KR100449125B1 - Method for purifying aminopeptidase m from kidney of pig in higher purity and yield, thereby removing methionine without treatment of protease inhibitor - Google Patents
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Abstract
Description
[산업상 이용 분야][Industrial use]
본 발명은 돼지 신장으로부터 아미노펩티다제 엠(aminopeptidase M)을 고순도로 분리, 정제하는 방법을 제공하는 기술에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 유전자 재조합 방식에 의해 제조된 메치오닐 단백질로부터 아미노 말단에 존재하는 메치오닌을 제거하여 천연형과 동일한 아미노산 서열을 갖는 재조합 단백질을 제조할 때 전환 효율성을 높여 줄 수 있는 아미노펩티다제 엠을 고순도로 정제하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a technique for providing a method for separating and purifying aminopeptidase M from porcine kidney with high purity, and more particularly, from a methionyl protein produced by genetic recombination to an amino terminus. The present invention relates to a method for purifying aminopeptidase M, which can increase conversion efficiency when preparing a recombinant protein having the same amino acid sequence as a natural form by removing methionine present.
[종래 기술][Prior art]
아미노펩티다제 엠은 포유동물의 신장과 소장의 미세구 마이크로솜 (microsome) 분획에 존재하는 막 효소로 펩타이드에 작용하여 아미노 말단의 아미노산을 유리시키는 작용을 하며(Methods in Enzymology19, 514, 1970), 아미노산 서열에 따라 특이성이 다른 것으로 알려져 있다(J. Biochemistry94, 619, 1983).Aminopeptidase M is a membrane enzyme present in the microsphere fraction of the kidney and small intestine of mammals and acts on the peptide to release amino terminus amino acids ( Methods in Enzymology 19, 514, 1970). Specificity differs depending on the amino acid sequence ( J. Biochemistry 94, 619, 1983).
한편 유전자 재조합 기술의 발달로 미생물을 이용하여 여러 인체 유래 단백질을 생산하여 의료 등의 목적에 이용하고 있다. 그러나 미생물을 숙주로 사용하여 인체 유래 단백질을 생산할 경우 AUG가 단백질 합성 개시 코돈(codon)으로 사용되어야 하기 때문에 아미노 말단에 메치오닌(methionine)을 지닌 단백질이 합성되게 되며, 이에 따라 천연형 단백질을 구성하는 아미노산 잔기 이외에 메치오닌이 첨가된 메치오닐 단백질이 생성된다. 예를 들면 천연형인 인체 유래 성장 호르몬은 191개의 아미노산으로 이루어져 있으나 뇌하수체 유래 성장호르몬은 신경계 질환을 일으키는 안전성에 문제가 있어 사용이 제한되고 있고(Neuropathology Applied Neurobiology12, 509, 1986), 유전공학기술을 이용하여 미생물에서 생산된 메치오닐 인간 성장호르몬은 생물학적 활성면에서는 천연형 인간 성장호르몬과 동일한 성질을 나타내나(J. A. Endocrinology 122, 2920, 1988), 메치오닌 잔기가 첨가됨으로 인해 192개의 아미노산으로 이루어지게 되어 항체 생성률이 천연형보다 약간 높다는 보고가 있었다(Lancet I 697, 1986).Meanwhile, with the development of genetic recombination technology, various human-derived proteins are produced using microorganisms and used for medical purposes. However, when a human-derived protein is produced using a microorganism as a host, the protein having a methionine at the amino terminus is synthesized since AUG must be used as a codon for initiating protein synthesis, thereby forming a naturally occurring protein. In addition to amino acid residues, methionyl proteins are added with methionine added. For example, a natural human-derived growth hormone consists of 191 amino acids, but pituitary-derived growth hormone is restricted in use due to safety problems causing neurological diseases ( Neuropathology Applied Neurobiology 12, 509, 1986), and genetic engineering technology. Methionyl human growth hormone produced by microorganisms has the same properties as natural human growth hormone in terms of biological activity (JA Endocrinology 122, 2920, 1988), but it is composed of 192 amino acids due to the addition of methionine residues. Antibody production rates have been reported to be slightly higher than natural forms (Lancet I 697, 1986).
