SU1669981A1 - Рекомбинантна плазмидна ДНК рRД 6 - источник зонда дл тестировани представителей рода FRaNcISeLLa, штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI, содержащий рекомбинантную плазмидную ДНК рRД 6 - источник зонда дл тестировани представителей рода FRaNcISeLLa - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к медицинской микробиологии, генетической инженерии, биотехнологии и может быть использовано дл  обнаружени  представителей рода FRANCISELLA методом молекул рной гибридизации. Цель изобретени  - создание штамма E. COLI, содержащего рекомбинантную плазмиду с фрагментом ДНК, комплиментарным видоспецифическому участку хромосомной ДНК FRANCISELLA TULARENSIS. Плазмида  вл етс  источником зонда дл  обнаружени  франсисел. Сконструирован штамм путем введени  в E. COLI JM 103 с помощью генетической трансформации искусственно полученной рекомбинантной плазмиды PRD 6 с фрагментом ДНК, комплементарным видоспецифическому участку хромосомальной ДНК тул ремийного микроба. Плазмида  вл етс  источником ДНК-зонда дл  обнаружени  франсисел. Штамм депонирован в Музее живых культур Всесоюзного научно-исследовательского противочумного института "Микроб" под номером E. COLIJM 103PRD 6 КМ 7. 1 табл.

Description

Изобретение относитс  к медицинской микробиологии, генетической инженерии , биотехнологии и может быть использовано дл  обнаружени  представителей рода Francisella методом молекул рной гибридизации.

Цель изобретени  - создание штамма Е. coli, содержащего рекомбинантную плазмиду с фрагментом ДНК, комплементарным видоспецифическому участку хромосомаль- ной ДНК Francisella tularensls. Плазмида  вл етс  источником ДНК-зонда дл  обнаружени  франсисел.

Дл  достижени  поставленной цели конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК pRD6, содержащую репликон вектора pUC19, по Есо Rl-сайту которого встроен фрагмент

ДНК длиной 790 п.о., комплементарный специфическому участку хромосомальной ДНК Francisella tularensis. Плазмида неконьюга- тивна, амплифицируетс  при добавлении в среду хлорамфеникола.

Рекомбинантна  плазмида pRD6 длиной 3476 п.о., содержит целый репликон вектора pUC19 длиной 2680 п.о.,по Есо Rl- сайту которого встроен фрагмент ДНК длиной 790 п.о. (имеющий 3 сайта расщеплени  по Alul и один сайт по Cfol), комплементарный специфическому участку хромосомальной ДНК Francisella tularensls.

ДНК-зонд синтезируетс  в процессе репликации рекомбинантной плазмиды за счет репликона pUC19.

(

О

ю чэ

00

Штамм-продуцент зонда получают трансформацией Е. coli IM103 плазмидой pRD6. Рекомбинантна  плазмида выдел етс  из продуцента на стационарной фазе роста с выходом 2-3 мг/мл.

Штамм-продуцент плэзмиды pRD6 E. coll IM103 pRD6 KM характеризуетс  следующими признаками.

Морфологические. Клетки штамма в мазках 18-часовых культур имеют вид грамот- рицательных коротких полиморфных палочек размером 1-2хО,3-0,5 мкм. Неподвижны. На LB-arape в течение 18 ч при 37°С образуют колонии серовато-белого цвета. В бульоне через 18 ч вызывают помутнение среды, образуют на дне осадок. Устойчивы к ампициллину (100 мкг/мл) и стрептомицину (100 мкг/мл).

Культуральные признаки и физиолого- биохимические.Нуждаетс  в пролине.тиами- не. Штамм ферментирует с образованием кислоты и газа глюкозу, арабинозу, галактозу , маннозу, Не ферментирует лактозу. Ли- зируетс  кишечными фагами Т и Avir. Клетки штамма авирулентны дл  белых мышей и морских свинок при подкожном, аэрозольном и енутриконъюнктивальном заражении.

Получение плазмиды pRD6 и штамма IM103 pRD6 KM иллюстрируетс  следующими примерами.

