SU1514768A1 - Strain of hybrid cultivable mus musculus cells as producer of monoclonal antibody to recombinant necrosis factor of human beta-tumours - Google Patents
Strain of hybrid cultivable mus musculus cells as producer of monoclonal antibody to recombinant necrosis factor of human beta-tumours Download PDFInfo
- Publication number
- SU1514768A1 SU1514768A1 SU874352636A SU4352636A SU1514768A1 SU 1514768 A1 SU1514768 A1 SU 1514768A1 SU 874352636 A SU874352636 A SU 874352636A SU 4352636 A SU4352636 A SU 4352636A SU 1514768 A1 SU1514768 A1 SU 1514768A1
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- text
- strain
- cells
- necrosis factor
- hybrid
- Prior art date
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
ЛОВЕКАLOVEK
(57) Изобретение относится к гибридомной технологии. Цель изобретения получение гибридного штамма, продуцирующего моноклональное антитело (монАТ) к фактору некроза опухолейбета человека (ФИО-/3) , обладающего биохимической однородностью и высокой специфичностью. Штамм депонирован под номером ВСКК(И) № 17Ю.(57) The invention relates to hybridoma technology. The purpose of the invention is the production of a hybrid strain producing monoclonal antibody (monAT) to human tumor necrosis factor neurosis factor (FIO- / 3), which has biochemical uniformity and high specificity. The strain deposited under the number VSKK (I) No. 17YU.
МонАТ относится к Ιβ С2Ь изотипу, связывается с ФНО-β человека. Содержание монАТ в 1 мл культуральной среды и асцитной жидкости составляет соответственно 55-60 мкг и 6-7 мг. О Продукция антитела сохраняется в течение 20 пассажей в культуре. МонАТ А может быть использован для определения Р ФНО- /5 человека методом им- * мунобдотинга. 1 табл.MonAT belongs to the Ιβ С2Ь isotype, binds to human TNF-β. The content of monat in 1 ml of culture medium and ascitic fluid is, respectively, 55-60 μg and 6-7 mg. About Production of antibodies persists for 20 passages in culture. MonAT A can be used to determine human P TNF- / 5 by the method of im- * monobdoting. 1 tab.
Изобретение относится к гибридомной технологии.The invention relates to hybridoma technology.
Цель изобретения - получение гибридного штамма, продуцирующего моноклональное антитело (монАТ) к фактору некроза опухолей-бета человека, обладающего биохимической однородностью и высокой специфичностью.The purpose of the invention is to obtain a hybrid strain that produces monoclonal antibody (monAT) to human tumor necrosis factor-beta, which has biochemical homogeneity and high specificity.
Штамм получают следующим образом.Strain was prepared as follows.
Мышей линии Ва1Ь/с иммунизируют внутрибрюшинным введением 50 мкг Р ФНО-(3 в 0,15 мл 0,15 М МаС1 в смеси с равным объемом полного адъюванта Фрейнда. Иммунизацию повторяют через 14 дн тем же количеством антигена в смеси с неполным адьювангом Фрейнда.Mice of the Ba1b / c line are immunized by intraperitoneal administration of 50 μg P of TNF-α (3 in 0.15 ml of 0.15 M MaCl in a mixture with an equal volume of Freund's complete adjuvant. Immunization is repeated after 14 days with the same amount of antigen in a mixture with Freund's incomplete adjuvant.
