KR960005734B1 - Purification method for fibrinogen protease - Google Patents
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Abstract
Description
제1도는 반응단계별 중간 생성물 및 최종 생성물과 단백질 표준시료를 13% 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴 아마이드 겔 전기영동(SDS-PAGE)의 측정결과이다.FIG. 1 shows the results of 13% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) of intermediate and final products and protein standards for each reaction step.
* 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명* Explanation of symbols for main parts of the drawings
레인1 : 4가지 단백질을 표준시료로 한 것으로 위로부터 가인산 분해효소/소의 혈청알부민/오브알부민/탈산탈수효소/콩의 트립신 억제제/라이소자임이고,Lane 1: 4 proteins as a standard sample, phosphate degrading enzyme / bovine serum albumin / ob albumin / deacid dehydratase / soybean trypsin inhibitor / lysozyme,
레인2 : 황산암모니움에 침전된 단백질을 용해시킨 시료이며,Lane 2: A sample in which protein precipitated in ammonium sulfate was dissolved.
레인3 : 음이온 교환 크로마토그래피하여 겔에 결합되어진 단백질을 용출시킨 부분이고,Lane 3: an anion exchange chromatography to elute the protein bound to the gel,
레인4 : 라인신 아가로스 크로마토그래피하여 정제가 완료된 혈 섬유 분해효소이다.Lane 4: Refining complete hemofibrinase by rhinecin agarose chromatography.
본 발명은 토룡(Lumbricus rubellus)으로부터 혈섬유소 분해능을 갖는 프로테아제를 분리 정제하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 토룡(Lumbricus rubellus) 추출물로부터 혈섬유소 분해활성을 가진 프로테아제를 교환수지 컬럼을 이용하여 분회하고, 이를 기질 특이성을 이용한 라이신-아가로스 친화성 컬럼크로마토그래피를 하여서, 순도 95% 이상의 혈섬유 분해활성을 갖으면서 N-말단으로부터 Ile1-Val2-Gly3-Gly4-Ile5-Glu6-Ala7순의 아미노산 서열을 갖는 프로테아제를 분리 정제하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for separating and purifying a protease having a hemocellulose degradability from a thorax (Lumbricus rubellus). and lysine using this substrate specificity - hayeoseo agarose affinity column chromatography, and the purity greater than 95% while gateu blood fiber-decomposing activity Ile 1 -Val 2 -Gly 3 -Gly 4 -Ile 5 from N- terminal -Glu A method for isolating and purifying proteases having an amino acid sequence of 6- Ala 7 order.
중국의 고전 의약서에 따르면 토룡(earthworm)은 중풍에 의한 반신불수 치료에 널리 사용한 기록이 있으며, 특히 혈관 질환치료에 효과가 있다고 알려져 있다.According to a classical Chinese medicine, earthworms have been widely used to treat paraplegia due to stroke, and are known to be effective in treating vascular diseases.
또한, 토룡의 체강내에는 혈 섬유를 분해하는 효소가 있다는 것을 알려져 있다(일본 특호공개공보 소59-63184호 및 소59-184131호).In addition, it is known that there are enzymes that degrade blood fibers in the body cavity of Taurus (Japanese Patent Laid-Open Nos. 59-63184 and 59-184131).
이러한 효과와 성분을 지닌 토룡의 현탁액에는 위와 같은 효소 이외에도 탄수화물, 리피드, 핵산, 이들의 분해산물, 토룡표피등 다른 여러가지 불순물들을 함유하고 있다.In addition to the above enzymes, the Serpent suspension containing these effects and ingredients contains carbohydrates, lipids, nucleic acids, their degradation products, and various other impurities such as the Serpent epidermis.
따라서, 토룡의 분말 또는 현탁액상에서 혈 섬유를 분해하는 기능이 없는 불필요한 물질을 제거하고 혈 섬유를 분해하는 기능을 가지는 단백질 분해효소를 얻기 위해서는 별도의 분리단계가 필요하다.Therefore, a separate separation step is necessary to remove unnecessary substances without the function of decomposing blood fibers and to obtain proteolytic enzymes having the function of decomposing blood fibers on the powder or suspension of the thorax.
