SU1106833A1 - Способ выделени микроорганизмов из суспензий - Google Patents

Abstract

1. СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ИЗ СУСПЕНЗИЙ путем пропускани  исследуемого материала над мембраной , сорбции и последующей десорбции микроорганизмов, отличающийс   тем, что, с целью повьппени  сохранности биологической активности целевого продукта, суспензию пропускают над поверхностью мембраны со скоростью тангенциального потока 0,120 см/с при перепаде давлени  на мембране 0,01-1,0 мПа, после сорбции микроорганизмов жидкую фазу удал ют и микроорганизмы десорбируют с помощью тангенциального потока буферного раствора при скорости 20-200 см/с и отсутствии перепада давлени  на мембране или периодической подачи на мембрану импульсов отрицательного давле (Л ни  длительностью 0,01-100 с с интервалом между импульсами 0,1-100 с. 2. Способ по п. 1, отличающийс  тем, что, с целью ускорени  десорбции, поток буферного раствора барботируют.

Description

1 Изобретение относитс  к микробио логии и вирусологии и касаетс  вьделени  микроорганизмов из суспензий. Известен способ разделени  биологических суспензий с помощью процессов фильтрации через пористые мембра ны , 3. Однако пориста  мембрана закупори ваетс  крупными частицам I, задерживает фильтрацию мелких частиц, что снижает производительность этого способа. Известен также способ выделени  микроорганизмов из суспензий путем пропускани  исследуемого материала НаД мембраной, сорбции и последующей десорбции микроорганизмов .23. Однако известный способ не обеспе чивает высокой сохранности биологической активности целевого продукта Целью изобретени   вл етс  повышение сохранности биологической активности целевого продукта. Поставленна  цель достигаетс  тем что согласно способу выделени  микро организмов из суспензий путем пропус кани  исследуемого материала над мем раной, сорбции и последующей десорбции микроорганизмов, суспензию пропускают над поверхностью мембраны со скоростью тангенциального потока 0,1 20 см/с при перепаде давлени  на мембране 0,01-1,0 мПа, после сорбции микроорганизмов жидкую фазу удал ют и микроорганизмы десорбирукгг с помощью тангенциального потока буферного раствора при скорости 20-200 см/с и отсутствии перепада давлени  на мемб ране или периодической подачи на мембрану импульсов отрицательного давлени  длительностью 0,01-100 с с интервалом между импульсами 0,1100 с. Кроме того, с целью ускорени  десорбции, поток буферного раствора барботируют. Способ осуществл ют следующим образом . Биологическую суспензию (БС) пропускают над обычными мембранами со скоростью тангенциального потока (вдоль поверхности мембраны) 0,120 см/с и перепаде давлени  на мембрайе 0,01-1 мПа за счет гидродинамических сил, обусловленных потоком через поры, крупный компонент удержи ваетс  на поверхности мембраны, в то врем  как мелкий компонент частич но фштьтруетс  через поры и частично 331 уноситс  тангенциальным потоком. Дл  полноты осаждени  крупного компонента раствор, прошедший через фильтрующий аппарат, рециркулируют (возвращаетс  в исходную емкость) в течение 1-3 ч. После завершени  процесса посадки часть раствора, содержащую мелкий компонент, сливают, а частицы крупного компонента десорбируют буфером с рН в пределах 6,5-7,5. Дл  этого поток фильтрата перекрывают, тем самым прекращаетс  действие давлени  жидкости на крупный компонент БС. Дл  полноты смыва скорость тангенциального потока буфера увеличивают до 20-200 см/с. Врем  элюции 1030 мин. Проведенные эксперименты показали , что более эффективна  посадка крупного компонента достигаетс  при предварительной очистке исходной БС на фильтре Петр нова, а смыв этого компонента облегчаетс  при применении барабана (введение в буфер пузырьков газа - азот, воздух). Обнаружено также, что повышение скорости фильтрации и прохождени  мелкого компонента в фильтрат достигаютс  в том случае, если на мембрану подаетс  не посто нный, а пульсирующий перепад давлени . Оптимальные результаты достигаютс  при длительности действи  импульсов 0,1-100 с и промежутков между импульсами 0,1-100 с. Импульсы давлени  могут подаватьс  как в направлеНИИ фильтрации, так и обратно ему. Пример 1. Фильтраци  производитс  по схеме, в которой используетс  фильтрационный модуль типа фильтрпресс с рабочей поверхностью 3760 Модуль укомплектован ацетатцеллюлозными мембранами со средним радиусом пор 1000 А (мембраны Биопор производства ВНИИОЧБ). В качестве БС используетс  вируссодержаща  аллантоисна  жидкость (ВЛЖ) с вирусом А (Техас ) . Скорость тангенциального потока ф iльтpyeмoй жидкости на стадии посадки 20 см/с, Др 1 МПа. Смыв вирусных частиц после посадки на мембраны осуществл етс  0,5 М трис-буфером, рН 7,2 при скорости потока буферного раствора 200 см/с. Процесс посадки вируса проводитс  в течение 3ч. Исходный объем ВАЖ 4000 мл. Титр РГА/0,2 исходной ВАЖ 1:1024, содержание белков 2000 мкг/мл (по Лоури). Конечный объем ко цьнтрата (после осадки и смыва буферным раствором.