Еще через 14 дн 50 мкг Р ФНО- β вео— дят внутрибрюшинно в 0,5 мл 0,15 М ЫаС1. Спустя 3 дн проводят гибридизацию 6х107 клеток селезенки иммунных мышей и 1,2х107 клеток миеломы Χ63-Αβ8-653 50%-ным раствором полиэтиленгликоля моль.массы 4000, содержащего 5% диметилсульфоксида. После гибридизации и отмывки клеток от полиэтиленгликоля, последние высевают в 96-луночные панели по 1х105 спленоцитов в лунку. Для культивирования и селекции гибридом используют среду 1МДМ (модифицированная 1вкоуе 'в среда Дульбекко) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сывороткиAfter another 14 days, 50 μg of P TNF-β is given intraperitoneally in 0.5 ml of 0.15 M NaCl. After 3 days, 6x10 7 cells of spleen of immune mice and 1.2x10 7 myeloma cells Χ63-Αβ8-653 were hybridized with 50% polyethylene glycol solution, mass 4000, containing 5% dimethyl sulfoxide. After hybridization and washing of cells from polyethylene glycol, the latter are seeded in 96-well panels of 1x10 5 splenocytes per well. For the cultivation and breeding of hybridomas use 1MDM medium (modified 1 in 'on Dulbecco's medium) with the addition of 10% fetal calf serum
1514768 А11514768 A1
'3'3
15147681514768
(ОТС), 1(Г4М гипоксантина, 4'10 7 М аминонтерина и 1,6 ·10 М тимидина. Гибриды-продуценты клонируют 2 раза методом конечных разведений, высевая по 1 клетке в лунку, содержащую 4'10 клеток селезенки. После двух клонирований практически 100% субклонов продуцируют монАТ к Р ФИО- . Продукция антитела сохраняется как минимум в течение 20 пассажей в культуре. Гибридома получила условное название ЛТД9.(OTS), 1 (G 4 M hypoxanthine, 4'10 7 M aminonterin, and 1.6 · 10 M thymidine. Producer hybrids are cloned 2 times by the final dilution method, sowing 1 cell per well, containing 4'10 spleen cells. After two cloning, almost 100% of the subclones produce MonAT to P. FIO-. The antibody production is preserved for at least 20 passages in culture. The hybridoma has received the conditional name LTD9.
Штамм характеризуется следующими признаками.The strain is characterized by the following features.
Культуральные признаки. Стандартные условия культивирования. Среда 1МДМ с 10% донорской телячьей сыворотки, 2 х 10'4 Μ 1 - глутамина,Cultural features. Standard cultivation conditions. Wednesday 1MDM with 10% donor calf serum, 2 x 10 ' 4 1 - glutamine,
100 мкг/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,05х10”^М меркаптоэтанола, при 37°С и с атмосфере 5% С02. Для выращивания штамма используют стеклянную посуду. Посевная доза 100-200 тыс.клеток на 1 мл. Клетки пассируют 1 раз в 2-3 дн. Кратность рассева - 1:6-1:8. Культура суспензионная .100 μg / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 0.05x10 ”^ M mercaptoethanol, at 37 ° C and with an atmosphere of 5% C0 2 . For growing strain using glassware. Sowing dose of 100-200 thousand cells per 1 ml. Cells are passaged once every 2-3 days. The multiplicity of sieving - 1: 6-1: 8. Suspension culture.
Культивирование в организме животного. Для выращивания асцита пригодны мыши ВАЬВ/С.Мышам за 7-30 дн до инъекции клеток штамма вводят внутрибрюшинио (в/бр) по 0,5 мл пристана. Клетки инъецируют в/бр по 2-5x10 кл/мл среды 1МДМ. Асцит формируется через 12-14 дн.Cultivation in the animal. VABB / C mice are suitable for growing ascites. For 7–30 days before the injection of strain cells, intraperitoneal (ip) in 0.5 ml of pristane is injected. Cells are injected ip at 2-5x10 cells / ml of IMMD medium. Ascites is formed in 12-14 days.
Продуктивность штамма. Секреция монАТ на 2-3 дн культивирования составляет 55-60 мкг/мл культуральной среды и 6-7 мг в 1 мл асцитной жидкости при определении иммуноферментным методом.The productivity of the strain. MonAT secretion for 2-3 days of cultivation is 55-60 µg / ml of culture medium and 6-7 mg in 1 ml of ascites fluid when determined by an enzyme immunoassay.