따라서 재조합 인간 성장호르몬 등의 재조합 천연형 단백질을 제조하려는 시도가 많이 있었다. 예를 들면 아미노 말단을 수식하여 발현시킨 후 특수한 프로테아제(protease)를 이용하여 부수적인 아미노산을 절단하는 방법(W/O 86/04609;Biotechnology5, 161, 1987;J. Biotechnology18, 41, 1991), 성장호르몬이 세포내에서 생합성된 후 세포의 주변질 또는 배양액 중으로 분비되면서 아미노 말단의 메치오닌이 제거되도록하여 천연형 인간 성장호르몬을 제조하는 방법(USP 4755465; Biotechnology 4, 991, 1986; Gene 55, 189, 1987; Gene 54, 197, 1987)등이 있다. 그러나 상기의 방법으로 인간 성장호르몬을 숙주에서 발현시킬 경우 그 발현수율이 전체 단백질에 매우 낮다는 문제점이 있다. 이에 따라 이미 개발된 숙주/벡터계를 이용하여 메치오닐 인간 성장호르몬을 생산한 후 메치오닌만을 제거하는 방법이 많이 개발되었는데, 그와 같은 방법으로는 아미노펩티다제로 처리하는 방법 또는 아미노펩티다제 엠으로 처리하는 방법이 알려져 있다(W/O 86/01229; EP 204527 A1; KP출원 92-25910). 일반적으로 돼지 신장으로부터 조직세절, 원심분리, 트립신처리, 유안분획, DEAE-세파덱스 이온교환크로마토그라피의 과정을 차례로 거쳐 분리정제한 시판되는 아미노펩티다제 엠을 사용할 경우, 분리한 아미노펩티다제 엠에 기질특이성이 다른 펩타이드 분해효소가 혼재될 가능성이 높아 메치오닐 단백질로부터 목적하는 천연형 단백질로의 효율적인 전환을 기대할 수 없어 예상하지 못한여러 분해 산물이 생성되는 문제점이 있고(蛋白質 核酸 酵素 29, 825, 1984;J. Biochemistry94, 619, 1983), 재조합 메치오닐 단백질에서 메치오닌만을 제거하기에는 효과적이지 못한 문제점이 또한 있다.Therefore, there have been many attempts to produce recombinant natural protein such as recombinant human growth hormone. For example, a method of modifying and expressing an amino terminus and cleaving ancillary amino acids using a special protease (W / O 86/04609; Biotechnology 5, 161, 1987; J. Biotechnology 18, 41, 1991) After the growth hormone is biosynthesized in the cell and secreted into the periplasm or culture of the cell to remove the amino terminal methionine to produce a natural human growth hormone (USP 4755465; Biotechnology 4, 991, 1986; Gene 55, 189, 1987; Gene 54, 197, 1987). However, when the human growth hormone is expressed in the host by the above method, the expression yield is very low in the whole protein. Accordingly, a number of methods for removing methionine after producing methionyl human growth hormone using a previously developed host / vector system have been developed. Such a method includes an aminopeptidase treatment or an aminopeptidase M. Processes are known (W / O 86/01229; EP 204527 A1; KP Application 92-25910). In the case of using commercially available aminopeptidase M, which is generally separated and purified from pig kidneys in the course of tissue cutting, centrifugation, trypsin treatment, mammary fraction, and DEAE-Sephadex ion exchange chromatography, the isolated aminopeptidase There is a high possibility of mixing of peptide degrading enzymes having different substrate specificities in M. Therefore, it is not possible to expect an efficient conversion from methionyl protein to a natural protein of interest. 825, 1984; J. Biochemistry 94, 619, 1983), there is also a problem that is not effective to remove only methionine from recombinant methionyl protein.
또한 이러한 분해산물 생성을 저해하는 효소 저해제를 첨가하는 방법이 있으나(J. Biochemistry94, 619, 1983), 이와 같은 효소 저해제는 생체에 독성이 있다는 문제점이 있다.In addition, there is a method of adding an enzyme inhibitor that inhibits the production of such degradation products ( J. Biochemistry 94, 619, 1983), but such an enzyme inhibitor has a problem in that it is toxic to a living body.
[본 발명이 해결하려 하는 과제][PROBLEMS TO BE SOLVED BY THE INVENTION]
이에 본 발명자들은 아미노펩티다제 엠을 보다 효과적으로 정제하기에 위한 방법에 대하여 연구한 결과, 소수성 크로마토그라피와 겔여과크로마토그라피를 이용하여 아미노펩티다제 엠을 정제할 경우 메치오닐 단백질로부터 효과적으로 메치오닌만을 제거할 수 있다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.Therefore, the present inventors studied a method for more effectively purifying aminopeptidase M. When purifying aminopeptidase M using hydrophobic chromatography and gel filtration chromatography, only methionine was effectively extracted from methionyl protein. The present invention has been completed by discovering that it can be removed.
