SU1053832A1 - Способ получени 5-дезоксирибомононуклеотидов - Google Patents

Abstract

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 5--ДЕЗОКСИРИБОМОЯОЯУКЛЕОТИДОВ из дезоксирибонуклеиновой кислоты, включающий ее гидролиз в присутствии нуклеаз при нагревании с последующим йыделенкем цёЛсжого продукта, отличающийс  тем, что, с целью одновременного получени  5 -дезоксирМСоди-и 5 -деэоксирйботринуклеотидов, гидролиз осуществл ют в присутствии нуклеазы, вьшеленной иэ бактерии 6errat4o шагсепэсепз при 25 - , рН 8,1 8,5, времени инкубации 2 - 18 ч. в соотношении исходного сырь  и нуклеазы 1:200. (Л С

Description

Р

Ьп

00 00 SD Изобретение относитс  к полученик биологически активным, веществ, а именно 5 -дезоксирибомоно-, 5-дезо ксирибоди-и 5 -дезоксириботринуклеотидов , которые наход т применение в медицине в качестве лечебных препа ратов и физиологически активных веществ , в научных исследовани х в качестве объектов и инструментов исследовани , в пищевой промьпиленности дл  улучшени  вкуса, придани  аромата м са и повЕзЛпени  питательной ценности р ду растительных пищевьк продук тов., Известен способ получени  5 мон нуклеотидов нуклеиновых кислот, заключающийс  в ферментативном гидро лизе нуклеиновойкислоты, при этом расщепление нуклеиновой кислоты осуествл ют с помощью фосфодиэстераз, выдел емых актиномицетатами в культуральную жидкость в ходе ферментации ij . Однако известный способ не позвол ет получить целевой продукт а высоким выходом и удовлетвор ющей чистотой. Известен также способ получени  5 -дезоксирибонуклеотидов йЭ.дезоксирибонуклеиновых кислот, включающий их гидролиз с помощью нуклеаз, выделенных из печени морских промысловых рыб при ЗТ-с в течение 24 ч, и при рН 7,0 с последующим зьхделением целевого продукта 2 . Известный способ не обеспечивает одновр€2менного получени  5 дезоксирибоконо- , 5 -дезоксирибоди-и 5 -дезоксириботринуклеотидов. Цель изобретени  - одновременное получение 5 -дезоксирибоди-и 5 -дезоксириботринуклеотидов. Поставленна  цель достигаетс  тем, что согласно способу получени  -S-. дезоксирибомононуклеотидов нз дезоксирибомононуклеиновой.кислоты, включающем ее гидролиз в присутствии нукл.еаз при нагревании с последующим выделением целового продукта, .гидролиз осуществл ют в присутствии нуклеазы , выделенной из бaктepии5erfat a тагсевсепа при 25 , рн 8,1-8,5, времени инкубации 2-18 ч и соотношеНИИ исходного сырь  и нуклеазы 1:200 Выделение, фермента из культуральной жидкостиqj6§b3;ife3 flTdfeenAfe/(SBn 211 АТСС-9986 штамм № 24 осуществл ют следующим образом., Культуру выращивают на полусинтет ческой среде в течение 2 су т при в конических колбах с интенсивной аэрацией при перемешивании (на качалках 70-80 об/мин). Посев производ т односуточной культурой из расчета 0,5-1 млн. клеток на 1 мл среды. Сост.ав среды дл  выращивани  % S глицерин 0,5; цитрат аглмони  0,5; KrjHPO 1; MgSQjO ,05;NaCe 0,05 ,006 гидролйзат .казеина 0,1; дрожжевой автолизат 0,3 при рН 7,5, По окончании выращивани  бактериальные клетки удал ют центрифугированием , а из надосадочной жидкости выдел ют нуклеазу с помощью фракцио- нировани  сульфатом аммони  (90% насыщени ) и последунхцей очистки на двух монообменных колонках. Перва  колонка с ДЭАЭ-целлюлозой. Провод т пропускание ферментного раствора (сульфат-аммонийна  фракци  нуклеазы после диализа и центрифугировани ) через колонку, уравновешенную 0,05 М натрий-ацетатным буфером, рН 5,2. При этом весь ферментный белок не задерживаетс  колонкой, на ней остаетс  больша  часть балластных белков, содержащихс  в сульфатамуЮНийной фракции нар ду с нуклеазой . Втора  колонка с фосфоцеллюлюзой. Провод т пропускание ферментного раствора (фракци  после очистки на ДЭАЭ-целлюлозе) через колонку, уравновешенную 0,05 М натрий-ацетатным буфером, рй 5,2. В этих услови х нуклеаза специфически сорбируетс  ионообменником, а больша  часть балластных белков не задерживаетс  колонКОй и выходит .из .нее при-шанесении и последующей промывке буфером Элюци  ферментного белка осуществл етс  О,. М натрий.-ацетатным буфером, рН б,2. В процессе очистки нуклеазы и сульфат амг/1онийной фракции активн-.-::ть фермента контролируют по начальной скорости образовани  кислотораствори,мых продуктов гидролиза дезоксирибонуклеиновой кислоты(ДНК) под вли нием вьщел емой нуклеазы. За единицу, актив .ности принимают количество фермента, которое дает увеличение поглощени  ультрафиолетовых лучей при 260 нм продуктами гидролиза ДНК, растворимыми в 4% НСеО4 , равное 1 оптической единице, в пересчете на 1 мг фермента за 1 ч инкубации при (е,ц/мг/ч, А 260) . Инкуба.ционна  проба объе.мом 1 мл содержит 1 мг ДНК 0,1 К трисНсе буф.ер, рН 8,5; 0,007 М и 0,1 мл ферментного раствора в таком разведении, которое обеспечивает начальную скорость прохождени  ферментативного гидролиза субстрата, П р и М е ;р. Берут 10 мг ДНК тимуса крупного рогатого скота (или из любого другого источника) , раствор ют в 10 мл дистиллированной воды и добавл ют 8 мл 0,25 М тоип-НгЕ.. буфера,рй 8,5, содержащего 0,0175 М N5564. Затем внос -т 0,1 мл раствора фермента, разведенного таким образом, чтобы на 1 мг ДНК в .