SU1412061A1 - Способ получени вещества, стимулирующего пролиферативный процесс эндокринного отдела поджелудочной железы - Google Patents

Description

(46) 07.09.90.БЮЛ. 33 . (21) 4151835/28-14 22) 03.12.86

(71)1-й Московский медицинский институт им. И.М, Сеченова

(72)Э.И. Гальперин, О.Ю. Абакумова и Н.Н, Ионочки а

(53) 612.015(088.8) (56) Бабикова ., Биюмкии В.Н., Шальнев Б.И., Полонска  Л.Б. Клеточные культуры из поджелудочной железы плодов крупного рогатого citoTa, полученные с пр1тенением коллалитИна. Бюп. экспер. биологии и медицины, 1977, т.83, f 3, с.350-353.

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЕЩЕСТВА СТИМУЛИРУЮЩЕГО ПРОЛИФЕРАТИВНЫЙ ПРОПЕСС ЭНДОКРИННОГО ОТДЕЛА ПОДЖЕЛУДОЧЙСА ЖЕЛЕЗЫ

(57) Изобретение относ тс  к.эодокрй- нопогии. Пслжелудочные железы измельчают, диспергируют в 0,ЗХ-ном растворе коллагштина и ресуспецдиру ют в среде 199. Осадок гоногенизиру- ют. Гомогенат центрифугирует, над- осадочную жидкость прогревают, центрифугируют и фипьтрз ют. Полученное вещество обеспечивает более раннюю и полноценную компенсацию инсул р-г ной недостаточности.

15

20

1

Изобретейие относитс  к медицине, а именно к эндокринологии.

Цель достигаетс  путем использовани  регенерирующей поджелудочной г железы взрослого донора, из которой вьщел ют островки Лангерганса, а из них после соотвегствующей обработки получают средство содержащее факторы , стимулирующие пролиферацию (ФСП) ю островков Лангерганса в поджелудочной железе после ее обширных резекций.

Способ осуществл ют следующим образом .

Дл  получени  средства используют регенери1рующую .поджелудочную железу troK) крыс-доноров. Дл  этого у 170 беспородных белых крыс-самцов массой 200-220 г под эфирным наркозом после среднесрединной лапаротомии производ т резекцию селезеночного отдела поджелудочной железы (что по массе Составл ет 50%) и спленэктомию (так как поджелудочна  железа в этом отделе имеет интимную СВЯЗЬ с сосудами селезенки). Срединную рану ушивают наглухо. .

Через 36-А4 ч доноров забивают методом декапитации и сраАу же забирают поджелудочную желе:, которую 1томещают в чагику Петри (манипул ции провод т при ). Масса полученной Ж от рсех доноров 80 г. .

Островки Лангертакса вьщел ют из полученной ткани, т.е. из регенерирующей ПЖ по следующей методике.

Подл .елудочную железу (масса 80 г) тг.щнергают механическому измельчению ::.о;А Шцами, после чего продавливают через сетку с диаметром пор 1-2 мм. Фрагменты ПЖ диспергируют в 0,3%-ном pacysope Коллалитина (активность - mg.,приготовленного на раство1412061 .2

и С в течение 20 мин. Надосадочную жидкость (290 нгт) прогревают при температуре в течение 15 мин. Повторно центрифугируют при тех же услови х и фильтруют через миллипоровый фильтр Aufs 0,3-0,6 мк (Сынпор, ЧССР).

Полученное вещество в колич естве 280 мл содержит до 0,5 мг/мл белка (определенного по методике Лоури) и приводит к стимул ции синтеза ДНК В ткани ПЖ крыс с инкреторной недостаточностью в 1,9; 3,2 и 2,6 раз соответственно через 10,12 и 24 ч после введени .

Определение активности вещества.

Активность полученного вещества определ ют на 30 беспородньк белых крыса-самцах массой 160-180 г, у которых ИН вызывают по следующей схеме: производ т резекцию 50% ткани. ПЖ (по вьгаеописанной методике), череа 24 ч и 48 ч им внутрибрюшинно ввод т 5%-ный водный раствор Аллоксана (фирмы Chemapol, ЧССР). Ч ерез 48 ч после последней инъекции Аллоксана у крыс развиваетс  инкреторна  недостаточность , про вл юща с  клиникой сахарного диабета (глюкоза крови - 276, мг%). В 3Tif сроки 15 крысам с ИН внутрибрюшинно в дозе 1 мп ввод т полученное средство, содержащее ФСП (опыт), 15 крысам в той же дозе ввод т внутрибрюшинно физиологический раствор (контроль). -,

Активность вещества оценивают по степени его вли ни  на синтез ДНК в ткани ПЖ у крыс опытной и контрольной групп. Синтез ДНК в ткани ПЖ определ ют через 10,12,20 и 24 ч после введени  средства и физиологического райтвора.

