SU1601117A1 - Способ размножени винограда IN VIтRо - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биотехнологии и касаетс  микроклонального размножени  винограда. Целью изобретени   вл етс  повышение входа безвирусного посадочного материала и ускорение процесса размножени . Способ состоит в том, что на модифицированную среду Мурасиге-Скуга высаживают меристемы, вычлененные из почек невызревших побегов. Затем получают побеги, обрабатывают их базальные концы βИУК, укорен ют, провод т микрочеренкование, после чего адаптируют полученные растени  к услови м открытого грунта. 2 з.п.ф-лы.

Description

логиГ относитс  к биотехном гг: рГ:гг -°- --

..:;.;.- .

-и вь,садкой в .еплицу д а а о этом в к УСЛОВИЯМ, при

этом в качестве исходного материала используют почки невызревших побегов кую в ° -- ют меристемати ес

.ос;:--/.--e%:i- : в7 ЬЕ

НОИ кислотой Й-ИУК- , - УКСУС ненир н ° укоре Г--ма озлемен ов Г ™ °--- Кроме того, введение эксплантатов в культуру осуществл ют на средГму Расиге-Скуга при содержании 6-бензил- аминопурина 0,1-0,2 мг/л. При этом адаптацию полученных растений к не гг„-г- -:- .

S.

СО

I В конце сент бр  готов т невызревшую часть основных и пасынковых побегов. Побеги хран т во влажных ошлках при О - в течение 2 мес. Б начале декабр  приступают к вычленению и культивированию эксплантатов. Перед посевом исходный материал стерилизуют . За отовленные побеги нарезают на одноглазковые черенки, тща- тельно отмывают в теплой мыльной во- ,е (АО-ЗО С) , дл  чего используют детское мыпо. Затем промывают водо- . проводной и дистиллированной водой, 1 оме1цают в стекл нный бокс и на 40 с заливают 70%-ным этиловым спиртом, а затем на 30 мин 10%-ным раствором ипохлорида кальци , который, отмыва- ют в течение 10 мин в трех-четырех 1брци х дистиллированной автоклави- зованной воды. После этого в cтepiиль- гюм боксе под микроскопом МБС-9 при 25-кратном увеличении с помощью дис - цизионных игл -из почек вычлен ют ме- ристематические верхушки размером 0,17-0,25 мм (в зависимости от величины почек) , состо щие из конуса нарастани  и двух-трех листовых при- . мордиев. Вьщеленные таким образом . 100 эксплантатов сорта Агат донской помещают на питальную среду Мураси- ге-Скуга следующего состава, мг/л (классическа  пропись): 1650; КНОз 1900; CaCl2-6H2,0 ААО; MgS04 х х 7Н20. 370; 1 70; Н дВО 3 6 ,2 ; MnSO,. 22,3; СоСХг бН О 0,025; Си504-5НгО 0,025; ZnSOv 7Н.,0 8,6; Na,Mo04-2H O 0,25; KI 0,83; FeSO, х X 7Н20 27,8; Ыа ЭВТА 2Н2.0 37,3 и дополнительно мезо-инозит 100; пи- . ридоксин 0,2; тиамин О ,2, никотино- ва  кислота 0,5; 6-бензиламинопурин (БАП) 0,15; сахароза 3%; агар 7,5 г/л рН среды перед автоклавированием 5, Пробирки с высаженными эксплантатам . помещают в культуральную комнату пр температуре воздуха 25-27 С, фотопериоде 16 ч освещенности 5000 лк, относительной влажности воздуха 7075% .

Через 5 нед из 100 высаженных эксплантатов у 60 отмечаетс  развитие , побегов до 8-10 мм длиной с че- тьфьм -п тью листочками. Так как образовани  корней у. этих побегов не происходит, приступают к обработке ба зальных концов побегов раствором 5-ИУК. В боксе в асептических услови х побеги достают из пробирок и

помещают базальными .концами на часовые стекла, в которые наливают раствор А -ИУК в концентрации 100мг/л. Через 20 ч побеги высаживают на модифицированную среду Мурасиге-Скуга (второй состав), не содержащую ростовых веществ и с уменьшенным содержанием макроэлементов, мг/л: KNO-j 950; MgS04-7H O 185; CaCl х2Н2П 166, ,68 мг/л. При этом Fe -хелат и микроэлементы оставили по Мурасиге-Скугу, мезоинозит 50 мг/л, пиридокг-ин 0,2 мг/л; сахароза 10 г/л; рН 5,6-6,0.

