SU1290170A1 - Способ количественного определени микроорганизмов - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к микробиологии и позвол ет сократить врем  исследовани  и повысить точность определени  микроорганизмов. Анализируемую жидкость смешивают с иммуносор- бентом, инкубируют, сорбент промывают фосфатным буфером. Иммуносорбент со св занными клетками обрабатывают щелочным раствором додецилсульфата натри  в концентрации . Хеми- люминесцентным методом с помощью лю- минола и перекиси водорода определ ют выделенный гемин. Количество клеток в образце определ ют по калибровочной кривой зависимости интенсивности излучени  от содержани  клеток в стандартных растворах. i (Л to дЭ

Description

1 12

Изобретение относитс  к способам измерени , использующим биологически активные вещества, а именно специфическому способу определени  количества бактериальных клеток в биологиче- ских жидкост х и культуральной среде и может быть использовано в клинической микробиологии, микробиологической промышленности, и в других отрасл х промышленности, где необходим контроль биозараженности.

Известен способ количественного определени  микроорганизмов, предусматривающий св зывание их со специфическими антителами, сорбированными на поверхности твердой фазы. Дл  проведени  анализа по известному способ анализируемый образец, содержащий клетки микроорганизмов, инкубируют с иммобилизованньми на твердом носи- теле антителами, специфическими к поверхностным детерминантам клетки (40-60 мин). Затем иммуносорбент, св завший клетки, несколько раз по 5-10 мин промывают и инкубируют с ан тителами, мечеными ферментом.

Продолжительность второй инкубаци 40-60 мин. После этого сорбент тщательно отмывают (4-5 раз в течение Ю мин) от несв завшегос  конъюгата антител с ферментом, и фермент, св занный с носителем.вы вл ют, определ   его активность. Дл  этого к отмытому носителю добавл ют смесь субстратов (о-фенилен-диамин и перекись водорода). Конечный результат регистрируют измерением оптической плотности окрашенного продукта реакции, нарабатываемого в течение 30 мин. Общее врем  анализа около 3-4 ч. Пре- дел обнаружени  .З-10 кл/мп.

Известный способ обладает следующими недостатками: определ ютс  не только целые клетки, но и их фрагменты , что существенно вли ет на пра- вильность получаемых результатов, длительность анализа.

Цель изобретени  - ускорение процесса и и повышение точности определени  микроорганизмов.

Поставленна  цель достигаетс  тем, цто согласно способу количественного определени  микроорганизмов, предусматривающему св зывание их со специфическими антителами, сорбирован- ными на поверхности твердой фазы, св занные микроорганизмы обрабатывают щелочным раствором, содержащим 10 -10 М додецилсульфата натри 

f 0 5

о Q

е

5

5

70-2

(ДСН), с последующим определением в полученной смеси люминесцентным методом концентрации выделившегос  из клеток гемина, по которой с помощью калибровочной кривой определ ют концентрацию микроорганизмов.

Способ осуществл ют следующим образом .

Пробу анализируемой жидкости, содержащую бактериальные клетки, смешивают с иммуносорбентом. Соотношение объема пробы и объема иммуносорбента варьируетс  в зависимости от типа используемого сорбента и составл ет 100 мкл;50 мкл-100 мкл:400 мкл. После инкубации в течение 40-60 мин, необходимой дл  св зывани  клеток с иммобилизованными антителами, сорбент промВ1вают три раза 0,01 М К- фосфатным буфером (рН 7,4), содержащим 0,15 М NaCi и 0,05% тритона Х-100. После этого образец иммуносорбента со св занными клетками подвергаетс  обработке 0,2 М раствором NaOH, содержащим М ДСН в течение 3-5 мин. В процессе этой обработки происходит разрушение клеточной оболочки и осуществл етс  перевод гемина с твердой фазы в раствор . Аликвота раствора затем вноситс  в пробирку кюветного отделени  люминометра, в которую добавл ютс  люминол и перекись водорода.

Гемин катализирует реакцию окислени  люминола Н 0, сопровождающуюс  излучением света. Интенсивность люми- .несценции пропорциональна концентрации гемина и, следовательно, количеству клеток, св завшихс  с иммуносорбентом . Количество, клеток в образце определ ют по калибровочной кривой зависимости интенсивности излучени  от содержани  клеток в стандартных растворах.

Пример 1. Построение калибровочного графика и определение количества клеток E.coli.