Характеристика полученного продукта. Штамм продуцирует монАТ Ιβ С2Ь. Специфичность - ФИО—β .Characteristics of the resulting product. The strain produces monat Ιβ C2B. Specificity - name — β.
Методы оценки сохранения специфичности: тест на связывание монАТ с иммобилизованным ФИО-β (иммуноферментный анализ). Антиген сорбируют на пластике: 500 нг в 50 мкл 0,1 М бикарбонатного буфера, рН 9,6, ночь при 4°С. Затем, после отмывки наносят тестируемую культуральную среду й после инкубации и отмывки определяют количество сорбированных антител мечеными пероксидазой кроличьими антимышиными антителами. Все отмывкиMethods for assessing the preservation of specificity: a test for the binding of monAT to an immobilized FULL NAME-β (enzyme immunoassay). The antigen is sorbed on plastic: 500 ng in 50 μl of 0.1 M bicarbonate buffer, pH 9.6, overnight at 4 ° C. Then, after washing, the test culture medium is applied after incubation, and the amount of sorbed antibodies with peroxidase-labeled rabbit anti-mouse antibodies is determined by washing. All washes
приводят бидистиллированной водой. Контролем служит бычий сывороточный альбумин в качестве антигена.lead bidistilled water. The control is bovine serum albumin as an antigen.
Криоконсервнрование. Для длительного хранения клетки штамма замораживают в эмбриональной телячьей сыворот ке с добавлением 10% диметилсульфоксида. Режим замораживания: 1 С в 1 мин до -70°С. После замораживания клетки переносят в жидкий азот. РазоCryoconservation. For long term storage, strain cells are frozen in fetal calf serum with the addition of 10% dimethyl sulfoxide. Freezing mode: 1 C in 1 min to -70 ° C. After freezing, cells are transferred to liquid nitrogen. Razo
мораживание на водяной бане при 37 С. Жизнеспособность клеток после размораживания 50-55% по окрашиванию трипановым синим.freezing in a water bath at 37 C. Cell viability after thawing 50-55% by trypan blue staining.
Контаминация. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питатель ные среды. Заражение микоплазмой не выявлено при окрашивании красителями на ДНК и по характеру включения тимидиновой метки.Contamination. Bacteria and fungi were not detected in culture during long-term observation and culture on nutrient media. Infection with mycoplasma was not detected by staining with dyes on DNA and the nature of the inclusion of thymidine label.
Пример 1. Тест на определение специфичности взаимодействия монАТ с антигенами, иммобилизованными на пластике.Example 1. Test for determining the specificity of the interaction of monat with antigens immobilized on plastic.
Р ФИО- о4 , Р ФНО- β и бычий сывороточный альбумин (БСА) в количестве 0,5 мкг в 50 мкл 0,1 М карбонатного буфера, рН 9,6 вносят в лунки 96-ячеечныХ микроплат и сорбируют ночь при 4°С. После отмывок в ячейки вносят по 50 мкл культуральной среды штамма ЛТД9 или разведенных 1:5000 в 0,01 М фосфатном буфере, рН 7,4 0,15 М ЫаС1, 1% БСА (ЗФР-БСА) поликлональных кроличьих антител, специфичных к Р ФНО~ (5. Панель инкубируют 2 ч при 20 С, затем отмывают 5 раз бидистиллированной водой и вносят по 50 мкл в лунку кроличьи противомышиные антитела, мечение перексидазой, разведенные 1/2500 в ЗФР-БСА и меченые перексидазой противокроличьи антитела 1/2500 в ЗФР-БСА. После инкубации в течение 1 ч при 20°С плату отмывают и в лунки добавляют субстрат - ортофенилен - диамин гидрохлорид, 0,6 мг/мл в цитратно-фосфатном буфере, рН 4,7, содержащем 0,03% Нг0^. Реакцию останавливают через 10 мин 1 М серной кислотой и учитывают