SU1089516A1 - Способ исследовани молока на содержание жира и белка - Google Patents

Abstract

1. СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ МОЛОКА НА СОДЕРЖАНИЕ ЖИРА И БЕЛКА, предусматривающий отбор пробы, экстракцию из нее жира органическим растворителем, введение в обезжиренный раствор химического реактива цп9 получени  цветного комплекса d белком, его последующее фотоколориметрирование и установление значени  оптической плотности, пропорциональной количеству белка в исследуе- мой пробе, отличаюти и с  тем, что, с целью повьшени  точности и обеспечени  возможности одновременного определени  содержани  в исследуемой пробе углеводов, органический растворитель добавл ют к отобранной пробе в соотношении 90:1, затем удал ют осажденный белок из обезжиренного раствора и ввод т в йоследний воду дл  получени  водноорганической смеси с последунщим ее разделением на водную и органическую фазы, причем дополнительно получают цветные комплексы с жирон и углеводаьт путем .введени  реактивов соответствеино в органическую и водную фазы, при этом содержание жира и углеводов определ ют фотоколориметрированием цветных комплексов с жиром и углеводами в зависимости от установленных значений оптической плотности, пропорциональных содержанию жира и углеводов в исследуемой пробе. 2. Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и и с   тем, что в качестве органического растворител  использ пот 00 смесь Фолча, а в качестве реактивов ;о дл  получени  цветных комплексов с СП белком, жиром и углеводами - соответственно биуретовый, сульфофосфо05 ванилиновый и антроновый реактивы.

Description

Изобретение относитс  к биологии и медицине, в частности к способам исследовани  состава женского молока . Известны способы определени  бел ка, жира и углеводов в молоке, пред сматривакицие- определение белка в альбуминометре или с помощью метода Кьельдал , определение жира бутирометрически или путем центрифугирова ни , определение углеводов путем титровани  раствором Бенедикта 1 3. Недостатком указанных способов  вл етс  их невысока  специфичность и точность, значительна  трудоемкость и необходимость в относительн большом количестве молока (5-20 мл) причем каждый нутриент определ етс  в отдельной пробе молока. Это делает невозможным исследование соста ва женского молока указаннь1ми способами в клин 1ко-диагностических j лаборатори х лечеЬно-профилактическ учреждений. Поскольку количество материала (женского молока), которое можно вз ть дл  исследовани  без ущерба дл  ребенка, ограничено, особенно в первые дни лактации из-за малого количества образующегос  молока. Изрестен также способ исследовани  молока на содержание жира и белка, предусматривающий отбор пробы , экстракцию из нее жира органическим растворителем, введение в обезжиренный раствор химического реактива дл  получени  цветного комплекса с белком, его последующее фотоколориметрирован .ие и установление значени  оптической плотности, пропорциональной количесву белка в .исследуемой пробе-С 23. Недостатками такого способа  вл  ютс  неполна  экстракци  жира спиртово-эфирной смесью и недостаточна  точность его определени  весовым методом в сочетании со значительными затратами времени, а также невысока  специфичность химических реакций дл  определени  белка и лактозы, что значительно снижает точность и f - достоверность определени , Цель изобретени  - повышение точности определени  белка и жира в одной пробе молока с одновременным определением в этой же пробе содержани  углеводов. Поставленна  цель достигаетс  тем, что согласно способу исследова .ни  молока на содержание жира и белка , предусматривающему отбор пробы, экстракцию из нее жираорганическим . растворителем, введение в обезжиренный раствор химического реактива дл  получени  цветного комплекса с белком, его последующее фотоколориметривание и установление значени  оптической плотности, пропорциональной количеству белка в исследуемой пробе, органический растворитель добавл ют к отобранной пробе в соотношении 90:1, затем удал ют осажденный белок из обезжиренного раствора и ввод т в последний воду, дл  получени  водноорганической смеси с последующим ее разделением на водную и органическую фазы, причем дополнительно получают цветные комплексы с жиром и углеводами путем введени  реактивов соответственно в органическую и водную фазы, при этом содержание жира и углеводов определ ют фотоколориметрированием цветных комплексов с жиром и углеводами в зависимости от установленных значений оптической плотности, пропорциональных содержанию жира и углеводов в исследуемой пробе. Кроме того, в качестве органического растворител  используют смесь Фолча, а в качестве реактивов дл  получени  цветных комплексов с белком , жиром и углеводами - соответственно биуретовый, сульфофосфованилиновый и антроновый реактивы. Дл  осаждени  белка и одновременного полного извлечени  жира и углеводов из молока примен етс  смесь Фолча (хлороформ:метанол 2:1), которую добавл ют к исследуемой пробе молока в соотношении 90:1, полученную смесь встр хивают и центрифугируют , в результате чего образуетс  белковый осадок и супернатант, содер жащйй жир и углеводы, который отдел ют от .осадка путем добавлени  воды раздел ют на водную и органическую фазы, содержащие, соответственно , углеводы и жир. Смесь Фолча и молоко смешивают в соотношении 90:1, поскольку установленЬ (табл. 1), что при уменьшении количества смеси Фолча не происходит полного осаждени  белка и полной экстракции жира (углеводы экстрагируютс  полностью), а при увеличении количества смеси олча, нар ду с полным осаждением

