(П
С Изобретение относитс к микробио логической промьштенности и касаетс нового штаммй бактерий, использу мого дл получени этанола. Известен штамм бактерий Zyraomon продуцент этанола С11. Бактерии рода Zymoraonas в сравнении с традиционно используемыми продуцентами этанола - дрожжами Saccharomyces, Schizosaccharotnyces, обладают существенными преимущества ми. Удельна скорость об)азовани этанола у бактерий Zymomonas в несколько раз превосходит эту величину у лучших продуцентов этанола дрожжей . Благодар высокой скорости катаболизма у Zyraomonas с помощью бактерий, использу .современные технологические приемы (иммобилизаци клеток, рециркул ци клеток фпокул ци и др.), можно создать системы, превосход щие по своей продуктивности известные системы, основанные на использовании дрожжей Реакции катаболизма углеводов у Zymomonas отличаютс от дрожжей. У Zymomonas не наблюдаетс торможен процесса образовани этанола высокими концентраци ми углеводов. Суммарное уравнение превращени глюкозы в этанол у Zvraomonas такое же, как у дрожжей, т.е. из одной молекулы глюкозы получают до двух молекул этанола. Таким образом, тео ретически максимальный вьпсод этанол из глюкозы у составл ет 0,51 г/г. На практике эта величина меньше и составл ет 0,47 у Zymomonas и до 0,44 у дрожжей. Это обусловлено тем что часть глюкозы используетс дл роста клеточной массы, а также тем, что помимо этанола при спиртовом брожении образуютс в малом количестве побочные продукты - ацетат, ацетальдегид, лактат. Чувствительность процесса бактериального спиртового брожени к эт лу не уступает дрожжам. Метаболизм у лучших штаммов Zymomonas не ингибируетс 8%-нь(м этанолом. Эти бактерии образуют до 120 г/л этанола. Известен штамм бактерий Zymomona mobilis СР4, который характеризует удельной продуктивностью при и рН 5 в среде, содержащей 200 г/л глюкозы, 4,0 г/г в час,удельной ско ростью потреблени глюкозы при 30°С и рН 5 в среде с 200 г/л глюкозы 02 8 г/г в час и при и рН 5 в среде с 300 г/л глюкозы образуетс 120 г/л этанола 2. Однако у .этого штамма выход этанола значительно понижаетс при содержании глюкозы в среде более 250 г/л. Например, при концентрации глюкозы в среде 250 г/л выход этанола составл ет 0,47 г этанола/г глюкозы, при концентрации глюкозы 300 г/л урсоставл ет 0,42 г этанола/г глюкозы. Кроме того, указанна культура поддерживаетс в активном состо нии частыми пересевами - 1 раз в неделю, так как при хранении более 7 дней в полуанаэробных услови х (в контакте с атмосферным воздухом) наблюдаетс уменьшение активности штамма. Целью изобретени вл етс штамм бактерий Zymomonas mobilis, обеспечивающий повышение выхода этанола при содержании глюкозы в среде более 250 г/л и обладающей повьш1енной устойчивостью к хранению в полуанаэробных услови х без потери активное ти. Предложенный штамм Zymomonas raobiiis-113 хранитс в Центральном музее промьшшенных микроорганизмов ВНИИгенетика , коллекционньй номер ЦМПМ В-2721 и характеризуетс следующими свойствами. Морфологические признаки. Клетки - короткие палочки с округленными концами 1,4-2,0x4,0-5,0 мк, бесспоровые, грамотрицательные, подвижные, встречающиес по одной, в парах и в некоторых случа х образующие цепочки. На стадии интенсивного роста в жидких средах культура образует равномерную муть. При-посеве на твердых средах в чашки Петри культура образует круглые, гладкие, выпуклые коло- НИИ сероватого цвета. Физиологические признаки. Культура относитс к аэротолерантным анаэробам. Оптимум роста при 30°С В качестве