SU1233806A3 - Способ определени активности сериновой протеазы - Google Patents

Description

Изобретение относитс  к биохимии, в частности к способу определени  активности сериновой протеазы. .,

Целью изобретени   вл етс  :ювы- шение чзгвствительности способа.,

Способ осуществл ют следующим об- разом.

В энзимеодержаший материал добавл ют субстрат - маркированное вещес- во , содержащее производные амимокис- лот, общей формулы

R, (Aj), -(.-R, где R - водород, ацдл;

А - валин, изолейцин, аланин,

глицин;

А - пролин, фенилаланин, глицш валин, пипеколиновое производное глютаминовой кислоты пироглютаминова  кислота., лейцинS аланин, глютамино™ ва  кислота; сложный метиловый эфир глютаминовой кислоты , аргинин, изолейцин. тирозин;

А - фенилаланин, пролин, лейции серии, глицин, валин. аланин;

А, - аргинин, лизин; RJ - люминол, изолюмикол; п - О или .

Реакцию взаимодействи  протеазы и субстрата провод т в услови х, обеспечивающих оптимальность протекани  реакции дл  данного ;1нзима. В зависимости от степени активности протеазы и концентрации субстрата,, реакцию провод т в течение 055-5 мин

: ггрекращают добазле:- ием кислоты или гцелочи 5 пр -1Бод 1цег о к изме1 ению рН с:редь 5 обеспечивающему прекраще- мие д;1льнейше.й активности протеазы.

Затем коли1-;ество высвободившегос  :чар1 :ера - лЮ М 1Нола или изолюминола, 11Пре:дел ют путем добавлел-:и  окислител : I-J измерени  количества испускаемого при этом света при помощи под- код , приспособлени . При этом количество вы свобождаюшего г аркера линейно пропорционально количеству знаима, поэтому количество света пре,цста.вл ет собой меру дл  активности протеазы.

П р и ; е р I , К раствору, содержащему 100 мк,п урокиназы и 200 мкл 10 И pG7u-Gily Arg-Ts2/-HCt-, добавл ют 800 мкл гРис-буфера с рН 9,0 ионной силой 0,05. Смесь инкубируют при 3 течение 5 мин. Гидролиз субстрата останавливают добавлением 20%-;г1ой уксусной кислотЫ; отбирают 50 среды,, в котором спектрофлуо- рог етрнчески определ ют количество высвободившегос  маркера (изолюмино- па ), которое соответствует 0,01 гдкннцы урокин азы,

П р и е р 2. К раствору согласно npi jwepy , со,держащему в качестве ф&рмкнта тромбинJ добавл ют в качестве субстрата вещества со структурой, п:рИЕе;деннсй В табл. I . Определ ют (.П ГНйзчгльнсе количество фермента (МКЗ). которое возможно вы вить при помощи- используемых субстратов .

Результаты сведены в табл. 1.

Т ,;, б л и п а I

Примечание : Вое - третичный бутилоксикарбонил,

СЬо - карбобензокси, Bz - бензои.п, pGГи - пироглютаминова  кислота.

ts

П р и м е р 3. Повтор ют осущест- с применением сериновых ферментов вление способа, согласно примеру 1, субстратов, согласно табл. 2.

Таблица2

УрокиназаpGhu-Ghy-Arg-IsI

- -pGhu-Ghy-Arg-pNa

ТромбинTos-Phe-Pro-Arg-IsI

- -H-D-Phe-pip-Arg-pNa

ПлазминBoc-Val-Leu-Lys-IsI

- -H-D-Val-Leu-Lys-pNa

Представленные данные показывают, что использование изобретени  (приме- меры , 3, и 5) позвол ет повысить чувствительность способа определени  активности сериновых протеаз в сравнении с известным способом (примеры 2 , 4 и 6 ) .

П р и м е р 4. Повтор ют осущес г- влени  способа, согласно примеру 1, в качестве фермента используют 5,0 10 М трипсина, а в качестве субстратов используют нижеперечисленные :

ВНИИПИ Заказ 2789/60 Тираж 490

Подписное

Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектна , 4

Продолжение табл,)

0,01 единицы 0,5 единицы

0,01 10 единицы

3,5 10- единицы

0,02-10 единицы казеина

1 1 О единицы казеина

H-D-VaT-Len-Arg-IsI-2HCr; Cbo-GIy-Pro-Arg-IsI-HCI;

Boc-IIe-GIuCNCjH, )-Cly-Arg-IsI HCl;

H-Phe-Prо-Arg-IsI;

Bz-Arg-Lum-HCJ;

Bz-Arg-IsI HCI; H-D-Leu-Ser-Arg-IsI-2HC ;

Cbo-Cly-Gly-Arg-Lum-AcOH;

Ac-Ala-Pro-Arg-IsI;

Suc-AJa-Pro-Lys-Ist;

H-0-Arg-VaI-Tyr-IsI-2HCl. Количество высвободившегос  маркера соответствует используемой в

опыте концентрации фермента.

Подписное

Claims (1)

1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ СЕРИНОВОЙ ПРОТЕАЗЫ путем взаимодействий энзимсодержащего материала с маркированным веществом, содержащим производные аминокислот, .отличающийся тем, что, в качестве маркированного вещества используют вещество общей формулы ^-(АД -(аД -(АД -A,-R,.

   где R - водород, ацил;

   A_q - валин, изолейцин, аланин, глицин;

   А - пролин, фенилаланин, глицин, валин, пипеколиновое производное глютаминовой кислоты, пироглютаминовая кислота, лейцин, аланин, глютаминовая кислота, сложный метиловый эфир глютаминовой кислоты, аргинин, изолейцин, тирозин;

   А- фенилаланин, пролин, лейцин, <© серин, глицин, валин, аланин ;

   А. - аргинин, Лизин;

   F_г - люминол, изолюминол;

   η ’ - 0 или 1 .

   >

   СМ i 23 3806