белка и полной экстракцией жира, наступает нежелательное разведение супернатанта с уменьшением концентрации в нем жира и углеводов.

Наличие белка, жира и углеводов в осадке и супернатанте при различном соотношении смеси Фолча и молока приведено в таблице 1.

Таблиц

+ +

+

+ + + + + Примечание.

К полученному осадку белка добавл ют биуретовьш реактив, к отобранному образцу водной фазы т антроновьй реактив, к отобранному и выпаренному досуха образцу органической фазы серную кислоту и фосфованилиновый реактив. Оптическую плотность полученных при этом цветных комплексов измер ют на фртоэлектроколориметре

На фиг. 1, 2 и 3 показаны графики зависимости измеренной величины оптической плотности от содержани  соответственно белка, жир1а и углеводов .

Дл  определени  количествабелка, жира и углеводов в исследуемой пробе молока используют калибровочные кривые, построенные на основании определени  указанных нутриентов в

+ +

+ ч+ + Ч +

эталонных .растворах: дл  белка - в растворе альбумина с содержанием его 5, 10, 15, 20, 25, 30 г/л .1) дп  жира - в растворе триолеина с содержанием его 10, 20, 30, 40, 50, 60 г/л (фиг. 2) дл  углеводов - в растворе лактозы с концентраци ми 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 г/л (фиг. 3).

. Реактивы, необходимые дл  осуществлени  предлагаемого способа.

1.Смесь Фолча (хлороформ:метанол 2:1),

2.Биуретовый реактив: (- 4,5 г сегнетовой соли (КНаС(.) раствор ют в 40 мл 0,2 н. NaOH, после чего прибавл ют 1,5 г CuSO.5H20 и 0,5 г KI; раствор доливают до 100 мл 0,2 н. NaOH, хран т в темном месте; Наличие белка, жира и углеводов в осадке и супернатанте определ ют: белка - биуретовым методом, жира - сульфофосфованилиновым методом, углеводов - с антроновым реактивом; + - данный компонент в пробе присутствует; - - данный компонент в пробе отсутствует. реактив устойчив в течение 1 мес; S - 0,5% раствор KI в 0,2 н. NaOH. Реактив устойчив 2 недели. Рабочий раствор биуретового реак тива: 20 мл реактива смепшвают с 80 мл реактива S , Хран т в темноте Реактив устойчив 2 недели. 3.Серна  кислота, концентрированна  по Савалю. 4.Фосфованилиновый реактив: 1 ч 0,6%-Hofo водного раствора ванилина смешивают с 4 ч. концентрированной ортофосфорной кислоты. Смесь хран т в посуде из темного стекла при комнатной температуре. 5.Антроновый реактив: к 34 мл в ды приливают 66 мл серной кислоты уд.в. 1,84 охлаждают, добавл ют 50 мг антрона и 1 г тиомочевины, пе ремешивают, нагревают до 80®С. Реа тив устойчив 2 недели в холодильнике в темной бутылке. Пример. В пробирку, содержа щую 4,5 мл смеси Фолча, приливают 0,05 мл молока, тщательно встр хивают в течение 1 мин, центрифугирую при скорости 3000 об/мин в течение 5 мин и супернатант количественно сливают в чистую пробирку. К осадку добавл ют 1 мл биуретового реактива тщательно перемешивают на вихревом смесителе в течение 1 мин и оставл  ют на 30 мин при комнатной температуре дл  развити  реакции и образовани  комплекса сине-фиолетового цвета - после чего провод т фотометрию против бизфетового реактива на фотоэлектроколориметре при зеленом светофильтре в кювете с толщиной

21,0

0,205

0,190 Примечание.

