SU1701197A1 - Способ получени каллуса кукурузы - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биотехнологии , а именно к биологическим исследовани м сельскохоз йственных растений методом культуры тканей и клеток, и может быть использовано в работе по созданию новых форм растений, в частности гибридов и исходных форм кукурузы, обладающих хоз йственно ценными признаками. Целью изобретени   вл етс  повышение выхода змбриогенного каллуса. Способ состоит в том, что незрелые зародыши кукурузы культивируют на питательной среде Мурасиге- Скуга при температуре 29-32°С, при этом в среду дополнительно внос т Дикамбу, Пик- лррам и 2,4-Д, 6 табл.

Description

СП

с

Изобретение относитс  к биотехнологии , а именно к биологическим исследовани м сельскохоз йственных растений методом культуры клеток и тканей, и может быть использовано в работе по созданию новых форм растений, в частности сортов и исходных форм кукурузы, обладающих хоз йственно ценными признаками.

Целью изобретени   вл етс  повышение выхода эмбриогенного каллуса.

Способ состоит в том, что эксплантаты культивируют при повышенной температуре (29-32°С) на питательной среде Мурасиге и Скуга, в которую совместно добавл ют три ауксина а определенных концентраци х: Дикамбу, Пиклорам и 2,4-Д (по 0,1-0.5 мг/л). При совместном их внесении змбриогенные каллусы образуютс  со значительно большей частотой, чем когда ауксины добавл ютс  по отдельности.

Способ осуществл етс  следующим образом .

В качестве эксплантатов используют незрелые зародыши кукурузы сорта Шиндель- майзер, пиний ИК 226-ТВ, А 554, размером 1,5-2,5 мм (15-20 дней после опылени ). Незрелые семена поверхностно стерилизуют в 0,1 %-ном растворе сулемы, после промывки из них вычлен ют незрелые зародыши и высаживают щитком вверх на среду с минеральными сол ми по Мурасиге и Скугу (в основном варианте) с 30 г/л сахарозы, 1 мг/л тиамина, 1 мг/л пиродоксина, 1 мг/л никотиновой кислоты, 100 мг/л мезоинози- та, 500 мг/л пролина, 100 мг/л гидролизата казеина 0,8% агара, 0,1-0,5 мг/л 2,4-Д, 0,1- 0,5 мг/л Пиклорама, 0,1-0,5 мг/л Дикамбы, рН среды довод т до 5,8. Культивируют в темноте при 29-32°С в течрние трех недель. Затем сформировавшиес  каллусы пассиру ч о

чэ -ч

ют на свежую питательную среду каждые 2-3 недели. Дл  регенерации растений сформировавшиес  змбриогенные каллусы перенос т на среду с 0,1 мг/л2,4-Д, 0,1 мг/л Дикамбы, 0,1 мг/л Пиклорама, 50 мг/л триптофана , 5 мг/л аденина и культивируют на свету при 26 ±1°С при 16-часовом фотопериоде .

П р и м е р 1. Вли ние температуры культивировани  на выход эмбриогенного каллуса.

Изучают вли ние температуры культивировани  незрелых зародышей на выход змбриогенного каллуса кукурузы (лини  В- 73). Дл  этого незрелые зародыши высаживают на среду МС с 1 мг/л 2,4-Д и культивируют: а) при температуре 26 ±1°С; б) при температуре 29 ±1°С; в) при 32 ± 1°С; г) при 35 ± 1°С.

Через 3 недели определ ют выход змбриогенного каллуса. Культивирование при температуре 32 ±1°С увеличивает выход змбриогенного каллуса в несколько раз (табл.

1).

Все далее описываемые опыты провод т при температуре 32 ±1°С.

П р и м е р 2. Вли ние минеральных солей на выход эмбриогенного каллуса кукурузы .

Дл  культивировани  тканей кукурузы используют самые разнообразные среды. В св зи с этим требуетс  вы снить, кака  из наиболее часто употребл емых сред  вл етс  наилучшей дл  образовани  змбриоген- ных каллусов кукурузы из незрелых зародышей. Изучают вли ние солей по Му- расиге и Скугу (МС), Гамборга (В5), Чу-Вонга (№6) и Нича на частоту образовани  эмбри- огенных каллусов из различных генотипов. Результаты отражены в табл. 2.

Эмбриогенные каллусы образуютс  с самой высокой частотой на среде Мурасиге и Скуга дл  всех генотипов. В св зи с этим все дальнейшие опыты провод т на среде Мурасиге и Скуга.

П р и м е р 3. Вли ние фитогормонов на выход эмбриогенного каллуса.

Далее исследуют вли ние различных ауксинов (2,4-Д, Пиклорама, Дикамбы) и их комбинаций на образование эмбриогенного каллуса. Дл  этого готов т среду Мурасиге и Скуга в четырех вариантах: с 1 мл/л Пиклорама (среда П), с 1 мг/л 2,4-Д (среда Д), с 1 мг/л Дикамбы (среда Ди), и в четвертую среду внос т по 0,33 мг/л каждого фи- тогормона (среда ПДДи). Частота образовани  эмбриогенного каллуса  вл етс  наиболее высокой на среде ПДДи дл  всех генотипов (табл. 3).