на спектрофотометре с вертикальным лучом при длине волны 492 нм.P FIO- O4, P TNF-β and bovine serum albumin (BSA) in the amount of 0.5 μg in 50 μl of 0.1 M carbonate buffer, pH 9.6 is added to the wells of 96-well microplates and sorb overnight at 4 ° C . After washing, 50 μl of culture medium of strain LTD9 or diluted 1: 5000 in 0.01 M phosphate buffer, pH 7.4, 0.15 M LaCa, 1% BSA (PBS-BSA) polyclonal rabbit antibodies specific to P are introduced into the cells. TNF ~ (5. The panel is incubated for 2 hours at 20 ° C, then washed 5 times with double-distilled water and 50 μl per well of rabbit anti-mouse antibodies, labeled with peresidase, diluted 1/2500 in PBS-BSA and labeled with peroxidase anti-rabbit antibodies 1/2500 SFR-BSA. After incubation for 1 h at 20 ° C, the plate is washed and the substrate, orthophenylene-dia, is added to the wells. yn hydrochloride, 0.6 mg / ml in citrate-phosphate buffer, pH 4.7, containing 0.03% H r ^ 0. The reaction was stopped after 10 min with 1 M sulfuric acid and allow for a vertical beam spectrophotometer at a wavelength of 492 nm.
Результаты опыта по изучению специфичности связывания монАТ, продуцируемого клетками штамма ЛТД9, сThe results of the experiment on the study of the specificity of binding of monat produced by cells of the strain LTD, with
-антигенами, иммобилизованными на пластике, представлены в таблице.-antigens immobilized on plastic are presented in the table.
15107681510768
Результаты опыта по изучению специфичности свидетельствуют о высокой специфичности монАТ, вырабатываемого клетками штамма ЛТД9, и показывают возможность применения этого монАТ для определения Р ФИО- β с помощью иммуноферментного метода.The results of the experiment on the study of specificity testify to the high specificity of monAT produced by the cells of the LTD9 strain, and show the possibility of using this monAT to determine the P FIO-β using an enzyme immunoassay method.
Пример 2. Взаимодействие монАТ ЛТД9 с Р ФИО- β человека, перенесенным на нитроцеллюлозу'после диск-электрофореза в полиакриламидном геле.Example 2. The interaction of monat LTD with R FIO-β person, transferred to nitrocellulose 'after the disc electrophoresis in polyacrylamide gel.
Электрофорез в 15%-ном полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГЭ) проводят с использованием аппарата для вертикального электрофореза, Р ΦΗΟ-β 10 мкг, в буфере для образца с меркаптоэтанолом и эквивалентное количество лизата Е.соН в таком же буфере прогревают 2 мин при 100°С и наносят в ячейки геля. Электрофорез осуществляют при постоянной силе тока 50 мА.Electrophoresis in 15% polyacrylamide gel in the presence of sodium dodecyl sulfate (SDS-PAGE) is carried out using a vertical electrophoresis apparatus, P ΦΗΟ-β 10 μg, in a sample buffer with mercaptoethanol and an equivalent amount of E. coli lysate in the same buffer is heated 2 min at 100 ° C and applied to the cells of the gel. Electrophoresis is carried out at a constant current of 50 mA.
Электроперенос разделенных компонентов из геля на нитроцеллюлозу (НЦ) с диаметром пор 0,45 мкм производят в аппарате в течение 1 ч. После переноса НЦ промывают дистиллированной водой и далее обрабатывают с помощью набора для иммуноблотинга,The electrical transfer of the separated components from the gel to nitrocellulose (NC) with a pore diameter of 0.45 μm is performed in the apparatus for 1 hour. After the transfer, the NC is washed with distilled water and further processed using an immunoblot kit.