따라서 본 발명의 목적은 돼지 신장으로부터, 재조합 메치오닐 단백질의 아미노 말단에 존재하는 메치오닌을 특이적으로 제거하여 천연형과 동일한 아미노산 서열을 갖는 재조합 단백질을 제조할 수 있는 고순도의 아미노펩티다제 엠을 분리, 정제하는 방법을 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a high-purity aminopeptidase M which can prepare a recombinant protein having the same amino acid sequence as that of the natural form by specifically removing methionine present at the amino terminus of the recombinant methionyl protein from porcine kidney. It is to provide a method for separation and purification.
[과제를 해결하기 위한 수단][Means for solving the problem]
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 돼지 신장으로부터 조직을 세절하여, 원심분리하고, 원심분리하여 얻은 침전물을 트립신으로 처리한 후, 유안으로 침전하는 공정을 포함하는 아미노펩티다제 엠을 정제하는 방법에 있어서, 유안 침전 후 소수성 크로마토그라피를 실시하고, 상기 소수성 크로마토그라피를 실시하여 얻은 아미노펩티다제 엠 활성 분획 용액에 겔 여과 크로마토그라피를 실시하는 공정을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 아미노펩티다제 엠의 정제방법을 제공한다.In order to achieve the object of the present invention as described above, the present invention is an aminopeptide comprising the step of slicing the tissue from the pig kidney, centrifugation, and processing the precipitate obtained by centrifugation with trypsin, and then settling into the milk The method for purifying M. further comprises a step of performing hydrophobic chromatography after precipitation of the yuan and performing gel filtration chromatography on the aminopeptidase M active fraction solution obtained by performing the hydrophobic chromatography. A method for purifying aminopeptidase M is provided.
상기한 본 발명에 있어서, 상기한 소수성 크로마토그라피는 페닐-세파로즈 CL-4B 또는 페닐-세파로즈 패스트 플로우(Phenyl-Sepharose Fast Flow) 칼럼이고, 겔 여과 크로마토그라피는 세파크릴 S-300, 세파로즈 6B 또는 세파로즈 CL-6B 칼럼인 것이 바람직하다. 이 때 상기한 소수성 크로마토그라피는 1.3M과 0M의 유안 염선형농도구배로 용출하는 것이 바람직하다.In the present invention, the hydrophobic chromatography described above is a phenyl-Sepharose CL-4B or a phenyl-Sepharose Fast Flow column, and the gel filtration chromatography is Sephacryl S-300, Sepharose. It is preferred that it is a 6B or Sepharose CL-6B column. At this time, the hydrophobic chromatography described above is preferably eluted with a chlorine salt farm of 1.3M and 0M.
또한 본 발명은 상기한 본 발명의 아미노펩티다제 엠의 정제방법에 따라 정제된 아미노펩티다제 엠을 프로테아제 저해제 처리 없이 반응액 중에서 재조합 천연형 단백질과 반응시키는 천연 단백질의 제조방법을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a method for producing a natural protein by reacting the purified aminopeptidase M with a recombinant natural protein in the reaction solution without a protease inhibitor treatment according to the purification method of the aminopeptidase M of the present invention described above.
상기한 본 발명의 천연 단백질의 제조방법은, 상기 재조합 단백질은 재조합 인간 성장호르몬인 것이 바람직하다.In the above-described method for producing a natural protein of the present invention, the recombinant protein is preferably a recombinant human growth hormone.
[작 용][Action]
본 발명을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 돼지 신장의 피질을 분리하여 완충액을 첨가한 후 균질화하고 원심분리하여 상등액을 모은 다음, 얻어진 상등액에 분획 침전을 실시하고, 이후 원심분리로 모은 침전물을 완충액으로 용해시키고, 용해액에 톨루엔을 첨가하여 반응시키고 원심분리하여 막층을 분리하여 완충액에 현탁시키고, 현탁액을 트립신 처리하여 가용화시키고 원심분리하여 상등액만을 수집하고, 이 상등액에 유안으로 처리하여 20-80%의 유안 농도에서 침전하는 침전물을 모으고, 얻어진 침전물을 완충액에 용해시킨 후 소수성 크로마토그라피하여 활성을 나타내는 분획들을 수집하여 농축하고, 농축액을 겔 여과 크로마토그라피하여 활성을 나타내는 분획들을 수집하는 단계를 포함하는 아미노펩티다제 엠의 정제방법을 제공한다.The present invention separates the cortex of the pig kidney, adds a buffer solution, homogenizes and centrifugs to collect the supernatant, and then fractionate precipitate in the obtained supernatant, and then dissolve the precipitate collected by centrifugation in a buffer, toluene in the lysate The reaction mixture was added and centrifuged to separate the membrane layer, suspended in a buffer solution, the suspension was trypsinized, solubilized, and centrifuged to collect only the supernatant. Collecting, dissolving the obtained precipitate in a buffer and hydrophobic chromatography to collect and concentrate the fractions showing the activity, the concentrate is purified by gel filtration chromatography to collect the fractions showing the activity purification of aminopeptidase M Provide a method.