이러한 토룡으로부터 프로테아제를 얻는 기존의 정제법으로서는, 일반적으로 전처리 과정을 거친 토룡엑기스에 함유되어 있는 프로테아제 군을 황산암모니움 분리법이나 겔 크로마토그래피방법으로 분리함으로써 정제된 프로테아제를 얻는 방법이 이용되고 있다.As a conventional purification method for obtaining a protease from the thorax, a method of obtaining a purified protease by separating the protease group contained in the thorax extract, which has been pretreated, by ammonium sulfate separation or gel chromatography, is used.
그러나, 이와 같은 종래의 방법은 특히, 전처리 과정을 거친 토룡 추출물로부터 프로테아제를 정제하기 위해 컬럼크로마토그래피를 실시하는 단계에 있어서 여러가지 문제점을 갖고 있다. 예를 들면 혈섬유소 분해활성을 가진 프로테아제를 얻기 위해 음이온 교환수지 컬럼, 겔 컬럼, 흡착 컬럼, 소수성 흡착 컬럼 등 적어도 3종류 이상의 컬럼을 사용하여야하며, 특히 겔 컬럼을 사용할 경우에는 많은 양의 시료를 한꺼번에 처리하기 어려울 뿐만 아니라 많은 시간이 소요된다.However, such a conventional method has various problems, particularly in the step of performing column chromatography to purify protease from pre-treatment of thorax extract. For example, to obtain a protease with hemolytic activity, at least three or more types of columns such as anion exchange resin column, gel column, adsorption column, and hydrophobic adsorption column should be used. Not only are they difficult to handle at once, they are also time consuming.
본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하고자 연구 노력한 결과, 겔 컬럼을 사용하지 않고 음이온 교환수지 컬럼과 기질의 친화력을 이용한 친화성 컬럼크로마토그래피를 사용하고, 크로마토그래피 후 NaCl 농도 구배조절하여 고순도의 혈섬유소 분해활성을 가진 프로테아제를 토룡(Lumbricus rubellus)으로부터 대량 생산하는데 유용하게 이용될 수 있는 새로운 정제방법을 완성하게 되었다.The present inventors have tried to solve the above problems, using affinity column chromatography using the affinity of the anion exchange resin column and the substrate without using a gel column, after chromatographic gradient control of NaCl concentration of high purity blood A new purification method has been completed that can be useful for mass production of protease with fibrinolytic activity from Lumbricus rubellus.
따라서, 본 발명의 목적은 효소의 기질 특이성을 이용하여 토룡(Lumbricus rubellus)의 추출물로부터 혈섬유소 분해활성 프로테아제를 95% 이상의 고순도로 대량 정제하는데 유용한 프로테아제의 분리 정제방법을 제공하는데 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for separating and purifying a protease, which is useful for mass-purifying a high fibrinolytic activity protease with high purity of 95% or more from the extract of Lubricus rubellus using the substrate specificity of an enzyme.