3.

врем  смыва 30 мин) 400 мл, титр РГА/0,2 концентрата 1:16000, содержание белков 2000 мкг/мл. Сохранение активности вируса (в процентах к исходной ВАЖ) 100%. Увеличение удельной активности (по отношению к исходной ВАЖ) 10 раз.

Пример 1а. Приборное оформление опыта такое же, как и в примере 1.

Фильтрационный модуль укомплектован мембранами Биопор со средним радиусом пор 1000 А. Биологическа  суспензи  - вирус Ньюкасловской болезни (ВНБ). Исходна  активность А 7,5 1/мл. Исходный объем БС 5000 мл. Посадка проводитс  в течение 2,5 ч при скорости тангенциального потока БС 0,07 см/с, йр 0,01 МПа. Смыв вируса после посадки на мембране осуществл етс  0,05 М трис-буфером рН 7,5, при скорости 20 см/с. Конечный объем концентрата (после посад ки и смыва) 490 мл. А концентрата 35 1/мл, А фильтрата 40 1/мл. Электронна  микроскопи  показывает наличие большого количества вирусных частиц в фильтрате. Сохранение активности вируса 47%.

Пример 2. Приборное оформление опыта такое же, как и в примере 1

Фильтрационный модуль укомплектовываетс  мембранами Биопор со средним радиусом пор 2000 А. Биологическа  суспензи  Serracia marcescens штамм В-10, М-1, число клеток 3-10 1/мл, активность по ферменту (эндонуклеазе ) 2000 1/мл (эндонуклеазна  активность А определ етс  методом Мак-Карти). Посадка проводитс  в течение 3,5 ч при скорости тангенциального потока фильтруемой жидкости 100 см/с, Лр МПа. Скорость смыва клеток после посадки на мембрану 200 см/с при рН 6,5. Исходный объем БС 4000 мл. В обесклеточенной жидкости А 2000 1/мл, а электронна  микроскопи  показывает практически полное отсутствие клеток. Сохранение эндонуклеазной активности 100%.

Пример 3. Приборное оформление опыта такое же, как и в примере 1.

Фильтрационный модуль укомплектовываетс  мембранами Биопор со средним радиусом пор 1000 А. Биологическа  суспензи  - вирус Пьюкасловской болезни (ВНБ). Исходна  активность А 7,5 1/мл (А определ етс  по мак068334

симальному разведению при кратности 1:10, обеспечивающей 50% - гибель 10-ти дневных куриных эмбрионов). Исходный объем БС 3500 мл, Посад5 ка проводитс  в течение 3 ч при скорости тангенциального потока БС 0,1 см/с, dp 0,01 Ша. Смыв вируса после посадки на мембране осуществл етс  0,05 М трис-буфером, рН 7,5,

0 при скорости 20,0 см/с. Конечньй объем концентрата (после посадки и смыва) 400 мл, А концентрата 70 1/мл, А фильтрата 1 1/мл. Электронна  микроскопи  показывает отсутствие вируса

5 в фильтрате. Сохранение активности вируса 100%.