상기한 본 발명에 있어서, 상기한 소수성 크로마토그라피는 페닐-세파로즈 CL-4B(Phenyl-Sepharose CL-4B) 또는 페닐-세파로즈 패스트 플로우(Phenyl-Sepharose Fast Flow) 칼럼, 겔 여과 크로마토그라피는 세파크릴-S300(Sephacryl-S300), 세파로즈 6B(Sepharose 6B) 또는 세파로즈CL-6B(Sepharose CL-6B) 칼럼상에서 실시하는 것이 바람직하다.In the present invention, the hydrophobic chromatography is phenyl-Sepharose CL-4B or Phenyl-Sepharose Fast Flow column, gel filtration chromatography is Sepha It is preferred to carry out on a Sephacryl-S300, Sepharose 6B or Sepharose CL-6B column.
상기한 소수성 크로마토그라피에서는 1.3M과 0M 범위의 유안 염 선형농도구배로 용출하는 것이 바람직하다.In the hydrophobic chromatography described above, it is preferable to elute the sulphate linear thickener in the range of 1.3M and 0M.
또 상기한 아미노펩티다제 엠을 사용하여 재조합 천연형 단백질을 제조할 때, 재조합 메치오닐 단백질로는 통상의 정제 방법에 의해 대장균, 효모 등의 숙주세포로부터 얻어진 메치오닐 단백질을 사용할 수 있으며, 재조합 메치오닐 인간 성장호르몬의 경우 1mg당 0.5 단위의 아미노펩티다제 엠을 사용하여 처리하는 것이 바람직하다.In addition, when preparing a recombinant natural protein using the aminopeptidase M described above, as the recombinant methionyl protein, methionyl protein obtained from host cells such as E. coli and yeast may be used by a conventional purification method. For methionyl human growth hormone it is preferred to use 0.5 units of aminopeptidase M per mg.
따라서, 본 발명은 돼지 신장으로부터 효율적인 정제 과정을 거쳐 적절히 아미노펩티다제 엠을 분리함으로써 이를 이용하여 재조합 천연형 단백질을 제조할 때, 계속적인 아미노산 분해없이 아미노 말단의 메치오닌 잔기만을 선택적으로 제거하여 부수적인 분해 산물의 발생 없이 천연형 단백질를 제조하는 방법을 제공한다.Accordingly, the present invention, when preparing a recombinant native protein by separating the aminopeptidase M appropriately through efficient purification process from porcine kidney, by selectively removing only the amino terminal methionine residues without continuous amino acid degradation, incidental Provided are methods for preparing native proteins without the generation of phosphoryl degradation products.
이하 본 발명을 실시예에 의거하여 상세히 설명하면 다음과 같다. 그러나 하기한 실시예는 본 발명이 이해를 돕기 위한 본 발명의 바람직한 일 실시예일 뿐 본 발명이 여기에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples. However, the following examples are only preferred embodiments of the present invention for the purpose of understanding the present invention, but the present invention is not limited thereto.
하기한 실시예에서 사용되는 메치오닐 인간 성장호르몬은 대한민국 특허출원 제95-23434호에 의해 명시된 방법으로 정제된 것, 또는 정제 중간물이고, 아미노펩티다제 엠의 단위는 50mM의 테스 완충액(pH 7.0)에서 알라닌-파라 니트로아닐리드(Ala-pNA)를 기질로 37℃에서 반응시켰을 때 1μmol의 생성물(p-nitroaniline)을 유리하는 효소량을 1단위로 정의한다.The methionyl human growth hormone used in the examples below is purified by the method specified by Korean Patent Application No. 95-23434, or a purification intermediate, and the unit of aminopeptidase M is 50 mM test buffer (pH). In 7.0), the amount of enzyme that liberates 1 μmol of product (p-nitroaniline) is defined as 1 unit when alanine-para nitroanilide (Ala-pNA) is reacted with a substrate at 37 ° C.
