SU1545161A1 - Способ определени гликозаминогликанов в жидких средах - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биологической химии. Цель изобретени  - упрощение способа за счет сокращени  числа трудоемких операций при одновременном уменьшении объема исследуемой пробы. Способ основан на способности гликозаминогликанов взаимодействовать с положительно зар женным флуорокрасителем - акридиновым оранжевым. Смесь акридинового оранжевого и исследуемой жидкости внос т в лунку в агарозном геле, содержащем гепарин, и после ее диффузии в гель измер ют диаметр кольца преципитации, образующегос  при взаимодействии гепарина с избытком акридинового оранжевого, не св завшегос  с гликозаминогликанами исследуемой жидкости. При этом диаметр кольца преципитации обратно пропорционален концентрации гликозаминогликанов в исследуемой жидкости. Способ позвол ет просто и быстро (в течение 5 ч) определ ть концентрацию гликозаминогликанов в большом количестве образцов и может быть широко использован в клинической биохимии, при проведении массовых обследований вне специализированной биохимической лаборатории, в медицинской промышленности дл  контрол  производственных этапов при получении лекарственных препаратов, содержащих гликозаминогликаны, и экспериментальных работах. 4 табл.

Description

либо пробирках дл  микропроб смешивают по 10 мкл 0,05%-ного водного ,- раствора акридинового оранжевого (АО) и по 10 мкл исследуемой жидкости . Смесь инкубируют 20 мин и пет ренос т микрошприцем или автоматической пипеткой по 15 мкл смеси в лунки в агарозном геле. Чашку Петри закрывают и оставл ют на 4 ч при комнатно температуре. За это врем  не св занный ГАГ исследуемой жидкости избыток 0 диффундирует в гель и формирует с гепарином видимое копьцо преципита ции. Дл  измерени  диаметра кольца используют конусную линейку, изготовленную из масштабной бумаги,, Конусна  линейка располагаетс  под дном чашки Петри и колыго преципитации совмещаетс  с соответствующим ее Диаметру участком конуса. Концентрацию ГАГ определ ют по калибровочной рсривой, построенной в координатах Диаметр кольца преципитации (мм)/ /концентраци  ГАГ в стандартных раст |ворах (мг/мл). В качестве стандартных растворов ГАГ используют растворы хондроитинсульфата в 0,15 М раст- йоре хлористого натри  в пределах Концентраций 0,05 - 0,3 мг/мл. При этом диаметр кольца преципитации измен етс  соответственно от 6,,1 м до 5,01:0,1 мм (нижн   граница чувствительности 0,5 мгк ГАГ)о Повышение концентрации гепарина и/или АО позвол ет , при необходимости, получать калибровочные кривые дл  определени  концентрации ГАГ в более высоких концентрационных пределах, Наличие в исследуемой жидкости белка в концент- рации 4 мг/мл не преп тствует взаимодействию ГАГ и АО.

Пример 1„ Построение калибровочной кривой дл  стандартных растворов ГАГ.

Дл  построени  калибровочной кривой готов т 1 мл 0, водного раствора АО и по 1 мл стандартных растворов хондроитинсульфата (ХС) в концентрации 0,05; 0,10j 0,20; 0,30 мг на 1 мл 0,15 М раствора хлористого натри . В  чейках планшета дл  иммунологических реакций смешивают по 10 мкл стандартного раствора ХС и 10 мкл раствора АО, По 15 мкл смеси перенос т в лунки в ага розном геле и через 4 ч производ т измерение диаметров колец преципита

Q j 0 5 Q

5

5

0

циио Результаты измерени  представлены в табл. 1,

П р и м е р 2. Определение суммарного содержани  ГАГ в растворе про- теогликанов (ПГ).

Дл  определени  внос т в  чейку планшета, содержащую 10 мкл 0, го раствора АО, 10 мкл раствора ПГ в концентрации 0,2 мг на 1 мл О,15 М раствора хлористого натри . 15 мкл смеси перенос т в лунку в агарозном геле, через 4 ч измер ют диаметр кольца преципитации и по калибровочной кривой (пример 1) наход т соответствующую концентрацию ГАГ. Результаты измерени  дл  двух препаратов ПГ приведены в табл. 2 и свидетельствуют о том, что содержание ГАГ в исследуемых препаратах составл ет 90 и 85% от общего содержани  ПГ в растворах.

Пример 3. Оценка специфичности взаимодействи  АО с ГАГ.

Дл  исключени  возможного вли ни  белков на взаимодействие АО с ГАГ используют сыворотку здоровых доноров (), в которой концентраци  ,05 мг/мл. Результаты измерени  диаметра колец преципитации, образовавшихс  при отсутствии сыворотки и при ее добавлении, представлены в табл. 3 и свидетельствуют, что присутствие белка не вли ет на взаимосв зь АО с ГАГ} так как диаметры образовавшихс  колец завис т в данной серии экспериментов лишь от содержани  ГАГ в пробах,

П р и м е р 4. Определение концентрации ГАГ в моче больных ортопедического стационара с целью вы влени  гиперэкскреции ГАГ.

