SU1721089A1 - Strain of hybrid cultured mammalian mus musculus l - a producer of monoclonal antibody to glutamate receptors of human brain - Google Patents
Strain of hybrid cultured mammalian mus musculus l - a producer of monoclonal antibody to glutamate receptors of human brain Download PDFInfo
- Publication number
- SU1721089A1 SU1721089A1 SU894764873A SU4764873A SU1721089A1 SU 1721089 A1 SU1721089 A1 SU 1721089A1 SU 894764873 A SU894764873 A SU 894764873A SU 4764873 A SU4764873 A SU 4764873A SU 1721089 A1 SU1721089 A1 SU 1721089A1
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- strain
- glutamate receptors
- glutamate
- cells
- monat
- Prior art date
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относитс к гибридомной технологии и может быть использовано дл обнаружени глутаматных рецепторов мозга человека. Целью изобретени вл етс получение гибридомного штамма, продуцирующего моноклональное антитело (МонАт) к глутаматным рецепторам мозга человека. Штамм получен на основе клеток иммунной селезенки мыши линии BALB/C и клеток мышиной миеломной линии Х-63-Ад-653. МонАт принадлежит к субклассу 1д 61. Штамм депонирован под № ВСКК(П) 363 Д. Клетки штамма культивируют в стандартных услови х на среде с 20% сыворотки, а также в виде асцитной опухоли в сингенных мышах . Изучение взаимодействи МонАт с нейрорецепторами глутамата методом иммуноферментного анализа вы вило высокую специфичность, и возможность применени данного антитела дл вы влени иммобилизованных глутаматных рецепторов с помощью иммуноферментного метода. Св зывание МонАт, продуцируемого штаммом A-HGR-7C5, с глутаматными ре- цепторами на срезах посмертных препаратов коры головного мозга человека показало, что оно получено и пригодно дл сравнительного анализа распределени нейрорецепторов глутамата в норме и при патологии центральной нервной системы. ИThis invention relates to hybridoma technology and can be used to detect glutamate receptors in the human brain. The aim of the invention is to obtain a hybridoma strain producing monoclonal antibody (MonAt) to glutamate receptors in the human brain. The strain obtained on the basis of cells of the immune spleen of the mouse BALB / C and cells of the mouse myeloma line X-63-Ad-653. MonAt belongs to subclass 1d 61. The strain is deposited under VSKK (P) number 363 D. The cells of the strain are cultured under standard conditions on medium with 20% serum, as well as in the form of ascites tumor in syngeneic mice. Studying the interaction of MonAt with glutamate neuroreceptors by enzyme immunoassay revealed high specificity and the possibility of using this antibody for detecting immobilized glutamate receptors using the enzyme immunoassay. Binding of monat produced by strain A-HGR-7C5 with glutamate receptors on sections of post-mortem preparations of the human cerebral cortex showed that it was obtained and suitable for a comparative analysis of the distribution of glutamate neuroreceptors in norm and in the pathology of the central nervous system. AND
Description
Изобретение относитс к гибридомной технологии и может быть .использовано дл вы влени антигена - глутаматных рецепторов мозга человека.The invention relates to hybridoma technology and can be used to detect the antigen, the glutamate receptors of the human brain.