источника углерода использует глюкозу, фруктозу и сахарозу . В качестве источника азота хорошо используют (Ш,)250, средне , Дл роста нуждаетс в дрожжевом экстракте. В качестве ростового фактора использует пантотенат кальци биотин. Желатину не разжижает. Индол ,не образует. Нитраты не восстанавливает . Углеводы расщипл ет по пути Энтнера-Дудорова с образованием этанола и выделением углекислого газа. Культура растет на концентрированных средах, содержащих до 350 г/л глюкозы. При этом образуетс до 140 г/л этанола. Культура обладает повышенной каталазной , пероксндазной и супероксиддисмутазной активностью. Активность этих ферментов обеспечивает высокую резистентность клеток к кислороду и тем самым клетки не тер ют свою этанолсинтезирующую активность при хранении культуры длительное врем . Активность ферментов Zytnomonas mobilis-113, обеспечивающих резистентность к кислороду: каталазы 8-105 мк моль/мг белкамин,перокси-. дазыО,5мк моль/мг белка мин,а супероксиддисмутазы 34 Е/мг белка (од на единица Е активности супероксиддисмутазы равна количеству фермента, которое ингибирует на 50 % автоокисление адреналина). Предлагаемый штамм из сока сахар ной свеклы изолирован и отселекционирован . Он резистентный к высоким концентраци м глюкозы (более 250 г/ и вьщерживанию в полуанаэробных услови х. Пример. -Штамм Zymononas mobi lis-113 поддерживают периодическими пересевами один раз в две недели на жидкой среде следующего состава, г/л: Глюкоза 100 Дрозкжевой экстракт 0,5 КН2Р041 ( NH) SO 1 0,5 рН среды 6,0. Среду стерилизуют трехкратнь№1 вы держиванием в проточном паре. Культ ру сохран ют при . Посевной материал выращивают сте рильно на упом нутой среде при 31°С в течение 48 ч в колбах емкостью 250 мл, содержащих 200 мл среды. Колбы закрыты ватными пробками. Основную ферментацию провод т параллельно в четырех вариантах на среде следующего состава, г/л: дрожжевой экстракт 7,0; KHjPO 2,5; (NH,) 1,6; MgS047HjO 1,0 и глюкозу 200, 250, 300, 350 соответственно в каждом варианте, рН среды 6,0. Среду стерилизуют как указано. Посевной материал добавл ют к среде в количестве 10% по объему. Количество культуральной жидкости в аппарате 2 л. Ферментацию провод т при без аэрации. Исходное значение рН 6,0, В течение ферментации значение рН поддерживают на уровне 5,5 добавлением стерильного раствора NaOH. Среда перемешиваетс , скорость оборотов мешалки 200 об/мин. Продолжительность ферментации 36-46 ч, В конце ферментации определ ют концентрацию этанола, количество использованной глюкозы и вычисл ют выход этанола из глюкозы ( у.). Данные, полученные во всех четырех вариантах, в сравнении с известной культурой Zymomonas mobilis СР4 отражены в таблице. Таким образом, предложенный штамм бактерий позвол ет повысить выход этанола и обладает повьпиенной устойчивостью к хранению в полуанаэробных услови х. Экономический эффект от использовани бактериального штамма Zymononas mobilis-113 вместо дрожжей обеспечиваетс за счет уменьшени й.а :хода сьфь на единицу продукции и снижени эксплуатационных расходов ( сокращение длительности ферментации даст снижение расхода энергии и рабочей силы, а также общезаводских затрат). Так как выход этанола при работе с Zymomonas mobilis 0,47 кг/кг, с дрожжами 0,44 кг/кг, то при производстве каждой тонны этанола экономитс 140 кг сахара. Цена сахара мелассы 250 р./т, следовательно только за счет экономии сахара на 1 т спирта достигаетс экономи в размере 35 р. Величина выхода выше теоретически возможной (по данньм прототипа).