Неспецифическую сорбцию белка на НЦ блокируют в 0,02 М трис-НС1 буфере, рН 7,4 с 0,5 М ЛаС1 (ТБР) , содержащем 3% желатины. После этого НЦ промывают 2 раза ТБР с 0,05% твин20 (ТТБР) и разрезают на полоски.Nonspecific protein sorption on NC is blocked in 0.02 M tris-HC1 buffer, pH 7.4 with 0.5 M LaCl (TBR) containing 3% gelatin. After that, the SC is washed 2 times with TBR with 0.05% tween20 (TTBR) and cut into strips.
Специфичность связыванияBinding specificity
Полоски, соответствующие» ДСН-ПААГЭ Р ФИО- β и лизата Е.соН, помещают в стеклянные пробирки емкостью 15 мл и добавляют 10 мл супернатанта монАТ ЛТД9 или кроличьей антисыворотки в разведении 1/5000 в ТТБР с 1% БСА. Инкубацию продолжают 2 ч при 20°С на аппарате с горизонтальным перемеЮ шиванием. После этого НЦ отмываютThe strips corresponding to the 'LTO-PAGE P FIO-β and E. coli lysate are placed in 15 ml glass tubes and 10 ml of the supernatant MonAT LTD9 or rabbit antisera at a dilution of 1/5000 in TTBR with 1% BSA are added. The incubation is continued for 2 hours at 20 ° С on a device with horizontal stirring. After that, the NC wash
3 раза по 5 мин ТТБР, добавляют козьи антимышиные или антикроличьи анти тела, разведенные 1/2000 в ТТБР, 1% БСА и инкубируют 1 ч, при 20° С с пе15 ремешиванием. После 2 отмывок ТТБР и одной отмывки ТБР реакцию проявляют в растворе субстрата, содержанием 4-хлор-1-нафтол и 0,015% Н^О^, в течение 20 мин. Для хранения и фото29 графирования НЦ промывают в дистиллированной воде и высушивают на воздухе .3 times 5 min each of TTBR, goat anti-mouse or anti-rabbit anti bodies added, diluted with 1/2000 in TTBR, 1% BSA and incubated for 1 h, at 20 ° C with stirring. After 2 washes with TTBR and one washed with TBR, the reaction is shown in a substrate solution containing 4-chloro-1-naphthol and 0.015% H ^ O ^, for 20 minutes. For storage and foto29 graphing NTS washed in distilled water and dried in air.
Результаты этого примера свидетельствуют о связывании монАТ, проду25 цируемого клетками штамма ЛТД9, с Р ФИО- р после ДСП-ПААГЭ и электропереноса на нитроцеллюлозу. МонАТ штамма ЛТД9 может быть использовано для определения Р ФИО- /3 методом им30 муноблотинга.The results of this example indicate the binding of monAt, produced by the cells of the LTD9 strain, with P FIO-p after DSP-PAGE and electrotransfer to nitrocellulose. MonAT strain LTD9 can be used to determine the P FIO- / 3 method im30 munoblotting.