Цель изобретени - получение гибридомного штамма, продуцирующего моноклональное антитело к глутаматным рецепторам мозга человека, пригодное дл вы влени этих рецепторов, изучени их структуры и функционировани . Штамм гибридомы A-HGR-7C5 ВСКК(П) МЗбЗД получают следующим образом,The purpose of the invention is to produce a hybridoma strain producing monoclonal antibody to glutamate receptors in the human brain, suitable for detecting these receptors, studying their structure and functioning. The strain of hybridoma A-HGR-7C5 SCC (P) MZbZD prepared as follows,
Мышей линии BALB/C иммунизируют внутрибрюшинно введением 50 мкг глута- матсв зывающих мембранных белков, выделенных из посмертных препаратов коры головного мозга человека и идентифицированных в экспериментах радиолигандного св зывани с Н -1 -глутаматом как рецепторы глутамата, в полном адьюванте Фрёй- нда. Параллельно антиген ввод т в количестве 25 мкг в хвостовую вену. Через 7 дней иммунизацию повтор ют без адъю- ванта. Через 7 дн после этого мышей, сыворотка которых имеет титр 15000 (титр Определ ют методом иммуноферментного анализа), иммунизируют в течение 3 дн, ввод 25 мкг антигена в хвостовую вену ежедневно . По прошествии этого времени 12x10 клеток селезенки иммунных мышейBALB / C mice are immunized intraperitoneally with 50 µg of glutamatching membrane proteins isolated from post-mortem preparations of the human cerebral cortex and identified in experiments radioligand binding to H -1 glutamate as glutamate receptors, in complete Freydante's adjuvant. In parallel, the antigen is administered in an amount of 25 µg into the tail vein. After 7 days, the immunization is repeated without adjuvant. 7 days later, mice whose serum has a titer of 15000 (titer determined by ELISA) are immunized for 3 days, injecting 25 µg of antigen into the tail vein daily. After this time, 12x10 spleen cells of immune mice
Х|X |
ю оyoo o
0000
оabout
гибридизуют с 25x10 клеток миеломы ; мыши X63.Ag8.653 в присутствии среды RPMI1640, содержащей 45% (об./об.) поли- этиленгликол (мол.м. 3350) и 15% диметил- сульфоксида. После гибридизации и отмывки отполиэтиленгликол клетки высевают в 96-луночные планшеты по 2x105 клеток в лунку. Дл культивировани и селекции гибридных клеток используют среду RPMI 1640 с добавлением 10% лоша- диной сыворотки и 10% тел чьей эмбриональной сыворотки, .1-0 М гипрксантина,hybridized with 25x10 myeloma cells; X63.Ag8.653 mice in the presence of RPMI1640 medium containing 45% (v / v) polyethylene glycol (mol. 3350) and 15% dimethyl sulfoxide. After hybridization and washing with polyethylene glycol, cells are seeded into 96-well plates at 2x105 cells per well. For the cultivation and selection of hybrid cells, RPMI 1640 medium is used with the addition of 10% horse serum and 10% fetal bovine serum, .1–0 M Hyperxanthine,
аминоптеринаи 1,6х 10 5Мтимидина. Гибриды-продуценты клонируют методом конечных разведений, высева по 1 клетке в лунку планшета, содержащую 4х104 кле ток селезенки в качестве фидерного сло . После второго клонировани практически 100% субклонов продуцируют антитела к глутаматным рецепторам мозга человека. Продукци антител сохран етс как минимум в течение 28 пассажей в культуре. aminopterin 1.6 x 10 5Mthymidine. Producer hybrids are cloned by the finite dilution method, seeding 1 cell per well of the plate containing 4x104 cells of the spleen as a feeder layer. After the second cloning, almost 100% of the subclones produce antibodies to the glutamate receptors of the human brain. Antibody production is maintained for at least 28 passages in culture.
Штамм характеризуетс следующими свойствами.The strain is characterized by the following properties.
Среда дл культивировани - RPMI 1640 с добавлением 10% тел чьей эмбриональной сыворотки и 10% лошадиной сыворотки , 4 мМ L-глутамина, 10 мМ пирувата Na. 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, аминокислот и витаминов дл базальной среды Игла, 0,05 мМ меркап- тоэтанола. Культивирование провод т при 37°С в атмосфере 5% углекислоты.The culture medium is RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 10% horse serum, 4 mM L-glutamine, 10 mM pyruvate Na. 100 μg / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, amino acids and vitamins for the basal Eagle's medium, 0.05 mM mercaptoethanol. The cultivation is carried out at 37 ° C in an atmosphere of 5% carbon dioxide.