이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 토룡(Lumbricus rubellus)의 추출물을 음이온 교환수지 컬럼으로 크로마토그래피하여 혈섬유소 분해활성을 가진 프로테아제를 분리하고 라이신-아가로스 컬럼으로 처리하여 정제하는 방법에 있어서, 토룡(Lumbricus rubellus)의 추출물을 황산암모니움으로 침전시킨 후, 얻어진 프로테아제 용액을 DEAE(디에틸아미노에틸)음이온 교환수지 컬럼 크로마토그래피 하여 1차 분리된 분획을 수집하고, 이를 라이신-아가로스 친화성 컬럼크로마토그래피 하되 NaCl의 농도가 0mM부터 250mM까지 되도록 선형농도구배를 주어 N-말단으로부터 Ile1-Val2-Gly3-Gly4-Ile5-Glu6-Ala7순의 아미노산 서열을 갖는 프로테아제를 고순도로 분리 정제하는 방법을 그 특징으로 한다.The present invention chromatographed the extract of Lubricus rubellus with an anion exchange resin column to separate proteases with hemolytic activity and purify them with a lysine-agarose column, extract of Lubricus rubellus The precipitated product was precipitated with ammonium sulfate, and then the obtained protease solution was subjected to DEAE (diethylaminoethyl) anion exchange resin column chromatography to collect the first separated fraction, which was then subjected to lysine-agarose affinity column chromatography to obtain a concentration of NaCl. from the N- terminus to give a linear gradient from 0mM to 250mM to a method for purifying a protease to remove the high purity having an amino acid sequence of Ile 1 -Val 2 -Gly 3 -Gly 4 -Ile 5 -Glu 6 -Ala 7 net It is characterized by.
이와 같은 본 발명은 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.Such a present invention will be described in more detail as follows.
본 발명은 토룡(Lumbricus rubellus)의 추출물로부터 혈섬유소 분해 활성을 가진 프로테아제를 분리 정제하는데 있어서, 토룡 추출물 현탁액으로부터 원심분리하여 불용해 침전물을 제거하는 과정을 거쳐 얻어진 추출물 용해액에 소량의 황산암모니움으로 처리한 다음, 원심분리하여 침전물을 제거하고, 그 상등액을 다량의 황산암모니움으로 처리한 후 원심분리하여 상등액을 제거하고, 그 침전물을 인산완충액으로 녹인 후, 음이온 교환수지 컬럼과 기질 특이성을 가진 친화성 컬럼크로마토그래피를 하여, 순도 95% 이상의 혈섬유소 분해 활성 프로테아제를 정제하는 것이다.The present invention is to separate and purify the protease with hemolytic activity from the extract of Lubricus rubellus, a small amount of ammonium sulfate in the extract solution obtained by the process of centrifugation to remove the insoluble precipitate from the extract of the Serpentus extract And then remove the precipitate by centrifugation, the supernatant was treated with a large amount of ammonium sulfate and then centrifuged to remove the supernatant, and the precipitate was dissolved in phosphate buffer, followed by anion exchange resin column and substrate specificity. Excitation affinity column chromatography is carried out to purify the cellulose fibrinolytic activity protease with a purity of 95% or more.
본 발명에서 출발물질인 토룡(Lumbricus rubellus)의 추출물은 공지의 방법으로 얻는다.Extract of the Lumbricus rubellus starting material in the present invention is obtained by a known method.
이 추출물을 원심분리하여 불용해 침전물을 제거한 후, 얻어진 용해물에 황산암모니움을 첨가하여 20%(W/V) 용액으로 만든 후 원심분리하여 침전물을 제거하고, 상기 상등액에 황산암모니움 농도 구배를 55%(W/V) 포화용액으로 만든 후 원심분리하여 침전물을 얻는다.The extract was centrifuged to remove insoluble precipitate, and then the ammonium sulfate was added to the obtained solution to form a 20% (W / V) solution, followed by centrifugation to remove the precipitate, and the concentration of ammonium sulfate in the supernatant gradient. To 55% (W / V) saturated solution and centrifuged to obtain a precipitate.
또한, 본 발명에서는 상기의 공지방법에 따른 과정을 거쳐 제조한 단백질 분획물을 정제하기 위하여 인산염 완충용액(10mM 인산염, pH 7.2)으로 녹인 후, 음이온 교환수지 컬러크로마토그래피와 라이신-아가로스 친화성 컬럼크로마토그래피를 수행하여 더욱 정제된 혈섬유소 분해 활성 단백질을 얻을 수 있다.In addition, the present invention is dissolved in a phosphate buffer (10mM phosphate, pH 7.2) to purify the protein fraction prepared through the process according to the known method, anion exchange resin color chromatography and lysine-agarose affinity column Chromatography can be performed to obtain more purified hemolytic enzyme protein.