инкубируемой пробе приходилось 25.00 ц. активности фермента (на 1 мг ДНК внос т 5 мкг нуклеазы, обладающей удельной активностъю 500000). Гидролиз, провод т при 37°С ч или при 25°С 18 ч (при этом соблюдаютс  услови  исчерпывающего гидролиза субстрата в присутствии избыточного количества фермен  ного препарата). По окончании процесса ферментативного гидролиза ДНК гидролизат прогревают при 15 ми дл  инактивации и денатурации фер ментного б€Утка, а по вившуюс  при этом легкую мутность удал ют центрифугированием (5000 об/мин, 15 мин). Разделение смеси 5 -дезоксирибо уклеотидов осуществл ют известным способом, например методом ионообменной хроматографии на колонк.ах. Берут 18 мл гидролизата ДНК, полученного описанньам способом,что составл ет 300 оптических единиц поглощающего ультрафиолетовые лучи при 260 нм материала; и нанос т на ионообменную колонку (2x12 cMj объем 38 мл), содержащую ДЭАЭ-целлюлозу в ацетатной форме, рН 4,7. Колонку промывают дистиллированной водой, затем 7 М мочевиной, приготовленной на натрий-ацетатном буфере, рй 4,6 (в 1 л раствора 7 М мочевины содержитс  ,1 М натрий-ацетатного буфера, рЯ 4,7), до снижени  рН вытекадаего из колонки буфера до 6,2-5,3. По окончании промывки 5 -дезоксйрибонуклеотиды элюируют с колонки в пор дке увеличени  И5 полимерности градиентом возрастающих концеНтрацийКаЙ. Объем градиента (750 мл 7 М мочевины+натрий-ацетат , рН 4,7,+ OMWaC)+(750 мл 7 М мочевины + натрий-ацетат, рН 4,7, + + 0,3 М NaC6).Вытекающий из колонки элюат собирают .по фракци м и анализируют , спек трофотометрически при 60нм. Объем фракции 15 мл, скорост элюции 150 мл/ч, С колонки элюирова но п ть фракций пиков веществ, погло щающих ультрафиолетовые лучи при 260 нм. В элюате в сумме определено 94-97% материала от количества, нане сенного на колонку. При увеличении ионной силы элюирующего раствора до 2 М NaC (после окончани  градиента с колонки не снимаетс  дополнительн материал, поглощак& ий при 260 нм. Кажда  из п ти фракции веществ (в отдель.ности) обессоливаетс  от мочевины и КаССв колонке с ионообменником и подвергаетс  анализу и характеристике. Обессоливание полученного матери ла провод тследующим образом. Фракции, составл ющие каждый пик объедин ют по пикам, развод т 3-5 объемами дистиллированной воды и довод т рН до 8,0. Зат&л каждый пик (в отдельности) пропускают через ДЭАЗ-целлюлозную колонку (в карбона ной форме) . Объем колонки дл  каждо пика под ирают из расчета, что j О,2 ммоль нуклеотидного материала сорбируют на колонку объемом 90 мл. Колонку прог вают большим объемом дистиллированной воды (5 объемов колонки ) , затем 0,02 М карбонатом аммони  (рН 8,4) до отсутстви  ионов хлора в вытекающем буфере (проба с нитратом серебра) . Затем нуклеотиды элюируют с колонки .0,7 М карбонатсм аммони  (рЯ 8,4), Обессоленный элюат нуклеотидных фракций концентрируют под вакуумом на роторном испарителе при температуре вод ной баки не выше 30°С (или лирфи-льно высушивают) . К сухому остатку добавл ют небольшой объем воды (3-5 мл) и снова высушивают тем же Образом. Процедуру повтор ют до.прлиого удалени  карбоната аммони  fo6tratHo 3 раза) . Обессоленные фракции идентифицируют по пор дку элюции и ионной силе сн ти  каждой фракции с колонки, по отношению онцевого фосфата к общему фосфору, по снижению отношени  вели-, чины оптической плотности при 260- нм (Е) к фосфору (Р) с повышением длины алигбнуклеотида, по спектрам поглетце .ни  в .ультрафиолетовой области, (220 - 300 нм) ; . по наличиючдезоксирибозы в ка одом пике, определ емом с дифениловым реактивом. Результаты анализа материала, злюиррванного с ДЭАЭ-целлюлозы при хроматографическом разделении гидролизата ДЯК, полученного с помсщью нуклеазы5егга 4о mercescens; штамм 24, приведены в таблице. Результаты, аналогичные приведенным в таблице, получают при гидролизе 1 г, а также 10 г ДНК при соответствующем увеличении объемов инкубационной смеси и количества нуклеазы, используемой дл  фермент ативного расщеплени  субстрата, а также при соответствующем у.аели ениИ объёма колонки с ионообменником, используемым дл  фракционировани  гидролизат.а ДЙК и объемов всех рабочих буферных растворов. . Идентичные результаты получены на всех испытанных препаратах ДЯК отечественного производства, возможно широкое применение предлагаемого способа получений 5 - дезоксирибонуклеотидов в промьплленкых масштабах с использованием в качестве субстра .та ДНК отечественног о производства . / Полученные в результате хроматографического разделени  гидролизата ДНК., на ДЭАЭ-целлюлозе фракции, пред .ставл ющие собой смеси моно-, ди-и тринуклеотидо1В,при необходимости мргут быть легко разделены на индивидуальйые компонёнть BHyTJift каждой фрак .ции с помс цью ионообменной хроматог