На других средах частота образовани  змбриогенного каллуса различна  дл  разных генотипов, причем характер действи  фитогормонов различаетс  дл  каждого генотипа . Так, дл  сорта Шиндельмайзер среды по способности образовывать эмбриогенный каллус можно расположить в

р д: ПДДи Д П Ди, дл  линии А 554: ПДДи Ди П Д, а дл  линии В 73: ПДДи П Ди Д. Таким образом, обнаружен факт стимул ции образовани  эмбриогенного каллуса при совместном внесении в

среду культивировани  трех фитогормонов: Пиклорама, 2,4-Д и Дикамбы.

П р и м е р 4. Подбор оптимальной концентрации фитогормонов дл  образовани  эмбриогенного каллуса кукурузы.

Далее требуетс  вы снить, кака  концентраци  фитогормонов  вл етс  оптимальной дл  каллусообразовани . Дл  этого в среду МС внос т Пиклорам, 2,4-Д, Дикам- бу в следующих концентраци х: по 0,1 мг/л каждого фитогормона (среда 0,1 ПДДи), по

0,3 мг/л каждого фитогормона (среда 0,3 ПДДи), по 0,5 мг/л каждого ауксина (среда 0,5 ПДДи), по 1 мг/л (1 ПДДи) и по 2 мг/л каждого фитогормона (среда 2 ПДДи). В качестве контрол  используют среду МС с 1

мг/л 2,4-Д (среда Д). Частота образовани  эмбриогенных каллусов  вл етс  максимальной (генотип - лини  А 554) на среде 0,3 ПДДи, на средах 0,1-ПДДи и 0,5 ПДДи превышает контроль, а на средах 1 ПДДи и 2

ПДДи ниже, чем в контроле (табл. 4).

Таким образом, оптимум наблюдаетс  при добавлении 0,3 мг/л каждого фитогормона . Граничными концентраци ми предлагаемого способа будут концентрации

каждого фитогормона в 0,1-0,5 мг/л, поскольку при этих концентраци х выход эмбриогенного каллуса выше, чем в контроле.

П р и м е р 5. Регенераци  растений из эмбриогенных каллусов кукурузы.

Дл  регенерации растений эмбриоген- ные каллусу кукурузы перенос т на среду МС с 0,1 мг/л Пиклорама, 0,1 мг/л 2,4-Д, 0,1 мг/л Дикамбы, 50 мг/л триптофана, 5 мл/л аденина и далее их культивируют на свету

при 26 ±1°С при 16-часовом фотопериоде. Через две недели наблюдают регенерацию побегов. Определ ют процент каллусов с регенерацией и количество побегов на каллус (табл. 5).

Таким образом, из эмбриогенных каллусов , полученных предлагаемым способом, возможна регенераци  растений с высокой частотой.

Приведенные данные показывают, что использование способа позвол ет увеличить выход эмбриогенного каллуса до 90% (34% в прототипе), причем эффект увеличени  выхода наблюдаетс  у различных генотипов .

Перечень компонентов среды, использовавшихс  в осуществлении предлагаемого способа.

Состав питательной среды, мг/л: NhUN031650

KN031900

CaCfc -2H20440

MgSO4 -7HaO370

КН2Р04170

N32EDTA -2Н2037.3

FeS04 -7Н2027,8

6,2

4Н2022.3

7Н208.6

0,83

0.26 0,025

НзВОз

MnSCU

ZnS04

KJ

Na2Mo04 2H20

CuS04 -5H20

Вли ние температуры культивировани  на выход эмбриогенного каллуса

Вли ние минеральных солей на процент формировани  эмбриогенного каллуса из незрелых зародышей дл  разных генотипов

Вли ние фитогормонов на процент образовани  эмбриогенного каллуса из незрелых зародышей дл  разных генотипов

CoCl2 -6H200.025

Сахароза30000

Пролин500

Мезоинозит100,0

Никотинова  кислота0,5

Пиридоксин HCI1,0

Тиамин НСГ1,0

Агар7000

рН5,8

Гормоны(табл. 6)

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Способ получени  каллуса кукурузы, включающий эксплантацию незрелых зароды ше  на модифицированную питательную среду Мурасиге-Скуга и последующее куль- тивирование,отличающийс  тем,что. с целью повышени  выхода эмбриогенного каллуса, зародыши эксплантируют на питательную среду, дополнительно содержащую 0,1-0,5 мг/л натриевой соли дихлорфени- луксусной кислоты, 0.1-0,5 мг/л Пиклорама и 0,1-0,5 мг/л Дикамбы, и культивирование провод т при 29-32°С.

   Таблица 1

   Таблица 2

   Таблица 3

   Вли ние концентраций фитогормонов на выход эмбриогенного каллуса кукурузы линии А 554

   Таблица 5 Регенераци  растений из полученного по данному способу эмбриогенного каллуса

   Гормоны, необходимые дл  осуществлени  способа

   Таблица А

   Таблица 6