В течение мес ца побеги укорен ютс  и образуетс  60 оздоровленных от вирусных заболеваний растений. После этого приступают к их микроразмножению . Обеззараживанию растений способствует небольшой размер эксплантатов выдел емых из почек невызревших побегов 0,17-0,25 мм. Оздоровленные растени  размножают черенкованием: развившиес  растени  разрезают, оставл  на каждом отрезке один лист и почку в его пазухе. Этот микрочеренок снов помещают в .пробирку с модифицированной питательной средой второго состава , но в нее добавл ют -ИУК в количестве 0,3 мг/л. Через 4 нед. укорен ютс  54 растени  (процент укоренени  составл ет при этой концентрации А -ИУК 90), через 2 нед приступают к микроразмножению растений. До 1 июн  проведены три пассажа. Коэф- .фициент составл ет 1:480.

Перенос пробирочных укоренённых растений в нестерильные услови  осуществл ют , использу  торфоперегнойные горшочки с субстратом из торфа, почвы и песка (1:1:1). С помощью пинцетов растени  извлекают из пробирок , пропаласкивают корни в дистиллированной воде, высаживают, поливаю водой и накрывают на 6 дн полиэтиленовой пленкой. Пленку приоткрывают н несколько часов в день, а затем снимают . В дельнейшем растени  регул рно поливают и подкармливают смесью Чеснокова,

После того как происходит адаптаци  растений, по вл ютс  один - два новых щста, растени  высаживают в пленочное теплицы на солнечном обогреве с «неполностью контролируемыми услови ми выращивани : параметры температуры , влажности,- освещенности складывались и колебались в зависи51

мости от метеоусловий. Экстремальный услови  исключают путем регул рных проветриваний и поливов. Таким образом , данные услови  приближены к естественным услови м среды произрастани  полученного посадочного материала ,

П р и м е р 2. Способ осуществл ют на сорте Восторг.

В начале окт бр  готов т невызревшую часть основных и пасынковых побегов . Побеги хран т во влажных опилках при О - в течение 2 мес. В середине декабр  приступают к вычленению и культивированию эксплантатов.

Стерилизацию исходного материала осуществл ют, как в предыдущем случае . В стерильном боксе под микроскопом МБС-9 вычлен ют 100 верхушечных меристем и помещают на среду Мураси- ге-Скуга, котора  отличаетс  от среды , на которой культивируют Агат донской , содержанием БАЛ. 6-Бензилами- нопурин ввод т в среду в концентрации 0,1 мг/л. Услови  культивирэва- ни  верхушечных меристем аналогичны услови м сорта Агат донской.

Через 6 нед из 100 высаженных меристем 50 развивают побеги 8-10 мм длиной с трем -четырьм  листочками. Базальные части этих побегов в асептических услови х обрабатывают раствором |3-ИУК в контентрации 101 мг/л и высаживают на среду Мурасиге-Скуга следующего состава, мг/л: KNO, 955- , 140; MgS047Н О 187; CaCl х X 167; 69; Fe - хелат, микроэлементы, сахароза и рН оставались без изменени , а мезоинозит 51 мг/л, пиридоксин 0,21 мг/л.

В течение мес ца 49 побегов укорен ютс  и образуют оздоровленные растени . Через 2 нед приступают к их размножению путем микрочеренковани  В дальнейшем технологи  размножени  идентична дл  всех сортов, за исключением (i-ИУК, концентраци  которой в данном случае составл ет 0,4 мг/л, а Укорен емость микропобегов вино- рада 82,5%. Проведены три пассажа астений. Коэффициент размножени  раен 1:330.

Примерз. Способ осуществл т на сорте Русмол.

В конце окт бр  готов т невызрев- ую часть основных и пасынковых поегов и приступают к вычленению и ультивированию эксплантатов. Стериизацию исходного материала осущест55

1

й .

601117

вл ют как у сортов Агат донской и Восторг. Также в стерильных услови х вычлен ют 100 верхушечньпс меристем и помещают их на среду Мурасиге-Скуга содержание БАЛ в которой составл ют 0,2 мг/л.

Через 6 нед иэ 100 высаженных меристем развиваетс  66 побегов длиной ,0 8-10 мм с четырьм  - п тью листочка- ми. Базальные части этих побегов обрабатывают водным раствором/3-ИУК в концентрации 99 мг/л и высаживают на питательную среду Мурасиге-Скуга сле- ,5 дующего состава, мг/л: KNO, 945- NH4N03 135; MgS04-7H.,0 183,- CacL х X 2Н,0 165; КН.РО, 67; Ре- елат/м - роэл.ементы, сахароза и рН оставались без изменени , мезоинозит 49 мг/л- 20 пиридоксин 0,19 мг/л.

В течение мес ца 60 побегов укорен ютс  и образуют оздоровленные растени . Через 2 нед приступают к их микроразмножению по технологии, иден- 25 тичной примеру 1, за исключением -ИУК, которую добавл ют в питательную среду в концентрации 0,5 мг/л Укорен емость микрочеренков при этом составл ет 75%, количество пассажей 30 четыре, коэффициент размножени - : .

