To activate the pepsinogen, the solution is adjusted to pH 2 with 2 n. HCI and incubated for 30 min at room temperature. To complete the activation reaction, the pH is raised to 5.0 with 4 M sodium acetate solution. To separate the precipitate that forms, the solution is centrifuged at 5000 rpm for 40 minutes, 4 ° C. The specific activity of pepsin with respect to hemoglobin is 3500 units / mg of protein. The output activity is 60%.

П р и м е р 3. 200 г внутренних органов сельди гомогенизируют в 600 мл 5 мМ ацетатного буфера, рН 5, а затем центрифугируют 40 мин при 5000 об/мин, 4°С. К 650 млPRI me R 3. 200 g of the internal organs of the herring are homogenized in 600 ml of 5 mM acetate buffer, pH 5, and then centrifuged for 40 minutes at 5000 rpm, 4 ° C. To 650 ml

супернатанта приливают 325 мл трет-бути- лового спирта (соотношение 1:0,5), а затем добавл ют 165,75 г сульфата аммони (концентраци 17%), раствор его при перемешивании . После центрифугировани 15 мин325 ml of tert-butyl alcohol (1: 0.5 ratio) is poured into the supernatant, and then 165.75 g of ammonium sulfate (17% concentration) is added, the solution is added with stirring. After centrifugation, 15 min.

при 3000 об/мин сформировавшийс осадок отбрасывают, а в водноорганическую смесь добавл ют еще 273 г сульфата аммони (концентраци 45%), перемешива до полного растворени и центрифугиру at 3000 rpm, the precipitate formed is discarded, and another 273 g of ammonium sulfate (concentration 45%) is added to the water-organic mixture, mixing until complete dissolution and centrifuging

вслед за этим 15 мин при 3000 об/мин. Осадок раствор ют в 300 мл 5 мМ ацетатного буфера, рН 5,0. Дл активации пепсиногена рН раствора довод т до 2 с помощью 2 н. НС и инкубируют 30 мин при комнатнойthereafter 15 minutes at 3000 rpm. The precipitate is dissolved in 300 ml of 5 mM acetate buffer, pH 5.0. To activate pepsinogen, the pH of the solution was adjusted to 2 with 2N. NA and incubated for 30 min at room temperature

температуре. Дл окончани реакции активации рН поднимают до 4,0 с помощью 4 М раствора ацетата натри . Дл отделени образовавшегос осадка раствор центрифугируют при 5000 об/мин 40 мин, 4°С. Удельна temperature To complete the activation reaction, the pH is raised to 4.0 with 4 M sodium acetate solution. To separate the precipitate that forms, the solution is centrifuged at 5000 rpm for 40 minutes, 4 ° C. Is specific

активность пепсина по отношению к гемоглобину равна 3620 ед/мг белка. Выход по активности равен 55%.Pepsin activity in relation to hemoglobin is equal to 3620 units / mg of protein. The output activity is 55%.

Таким образом, предложенный способ позвол ет повысить удельную активностьThus, the proposed method allows to increase the specific activity

продукта, а также упростить технологический процесс и тем самым повысить его экономичность.product, and also to simplify the process and thereby increase its efficiency.

3535

Claims

Invention Formula

The method of obtaining pepsin, including the homogenization of the insides of fish, the separation of the enzyme-containing solution, purification, activation of the target product and its

isolation, characterized in that, in order to increase the specific activity of the target product and simplify the process, purification and isolation are carried out by successive addition to the enzyme

a solution of tert-butyl alcohol in a ratio of 1: (0.3-1), ammonium sulfate at a concentration of 12-17%, then at a concentration of 35-45%, and activation is carried out after isolation of the target product.