Посевна доза Ю5 клеток/мл. Через 3-4 дн концентраци антител в культуральной среде достигает 10-20 мкг/мл. Контаминаци бактери ми, грибками и микоплазмой не обнаружена. Дл длительного хранени гибридомные клетки мороз т в Эмбриональной тел чьей сыворотке с добавлением 10% диметилсульфоксида. Режим замораживани : 4°С/мин до 4°С, затем 1°/мин до-70°С, после чего клетки перенос т в жидкий азот. Клетки размораживают, перенос ампулы из жидкого азота в вод ную баню при 37°С. Sow dose Y5 cells / ml. After 3-4 days, the concentration of antibodies in the culture medium reaches 10-20 µg / ml. Contamination with bacteria, fungi and mycoplasma was not detected. For long-term storage, hybridoma cells are frozen in Fetal Bovine Serum supplemented with 10% dimethyl sulfoxide. Freezing mode: 4 ° C / min to 4 ° C, then 1 ° / min to -70 ° C, after which the cells are transferred to liquid nitrogen. The cells are thawed, transferring the ampoule from liquid nitrogen to a water bath at 37 ° C.
Дл выращивани гибридомнрго штам- ма в асцитной форме клетки ввод т внутри- брюшинно мышам линии BALB/c. обработанных пристанем, в количестве 4x106 клеток на мышь. Асцит созревает че- рез 12-14 дн.To grow a hybrid neurotromic strain in ascites form, the cells are administered intraperitoneally to BALB / c mice. processed piers, in the amount of 4x106 cells per mouse. Ascites ripens in 12–14 days.
Гибридома условно названа A-HGR- 7С5. Моноклональное антитело, продуцируемое штаммом A-HGR-7C5, относитс к изотипу IgG, подкласс G1 и св зывает над- мембранный участок глутаматных рецепторов мозга человека.Hybridomas are conventionally called A-HGR-7C5. The monoclonal antibody produced by the A-HGR-7C5 strain belongs to the IgG isotype, subclass G1, and binds to the supra-membrane region of the glutamate receptors of the human brain.
Специфичность взаимодействи антител с нейрорецепторами L-глутамата вы вл ют с помощью иммуноферментного и им- муногистохимического анализов.The specificity of the interaction of antibodies with neuroreceptors of L-glutamate is revealed by enzyme immunoassay and immunohistochemistry.
Дл получени препарата моноклональ- ных антител в количестве, необходимом дл проведени иммунохимических исследований , гибридные клетки помещают в пластиковый флакон площадью 25 см2 по 5х105 клеток в 5 мл среды RPMI 1640 с 10% эмбриональной тел чьей сыворотки, 10% лошадиной сыворотки, 4 мМ глутамина, 10 мМ пирувата Na, 100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,05 мМ меркапто- этанола. Клетки культивируют 3-4 дн при 37°С в атмосфере, содержащей 5% углекислоты . Культуральную среду .собирают центрифугированиемв течение 10 мин при 800д. Полученный супернатант используют дл вы влени специфичности, взаимодействи антитела с глутаматными рецепторами мозга человека.In order to obtain a preparation of monoclonal antibodies in an amount necessary for carrying out immunochemical studies, hybrid cells are placed in a plastic bottle with an area of 25 cm2 and 5x105 cells in 5 ml of RPMI 1640 medium with 10% fetal calf serum, 10% horse serum, 4 mM glutamine , 10 mM pyruvate Na, 100 µg / ml penicillin, 100 µg / ml streptomycin and 0.05 mM mercaptoethanol. Cells are cultured for 3-4 days at 37 ° C in an atmosphere containing 5% carbon dioxide. The culture medium is harvested by centrifugation for 10 min at 800d. The resulting supernatant is used to determine the specificity of the antibody to interact with the glutamate receptors of the human brain.
Определение специфичности взаимодействи моноклонального антитела с антигеном иммуноферментным анализом.Determination of the specificity of the interaction of a monoclonal antibody with an antigen by ELISA.