여기서 음이온 교환수지 컬럼크로마토그래피는 음이온 교환수지로서 DEAE(diethylaminoethyl)을 사용하고, 이때 단백질의 용출에는 pH 7.2의 300mMNaCl을 포함한 완충용액으로 선형농도구배를 주어 용출시켰다.The anion exchange resin column chromatography used DEAE (diethylaminoethyl) as the anion exchange resin, and the protein was eluted with a linear concentrated tool using a buffer solution containing 300 mM NaCl at pH 7.2.
이렇게 하여 1차로 분리되어진 분획을 모아서 완충용액으로 투석한 후 기질 특이성을 가진 라이신(lysine) 아가로스 컬럼에 통과시켜 2차의 분획을 수행한다.In this way, the fractions separated firstly were collected and dialyzed with a buffer solution, and then passed through a lysine agarose column having substrate specificity to perform a second fraction.
혈섬유소 분해활성을 가진 프로테아제는 기질인 혈전의 아르기닌(Arginine)이나 라이신(Lysine) 잔기를 절단하는 특성을 가지고 있으므로 기질 특이성을 가진 라이신 아가로스와 결합하게 되어 매우 우수한 정제효과를 나타낸다.Protease with blood fibrinolytic activity has the property of cleaving arginine or lysine residues in the thrombus, which is a substrate, and thus, it combines with lysine agarose having substrate specificity, thus showing an excellent purification effect.
상기의 방법에 따라 토룡(Lumbricus rubellus) 추출물로부터 혈섬유소 분해 활성을 가진 단백질을 분리, 정제시키게 되면 종래의 겔 컬럼과 소수성 겔 컬럼방법을 사용한 경우[참고문헌:유럽특허 제105092호]보다 적은 수의 컬럼공정으로 순도 95% 이상까지 증가된다.According to the method described above, the separation and purification of proteins with hemofibrosis activity from Lumbris (Lumbricus rubellus) extract is less than that of the conventional gel column and hydrophobic gel column method [Reference: European Patent No.105092]. The column process increases the purity to 95% or more.
상술한 바와 같이 본 발명의 방법에 의하면 해열, 경련치료, 혈액순환촉진, 반신불수치료, 고혈압치료등 혈관치료에 효과가 있는 것으로 알려진 토룡(Lumbricus rubellus)의 추출물에서 순도가 낮은 혈섬유소 분해효소를 고수율로 분리, 정제할 수 있으며, 본 발명의 정제방법은 토룡 추출물내에 있는 다른 단백질들의 정제에도 유용하며, 특히 혈섬유소 분해 활성능의 차이가 있는 프로테아제들의 분리, 정제에 매우 유용하다.As described above, according to the method of the present invention, a low-purity hemolytic enzyme is extracted from an extract of Lurkus (Lumbricus rubellus), which is known to be effective for vascular treatment such as antipyretic, spasms, blood circulation, banung insufficiency, and hypertension. It can be isolated and purified in high yield, and the purification method of the present invention is also useful for the purification of other proteins in the thorax extract, and is particularly useful for the separation and purification of proteases with differences in hemolytic activity.
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples.
[실시예]EXAMPLE
토룡 추출물 제조방법How to prepare thorax extract
토룡(Lumbricus rubellus) 몸체에 있는 오물을 물로 충분히 씻어서 제거한 후, 등장액 5리터(0.9% 나트륨염 W/V)로 살아 있는 토룡 5kg을 상온에서 방치한다. 2시간씩 5회에 걸쳐 용액을 바꾸어 주어 토룡의 체내에 있는 오물을 충분히 배설시킨 후 물로 토룡을 깨끗하게 세척한다.After thoroughly washing off the dirt in the body of Lumbris (Lumbricus rubellus) with water, remove 5 kg of live dinosaurs with 5 liters of isotonic solution (0.9% sodium salt W / V) at room temperature. Change the solution five times every two hours to excrete the soil inside the dragon's body, and then wash the dragon with water.