Синтез ДНК (удельную активность

25

30

35

40

р2 Kanks (80 мл) в течение 20 мин в магнитной мещалке при 20-22 С. После д ДНК) определ ют после внутрибрюшиино- о гстаивани  фрагментов ПЖ надосадоч- гр введени  Н -тимидина (СССР) по йую жидкость сливают. Осадок трижды (есуспендируют в среде № 199 (70 мп) с последук цим отстаиванием и удалением надосадочной жидкости. Из полученной смеси ОЛ (70 мл) получают вещество дл  коррекции инсул рной недостаточности , Взвесь ОЛ (70 мп) гомогенизируют в гомогенизаторе тефлон-стекло (в модификации Поттера) при в

50

55

100- мкКи на крысу. Врем  экспозиции 90 мин. Животных забивают методом декапитации , после чего сразу забирают ткань ПЖ и помещают ее в лед. Ткань гомогенизируют в гомогенизаторе теф- лон-с.текло (а модификации. Поттера) при в 3 объемах 0,05 М трис-НС1-., буфера, рН-7,7, содержащего 0,25 М сахарозу 0,005 М MgClj, и 0,025 М КС1. В аликвотах гомогената определ нгг (в 0,1 мл) удельную радиоактивность и содержание ДНК. Удельную радиоактивность определ ют после осаждени 

трех объемах дистиллированной воды (240 мп) в течение 1 мин.

Гомогенат (320 мп)- центрифугируют на центрифуге К-70 при об/мкн

ДНК) определ ют после внутрибрюшиино- гр введени  Н -тимидина (СССР) по

100- мкКи на крысу. Врем  экспозиции 90 мин. Животных забивают методом декапитации , после чего сразу забирают ткань ПЖ и помещают ее в лед. Ткань гомогенизируют в гомогенизаторе теф- лон-с.текло (а модификации. Поттера) при в 3 объемах 0,05 М трис-НС1-., буфера, рН-7,7, содержащего 0,25 М сахарозу 0,005 М MgClj, и 0,025 М КС1. В аликвотах гомогената определ нгг (в 0,1 мл) удельную радиоактивность и содержание ДНК. Удельную радиоактивность определ ют после осаждени 

кислоторастворимого материала 10%- ной ТХУ и нанесени  его на миллипоро вые фильтры (№ 2 Synpor, ЧССР) в жидкостном сцинтйлл ционном счетчике Merk II (Nuclear Chicago, СИЛА) в сгдинтилл торе ЖС-106 (СССР). Содержание ДНК определ ют по методу Влобел  и Поттера. Результаты вьгражают в импульсах в 1 мин,

В результате получают данные, что введение вещества приводит к стимул ции синтеза ДНК в ткани ПЖ крыс с экспериментальной инкреторной недосг таточностью через 10,12 и 24 .ч соот- ветственно в 1,9; 3,2и 2,6 раз (по сравнению с контрольной группой).

В опыт вз то 18 беспородных собак обоего пола, массой от 5 до 18 кг. Всем произведена субтотальна  (85%) резекци  поджелудочной железы с пере , в зкой панкреатического протока. Животные разделены на две группы: в первой (10 собак), введени  средства не производили (контроль) , во второй (8 собак). Животным внутрибрюшинно сразу же после операции ввод т Полученное средство из расчета 4,0-5,0 м на 1 кг массы тела (опыт), средство имеет следующую характеристику: содержание белка - не более 0,5 мг/мл, активность - усиление синтеза ДНК в тк-ани ПЖ крыс с ИН в 1,9J 3,2 и 2,6 раз соответственно через 10,12 и 24

В послеоперационном периоде у животных первой группы уровень глюкозы в крови натощак остаетс  высоким в течение 3 нед после операции, а толе рантйость к глюкозе - сниженной на прот жении всего периода наблюдени  (1 нес.). Это обусловлено снижением секреции инсулина, о чем свидетельствовало уменьшение содержани  инсулин и С-пептидов в крови натощак и в процессе проведени  -сахарной нагрузки. Кроме Toroj отмечаетс  временное (в течение 2 нед.) повьопение уровн  контрисул рного гармона - глюкагона,

Дп  гистологической картины ПЖ в различные сроки после операции у животных данной группы было характер но нарастание дистрофии, фиброза и атрофии ацинусов и части островков Лангерганса. Однако нар ду с этим в ПЖ спонтанно протекают репаративны процессы (гипертрофи  ОЛ, увеличение количества переходных ациноостровко- вых клеток), которые и определ ют временный характер гипергликемии, Од

.