실시예 1 : 돼지 신장의 처리Example 1 Treatment of Porcine Kidneys
우선 돼지 신장의 피질을 분리한다. 신장 kg당 3L의 100mM 트리스완충액(pH 7.3)을 첨가하여 균질화하고 3,000xg로 15분간 원심분리하여 상등액을 얻었다.First, the cortex of the pig kidneys is separated. 3 L of 100 mM Tris buffer solution (pH 7.3) per kg of kidney was added to homogenize and centrifuged at 3,000xg for 15 minutes to obtain a supernatant.
이 상등액을 분획 침전하기 위하여 초산으로 pH를 5.0으로 맞추고, 3,000xg로 20분간 원심분리하였고, 여기서 얻은 침전물에 신장 kg당 2L의 100mM 트리스 완충액(pH 7.3)을 첨가하여 용해시켰다.In order to fractionally precipitate this supernatant, the pH was adjusted to 5.0 with acetic acid and centrifuged at 3,000 × g for 20 minutes, and the precipitate obtained was dissolved by adding 2 L of 100 mM Tris buffer (pH 7.3) per kg of kidney.
이 용액 중 막층만을 분리하기 위해 신장 kg당 100ml의 톨루엔을 첨가하고, 38℃에서 60분간 교반하였고, 이후 4℃에서 일야방치하였다. 이 용액을 12,000xg로 1시간 원심분리를 행하여 중간층에 형성된 단백질 응결층을 취하고, 이것을 1L의 10mM 트리스 완충액(pH 7.3)으로 현탁시켰다.To separate only the membrane layer in this solution, 100 ml of toluene per kg of kidney was added, stirred at 38 ° C. for 60 minutes, and then left at 4 ° C. overnight. The solution was centrifuged at 12,000 × g for 1 hour to obtain a protein condensation layer formed in the intermediate layer, which was suspended in 1 L of 10 mM Tris buffer (pH 7.3).
이 현탁액을 신장 0.1kg당 20mg의 트립신으로 37℃에서 2시간 동안 처리하고이 용액을 12,000xg로 1시간동안 원심분리하여 톨루엔층을 버리고 상등액만을 모았다. 트립신을 처리하여 얻은 상등액으로부터 20-80% 유안 침전물을 얻어 이 침전물을 50mM 인산염 완충액(pH 7.0)으로 용해시켰다.The suspension was treated with 20 mg of trypsin per 0.1 kg of kidney at 37 ° C. for 2 hours and the solution was centrifuged at 12,000 × g for 1 hour to discard the toluene layer and only the supernatant was collected. A 20-80% yuan precipitate was obtained from the supernatant obtained by trypsin treatment, and the precipitate was dissolved in 50 mM phosphate buffer (pH 7.0).
실시예 2 : 아미노펩티다제 엠의 분리Example 2 Isolation of Aminopeptidase M
실시예 1에서 수득한 유안 침전용액을 1.3M의 유안을 포함한 50mM 인산염 완충액(pH 7.0)으로 평형화된 페닐-세파로즈 칼럼(5.6×12.5cm, 300ml)에 흡착시킨 후 1.3-0M의 유안 염 선형 농도 구배를 이용하여 아미노펩티다제 엠을 용출시켰으며, 그 결과를 제1도에 나타내었다.The fluoroprecipitation solution obtained in Example 1 was adsorbed onto a phenyl-sepharose column (5.6 × 12.5 cm, 300 ml) equilibrated with 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 1.3 M of milk, followed by 1.3-0 M of sulphate linear. A concentration gradient was used to elute the aminopeptidase M and the results are shown in FIG.
용출된 활성분획을 농축기(MWCO 10kD)로 5ml까지 농축하고, 이 농축액을 50mM 테스 완충액(pH 7.0)으로 평형화된 세파크릴 S-300 칼럼(2.5×30cm)에 주입하여 겔 여과 크로마토그라피를 수행하였으며 그 결과를 제2도에 나타내었다.The eluted active fraction was concentrated to 5 ml with a concentrator (
아미노펩티다제 엠의 활성을 지닌 용출액을 전기영동(Native-PAGE)을 실시했을 때 제3도에서와 같이 단일 밴드의 아미노펩티다제 엠임을 확인하였다.When the eluate having the activity of aminopeptidase M was subjected to electrophoresis (Native-PAGE), it was confirmed that it was a single band of aminopeptidase M as shown in FIG.