На полистироловый 96- чеечный планшет сорбируют антиген - 1 мкг на чейку в 100 мкл карбонатного буфера (100 мМ, рН 9,6) при 4°С в течение ночи. После насыщени планшета 0,05%-ным раствором ТвинЧ 20 в фосфатно-солевом буфере (5мМ NahtePCM. 140 мМ NaCI, рН 7,4) дл уменьшени неспецифического св зывани антител с пластиком (1 ч, 20°С), в чейки внос т 100 мкл культуральной среды штамма А- HGR-7C5 (1 ч, 20°С). Затем планшет промывают 4 раза фосфатно-солевым буфером, содержащим 0,05%-ный Твин-20, и внос т антитела кролика против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксида- зой хрена (2 мкг/мл, 1 ч, 20°С). После окончани инкубации несв завшиес продукты реакции отмывают указанным выше способом, а св завшийс конъюгат определ ют по расщеплению субстрата пероксида- зы (HaCte) в присутствии хромогена - ортофенилендиамина. Положительна реакци характеризуетс развитием коричневой окраски, интенсивность которой измер ют по поглощению при 492 нм. В качестве контрольных антигенов используют глутаматутилизи- рующие ферменты: глутаматдегидрогеназу и глутаматдекарбоксипазу.A polystyrene 96-well plate is sorbed with antigen — 1 μg per well in 100 μl of carbonate buffer (100 mM, pH 9.6) at 4 ° С overnight. After the tablet was saturated with a 0.05% solution of Tween-20 in phosphate-buffered saline (5 mM NahtePCM. 140 mM NaCI, pH 7.4) to reduce the nonspecific binding of antibodies to plastic (1 h, 20 ° C), t 100 μl of culture medium strain A-HGR-7C5 (1 h, 20 ° C). The plate is then washed 4 times with phosphate-saline buffer containing 0.05% Tween-20, and rabbit antibodies against mouse immunoglobulins conjugated with horseradish peroxidase (2 µg / ml, 1 h, 20 ° C) are added to the rabbit. After the end of incubation, the incompatible reaction products are washed as described above, and the bound conjugate is determined by the cleavage of peroxidase substrate (HaCte) in the presence of the chromogen, orthophenylene diamine. The positive reaction is characterized by the development of a brown color, the intensity of which is measured by absorption at 492 nm. Glutamate utilizing enzymes, glutamate dehydrogenase and glutamate decarboxypase, are used as control antigens.
Результаты показывают, что антитела эффективно св зываютс с глутаматными рецепторами мозга человека и не взаимодействуют с контрольными антигенами.The results show that the antibodies effectively bind to the glutamate receptors of the human brain and do not interact with control antigens.
Определение специфичности моноклонального антигена иммуногистохимическим анализом.Determination of the specificity of monoclonal antigen by immunohistochemical analysis.
Дл этого исследовани используют срезы посмертных препаратов коры головного мозга человека. Полученные при аутопсии (не позднее 1 ч после смерти) образцы коры помещают в жидкий азот и используют дл приготовлени срезов (5 мкм). Дл фиксации срезов используют 10%-ный раствор формалина в фосфатно-солевом буфере . Фиксацию провод т в течение 10 мин при 20°С. Срезы отмывают ,в течение 1 ч фосфатно-солевым буфером и нанос т моноклональные антитела (культуральную среду) с добавлением 10% человеческой сыворотки (инкубаци 30 мин, 20°С). После промывки фосфатно-солевым буфером (10 мин, 20°С) нанос т кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши с 10% челове- ческой сыворотки. Срезы отмывают как описано выше и инкубируют с культураль- ной средой, содержащей моноклональные антитела против пероксидазы и перокеида- зу (30 мин, 20°С), отмывают снова, реакцию про вл ют с помощью субстрата -диамино- бензидина в трис-HCI буфере (50 мМ трис, 150 мМ NaCI, pH 7,5) в присутствии H2U2. Моноклональное антитело вы вл ет интенсивно окрашенные тела нейронов, нейро- пиль, осевые цилиндры миелинизированных и немиелинизированных волокон с помощью светового микроскопа. Дл определени специфики окрашивани срезы прединкубируют с L-глутаматом (100 мкм) в трис-цитратном буфере (50 мМ трис, 10 мМ CaCfc, pH 7.2) вFor this study, sections of postmortem preparations of the human cerebral cortex are used. Obtained at autopsy (no later than 1 