SU1446155A1 - Способ получени растений-регенерантов кукурузы из культуры тканей - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биотех- иологии, а именно к культивированию тканей растений, и может быть использовано в селекционной работе. Целью изобретени   вл ет.с  увеличение выхода растений-регенерантрв из культуры тканей, а также повыпение их жизнеспособности, что достигаетс  добавлением в среду дл  регенерации, и в среду дл  укреплени  побегов предшественников мтогормонов - триптофана и аденина. 6 табл.

Description

Изобретение относитс  к биотехнологии , в частности к биологическим исследовани м сельскохоз йственных растений методом культуры изолированных тканей, и может быть использовано в .работе по созданию новых форм растений, в частности сортов и линий кукурузы, обладающих хоз йственно ценными признаками,.

Низкий выход регенерантрв растений в культуре тканей злаковых  вл етс  одним из лимитирующих факторов дл  применени  клеточных технологий в процессах создани  новых сортов растений с хоз йственно ценными признаками..

Целью изобретени   вл етс  повышение выхода растений-регенерантов и увеличение их жизнеспособности.

Способ заключаетс  в том, что при культивировании растений кукурузы в культуре тканей, включающем культивирование эксплантатов на питательной среде, субкультивирование первичных каллусов, отбор морфоген- ных каллусов и получение в дальнейшем растений-регенерантов,в среду дл  регенерации растений и в- среду дл  укреплени  сформировавшихс  по- бегов добавл ют предшественники фи- тогормонов - -триптофан (предшественник ауксина) и аде-нин (предшественник цитокинина) в определенном соотношении. При этом наличие в среде предшественников фитогормонов позвол ет смещать направленность синтеза эндогенных фитогормонов и дает возможность более тонко регулировать морфогенетические процессы в каллу- сах сообразно физиологическим особенност м каждого генотипа.

Способ осуществл етс  следующим

способом..

Незрелые зародыши (15-20 дн после опьшенн ) гибридов кукурузы поверхностно стерилизуют в 2%-ном растворе хлорамина в течение 20 мин, трижды промывают в стерильной дистиллированной воде и помещают на среду N6 Чу-Вонга, содержащую 1 мг/л тиамина, 3% сахарозы, 1% агара, 1 мл/л 2,4-ди хлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д), щитком вверх и культивируют при 32±

±1 С в темноте в течение 2-3 недель. Образовавшиес  каллусы пассируют на свежую питательную среду .каждьй 2-3 недели.

0

5 Q Q

е

5

0

5

Через 2-3 пассажа среди каллусов отбирают морфогенные двух типов: желтые , плотные, развивающиес  из зародышевой оси, или белые, блест щие, плотные, развивающиес  из тканей щитка .

Отобранные каллусы перенос т на среду регенерации N6, содержащую 1 мг/л тиамина, 3% сахарозы, 7, агара , 40-60 мг/л триптофана, 1-9 мг/л аденина, 0,1-0,3 мг/л 2,4-Д, и культивируют на свету при при 16-часовом фотопериоде.

Через 1-2 недели образовавшиес  побеги перенос т на среду N6, содержащую 1 мг/л тиамина, 3% сахарозы, 1% агара, 10-30 мг/л триптофана и 1-20 мг/л аденина, дл  укреплени  сформировавшихс  побегов и культивируют при 16-часовом фотопераоде при 27±ГС.

Через неделю укрепившиес  побеги высаживают на среду дл  укоренени , содержащую половинную концентрацию солей по N6 и 1% сахарозы, 1% агара , и выдерживают на ней в течение недели при и 16-часовом фото- периоде. Укоренившиес  побеги пересиживают в почву и культивируют до стадии зрелости.