적용예 1 : 본 발명에 의한 아미노펩티다제 엠을 이용한 재조합 인간 성장호르몬의 제조 (1)Application Example 1 Preparation of Recombinant Human Growth Hormone Using Aminopeptidase M of the Present Invention (1)
약 2mg에 해당하는 재조합 메치오닐 인간 성장호르몬에 본 발명의 방법으로 정제된 아미노펩티다제 엠 1단위를 첨가한 반응액(1 mM 염화코발트, 150mM 염화칼륨, 50mM 테스 완충액, pH 7.0) 1ml을 45℃에서 반응시켰다. 반응 20시간 후 반응액을 고속 역상 크로마토그라피하여 반응시켰다. 반응 20시간 후 반응액을 고속 역상 크로마토그라피하여 분석한 결과, 재조합 메치오닐 인간 성장호르몬이 재조합인간 성장호르몬으로 전환된 것을 확인하였고, 이것을 제4도에 나타내었다. 제4-1도는 아미노펩티다제 엠으로 처리하지 않은 시료, 제4-2도는 아미노펩티다제 엠 처리 후의 시료에 대한 크로마토그라피 결과를 나타낸다. 두 크로마토그람에서 성장호르몬 주피이크 이외의 다른 피이크 양상은 비슷하며 따라서, 아미노 말단의 메치오닌만이 선택적으로 절단되고 더 이상의 아미노산은 절단되지 않음을 확인할 수 있었다.1 ml of a reaction solution (1 mM cobalt chloride, 150 mM potassium chloride, 50 mM test buffer, pH 7.0) containing 1 unit of aminopeptidase M purified by the method of the present invention was added to a recombinant methionyl human growth hormone equivalent to about 2 mg. The reaction was carried out at 占 폚. After 20 hours of reaction, the reaction solution was reacted by high-speed reverse phase chromatography. After 20 hours of reaction, the reaction solution was analyzed by high-speed reversed phase chromatography. As a result, it was confirmed that recombinant methionyl human growth hormone was converted to recombinant human growth hormone, which is shown in FIG. FIG. 4-1 shows the chromatographic results for the sample not treated with aminopeptidase M, and FIG. 4-2 shows the sample after the aminopeptidase M treatment. Peak patterns other than growth hormone main peak in both chromatograms were similar and thus, only amino-terminal methionine was selectively cleaved and no more amino acids were cleaved.
적용예 2 : 본 발명에 의한 아미노펩티다제 엠을 이용한 재조합 인간 성장호르몬의 제조 (2)Application Example 2 Preparation of Recombinant Human Growth Hormone Using Aminopeptidase M of the Present Invention (2)
약 2mg의 재조합 메치오닐 인간 성장호르몬에 해당되는 재조합 메치오닐 인간 성장호르몬의 제조과정 중의 중간물(순도 70%이상)에 본 발명의 방법으로 정제된 아미노펩티다제 엠 1단위를 첨가한 반응액(1mM 염화코발트, 150mM 염화칼륨, 50mM 테스 완충액, pH 7.0) 1ml을 45℃에서 반응시켰다. 20시간 반응시킨 반응액을 고속 역상 크로마토그라피하여 분석한 결과, 재조합 메치오닐 인간 성장호르몬이 재조합 인간 성장호르몬으로 전환된 것을 확인하였고, 이것을 제4도에 나타내었다. 제4-3도는 아미노펩티다제 엠으로 처리하지 않은 시료, 제4-4도는 아미노펩티다제 엠 처리 후의 시료에 대한 크로마토그라피 결과를 나타낸다. 두 크로마토그람에서 성장호르몬 주피이크 이외의 다른 피이크 양상은 비슷하며 따라서, 아미노 말단의 메치오닌만이 선택적으로 절단되고 더 이상의 아미노산은 절단되지 않음을 확인할 수 있었다.Reaction solution in which 1 unit of aminopeptidase M purified by the method of the present invention is added to an intermediate (more than 70% purity) during the preparation of recombinant methionyl human growth hormone corresponding to about 2 mg of recombinant methionyl human growth hormone. 1 ml (1 mM cobalt chloride, 150 mM potassium chloride, 50 mM test buffer, pH 7.0) was reacted at 45 ° C. As a result of analyzing the reaction solution reacted for 20 hours by high-speed reverse phase chromatography, it was confirmed that the recombinant methionyl human growth hormone was converted to the recombinant human growth hormone, which is shown in FIG. Figures 4-3 show chromatographic results for samples not treated with aminopeptidase M and Figures 4-4 show samples after aminopeptidase M treatment. Peak patterns other than growth hormone main peak in both chromatograms were similar and thus, only amino-terminal methionine was selectively cleaved and no more amino acids were cleaved.