П р и м е р 4. Способ осуществл ли на сорте Ромулюс.

В начале окт бр  заготовили не- вызревшую часть основных и пасынковых побегов. Побеги хранили во влажных опилках 1 мес. Во второй декаде но бр  приступили к. вычленению и культивированию эксплантатов. Стерилиза- цию исходного-материала проводили так же, как и в предыдущих опытах.

В асептических услови х под микроскопом вычлен ют 100 верхущечных меристем и помещают на среду Мураси- ге-Скуга с содержанием БАП 0,25 мл/л. Через 5 нед из 100 высаженньпс меристем развиваетс  30 побегов длиной .а 1U мм с трем  - четырьм  листочками . Базальные части побегов обра- батыв.ают водным раствором и-ИУК в концентрации 100 мг/л и высаживают на питательную среду Мурасиге-Скуга следующего состава, мг/л: KNO 950- NH4NO, 138; MgSO .7Н-0 185; CaCl. х X 2Н,0. 166; , ta; Fe:xeлaт 5 микроэлементы оставались без изменени  по Мурасиге-Скуга, мезоинозит 50; пиридоксин 0,2.

. В течение мес ца 50 побегов укорен ютс  и образуют оздоровленные расте 16011

ни . Через 2 нед приступают к их микроразмножению и адаптации по описанной технологии с содержанием jS-ИУК 0,3 мг/л, как и в примере 1. До 1 июн  сделано три пассажа и коэффициент размножени  составл ет 1:400. Использование предлагаемого способа позвол ет получить безвирусный посадочный материал в большом количестве в ускоренный срок.

10

Ф о рмула изобрете ни 

1. Способ размножени  винограда in vitro, включающий стерилизацию исходного материала, вычленение эксплантатов , посадку их на питательную среду Мурасиге-Скуга, содержащую 6-бензиламинопурин, с последующим культивированием и дальнейщую высадку в теплицу дл  адаптации к услови м открытого грунта, отличающий- с q тем, что, с целью повьшени  выхода безвирусного посадочного матери- ала и ускорени  процесса размножени , в качестве исходного материала используют почки невызревших побегов, в качестве эксплантата - наход щуюс 

8

0

5

0

25

в почке меристему, а культивирование осуществл ют в три этапа, первым из которых  вл етс  получение из эксплантатов побегов, вторым - укоренение полученных побегов и третьим - микроразмножение , при этом перед укоренением провод т обработку базальных концов побегов, полученных на первом этапе культивировани , Д-индолилук- сусной кислотой, а укоренение осуществл ют на безгормональной модифицированной среде. Мурасиге-Скуга с умень- щенным вдвое содержанием макроэлементов и последующее микроразмножение осуществл ют на той же питательной среде с добавлением -индолилуксус- ной кислоты.

2.Способ ПОП.1, отличающийс  тем, что, с целью уменьшени  сомаклональной изменчивости, на первом этапе культивировани  в пита- тельную среду ввод т 6-бензиламинопу- рин в количестве О,1-0,2 мг/л.

3.Способ по пп. 1 и- 2, о т л и - чающийс  тем, что /3 -индоли- луксусную кислоту дл  обработки базальных концов побегов используют в концентрации 99-101 мг/л.

Claims (3)

1. Формула и з о б р е т е ния • f

   1. Способ размножения винограда . in vitro, включающий стерилизацию исходного материала, вычленение эксплантатов, посадку их на питательную среду Мурасиге-Скуга, содержащую 6-бензиламинопурин, с последующим культивированием и дальнейшую высадку в теплицу для адаптации к условиям открытого грунта, от л и ч а ю щ и йс з тем, что, с целью повышения выхода беэвирусного посадочного матери- 25 ала и ускорения процесса размножения, в качестве исходного материала используют почки невызревших побегов, в качестве эксплантата - находящуюся в почке меристему, а культивирование осуществляют в три этапа, первым из которых является получение из эксплантатов побегов, вторым - укоренение полученных побегов и третьим - микроразмножение, при этом перед укоренением проводят обработку базальных концов побегов, полученных на первом этапе культивирования,β -индолилуксусной кислотой, а укоренение осуществляют на безгормональной модифицированной среде. Мурасиге-Скуга с уменьшенным вдвое содержанием макроэлементов и последующее микроразмножение осуществляют на той же питательной среде с добавлением β-индолилуксусной кислоты.
2. 2. Способ поп.1, отличающийся тем, что, с целью уменьшения сомаклональной изменчивости, на первом этапе культивирования в питательную среду вводят 6-бензиламинопурин в количестве 0,1-0,2 мг/л.
3. 3. Способ по пп. 1 и· 2, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что β -индолилуксусную кислоту для обработки базальных концов побегов используют в концентрации 99-101 мг/л.