Получение морфогенньЬс каллусов кукурузы (общее дл  всех случаев). Незрелые зародьгащ 15-20 дн после опьшени  гибридов кукурузы Днепровский 247, Р-927, н.5166 и инбрёдной линии 0,5445 поверхностно 1 Стерилизуют в 2%-ном растворе хлорамина в течение 20 мин, трижды промывают в стерильной дистиллированной воде и помещают на среду Ntj Чу-Вонга, содержащую 1 мг/л тиамина, 3% сахарозы, 1% агара, 1 мг/л 2,4-Д, щитком вверх и культивируют при 32±l c в темноте в течейие 2-3 недель. Образовавшиес  каллусы пассируют на свежую питательную среду каждые 2-3 недели.

Через 2-3 пассажа среди каллусов отбирают морфогениые двух типов: желтые , плотные, развивакщиес  из тканей зародышевой оси, или белые, блест щие, плотные, развивающиес  из тканей щитка. Отобранные каллусы перенос т на среду регенерации.

Пример 1. Полученные морфо- генные каллусы пересаживают на среду регенерации N6, содержащую 1 мг/л тиамина, 3% сахарозы, 17, агара, 40 мг/л триптофана, 1 мг/л аденина.

0,1 мг/л 2,4-Д, и культивируют на свету при 27±1°С при 16-часовом фотопериоде .

Через 1-2 недели формируютс  листовые зачатки, побеги на некоторых морфогенных каллусах. Частота образовани  регенерантов зависит от генотипа исходного растени .

IIpoueH i регенерации растений Дл  различных генотипов кукурузы на среде N6 с 40 мг/л триптофана, 1 мг/л аденина. О,1 мг/л 2,4-Д приведен в табл. 1.

Таким образом, осуществление способа возможно при использовании в среде регенерации 40 мг/л, триптофана , 1 мг/л аденина и 0,1 мг/л 2,4-Д (нижн   граница за вленного интервала концентраций компонентов).

Прим ер 2. Мо рфогенные каллусы пересаживают на среду N6, содержащую 1 мг/л тиамина, 3% сахарозы 1% агара, 50 мг/4т триптофана, 5 мг/л аденина 0,2 мг/л 2,4-Д, и культиви- РУ1ЭТ на свету при 27±1 С при 16-часовом фотопериоде.

Че рез 1-2 недели наблюдаетс  формирование зачатков побегов, причем со значительно большей частотой, чем на среде регенерации (пример I). Частота регенерационных событий также зависит от генотипа растений доноров эксплантатов.

Процент регенерации растений дл  ра: личных генотипов на среде N6 с 50 мг/л триптофана, 5 мг/л аденина и 0,2 мг/л 2,4-Д приведен в табл.2.

Таким образом, осуществление способа возможно при использовании в среде регенерации 50 мг/л триптофа- на, 5 мг/л аденина, 0,2 мг/л 2,4-Д наилучшим образом, с наивысшей частотой регенерации (оптимальные концентрации компонентов).

П р и м е р 3. Морфогенные кал/1у- сы пересаживают на среду регенерации N6, содержащую 1 мг/л тиамина, 3% сахарозы, 1% агара, 60 мг/л триптофана , 9 мг/л аденина и 0,3 мг/л 2,4-Д, и культивируют на свету при и 16-часовом фотопериоде.

Частота формировани  зачатков побегов , образующихс  через 1-2 недели снижаетс  дл  всех тестированных генотипов по сравнению с вариантом с оптимальными значени ми концентраций компонентов. Осуществление способа

0

5

0

получени  растений-регенерантов из каллусов возможно при концентрации в среде регенерации N6 триптофана 60 мг/л, аденина 9 мг/л, 2,4-Д 0,3 мг/л (верхн   граница за вленного интервала концентраций компонентов ).

Процент регенерации растений дл  различных генотипов на среде N6 с 60 мг/л триптофана, 9 мг/л аденина и 0,3 мг/л 2,4-Д приведен в табл. 3.

II р и м е р 4. Изучают вли ние различных концентраций триптофана и аденина на регенерацию растений в культуре каллусов. Концентрацию триптофана в среде N6 мен ют от 20 до 80 мг/л, аденина от О до 10 мг/л, концентраци  2,4-Д фиксируетс  на уровне 0,2 мг./л.