비교예 1: 프로테아제 저해제에 의한 영향Comparative Example 1: Influence by Protease Inhibitor
약 2mg의 재조합 메치오닐 인간 성장호르몬에 본 발명의 방법으로 정제된 아미노펩티다제 엠 1단위와 이를 프로테아제 저해제인 DFP와 PMS 각 1mM로 37℃에서 2시간 처리한 것들을 사용하여, 반응액(1mM 염화코발트, 150mM 염화칼륨, 50mM 테스 완충액, pH 7.0) 상에서 재조합 인간 성장호르몬으로 전환하였다. 45℃로 20시간 반응한 후 반응액을 각각 고속 역상 크로마토그라피로 분석을 행하였고, 그 결과를 제4도에 나타내었다. 마찬가지로 전기영동한 결과는 제5도에 나타내었다.About 2 mg of recombinant methionyl human growth hormone was treated with 1 unit of aminopeptidase M purified by the method of the present invention and treated with 1 mM of DFP and PMS, which are protease inhibitors, at 37 ° C. for 2 hours, and the reaction solution (1 mM). Cobalt chloride, 150 mM potassium chloride, 50 mM test buffer, pH 7.0) was converted to recombinant human growth hormone. After reacting at 45 ° C. for 20 hours, the reaction solution was analyzed by high-speed reverse phase chromatography, and the results are shown in FIG. 4. Likewise, the result of electrophoresis is shown in FIG.
제4-5도는 DFP와 PMSF로 처리하지 않은 아미노펩티다제 엠을 반응에 사용한 경우이고, 제4-6도는 DFP와 PMSF로 처리한 아미노펩티다제 엠을 반응에 사용한 경우를 나타낸 것이다. 두 크로마토그람에서 모두 메치오닐 인간 성장호르몬이 인간 성장호르몬으로 전환되는 것을 확인하였고, 두 크로마토그람으로부터 본 발명에 따라 정제한 아미노펩티다제 엠의 경우에는 프로테아제 저해제인 DFP와 PMSF의 처리없이도 프로테아제 저해제를 처리한 것과 동일한 전환을 보여줌을 알 수 있다. 또 제5도에서도 메치오닐 인간 성장호르몬을, 본 발명에 따라 정제한 아미노펩티다제 엠을 프로테아제 저해제를 처리하여, 전환시킨 시료(lane 1)와 처리하지 않은 아미노펩티다제 엠으로 전환시킨 시료(lane 2)를 분석했을 때의 전기영동 양상이 유사함을 알 수 있었다.4-5 shows a case where the aminopeptidase M not treated with DFP and PMSF is used for the reaction, and FIG. 4-6 shows a case where the aminopeptidase M treated with DFP and PMSF is used for the reaction. In both chromatograms, it was confirmed that methionyl human growth hormone was converted to human growth hormone, and in the case of aminopeptidase M purified according to the present invention from both chromatograms, the protease inhibitor was not treated without protease inhibitors DFP and PMSF. You can see that it shows the same conversion as processing. Also in FIG. 5, methionyl human growth hormone was converted into an aminopeptidase M purified according to the present invention by treatment with a protease inhibitor and converted into a sample (lane 1) and an untreated aminopeptidase M. Analysis of (lane 2) showed similar electrophoretic behavior.
따라서 본 발명에 따라 아미노펩티다제 엠을 정제할 경우 기존의 방법으로는 혼입되던 프로테아제가 제거되고 저해제 처리없이도 재조합 천연형 단백질로 전환시키는데 적절하게 이용할 수 있음을 본 발명에서는 확실하게 입증하였다.Therefore, the present invention clearly demonstrated that the purification of the aminopeptidase M according to the present invention can be suitably used to remove the protease incorporated by the conventional method and convert it into a recombinant native protein without inhibitor treatment.