П р и м е р 1. Конструирование плазмиды pRD6.

Хромосомальную ДНК тул ремийного микроба выдел ют методом щелочного лизиса с последующей обработкой фенолом и осаждением ДНК этанолом

1 мкг вектора pUC 19 гидролизуют ре- стриктазой EcoRI (5 ед.) в течение 1 ч при 37°С в буфере, содержащем 50 мМ трис- HCI. рН 8,0, 10 мМ MgCl2, 50 мМ NaCI. Полноту гидролиза контролируют электрофорезом аликвоты (1 /10 ч.) рестрикционной смеси в 0,8%-ном агарозном геле. Реакцию останавливают при 70°С (10 мин) и ДНК осаждают из 0,3 М ацетата натри  (рН 4,8) этанолом, Хромосомальную ДНК тул ремийного микроба гидролизуют EcoRI аналогично (3-4 мкг). Плазмидную и хромосо- мальную ДНК лигируют в 50 мкл буфера (50 мМ трис-HCI, рН 7,6, 10 мМ МдС1г. 0,5 мМ АТФ, 5 мМ ДДТ) в течение 10 ч при 10°С ДНК-лигазой (фаза Т4), Реакцию контролируют электрофорезом в 0,8%-ном агарозном геле (1/10 ч.). Таким же количеством лигазной смеси трансформируют штамм Е. coll IM 103.

Выбор штамма обусловлен тем, что в присутствии pUC 19 он способен синтезировать фермент / -галактозидазу за счет комплементации дефектного хромосомального гена N-концевым фрагментом гена, наход щегос  на плазмиде. Эта способность штамма не про вл етс  в присутствии рекомбинантной плазмиды со встроенным по EcoRI сайту фрагментом ДНК, длина которого не кратна трем, вследствие сдвига рамки считывани  / -галактозидазы. Клоны с такими рекомби- нантными плазмидами, не обладающие / галактозидазной активностью, могут быть отобраны на индикаторной среде с хромо- генным субстратом X-gal по отсутствию голубой окраски.

Клетки культуры E.coll IM 103, трансформированные лигазной смесью, высеивают на чашки с LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина, 40 мкг/мл X-gal и 240 мкг/мл индуктора-галактозидазы ИПТГ (изо- пропил- /S-D-тиогалактопиранозида). Через

14-20 ч при 37°С на чашках вырастают голубые и белые колонии трансформантов.

Из отобранных белых рекомбинантных клонов выдел ют плазмидную ДНК, которую затем анализируют рестриктазами.

П р и м е р2.

1.Получение штамма-продуцента плазмиды pRD6.

Плазмидой pRDG трансформируют штамм Е. coli IM 103, в результате чего пол- учают продуцент плазмиды pRD6. Плазмидную ДНК выдел ют из 500 мл стационарной культуры штамма Е. coli IM 103 pRD6 методом Бирнбойма и Доли.

2.Получение радиоактивного зонда дл  видоспецифического определени  франсисел .

Дл  получени  зонда 10 мкг плазмид-- ной ДНК гидролизуют в объеме 100 мкл ре- стриктазой EcoRI (20 ед.) в течение 1 ч при

37иС в буфере, содержащем 50 мМ трис- HCI, рН 8,0, 10 мМ MgCb, 100 мМ NaCI. Полноту гидролиза плазмидной ДНК провер ют электрофорезом аликвоты рестрикционной смеси в 0,8%-ном агарозном геле. К

гидролизату добавл ют 3 мкм с удельной активностью 3000 кл/ммоль, по 2 мкл dTTP, dGTP с концентрацией 5 мМ/мл и 1 мкм (5-7 ед.) фрагмент Кленова ДНК- полимеразы 1. Смесь инкубируют при

комнатной температуре 5-10 мин и после добавлени  20 мкл 50%-ного глицерина с красител ми раздел ют электрофорезом в 5%-ном полиакриламидном геле. Положение вырезанного из плазмиды фрагмента

ДНК определ ют авторадиографией гел  в течение 20-40 мин. Меченый фрагмент вырезают и элюируют из гел  0,3 М ацетатом натри  в течение 2 ч при 65°С. ДНК осаждают добавлением к элюату 10 мкг т-РНК-носител  и 2,5 объемов 96%-ного этанола. Осадок раствор ют в 100 мкл дистиллированной воды и используют в качестве зонда при гибридизации колоний после 5-минутного прогревани  при 100°С.

