SU1698290A1

SU1698290A1 - Способ отбора мутантов парафинусваивающих дрожжей

Info

Publication number: SU1698290A1
Application number: SU884429461A
Authority: SU
Inventors: Сергей Петрович Коваленко; Алла Николаевна Щербина; Нонна Михайловна Горнак
Original assignee: Институт Микробиологии Ан Бсср
Priority date: 1988-05-23
Filing date: 1988-05-23
Publication date: 1991-12-15

Abstract

Изобретение относитс к микробиологической промышленности, а именно к способам отбора мутантов микроорганизмов дл получени биомассы. Целью изобретени вл етс ускорение селекции дрожжей, обладающих повышенной способностью усваивать короткоцепочечные н-парафины. Суспензию клеток исходного штамма обрабатывают мутагеном и высевают на плотную и жидкую селективные питательные среды, содержащие каприлат натри в концентрации , полностью подавл ющей рост исходного штамма. Выжившие в этих услови х и образовавшиес отдельные колонии мутантов после очистки рассевом на той же среде провер ют на скорость роста и на уровень наполнени биомассы при культивировании на жидкой парафинсодержащей среде. 1 табл. сл С

Description

Изобретение относитс к микробиологической промышленности, а именно к способам отбора мутантов микроорганизмов дл получени биомассы.

Целью изобретени вл етс ускорение селекции дрожжей, обладающих повышенной способностью усваивать короткоцепочечные н-парафины.

Отбор мутантов прозод т как на плотных , так и на жидких питательных средах, содержащих селектирующий агент, каприлат натри . Концентрацию подбирают таким образом, чтобы основна масса клеток исходного штамма не способна была образовывать колонии. Этой способностью обладают лишь немногие мутантные клетки дрожжей, приобретшие ее в результате действи мутагена. На каждом этапе селекции концентрацию каприлатанатри увеличивают , а мутагенной обработке подвергают лучший из мутантов, полученных на предыдущем этапе селекции.

Суспензию клеток исходного штамма обрабатывают мутагеном и высевают на плотную или жидкую селективные питательные среды, содержащие каприлат натри в концентрации, полностью подавл ющей рост исходного штамма (применительно к нашему обьекту концентраци селектирующего агента постепенно повышалась от 0,02 до С,15 %). Выжившие в этих услови х и образовавшие отдельные колонии мутанты после очистки рассевом на той же среде провер ют на скорость роста и на уровень накоплени биомассы при культивировании на жидкой парафинсодержащей среде.

П р и м е р 1. Суспензию клеток дрожжей Candida maltosa ВСБ-899 (лучшего из известных промышленных продуцентов кормового белка на основе н-парафинов)

О

чэ

00

$

о

выращивают в -специальных качалочных колбах емкостью 500 мл на высокоскоростной качалке (240 об/мин) при 30°С в жидкой питательной среде (по 50 мп) следующего состава, мас.%: Парафины Новополоцкого НПЗ 0,4 (Сэ следы, Сю 2.5; Ci; 8,6; С 12 13,8; С|з 18,1 ;Ci4 19,5; Cis 16,6; Cie 10,7; Ci 7,4; С18 2,0; Cig 0,2; КдНРСМ . ЗН-Ю 0,38; NatoPO x2HzO 0,35; MgCte 0,11; (МНф-ЗОд 0,422, водопроводна вода - остальное, рН 5,0-5,5.

Полученную суспензию обрабатывают химическим мутагеном нигризогуанидином концентрацией 1 мг/мл 15-60 мин, затем отмывают мутаген фосфатным буфером, рН 7,0.

Суспензию микроорганизмов высевают по 0,1 мл на чашки Петри с питательной средой, имеющей следующий состав, мас.%: этиловый спирт 0,4; минеральные компоненты,как в составе среды,приведенном рыше, каприлат натри 0,01-0,03; водопроводна вода - остальное.

На I стадии селекции используют водорастворимый источиих углерода этанол,так как пути его ассимил ции близки с таковыми алканов. Исходный штамм ВСБ-899 очень чувствителен к каприлату натри , даже концентраци 200 мг/л полностью подавл ет его рост.-Устойчивые к згой концентрации мутанты образовывали видимые колонии только через 7 су т. Более высокие концентращ-н (0,03 %) настолько подавл ют рост, что даже отдельных колоний на среде не возникало. Меньшие концентрации (0,01 %) не обладают селектирующим действием - на чашках вы- ростзл сплошной газон.

Устойчивые к хаприлату натри колонии отсевают и очищают рассевом разведенных суспензий на среде того же состава.

Очищенные колонии каприлатустойчи- вых мутантов провер ют на продуктивность как по биомассе и скорости роста, так и исходным материалом дл дальнейшей селекции на повышение степени устойчивости к каприлату натри .

Проверку каприлатустойчивых мутантов на продуктивность по биомассе и определение удельных скоростей роста провод т на средах, где минеральные компоненты были, как в примере 1, а источником углерода были ч одном случае парафины в количеств0,4 мас.% (достаточном дл измерени ), а в другом - смесь парафинов с октаном и додеканом (2:1:1) - .0,4 мас.%.