П р и М е р 4. Приборное оформление опыта и тип БС такой же, как и в примере 1. Начальный объем БС

0 4000 мл, фильтруетс  через слой фильтра Петр нова со средним размером пор 1-10 мкм. Титр-РГА после такой предфильтрации полностью сохран етс , содержание белков сохра-

5 н етс . Врем  посадки 2,5 ч. Содержание белка в концентрате (после посадки и смыва буфером - услови  опыта такие же, так и в примере 1) 2000 мкг/мл, титр РГА/0,2 концентра0 та 1:16000. Сохранение активности вируса 100%.

Пример 4а. Приборное оформление опыта, мембраны и тип БС такой - же, как и в примере 1а. Начальный

5 объем БС 5000 мл. Исходна  активность А 7 1/мл. Посадка проводитс  в течение 2 ч при скорости тангенциаль .ного потока БС 22 см/с, dp 0,01 МПа . Смыв вируса после посадки на мембраны

0 осуществл етс  0,05 М трис-буфером, рЯ 7,5, при скорости 20 см/с. Конечный объем концентрата (после посадки и смыва 500 мл. А концентрата 40 1/мл, А фильтрата 30 1/мл.

5 Электронна  микроскопи  показывает наличие большого количества вирусных частиц в фильтрате. Сохранение активности вируса 57%.

Пример 5. Приборное оформле5Q ние опыта и биологическа  суспензи  така  же, как в примере 1. Однако в линию фильтрат подключаетс  перистальтический насос с одним роликом. Направление вращени  - навстречу потосе ку фильтрата. В результате периодически (половина времени полного оборота) создаетс  давление в зоне фильтрата, превьшгающее давление над фильтрующей мембраной м, как следствие, поток из

зоны фильтрата проходит сквозь мембрану в зону концентрата.

Таким образом, решаютс  две задачи - очистка пор мембран от примесных частиц (белков) и облегчаетс  смыв крупнодисперсных частиц (вируса) с поверхности мембраны. Программное устройство, управл ющее работой насоса , позвол ет осуществить врем  действи  импульсов давлени  в диапазоне 0,1-100 с и периодичность следовани  импульсов 0,1-100 с.

Результаты концентрировани  такие же,.как и в примере 1. Однако, если в примере 1 проницаемость по воде мембраны в фильтрующем аппарате падае от опыта к опыту в 1,5-2 раза от предьщущей , то в этом случае она практически остаетс  неизменной.

Сохранение активности вируса 100%.

Пример 6. Приборное оформление , тип БС и услови  опыта такие же.

как и в примере 1, только в процессе смыва буферный раствор перемешиваетс  с пузырьками газа (воздух, азот) в объемном соотношении 50%.

Врем  смыва 10 мин. Титр РГА/0,2 концентрата 1:16000, содержание белков 2000 мкг/мл. Выход по РГА (в процентах к исходному ВАЖ) 100%. Увеличение удельной активности (по отношению к исходной ВАЖ) 10 раз. Сохранение активности вируса 100%.

Предлагаемый способ очистки концентрировани  позвол ет сохранить 100% биологической активности выдел емых частиц при степен х концентрировани  до 20-25 раз при отсутствии концентрировани  белка, работать при использовании широкого класса мембран, диамет пор которых подбираетс  исход  из услови  полного задержани  крупнодисперсных частиц.

Claims (2)

1. СПОСОБ ВВДЕЛЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ИЗ СУСПЕНЗИЙ путем пропуска ния исследуемого материала над мембраной, сорбции и последующей десорбции микроорганизмов, отличающийс я тем, что, с целью повышения сохранности биологической активности целевого продукта, суспензию пропускают над поверхностью мембраны со скоростью тангенциального потока 0,120 см/с при перепаде давления на мембране 0,01-1,0 мПа, после сорбции микроорганизмов жидкую фазу удаляют и микроорганизмы десорбируют с помощью тангенциального потока буферного раствора при скорости 20-200 см/с и отсутствии перепада давления на мемб- ране или периодической подачи на мемб рану импульсов отрицательного давления длительностью 0,01-100 с с интервалом между импульсами 0,1-100 с.

2. Способ поп. 1, отличаю щийся тем, что, с целью ускорения десорбции, поток буферного раствора барботируют.

SU „.,1106833