h after death) bark samples are placed in liquid nitrogen and used to prepare sections (5 µm). A 10% formalin solution in phosphate-buffered saline is used to fix the sections. Fixation is carried out for 10 minutes at 20 ° C. Sections were washed with phosphate-saline buffer for 1 hour and monoclonal antibodies (culture medium) were added with 10% human serum (incubation for 30 minutes, 20 ° C). After washing with phosphate-saline buffer (10 min, 20 ° C), rabbit antibodies against mouse immunoglobulins with 10% human serum are applied. The sections are washed as described above and incubated with culture medium containing monoclonal antibodies against peroxidase and peroxidase (30 min, 20 ° C), washed again, the reaction is developed with the help of the substrate diamine benzidine in Tris-HCl buffer (50 mM Tris, 150 mM NaCI, pH 7.5) in the presence of H2U2. A monoclonal antibody detects intensely stained neuronal bodies, neuro saw, axial cylinders of myelinated and unmyelinated fibers using a light microscope. To determine the specificity of staining, sections were preincubated with L-glutamate (100 µm) in tris-citrate buffer (50 mM Tris, 10 mM CaCfc, pH 7.2) in
течение 30 мин при 37°С. Дальнейшую обработку срезов провод т ка к описано выше. Предварительна обработка срезов L-глутаматом приводит к значительному снижению , а в некоторых случа х к исчезновению окраски.for 30 min at 37 ° C. Further processing of the slices is carried out as described above. Pretreatment of the slices with L-glutamate leads to a significant reduction and, in some cases, to the disappearance of the color.
В качестве контрол в этих экспериментах используют моноклональные антитела к эндотоксину грамотрицэтельных бактерий (Ig класса М) и антитела к коллагену II (Ig класса G). С помощью этих антител не вы вл ют никаких структур нервной ткани.As a control, monoclonal antibodies to endotoxin of gram-negative bacteria (Ig class M) and antibodies to collagen II (Ig class G) are used in these experiments. With these antibodies, no structures of the nervous tissue are detected.
Эти результаты свидетельствуют о вы-, сокой специфичности моноклонального антитела -A-HGR-7C5, возможности применени этого антитела в качестве маркера дл вы влени глутаматных рецепторов и их распределени на срезах мозга человека в норме и при различной патологии центральной нервной системы с помощью иммуноферментного метода, а в перспективе и получени чистых препаратов глутаматных рецепторов на колонках с иммобилизованными антителами.These results indicate the high specificity of the monoclonal antibody -A-HGR-7C5, the possibility of using this antibody as a marker for detecting glutamate receptors and their distribution on sections of the human brain in normal conditions and in various pathologies of the central nervous system using the immunoenzyme method and, in perspective, the production of pure preparations of glutamate receptors on columns with immobilized antibodies.
Claims (1)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU894764873A SU1721089A1 (en) | 1989-12-06 | 1989-12-06 | Strain of hybrid cultured mammalian mus musculus l - a producer of monoclonal antibody to glutamate receptors of human brain |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU894764873A SU1721089A1 (en) | 1989-12-06 | 1989-12-06 | Strain of hybrid cultured mammalian mus musculus l - a producer of monoclonal antibody to glutamate receptors of human brain |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SU1721089A1 true SU1721089A1 (en) | 1992-03-23 |
Family
ID=21482484
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU894764873A SU1721089A1 (en) | 1989-12-06 | 1989-12-06 | Strain of hybrid cultured mammalian mus musculus l - a producer of monoclonal antibody to glutamate receptors of human brain |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
SU (1) | SU1721089A1 (en) |
-
1989
- 1989-12-06 SU SU894764873A patent/SU1721089A1/en active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Дамбинова С.А.. Смирнова Т.М., Маргу- лис М.Н., Огурцов Р.П. Биохими , 1987, т.52. вып.9, 1523-1530. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
