SU1366528A1 - Штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI-продуцент липополисахарида, обладающего митогенной активностью - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к микробиологии и касаетс  нового штамма, который может быть использован в микробиологической промьшшенности дл  производства реактивов при проведении иммунологических реакций. Цель изобретени  - штамм бактерий, способней продуцировать, липополисахарид,  вл ющийс  митогенным фактором в иммунологической реакции бласттранс-. формации лимфоцитов. Штамм Е. coli 137, обладающий этими свойствами, выделен из кишечника здорового человека . а S (Л

Description

оо о

05

сд ю

сх

Изобретение относитс  к микробиологии и касаетс  нового штамма, который может быть использован в мик робиологической промьшлеиности дл  производства реактивов при проведе НИИ иммунологических реакций.

Цель изобретени  - штамм бактерий , способный продуцировать липо- полисахарид,  в.л юш;ийс  митогенным фактором в иммунологической реакции бласттрансформации лимфоцитов.

Штамм Е. coli ИМВ-2417, обладающий этими свойствами, выделен из кишечника здорового человека общеприн тым методом с помощью элективной питательной среды Эндо и отобран в результате селекции из многих штам мов Е. coli по признаку наибольшей митогенной активности.

Депонирован в коллекции Государственного НИИ стандартизации и контрол  медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича МЗ СССР и имеет регистрационный номер 137.

Штамм имеет следующие культураль-

но-морфологические и физиолого-биохи мические признаки.

Морфологические признаки. Клетки - мелкие палочки 1,1-1,5 х 2,0- 6,0 ммк. Спор.не образуют, грамотри- цательные, подвижные, перитрихи.

Культуральные признаки. Хорошо растет на обычных питательных средах . На.м со-пептонном агаре колонии KpyrJibie, гладкие, с блест щей поверхностью . На м со-пептонном бульоне дает обильный рост, образу  помутнение и осадок. Растет в аэробных услови х при 30-37 С, рН 6,5-8,0,

Биохимические признаки. Разлагает с образованием кислоты галактозу, клюкозу, арабинозу, мальтозу, маннит сорбит, не ферментирует сахарозу. Б качестве единственного источника углерода может использовать ацета т. Нитраты восстанавливает до нитритов, образует индол.

Штамм Е. coli 137 при культивировании на синтетической среде, содержащей ферментолизат кукурузной муки, продуцирует липополисахарид, обладающий митогенной активностью.

Безвредность. Штамм относитс  к невирулентным дл  теплокровных организмов культурам. ЛД j этого штамма дл  белых мышей составл ет: при внут рибрюшинном введении 1,52 ,57x микробных клеток, на животное;

5

0

5

0

5

0

5

0

5

при введении через рот 5,55-10 ±1,93 -Ю микр.кл./животное;, при интрана-зальном введении ЛД дл  мышей не определ етс  - максимально возможна  дл  введени  доза 5,0 х10 микр.кл./животное вызывает гибель лишь 1 из 1,0 зараженных животных . Морфологических изменений в органах и ткан х зараженных животных не вы влено.

Штамм Е. coli 137 не патогенен дл  теплокровных организмов.

Выращивание микробной массы штамма Е. coli 137 и полу,чение липополи- сахарида производ т следующим образом .

Дл  получени  инокул та используют 24-часовую культуру, выращенную на м со-пептонном агаре при 37°С в колбах объемом 500 мл со 100 мл жидкой синтетической среды следующего состава, %: пептон 1,5, глюкоза 1,0, дрожжевой экстракт 0,5. NajHP04 2Н20 0,8, NaCl 0,3, MgSO -7H20 0,02.

Полученным посевным материалом засевают ферментеры со средой аналогичного состава в объеме 2% от количества засеваемой среды. При этом ферментер на 50% объема заполн етс  средой. Выращивание осуществл ют при в течение 18ч. В конце инкубации бактериальные клетки определ ют центрифугированием при 5500 об/мин. Промывают 3 раза ацетоном при центрифугировании (10 мин, 2500 об/мин) и высушивают на воздухе. Липополисахарид получают по методу Вестфал .

Пример. Штамм Е. coli 137, хран щийс  в столбике м со-пептонно- го агара (МПА) под маслом, высевают на кос к с МАА и .выращивают в термостате при 37°С в течение 24 ч. Затем культуру смывают с кос ков жидкой питательной средой указанного состава и засевают в колбы емкостью 500 мл, содержаш;ие 100 мл аналогичной питательной среды. Выращивают 24 ч при , после чего инокул т в объеме 2.% от объема среды в ферментере за- севали в ферментер АНКУМ-2 емкостью 3 л, заполненный на 50% (1,5 л) средой того же состава. Интенсивность аэрации в ферментере - 1,5 л/л.мин. при 100 об/мин мешалки, длительность выращивани  бактерий 18 ч при 37°С. Культуральную жидкость затем центрифугируют при 5500 об/мин в течение 30 мин. Биомассу промывают 3 раза

ацетоном при центрифугировании (10 мин, 2500 об/мин) и высушивают на воздухе.

Извлечение липополисахарида провод т по методу Вестфал , 10 г сухих бактериальных клеток экстрагируют 300 мл фенолводной смесью при 65 С в течение 20 мин при интенсивном

перемешивании. Смесь охлаждают до и центрифугирзтот при 2500 об/мин в течение 50 минут. Водный слой сливают в отдельный сосуд, а к феноль- ному слою и Нерастворимому осадку добавл ют один объем воды и обрабатывают повторно. Объединенные экстраты диализуют против проточной, а затем дистиллированной воды до полного удалени  фенола и лиофилизируют.

Липополисахарид используют в качестве митогена в реакции бласт- ной трансформации лимфоцитов периферической крови с помощью микрометода П. Г. Нараэова и В. И. Пурин .

Культуральна  среда общим объемом 3 мл содержит 0,3 мл цельной крови, 0,3 мл сыворотки IV группы (предварительно проинактивированной при 56 С в течение 30 мин), 100 мкг/мл липополисахарида и среду 199. Пробы культивируют в течение 5 сут. Учет реакции бласттрансформации лимфоцитов провод т морфологическим методом в фиксированных и окрашенных по

10

66528

Романовскому-Гимза мазках. В каждом препарате анализируют 200 клеток. В качестве бластных учитывают переходные формы - крупные клетки со средним диаметром 14 нм, увеличенным  дром, базофильной цитоплазмой, собственные бласты - крупные клетки неправильной формы диаметром 20- 24 нм, с эксцентричным  дром, ваку- олизированной цитоплазмой, клетки в стадии митоза. Помимо процентного выражени  результатов реакции бласт- трансформации лимфоцитов вычисл ют индексы стимул ции (отношение количества бластов в опыте к количеству бластов в контроле). При этом индекс стимул ции лимфоцитов составл ет 3,7i 0,3 имп/мин, процент бластных форм 20,8±1,9, что указывает на способность липополисахарида вызывать бласттрансфо рмацию лимфоцитов.

15

20

Таким образом, предлагаемый штамм Е. coli 137  вл етс  новым штаммом, продуцирующим Липополисахарид с мито- генной активностью.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Штамм бактерий Escherichia coli ГИСК № 137 - продуцент липополиса- харида, обладающего митогенной активностью .