SU1470765A1

SU1470765A1 - Способ получени субкультуры клеток человека и животных

Info

Publication number: SU1470765A1
Application number: SU874291323A
Authority: SU
Inventors: Владимир Викторович Архипов
Original assignee: Институт биологической физики АН СССР
Priority date: 1987-07-29
Filing date: 1987-07-29
Publication date: 1989-04-07

Abstract

Изобретение относитс к технике культивировани клеток дл организма и может найти применение в биологии и медицине. Целью изобретени вл етс повышение жизнеспособности субкультуры. Дл этого в состав культуральной питательной среды ввод т сыворотку крови собаки и после образовани моносло культуру помещают в холодильник при 4-6°С НА 12-24 Ч. В РЕЗУЛЬТАТЕ ЭТОГО МОНОСЛОЙ ПОЛНОСТЬЮ ОТДЕЛЯЕТСЯ ОТ ПОДЛОЖКИ, И ПОСЛЕ ПИПЕТИРОВАНИЯ ОБРАЗУЮТСЯ МЕЛКИЕ КЛЕТОЧНЫЕ АГРЕГАТЫ, ПРОЦЕНТ ЖИВЫХ КЛЕТОК В КОТОРЫХ ПО ТРИПАНОВОЙ ПРОБЕ СОСТАВЛЯЕТ 95-99%.

Description

Изобретемте относитс к технике культивировани клеток вне организма и. может найти применение в биологии и медицине.

Целью изобретени вл етс повышение ж.изнеспособности и сохранение нормальных функций клеток.

Пример. Эндотелиальные клет- ; ки аорты взрослой собаки выдел ют механическим соскабливанием их скальпе- - лем со стороны интимы. Клеточные агрегаты размельчают пипетированием в среде Игла MEM и центрифуг-ируют, Клетки ресуспендируют в 10 мл питательной ;Среды Игла MEM и разливают по 5 мл в два фпакона Фалкон. Причем в один :из них внос т 20% эмбриональной сыво- ротки коровы (контрольна культура Ь другой - 20% собачей сыворотки (опытна культура). Смену питатель- ных сред на соответствующие производ т через 2-3 суток. Через 12 суток культивировани при в обоих флаконах образовалс монослой эндотедиальных клеток с типичной морфало гией - булыжной мостовой. Затем куаьтуры помещают в термостат Ц-1241М с температурой 6°С. Через 24 ч культуры вы- нимают из термостата-холодильника и . просматривают под шткроскопом. В кон- трольной культуре моноспой IOICTOK остаетс прочно прикрепленным к подпож- -ке, тогда как в культуре с 20% собачьей сыворотки монослой полностью от- :дел етс от подложки и плавает в среде В виде пленки размером 547 см. После энергичной тр ски флакона с: клeтoч |ной пле1жой и последующего ггапетирова- ци образовываютс небольшие агрега- ты, содержащие в среднем по 5-15 клеток , которые пересеваютс в свежую среду Игла с 20% собачьей сыворотки в соотношении 1:6.

Часть клеток при этом используют дл оценки их жизнеспособности посредством окраски трипановым синим.Количество сизнеспособных (т.е. непоглотивших краситель) клеток в исходной

сд

успензии составл ет 95%. Через 4-5 ч осле помещеда культуры в термостат ри 37°С практически все клетки прикепл ютс к подложке и распластывают- j

.

Дл отделени клеток от подложки в.контрольной культуре используют ,1%-ный раствор трипсина в солевом уфере. В результате получают суспен- ю зию единичных клеток, котора также пересеваетс в соотношении 1:6 в среду Игла +20% эмбриональной сыворотки коровы. Окрашивание пробы этих клеток трипановым синим показывает, что коли-15 чество жизнеспособных клеток не превышает 80%, а врем прикреплени их к подложке и распластывани более 12 ч. Дальнейшее пассирование контрольной и опытной субкультур известным и 20 предлагаемым способом (т.е. без использовани ферментов) показывает, что после четвертого пересева эндоте- лиапьные клетки в контрольной культуре резко снижают скорость роста и сре-25 ди них по вл ютс аномальные гигантские клети, тогда как в опытной культуре изменений клеток по этим характеристикам не происходит. После п того пересева клетки в контрольной культу-: зо ре полностью дегенерируют, тогда как опытна культура пересеваетс восемь раз без каких-либо заметных изменений в скорости роста и морфологии.

П р и м е р 2. Перевиваемые фибро- j бласты мьшш линии ШН выращивают в , среде 199 + 10% .бычьей сыворотки до образовани моносло . Обработкой моносло этих клеток раствором 0,25% трип- сина получают суспензию фибробластов 40 в среде 199. Полученную суспензию клеток NIH. плотностью 35 тыс/мл помещают в шесть флаконов Каррел по 7 мл в

каждый.

В три из них добавл ют 10% бычьей 45 сыворотки (контрольньш культуры), в три других - 5% бычьей сыворотки плюс 5% собачьей сыворотки (опытные культуры ) и их помещают в термостат при . Периодически культуры просматри- р вают под микроскопом. В опытных культурах образование моносло происхо- дат через 3,5-4 суток, в контрольных - на 4,5-5 сутки..После образовани моносло опытные культуры помещают в термостат . Через 12 ч нахождени при в опытных культурах отмечают значительные участки отслоившегос от

подложки моносло и после встр хивани флаконов происходит его полное открепление . Посредством пипётировани клеточные пленки разбивают до образовани суспензии агрегатов в среднем по 3- 10 клеток в каждом. Окрашивание этой суспензии показывает, что 98% клеток жизнеспособны. Врем их распластывани на подложке после посева в свежую среду составл ет 1,0-1,5 ч в обоих типах сред.

В контрольных культурах отделение клеток провод т обработкой их моно- сло смесью трипсин-версена в соотношении 1:4. Количество жизнеспособных клеток по трипановой пробе составл ет 82%. Врем распластывани фибробластов после пересева составл ет от 1,5 до 2,5 ч.

П р и м е р 3. Фибропласты линии ВНК-21 культивируют до образовани моносло и затем обрабатывают раствором 0,25% трипсина с целью получени суспензии единичных клеток. Полученные клетки высевались в среду Игла MEM в два флакона Каррел . В один из них добавл ют 10% бычьей сыворотки в другой -5% бычьей сыворотки +5% сыворотки собаки. Через 3 суток в обоих культурах фибробласты образовывают монослой.. Флакон с культурой, содержащей сыворотку собаки, помещают в термостат при 5°С. Через 15 ч такой инкубации происходит полное от-- крепление клеток от стекла. После пипётировани И окраски трипановым синим устанавливают подсчетом, что 99% клеток вл ютс жизнеспособными.

Контрольна культура обрабатываетс 0,25%-ным раствором трипсина. Три- панова проба показывает, что жизне-, способными вл ютс 82% клеток.

Claims

Формула изобретени

Способ пассировани клеток человека и животных, включаощий их выращивание в среде, содержащей сыворотку крови собаки, и последующее отделение образовавшегос моносло от подложки , отлич ающий с тем, что, с целью повышени жизнеспособности и сохранени нормальных функций клеток, отделение моносло осуществл ют инкубацией культуры клеток на холоду при температуре 4-6°С в iечение 12-24 ч.