3. Использование зонда дл  гибридизации колоний разных видов микроорганизмов .

Клетки разных видов микроорганизмов нанос т на нитроцеллюлозные фильтры СЫНПОР с помощью стекл нных палочек.

Лизис клеток и гибридизацию при 65°С с зондом провод т следующим образом.

Фильтры с нанесенными на них колони ми помещают на фильтровальную бумагу, смоченную 0,5 н. NaOH,n выдерживают 5- 10 мин при комнатной температуре. Дл  нейтрализации фильтры помещают на фильтровальную бумагу (10 мин), пропитанную раствором 0.2 М трис-HCI (рН 7,5), 1 М NaCI. После5 мин просушивани  на воздухофильтры погружают на 15 мин в раствор, содержащий 300 мМ NaCI, 25 мМ Na2HP04, 50 мМ ЭДТА (р 6,8). Затем фильтры высушивают при 80° в течение 2 ч.

Провод т гибридизацию. Высушенные фильтры помещают на 1-2 ч в раствор дл  предгибридизации, состо щий из б х SSC, 02% SDS, 5 х Denchardt, 100 мкг/мл ДНК из спермы лосос  (однократный раствор SSC: 150 мМ NaCI, 15 мМ цитрата натри ; однократный Denchardt фикол 0.01 %, бычий сывороточный альбумин 0,01 %,поливинилпирролидон

0,01%). Из этого раствора фильтры перенос т в раствор дл  гибридизации, состо щий из 4 х SSC, 0,2% SDS, 2 х Denchardt,100 мкг/мл ДНК лосос , к которому добавлен 1

мкг меченого зонда. Гибридизацию провод т при 65°С в течение 16 ч. Затем фильтры отмывают 2 раза по 30 мин при 65°С раствором , содержащим 2 х SSC, 0,2% SDS, и высушивают при 65°С. После авторадиографии

фильтров регистрируют те штаммы, которые гибридизуютс  с зондом.

Результаты гибридизации приведены в таблице.

Как видно из таблицы, с зондом гибридизуютс  только представители рода Franclsella, что позвол ет использовать зонд дл  видоспецифического определени  фран- сисел.

Claims (2)

1. Рекомбинантна  плазмидна  ДНК

pRD6 - источник зонда дл  тестировани  бактерий рода Franclsella размером 3476 п.о. и содержаща  ДНК вектора pUC 19, размером 2686 п.о.; EcoRI-EcoRI-фрагмент

ДНК хромосомы F, tuiarensls штамма 10/15 размером 790 п.о.; сайты рестрикции: 3 сайта расщеплени  по Alul и однин сайт по Cfol; генетические маркеры: атрг-устойчивость к ампициллину.

2. Штамм бактерий Escherichla coll KM 7. содержащий рекомбинантную плазмид- ную ДНК pRD6 - источник зонда дл  тестировани  бактерий рода Franclsella.

Frannsflta c.novicida

ichi a col

Г, i г (; i n i л p с ч т i к

С ГЧ1-ИЯ psciidotnbercu l

( . ГЧ1П13 «nn-rticulllic.l

(irsini.i k r i ч г гпчеп t i i

О. гsinn viuiTmrttin

V.cl nl,.r,.

Psemlum rt,i ч Teruglru 4H

Рачгourpl1 a mulcocida

К 1 t-Ьч | f | 1   РПР11П1ОМ i Л

ItucKlm Pruituc vulgaris subcllis Ч i 1 1 a parncyphi Si i , 1 I i ( v-rm cri i llriu i I l.i Ti I itmsis llriif t 11 т a jo rt us

14 I

2f

И

2:

s

2

13 i 2