소디움애자이드(NAN30.01% W/V)를 포함한 인산완충액(10mM 인산염, pH 7.4) 5리터에 오물을 제거한 토룡(Lumbricus rubellus)을 넣어 치사시킨 후, 초고속 호모게나 이저로 10,000rmp에서 2분간 3회씩 분쇄하여 토룡 현탁액을 얻었다. 토룡 현탁액 상태로 상온에서 베크만 CPR 원심분리기(Rotor GH 3.7)로 3,500rpm에서 60분간 원심분리하여 토룡의 불용성 침전물을 제거한 후 토룡 추출물을 얻어 다음 단계에 사용하였다.5 liters of phosphate buffer (10 mM phosphate, pH 7.4) containing sodium azide (NAN 3 0.01% W / V) was added to the debris-free Lumbricus rubellus. Trituration three times to obtain the pterosaur suspension. Centrifuged at 3,500 rpm for 60 minutes with a Beckman CPR centrifuge (Rotor GH 3.7) at room temperature in the soil suspension suspension to remove the insoluble precipitate of the dinosaur was obtained in the following steps.
[실시예 2]Example 2
암모니움 농도 분획법에 의한 정제Purification by Ammonium Concentration Fractionation
상기 실시예 1에서 얻어진 토룡(Lumbricus rubellus) 추출물 6리터에 황산암모니움 816g을 0℃에서 서서히 넣어 교반하면서 충분히 균질화시키고, 이때 얻어진 현탁액을 원심분리(25,000×g, 30분간)를 실시한 후 침전물을 제거하고 상등액 5.6리터를 얻었다.6 liters of Lumbricus rubellus extract obtained in Example 1 was slowly homogenized while stirring 816 g of ammonium sulfate at 0 ° C., and then the obtained suspension was centrifuged (25,000 × g, 30 minutes), and then a precipitate was obtained. The supernatant was removed and 5.6 liters were obtained.
상등액에서 다시 황산암모니움 1027g을 가하여 교반하면서 충분히 균질화시킨 후 원심분리(20,000×g, 30분간)한 후, 젖은 상태의 침전물 185g을 얻었다.1027 g of ammonium sulfate was added to the supernatant again, sufficiently homogenized with stirring, followed by centrifugation (20,000 × g, 30 minutes), and 185 g of a wet precipitate was obtained.
[실시예 3]Example 3
컬럼크로마토그래피에 의한 정제Purification by Column Chromatography
상기 실시예 2에서 얻어진 침전물중 일부를 인산 완충용액(10mM 인산염 pH 7.2)으로 4℃에서 완전히 용해시킨 후 동일 완충용액으로 평형시킨 DEAE-세피로즈 CL-6B 컬럼(7cm×25cm)에 1000ml(약 2mg/ml 단백질 농도)의 정제하고자 하는 혼합물을 4ml/min의 속도로 통과시키면서 겔에 결합시키고, 컬럼에 다시 완충용액(10mM 인산염, pH 7.2, 100mM NaCl)을 통과시켜서 컬럼내에 유리된 상태로 남아있는 단백질을 모두 제거하였다.Some of the precipitates obtained in Example 2 were completely dissolved at 4 ° C. in phosphate buffer (10 mM phosphate pH 7.2) and then 1000 ml (about 7 cm × 25 cm) in a DEAE-Sepirose CL-6B column (7 cm × 25 cm) equilibrated with the same buffer. 2 mg / ml protein concentration), the mixture to be purified was bound to the gel while passing at a rate of 4 ml / min, and passed through the buffer again (10 mM phosphate, pH 7.2, 100 mM NaCl) to remain free in the column. All proteins were removed.