- 1412061

нако эти процессы не обеспечивают полноценной компенсации ннсул рной недостаточности, о чем свидетельствует низкий уровень инсулина и С-пептн10

20

- jj

- 25 л . ч.

- у реципиента, , 30

35

40

45

50

да, а также снижение толерантности к глюкозе на прот жении всего периода наблюдени .

Во втврой группе (опыт) введение средства приводит к снижению содержа ни  глюкозы в крови натощак уже со 2 сут. после операции и вплоть до конца наблюдени  и к стабильной компенсации ИН (т.е. к нормогликемии) с нормализацией толерантности к глюкозе уже со 2 нед. после операции. Это сопровождалось усилением синтеза инсулина (достоверным повышением содержани  инсулина и С-пептида в крови натощак и в процессе проведени  са-- харной нагрузки), а также менее значительным увеличением содержани  глю- кагона.

Введение препарата (средства) приводит к значительным морфологическим изменени м в оставшейс  части 1Ш отмечаетс  выраженна  гипертрофи  и увеличение количества ОЛ и ацин6ост ровковых клеток (достоверно выше, чем в контроле) . В ОД обнаруткиваютс  единичные фигуры митозов.

Таким образом, введение полученного средства собакам, перенесшим обширную резекцию ПЖ (85%), стимулирует спонтанно протекающие в ней репаративные процессы и приводит к более ранней и полноценной компенсации ИН,. не вызьта  при этом аллергических реакций.

Преимуществом предлагаемого способа получени  средства дл  коррекции инсул рной недостаточности  вл етс  следующее.

В качестве доноров можно использовать взрослых животньпс, что (технически ) облегчает получение средства; необходимость культивировани  полученных ОЛ отпадает;.

Можно использовать ПЖ от нескольких доноров, так как предлагаемый способ обработки ксено-ПЖ предусматривает удаление из ткани Щ1 термолабильных белков и снижает возможность возникновени  аллергических реакций

у реципиента,

Средство, привод  к стимул ции процессов репаратрш в оставшейс  после 85%-ной резекции части ПЖ, обеспечивает образование новых функционально активных эндокринных элементов

леэы, включающий измельчение резерци рованных поджелудочных желез крыс,, диспергирование в 0,3%-ном растворе

ПЖ - собственных ОЛ, функционирование, коллалитина при 20-22 С, ресуспенди . , . а Л .

которых обеспечивает компенсацию ИН и нивелирование Клиники сахарного ди&бета у экспериментальных животных.

Формуланэ обретени  ю

«

Способ получени  вещества, стимулирующего пролиферативный процесс эндокрийного отдела поджелудочной жерование в среде № 199, далее/, осадок гомогенизируют в дистиллированной воде 1-2 мин при 4±,0,1°С, гомогенат центрифугируют при 3000 об/мии q течение 20-30 мин, надосадочную жидкост прогревают при т.кип. воды в течение 15-20 ьмн, повторно центрифугируют в тех же услови х, фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,3-0,6 мк.

леэы, включающий измельчение резерци- рованных поджелудочных желез крыс,, диспергирование в 0,3%-ном растворе

коллалитина при 20-22 С, ресуспенди . а Л .

рование в среде № 199, далее/, осадок гомогенизируют в дистиллированной воде 1-2 мин при 4±,0,1°С, гомогенат . центрифугируют при 3000 об/мии q течение 20-30 мин, надосадочную жидкост прогревают при т.кип. воды в течение 15-20 ьмн, повторно центрифугируют в тех же услови х, фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,3-0,6 мк.

Claims (1)

1. Формула м э обретения 10

   Способ получения вещества,· стимулирующего пролиферативный процесс эндокринного отдела поджелудочной же лезы, включающий измельчение резерцир о ванных поджелудочных желез крыс,, диспергирование в 0,3%-ном растворе коллалитина при 2О-22^вС, ресуспендирование -в среде Ж 199, далее;, осадок гомогенизируют в дистиллированной воде 1-2 мин при 4±,0,1°С, гомогенат . центрифугирукл· при 3000 об/мин в течение 20-30 мин, надосадочную жидкость прогревают при т.кип. воды в течение 15-20 мин, повторно центрифугируют в тех же условиях, фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,3-0,6 мк.