비교예 2Comparative Example 2
본 발명에 따라 정제한 아미노펩티다제 엠과 시판되는 아미노 펩티다제 엠의 활성 및 정제된 아미노펩티다제 엠에 혼재되어 있는 DAP(dipeptidyl aminopeptidase)의 활성을 측정하여 그 결과를 하기한 표 1에 나타내었다. 하기한 표 1에 나타낸 것과 같이, 본 발명에 따라 정제한 아미노펩티다제 엠의 DAP 활성은 저해제 처리없이도 저해제로 처리한 것과 유사한 DAP 활성을 나타낸다. 또한 본 발명에 따라 정제한 아미노펩티다제 엠의 DAP 활성이 저해제 처리없이도 시판되는 아미노펩티다제 엠의 DAP 활성과 동일한 값으로 나타남을 알 수 있다.According to the present invention, the activity of purified aminopeptidase M and commercially available amino peptidase M and the activity of DAP (dipeptidyl aminopeptidase) mixed in purified aminopeptidase M were measured. Shown in As shown in Table 1 below, the DAP activity of the aminopeptidase M purified according to the present invention shows a similar DAP activity to that treated with the inhibitor without the inhibitor treatment. In addition, it can be seen that the DAP activity of the aminopeptidase M purified according to the present invention is represented by the same value as the DAP activity of the commercial aminopeptidase M without inhibitor treatment.
[표 1]TABLE 1
[효 과][effect]
본 발명에 따라서, 돼지 신장으로부터 적절한 순도로 분리된 아미노펩티다제 엠으로 아미노 말단에 메치오닌 잔기를 갖는 재조합 메치오닐 단백질, 예로 들면 메치오닐 인간 성장호르몬을 반응 완충용액 중에서 처리하면 다른 혼입 프로테아제에 의한 분해산물이 없이 재조합 천연형 단백질을 제조할 수 있다.According to the present invention, a recombinant methionyl protein, such as methionyl human growth hormone, having a methionine residue at the amino terminus of an aminopeptidase M, isolated from porcine kidney in proper purity, is treated by different incorporation proteases. Recombinant native protein can be prepared without degradation products.
제1도는 유안 침전물을 소수성 크로마토그라피한 결과를 나타낸 크로마토그램이고,1 is a chromatogram showing the result of hydrophobic chromatography of yuan precipitate,
제2도는 소수성 크로마토그라피한 아미노펩티다제 엠 용출액을 겔 여과 크로마토그라피한 결과를 나타낸 크로마토그램이고,2 is a chromatogram showing the result of gel filtration chromatography of the hydrophobic chromatographed aminopeptidase M eluate,
제3도는 본 발명의 정제 방법의 일 실시예에 따라 얻어진 아미노펩티다제 엠을 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(Native-PAGE)한 결과를 나타내는 사진이며,Figure 3 is a photograph showing the result of polyacrylamide gel electrophoresis (Native-PAGE) of the aminopeptidase M obtained according to an embodiment of the purification method of the present invention,
제4도는 본 발명의 정제 방법의 일 실시예에 따라 얻어진 아미노펩티다제 엠을 사용하여 메치오닐 인간 성장호르몬을 처리한 것을 고속 역상 크로마토그라피로 분석한 크로마토그램이고,4 is a chromatogram analyzed by high-speed reverse phase chromatography of the treatment of methionyl human growth hormone using aminopeptidase M obtained according to one embodiment of the purification method of the present invention,
제5도는 제4도의 것을 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동으로 분석을 실시한 결과를 나타내는 사진이다.FIG. 5 is a photograph showing the results of analyzing the thing of FIG. 4 by polyacrylamide gel electrophoresis. FIG.
Claims (3)
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| KR1019970012407A KR100449125B1 (en) | 1997-04-03 | 1997-04-03 | Method for purifying aminopeptidase m from kidney of pig in higher purity and yield, thereby removing methionine without treatment of protease inhibitor |
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| KR1019970012407A KR100449125B1 (en) | 1997-04-03 | 1997-04-03 | Method for purifying aminopeptidase m from kidney of pig in higher purity and yield, thereby removing methionine without treatment of protease inhibitor |
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| EP0204527A1 (en) * | 1985-06-04 | 1986-12-10 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Removal of the N-terminal methionine from methionylproteins |
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| KR920004565A (en) * | 1990-08-31 | 1992-03-27 | 최근선 | Method for Purifying Aminopeptidase from Vibrio Proteolyticus |
-
1997
- 1997-04-03 KR KR1019970012407A patent/KR100449125B1/en not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR19980075977A (en) | 1998-11-16 |
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