그 다음 완충용액(10mM 인산염, pH 7.2, 100mM NaCl) 4리터와 300mM NaCl을 포함하는 완충용액 4리터로 선형 농도 구배를 줄어 겔에 결합되어 있던 단백질을 용출시켰다.Then, 4 liters of the buffer solution (10 mM phosphate, pH 7.2, 100 mM NaCl) and 4 liters of the buffer solution containing 300 mM NaCl reduced the linear concentration gradient to elute the protein bound to the gel.
용출된 각 분획의 혈섬유소 분해 활성이 높게 나타나는 부분 500ml을 모은 후 완충용액(10mM 인산염, pH 7.2) 4리터에 넣어 3회 이상 투석하였다.Each of the eluted fractions was collected in 500 ml of high hemolytic activity, and then dialyzed three times or more in 4 liters of buffer solution (10 mM phosphate, pH 7.2).
상기 투석한 분획을 미리 동일 완충용액으로 평형시킨 라이신 아가로스(Sigma사 제품) 컬럼(1.6cm×45cm)에 통과시키면서 겔에 흡착시키고 컬럼에 완충용액(10mM 인산염, pH 7.2)을 통과시켜유리된 상태로 남아있는 단백질을 모두 제거하였다.The dialysis fraction was adsorbed onto the gel while passing through a lysine agarose (Sigma) column (1.6 cm x 45 cm) previously equilibrated with the same buffer solution and passed through the buffer solution (10 mM phosphate, pH 7.2). All remaining protein was removed.
그 다음 완충용액(10mM 인산염, pH 7.2) 및 완충용액(10mM 인산염, pH 7.2, 250mM NaCl)을 이용하여 NaCl의 농도 구배가 0mM부터 250mM까지 되도록 선형 구배시켜서 용출시켰다. 용출된 각 분획을 10% SDS-PAGE와 HPLC로 순도를 측정한 결과 순도가 94.4이고 분자량 32,500 달톤의 혈섬유소 분해 단백질 분획을 수집하였다.Then, using a buffer solution (10 mM phosphate, pH 7.2) and a buffer solution (10 mM phosphate, pH 7.2, 250 mM NaCl) was eluted by linear gradient so that the concentration gradient of NaCl from 0mM to 250mM. The eluted fractions were purified by 10% SDS-PAGE and HPLC. As a result, fractions of hemagglutinin protein with a purity of 94.4 and a molecular weight of 32,500 Daltons were collected.
상기 분획을 한외 여과막(Amicon사 제품)을 이용하여 농축시킨 후 완충용액(10mM 인산염, pH 7.4)에 충분히 용매투석시켜 15mg의 정제된 혈섬유소 분해효소를 얻었다. 정제된 단백질의 N-말단 잔기는 이소로이신(Isoleucine)이며, N-말단으로부터 Ile1-Val2-Gly3-Gly4-Ile5-Glu6-Ala7순의 아미노산 서열로 이루어져 있다.The fractions were concentrated using an ultrafiltration membrane (manufactured by Amicon), followed by solvent dialysis in a buffer solution (10 mM phosphate, pH 7.4) to obtain 15 mg of purified hemofibrinase. N- terminal residue of the purified protein is the isoleucine (Isoleucine), is made from the N- terminus of the amino acid sequence of Ile 1 -Val 2 -Gly 3 -Gly 4 -Ile 5 -Glu 6 -Ala 7 order.
상기 과정에 다른 단계별 중간 생성물 및 최종 생성물과 단백질 표준 시료를 13% SDS-PAGE하여 그 결과를 제1도에 나타내었다.13% SDS-PAGE of intermediate and final product and protein standard samples for different stages in the process are shown in FIG.
Claims (1)
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|
| KR1019920018812A KR960005734B1 (en) | 1992-10-13 | 1992-10-13 | Purification method for fibrinogen protease |
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Family Applications (1)
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- 1992-10-13 KR KR1019920018812A patent/KR960005734B1/en not_active IP Right Cessation
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| KR940009330A (en) | 1994-05-20 |
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