Результаты исследовани продуктивности мутантоп в сравнении с исходным штаммом на I стадии селекцги показывают, что мутанты варьируют по выходу биомассы от

90 до 115% от исходного штамма, причем повышенной продуктивностью обладают около 45% проверенных вариантов.

II этап - селекци на устойчивость к

возрастающим концентраци м каприлата натри . Ее осуществл ют двум пут ми. Параллельно с селекцией на плотных селективных средах (с концентраци ми каприлата натри 0,05 и 0,08%) провод т

0 автоселекцию дрожжей (с концентрацией каприлата натри 0,1%) длительным культивированием их (в течение 2 мес) в глубинных услови х - в колбах на качалке (услови культивировани в колбах описывались вы5 ше).

Селекци на средах со все возрастающими концентраци ми каприлата натри преследует следующие цели. На первом ее этапе, где каприлат натри с концентрацией

0 0,02% используют 8 качестве селектирующего фактора, отбирают формы, имеющие устойчивость к каприловой кислоте. На следующем этапе селекции, где единственным источником углерода в среде служит кзпри5 лат натри , возникают мутанты, способные расти на повышенной концентрации этого вещества.

По-видимому, автоселекци на среде с каприлзто м натри как единственным ис0 точником углерода приводит к отбору форм с повышенной активностью ацил-КоА-син- тетазы. На каждой ступени повышени устойчивости дрожжей к каприлату натри возникают мутации различных генов, в ре5 зультате чего отбирают формы с активацией нескольких ферментативных стадий процесса ассимил ции алкзнов.

П р и м е р 2. Селекцию каприлатустойчивых мутантов на повышение степени ус0 тойчивости к возрастающим дозам каприлата натри 0,05 и 0,08 % провод т как в примере 1, Минеральные компоненты среды были такими же, как и в среде примера 10 а в качестве единственного источника уг5 лерода служил каприлат натри , соответственно 0,05 и 0,08%. Все процедуры выполн ют так, как описано в примере 1.

П р и м е р 3, Автоселекцию каприлатустойчивых мутантов, отобранных в примере

0 1, осуществл ют длительным культивированием их в глубинных услови х в колбах на качалке (услови культивировани описаны в примере 1). Все минеральные компоненты среды как в примере 1, а каприлат натри в

5 количестве 0,1 % служит единственным источником углерода. Все жизнеспособные в селективных услови х мутанты после очистки провер ют на продуктивность. Кроме го- го, продолжают селекцию на устойчивость к еще большим концентраци м каприлата натри тех мутантных форм,-которые были выделены в результате автоселекции,

П р и м е р 4. Селекцию на пов ышение степени устойчивости к каприлату натри в концентраци х 0,12; 0,15; 0,18 и 0,20% провод т как в примере 1. первые два режима селекции (0,12 и 0,15% каприлата натри ) даютмножество мутантов. НасредесО,18% образуетс несколько колоний, однако после пересева жизнеспособных форм не было выделено. На максимальной из использованных концентраций каприлата натри не обнаруживают ни одной колонии спуст 3 недели культивировани .

В таблице показаны основные характеристики исходной культуры и выделенных мутантов.

0

5

Как видно из таблицы, некоторые выделенные мутанты, прошедшие селекцию в несколько этапов, на 32% продуктивнее, чег., исходна культура и их предшественники.

Claims

Формула изобретени Способ отбора мутантов пэрафинусваи- вающих дрожжей, включающий обработку культуры мутагеном, рассев и выращивание на питательной среде с селектирующим агентом, отличающийс тем, что, с целью ускорени селекции дрожжей, обладающих повышенной способностью усваивать : ороткоцепочечные н-парафины, в качестве селектирующего агента используют каприлат натри .

Сравнение способности по накоплению биомассы и удельных скоростей роста в периодическом культивирований на качалке исходного штамма дрожжей Candida maltoda ВСБ-899 и мутантов, полученных селекцией на каприлате натри разными способами

1Исходный штамм Candida maltosa

ВСБ-89945,0 0,061,92±0,1070,0 0,05 1,40f;0,01 Мутанты, полученные селекцией на плотных средах (в скобках указана концентраци каприлата натри в среде)

231 (0,05%)0,062,02±0,630,06 1,54+0,11

365 (0,12%)0,061,8910,20 С,06 1,51±0,16

475 (0,12%) 0,,14+0.090,06 1,57+0,06

592 (0,15%)0,061,99+0,120,07 1,85±0,35

Мутанты, полученные автоселекцией на жидкойсреде Ј каприлатом натри (0,1%)

6lilt0,072,26iO,460,06

7460,061,91.1:0,260,06

,092,54+0,580,03

9560,092,46+0,580,05

1,54+0,15 1,,02

0,98±0,53 1,45+0,10

1,54+0,15 1,,02

0,98±0,53 1,45+0,10