0,260

65,0

54, 7 Величины С (концентрации белка, жира и углеводов) определены по соответствующим калибровочным кривым (фиг. 1, 2 и 3), по ос м ординат которых отложены величины оптической плотности Е, а по ос м абсцисс - концентрации определ емых веществ. 166 рабочего сло  10 мм. В пробирку с супернатантом добавл ют 1,5 мл дистиллированной воды, тщательно встр хивают в течение 1 мин и центрифугируют 5 мин при скорости 1000 об/мин дл  расслоени  на 2 фазы - водную (верхнюю) и органическую (нижнюю). В водйой фазе определ ют содержание углеводов. К 0,2 мл водной фазы прибавл ют 2,3 мл антррнового реактива, перемешивают, став т на 15 мин в водчную баню с температурой воды 100 С, охлаждают и колориметрируют на фотоэлектроколоринетре при красном светофильтре в кювете с толщиной рабочего сло  5 мм. Б органической фазе определ ют содержание жира. 0,2 мл органической фазы перенос т в чистую обезжиренную пробирку, выпаривают досуха при 80 С, добавл ют 0,45 мл концентрированной серной кислоты, тщательно встр хивают пробирку, помещают в кип щую вод ную ёаню на 20 мин, после чего охлаждают, добавл ют 1,75 мл фосфованилинового реактива , тщательно перемешивают и через 1 ч колориметрируют на фотоэлектроколориметре при зеленрм светофильтре в кювете с толщиной рабочего сло  5 мм. Фотометрию проб при определении жира и углеводов провод т против контрольных проб, которые обрабатывают так же, как и опытные, только вместо 0,05 мл молока берут 0,05 мл воды. Примеры определени  белка, жира и углеводов в пробах молока привод тс  в табл. 2. „ Таблица 2

По сравнению с известным прбдлагаемый способ позвол ет повысить точность определени  белка, жира и ;углеводов за счет применени  смеси Фолча, полнее экстрагирующей жир, чем спиртовоЬфирна  смесь, и использовани  высокоспецифичных химических

реакций дл  определени  белка, жира и углеводов, кроме того, количество молока, необходимое дл  определени  белка, жира и углеводов, уменьшено в 40 раз, а врем  определени  сокращено в 3 рала .

Claims (2)

1. СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ МОЛОКА НА СОДЕРЖАНИЕ ЖИРА И БЕЛКА, предусматривающий отбор пробы, экстракцию из нее жира органическим растворителем, введение в обезжиренный раствор химического реактива для получения цветного комплекса с белком, его последующее фотоколориметрирование и установление значения оптической плотности, пропорциональной количеству белка в исследуе·' мой пробе, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и обеспечения возможности одновременного определения содержания в исследуемой пробе углеводов, органический растворитель добавляют к отобранной пробе в соотношении 90:1, затем удаляют осажденный белок из обезжиренного раствора и вводят в Носледний воду для получения водноорганической смеси с последующим ее разделением на водную и органическую фазы, причем дополнительно получают цветные комплексы с жиром и углеводаьи путем введения реактивов соответственно в органическую и водную фазы, при этом содержание жира и углеводов определяют фотоколориметрированием цветных комплексов с жиром и углеводами в зависимости от установленных значений оптической плотности, пропорциональных содержанию жира и углеводов в исследуемой пробе.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а тощи й с я тем, что в качестве органического растворителя используют смесь Фолча, а в качестве реактивов для получения цветных комплексов с белком, жиром и углеводами - соответственно биуретовый, сульфофОсфованилиновый и антроновый реактивы.

η 1089516

1 10895