При этом показано (табл. 4), что использование триптофана в концент- раиди ниже 40 мг/л и выше 60 мг/л, аденина ниже I мг/л и выше 9 мг/л не приводит к желаемому эффекту - регенерации растений.

Данные сведены в табл. 4.

Пример 5. Зачатки побегов, сформировавшихс  на среде регене-. рации, перенос т на среду N6 дл  укреплени  побегов, содержащую 1 мг/л тиамина, 3% сахарозы, 1% агара, 10-30 мг/л триптофана, 1-20 мг/л аденина и культивируют на свету при 16-часовом фотопериоде при .

При использова ши среды дл  укреплени  побегов с добавлением триптоQ фана и аденина в указанных интервалах концентраций наблюдаетс  более быстрый рост растений, увеличиваетс  их высота и диаметр,и, таким образом, повьшаетс  жизнеспособность регенеg рантов.

Вли ние триптофана и аденина в среде дл  укреплени  побегов на жизнеспособность растений-регенерантов. п оказано в табл. 5.

5

0

5

50

55

Примерб. Изучают вли ние различных концентраций триптофана и аденина в среде дл  укреплени  побегов на увеличение жизнеспособности регенерантов. Уровни триптофана мен ют от О до 40 мг/л, уровни аденина - от О до 30 мг/л.

Результаты исследований приведен в табл. 6.

Из табл. 6 видно, что при использовании концентраций триптофана выше 30 мг/л и аденина выше 20 мг/л наблюдаетс  некоторое угнетение роста побегов. При концентраци х трий- тофана 10 мг/л и аденина ниже 1 мг/л нет заметного увеличени  жизнеспособности регенерантов. .

Через неделю культивировани  на среде дл  укреплени  побегов регене- ранты пересаживают на среду дл  укоренени , содержащую половинную концентрацию солей по N6, 1% сахарозы, 1% агара, и вьщерживают на ней в течение недели при 27il°C и 16-часовом фотопериоде. Укоренившиес  побеги перенос т в почву и культивируют до стадии зрелости.

Таблица

Генотип

I

Побегообразование, %

Генотип

Таблица2

Побегообразование , %

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Способ получени  растений-регене- рантов кукурузы из культуры тканей, включающий культивирование первичных эксплантатов на питательной среде N6 Чу Вонга, субкультивирование первичных каллусов, отбор морфогенных каллусов и получение из них регенерантов , отличающийс  тем, что, с целью повышени  выхода растений-регенерантов и увеличени  их жизнеспособности, в питательную среду дл  регенерации добавл ют триптофан в концентрации 40-60 мг/л, аденин в концентрации 1-9 мг/л и 2,4-Д в концентрации 0,1-0,3 мг/л, а в среду дл  укреплени  побегов добавл ют, триптофан в концентрации 10-30 мг/л и аденин в концентрации 1-20 мг/л.

   Компоненты среды. Регенераци , % дл  гено- мг/лтипа

   5 0

   О

   О О

   о

   5,2

   Гибрцды

   Днепровский 247

   Р-927 н5166

   Инбредна  лини  05445

   58,3 12,3

   ia,5

   5.2

   Таблица 3

   30

   Генотип

   Побегообразование , %

   Гибриды

   Днепровский 247 Р-927 Н5166

   Инбредна  лини  05445

   9,3 2,2 2,5

   1,5

   Таблица 4

   О

   О

   о о

   (

   12,3

   О О О

   о

   58,3

   5 10

   10 0,6-1,0 1,0-1,6 1 1,0-1,5 1,2-1,7

   30 30 40 30 40

   10 20 10 30 30

   Составитель В. Демкин Редактор И. Гунько Техред М.Моргентал Корректор Г. Решетник

   Заказ 7566

   Тираж 520

   ВНИИПИ Государственного комитета по изобретени м и открыти м при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушска  наб., д. 4/5

   3,0 2,0 1,1 0, 8 0,8

   2,5-3,5 ,6 1,2-1,5 1,1-1,3, 1,0-1,4

   Подписное