Дл  -вы влени  повышенной концентрации ГАГ в моче пригодна калибровочна  крива , приведенна  в примере 1. Нормальный уровень экскреции ГАГ менее 0,14 мг/мл, все более высокие значени  могут указывать на нарушение метаболизма ГАГ. Дл  таких больных необходимы дополнительные клинико- лабораторные обследовани  в специальных биохимических лаборатори х. Дл  определени  берут 0,05%-ный водный раствор АО (необходимый объем реагента определ етс  числом обследуемых больных из расчета 10 мкл АО на одно определение). Внос т по 10 мкл раствора. АО в лунки планшета дл 

51

иммунологических реакций. Затем микрошприцем добавл ют в каждую лунку по 10 мкл мочи обследуемых пациентов Дл  шифровки образцов мочи используют цифры 1-12 (по горизонтали) и буквы А-Н (по вертикали), имеющиес  на бортиках планшета (пример шифров - А-1, А-5, В-10, C-I2 и т.д.). Через 4 ч после переноса 15 мкл каждой смеси в лунки в агарозном геле измер ют диаметры колец преципитации. Затем по калибровочной кривой определ ют концентрацию ГАГ и вы вл ют больных, имеющих концентрацию ГАГ больше 0,14 мг/мл (табл. 4). Дл  точного определени  концентрации ГАГ, превышающей 0,3 мг/мл, провод т повторное определение путем добавлени  двух объемов АО (20 мкл) и к 10 мкл мочи /необходимость повторного определени  при очень высоком содержании ГАГ в пробах возникает и при использовании известных способов. Приведенной в примере 1 калибровочной кривой в принципе достаточно дл  вы влени  больных с патологической концентрацией ГАГ ( 0,14 мг/мл). В табл. 4 это больные А-1, А-4, А-5, А-6, В-3, В-9, С-3, С-4. В данную группу попали все больные с мукополисахаридоза- ми - заболевани ми, св занными с нарушени ми деградации ГАГ, при которых наблюдаетс  повышенна  экскреци 

ГАГ с мочой.

I

I

Отличием предлагаемого способа  вл етс  техническа  простота выполн емых операций, сокращение времени проведени  большого числа определений , возможность использовани  микропроб тестируемых жидкостей. Упрощение способа состоит в том, что дл  . , определени  не требуетс  дорогосто щее оборудование, устран етс  р д трудоемких операций - например, диализ проб. При наличии предварительно залитых агарозой чашек Петри возможно проведение массовых обследований определенных групп населени  в экспедиционных и полевых услови х, например, при вы влении больных с му- кополисахаридозами в специализирован:6

ных медицинских учреждени х. Даже при наличии только однип чашки Петри диаметром 10 мм (42 лунки) можно исследовать 34 пробы и построить кали- бровочную кривую по 4 точкам в дубл х. Предлагаемый способ сокращает врем  определени  - это примерно 5 ч с момента получени  проб до момента определени  в них концентрации ГАГ. Известный способ требует более суток (пробы предварительно диализуют в течение ночи). Дл  определени  концентрации ГАГ предлагаемым способом необходимо не более 40-50 мкл исследуемой жидкости, дл  известного способа - не менее 200 мкл (в св зи со сложност ми при проведении диализа меньшего количества жидкости).

Способ позвол ет просто, быстро и с использованием меньшего количества исследуемой жидкости определ ть концентрацию ГАГ в больших сери х образцов. Способ может быть широко

использован в клинической биохимии, при проведении массовых обследований вне специализированной биохимической лаборатории, в медицинской промышленности дл  контрол  производственных

этапов при получении лекарственных препаратов, содержащих ГАГ (гепарина, хонсурида и др.) ив экспериментальных работах.

35

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Способ определени  гликозаминогли- канов в жидких средах, включающий обработку исследуемой пробы красителем,

   отличающийс  тем, что, с целью упрощени  способа за счет сокращени  числа трудоемких операций при одновременном уменьшении объема исследуемой пробы, к пробе добавл ют

   акридиновый оранжевый, смесь внос т в лунку в агарозном геле, содержащем гепарин, инкубируют, затем измер ют диаметр образовавшегос  кольца преципитации и определ ют концентрацию

   гликозаминогликанов, котора  находитс  в обратно пропорциональной зави- симости от диаметра кольца преципитации .

   Таблица 1

   0,2 0,2

   10

   10

   10 10

   Таблица 2

   5,9 6,1

   О, 18 О, 16,

   90 85

   Т а

   лица

   Таблица 4

   Множественна  эпифизар на  дисплази  Здорова, мать больного А-1

   Псевдоахондроплази  Мукополисахаридоз, тип VI

   Мукополисахаридоз Мукополисахаридоз, тип II

   Здорова, мать больного А-6

   Системное заболевание скелета

   Спондилоэпифизарна  дисплази 

   Псевдоахондроплази  Здорова, мать больного А-10

   Мезомелическа  карликовость

   Псевдоахондроплази  Здоров, брат больного

   ,Синдром Ларсена Псевдоахондоплази  Здоров, отец больного В-4

   Псевдоахондроплази  Спондилоэпифизарна  дисплази 

   Контрактура Дюпюитрена Мукополисахаридоз, тип Здорова, мать больной В-9

   Здоров, отец больной В-9

   Множественна  эпифизар на  дисплази  Здоров, брат больного В-12

   Здоров, брат больного С-3

   Хондродистрофи  Мак- Кьюсика-

   II

   1545161

   12 Продолжение табл,4