SU1721089A1 (en) | Strain of hybrid cultured mammalian mus musculus l - a producer of monoclonal antibody to glutamate receptors of human brain | |
RU2395576C1 (en) | STRAIN OF HYBRID ANIMAL CELLS Mus museums L - PRODUCER OF MONOCLONAL ANTIBODIES FOR EXPOSING NUCLEOPROTEIN OF EBOLA VIRUS, ZAIRE SUBTYPE (Mainga STRAIN) (VERSIONS), MONOCLONAL ANTIBODY PRODUCED BY SAID STRAIN (VERSIONS) AND SET FOR "SANDWICH" FORMAT IMMUNOENZYMOMETRIC TEST SYSTEM FOR EXPOSING NUCLEOPROTEIN OF EBOLA VIRUS, ZAIRE SUBTYPE (Mainga STRAIN) | |
NO173556B (en) | MONOCLONAL ANTIBODY THAT RECOGNIZES ALFA-2-3 BINDINGS, AND HYBRIDOM CELL LINE THAT PRODUCES ANTIBODY | |
CA1235078A (en) | Monoclonal antibodies, to bovine serum albumin and their use in bsa isolation | |
SU1514768A1 (en) | Strain of hybrid cultivable mus musculus cells as producer of monoclonal antibody to recombinant necrosis factor of human beta-tumours | |
SU1645295A1 (en) | Strain of cultured hybrid animal cells (musmusculus l): the producer of monoclonal antibodies against cattle b-lymphocytes | |
SU1726511A1 (en) | Strain of hybridous cultured cell mus musculus l , used for preparation of monoclonal antibodies to the general antigenic determinant of human and swine insulin | |
SU1530638A1 (en) | Strain of hybrid cultivable mus musculus cells as producer of monoclonal antibody to necrosis factor of alpha-tumors of man | |
SU1555360A1 (en) | Strain of mus musculus hybrid cultivated animal cells used to obtain monoclonal antibodies to alpha-subunit of gonadotropic hormones of man | |
SU1527257A1 (en) | Strain of hybrid cultivable mus musculus cells as producer of monoclonal antibodies to inducer of amiotrophic leukospongiosis | |
JPS63210665A (en) | Enzyme immunoassay of collagenase inhibitor | |
SU1595903A1 (en) | Strain of hybrid cultivable mus musculus l cells as producer of monoclonal bodies to insulin | |
RU1773938C (en) | Strain of hybrid cultivated cells from mus musculus l-producent of monoclonal antibodies to k99-adhesive antigen of eschericia coli | |
Gard et al. | A solid-phase β-galactosidase ELISA for detecting and quantifying monoclonal antibody binding to dissociated cell cultures of postnatal rodent cerebellum | |
SU1721091A1 (en) | Strain of hybrid cultured mammalian cells mus musculus l - a producer of monoclonal antibody, interacting with @@@-subunitъ of human chorionic gonadotropic hormone and human luteinizing hormone | |
SU1514769A1 (en) | Strain of hybrid cultivable mus musculus cells as producer of monoclonal antibodies to human single-chain activator of plasminogene of urokinase type | |
SU1507791A1 (en) | Strain of hybrid cultivable mus musculus cells as producer of monoclonal antibody to factor of alpha-tumor necroses of man | |
SU1604849A1 (en) | Strain of hybride cultivable mus musculus l. cells producing monoclonal antibodies to bacteria of brucella variety | |
SU1666532A1 (en) | Strain of hybridous cultured mammalian cells, mus musculcs l. producing monoclonal antibodies for nucleocapside protein or cattle virus | |
SU1685997A1 (en) | Strain of hybridous cultured mammalian cells mus musculus l - a producer of monoclonal antibodies to human thyrotropin | |
RU2059721C1 (en) | Strain of hybrid cultured murine cells mus musculus l used for preparing monoclonal antibodies to the human thyrotropic hormone | |
SU1747484A1 (en) | Strain of hybrid cultured cells mus musculus l, used for preparation of monoclonal antibodies to recombinant l-factor necrosis of human tumors | |
SU1521776A1 (en) | Strain of cultivated hybrid animal cells musculus mus - producer of monoclonal antibody-neutralizing biological activity of human factor of necrosis, alpha-tumors | |
SU1446154A1 (en) | Strain of hybrid cultivated cells of mus musculus for producing monoclonal antibodies to membrane protein of escherichia coli | |
SU1640157A1 (en) | Strain of hybridous cultivating mammalian cells, mus musculus l, used for preparation of monoclonal antibodies for dna-dependent rna-polymerase of bacteriophage t7 |