Claims (1)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU874352636A SU1514768A1 (en) | 1987-12-29 | 1987-12-29 | Strain of hybrid cultivable mus musculus cells as producer of monoclonal antibody to recombinant necrosis factor of human beta-tumours |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU874352636A SU1514768A1 (en) | 1987-12-29 | 1987-12-29 | Strain of hybrid cultivable mus musculus cells as producer of monoclonal antibody to recombinant necrosis factor of human beta-tumours |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SU1514768A1 true SU1514768A1 (en) | 1989-10-15 |
Family
ID=21345982
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU874352636A SU1514768A1 (en) | 1987-12-29 | 1987-12-29 | Strain of hybrid cultivable mus musculus cells as producer of monoclonal antibody to recombinant necrosis factor of human beta-tumours |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
SU (1) | SU1514768A1 (en) |
-
1987
- 1987-12-29 SU SU874352636A patent/SU1514768A1/en active
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
SU1514768A1 (en) | Strain of hybrid cultivable mus musculus cells as producer of monoclonal antibody to recombinant necrosis factor of human beta-tumours | |
SU1446154A1 (en) | Strain of hybrid cultivated cells of mus musculus for producing monoclonal antibodies to membrane protein of escherichia coli | |
SU1530638A1 (en) | Strain of hybrid cultivable mus musculus cells as producer of monoclonal antibody to necrosis factor of alpha-tumors of man | |
SU1446157A1 (en) | Strain of hybrid cultivated cells of mus musculus for producing monoclonal antibodies to membrane protein of escherichia coli | |
SU1521776A1 (en) | Strain of cultivated hybrid animal cells musculus mus - producer of monoclonal antibody-neutralizing biological activity of human factor of necrosis, alpha-tumors | |
SU1721089A1 (en) | Strain of hybrid cultured mammalian mus musculus l - a producer of monoclonal antibody to glutamate receptors of human brain | |
SU1472497A1 (en) | Strain of cultivable hybrid mus musculus cells for producing monoclonal antibodies to escerichia coli lipopolysaccharide | |
SU1514769A1 (en) | Strain of hybrid cultivable mus musculus cells as producer of monoclonal antibodies to human single-chain activator of plasminogene of urokinase type | |
RU1835848C (en) | Strain of hybrid cultured mammalian cells mus musculus l - a producer of monoclonal antibodies to choleraic enterotoxin | |
SU1723127A1 (en) | Strain of hybridous cultured mammalian cells mus musculus l - a producer of monoclonal antibodies to the human somatotropin | |
RU2014358C1 (en) | Strain of hybrid cultured cells of mus musculus l used for preparing of monoclonal antibodies to formate dehydrogenase of pseudomonas sp 101 | |
SU1507791A1 (en) | Strain of hybrid cultivable mus musculus cells as producer of monoclonal antibody to factor of alpha-tumor necroses of man | |
SU1437393A1 (en) | Strain of hybrid cultivable cells mus musculus used for producing monoclonal antibodies to recombinant human interleukin-2 | |
SU1742326A1 (en) | Strain of hybridous cultured mammalian cells mus musculus l - a producer of monoclonal antibodies to mycobacterium bovis | |
SU1555360A1 (en) | Strain of mus musculus hybrid cultivated animal cells used to obtain monoclonal antibodies to alpha-subunit of gonadotropic hormones of man | |
SU1413132A1 (en) | Strain of hybrid cultivated cells of mus musculus animals used for producing monoclonal antibodies for mitochondral creatine phosphokinase of human being | |
SU1661231A1 (en) | Strain of hybridous cultured mammalian cells mus musculus l, producing monoclonal antibodies for surface protein of cattle coronavirus | |
SU1381158A1 (en) | Strain of hybride cultivatable cells of mus musculus mice used for producing monoclonal antibodies to human urokinase | |
RU1773938C (en) | Strain of hybrid cultivated cells from mus musculus l-producent of monoclonal antibodies to k99-adhesive antigen of eschericia coli | |
SU1442545A1 (en) | Strain of hybrid cultivable animal cells mus culus l for producing monoclonal antibodies to gamma-chains of human and monkey immunoglobulins | |
SU1726511A1 (en) | Strain of hybridous cultured cell mus musculus l , used for preparation of monoclonal antibodies to the general antigenic determinant of human and swine insulin | |
SU1693046A1 (en) | Strain of hybridous cultured mammalian cells, mus musculus l - a producer of monoclonal antibodies to villebrand factor of human blood clotting system | |
SU1604849A1 (en) | Strain of hybride cultivable mus musculus l. cells producing monoclonal antibodies to bacteria of brucella variety | |
SU1710577A1 (en) | Strain of hybridous cultured mammalian cells mus musculus l - a producer of monoclonal antibodies to the human insulin | |
SU1312097A1 (en) | Musculus mouse strain of hybrid cultivated cells used for producing antibodies to angiotensin-converting enzyme of manъs lungs |