Культуральную жидкость, содержащую 10 клеток/мл E.cofi развод т 0,01 М К-фосфатным буфером, содержащим 0,15 М NaCI в следующих соотношени х: 1:10, 1:100, 1:200, 1:500,1:2000. Затем 0,5 мл раствора каждого разве- .дени  смешивают с 400 мкл суспензии .CNBr-сефарозы с иммобилизованными ан- ;тителами к E.coli. Смесь инкубируют при 37 С в течение 30 мин, после чего иммуносорбент промывают 0,01 М К-фосфатньпч буфером (рН 7,4), содер31

жащим 0,05% тритона Х-100. Пробирки центрифугируют, удал ют надосадок и добавл ют в каждую из них 1500 мкл 0,2 М раствора NaOH, содержащего 5-10 М ДСН и перемешивают. После инкубации в течение 3 мин из каждой из них отбирают 960 мкл раствора и помещают в кювету люминометра. Затем в эту же кювету автоматически внос т 20 мкл раствора люминола (10 М) и после 10 с инкубации реакцию инициируют добавлением 20 мкл Н 0 (5 х X 10 М), измер ют интенсивность хемлюминесценции и стро т калибровочный график зависимости интенсив- ности излучени  от количества клеток используемых в стандартных образцах Содержание .клеток в стандартном.образце контролируют методом световой микроскопии. Содержание клеток в не- известном образце (N) определ ют по калибровочному графику. Предел обнаружени  клеток E.coli - 10 клеток/м

П р и М е р 2. Построение калибровочного графика и определение био- массы актиномицетов Streptomyces chrysomallus.

Пр мой подсчет клеток актиномицетов  вл етс  затруднительным из-за образовани  агрегатов клеток неопре- деленного состава, поэтому определение ведут по сухому весу. Из суспензии микроорганизмов 1:2, 1:3, 1:5, 1:8, 1:10 готов т разведени  (по 12 мл). Бумажные фильтры (5 шт) высушивают при 80°С до посто нного веса , затем на них нанос т 3 мл суспензии клеток, фильтруют, фильтры высушивают в эксикаторе над CaCt. Фильтры помещают на 1 ч в сушильный шкаф при , взвешивают, при этом разница в весе после нанесени  суспензии клеток и чистого фильтра соответствует сухому весу биомассы в 3 мл клеточной суспензии.

Дл  опр.еделени  биомассы 3 мл соответствующего разведени  суспензии микроорганизмов инкубируют с иммобилизованными антителами к Streptomyces chrysomallus. Далее способ осуществл ют согласно примеру 1. Пре дел обнаружени  - 5 мг/мл.

П р и М е р 3, Определение клеток E.coli в смеси микроорганизмов.

Суспензию, содержащую E.coli и 10 клеток/мл Bacillus subtilis развод т 0,01 М К-фосфатным буфером, содержащим 0,15 М NaCl в следующих соотношени х: 1:10, 1:100, 1:200,

704

1:500, 1:2000. Затем 0,5 мл раствора каждого разведени  смешивают с 400 мкл суспензии CNBr-сефарозы с иммобилизованными антителами к E.coli. Инкубацию с иммуносорбентом, последующую экстракцию гемина и определение интенсивности хемлюминес- ценции провод т, как в примере 1. Затем стро т график зависимости интенсивности хемлюминесценции от количества клеток в пробе . Образец среды, содержащей неизвестное количество клеток, развод т 1:100, после чего 0,5 мл раствора разведени  инкубируют с 400 мкл иммуносорбента, отмывают, измер ют сигнал хемлюминесценции .

Определение количества клеток E.coli провод т по калибровочному графику, полученному дл  стандартных концентраций E.coli (как в примере 1). Количество клеток E.coli, определенное в смеси с клетками Bacillus subtilis соответствует количеству клеток, найденному по стандартному раствору в отсутствии второго микроорганизма .

Оценка эффективности экстракции гемина из микроорганизмов от концентрации Додецилсульфата натри  подтверждаетс  следующими данными:

Таким .образом, использование предлагаемого способа количественного определени  микроорганизмов (по сравнению с известным) сокращает врем  определени  с 3-4 ч до 1-1,5 ч, повышает точность анализа за счет определени  только целых клеток, а также увеличивает предел обнаружени  клеток .

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Способ количественного определени  микроорганизмов путем св зывани  их со специфическ11ми антителами, сорбированными на поверхности твердой фазы , отличающийс  тем, что, с целью ускорени  процесса и повышени  точности определени , св занные микроорганизмы обрабатывают ще51290170-6

   лочным раствором додецнлсульфата нат- делением его хемлюминесцентным матери  в концентрации 10 М, с дом с помощью люминола и перекиси во- последующим выделением гемина и опре- дорода.