графии наi Дауэксе в известных услови Зс . Кроме того, фракции ди-и три .нуклеотидов могут быть подвергнуты ферментативному гидролизу в известных услови х с целью получени  из них индивидуальных мононуклеотидоз.

Из приведенных данных следует, что использование з -эндонуклеазы erralia marcenscen, штамм 24 дл  гидролиза промышленных препаратов ДНК с целью получени  5-дезоксирибонуклеотндов по предлагаемому способу экономически выгодно, так как указанную нуклеазу выдел ют из культуральной жидкости бактерийSerratfа tnat-ces ens штамм № 24, который  вл етс  дверхпродуцентом данного фермента. Благбдар  чрезвычайно высокой продуктивности данных бактерий гарантируетс  получение в больших количествах препарата нуклеазы, активность которого в 20 и более раз превосходит активность препарата панкреатической 5 ДНКазы. Высока  активность нуклаsySetraliamarcesoens , штамм 24(.

(500 тыс.СП. ед/мг) позвол ет использовать очень малые количество фермента дл  гидролиза ДНК (на 1 г ДИК расходуетс  2,5 млн ед. активности, что составл ет около 5 мг ДНКазы), а гидролиз проводить в экономически рентабельных услови х и пол чать высок очистный целовой продукт с высоким выходом.

0 Суммарный выход отдельных «зоплит 5 -дезоксирибонуклеотидов, полученных по предлагаемому, с пособу, составл ет 95-98% от количества кислоторастворимого материала гидролизата

(80-85% составл ют индивидуальные фракции, а 15-20% содержитс  в зонах перекрыти  пиков при их разделении на ионообменниках). Фракции 5 -дезоксирибонуклеотидов характеризуютс  высокой чистотой и гомогенностью, о чем свидетельствует симметричность пиков при монообменной хроматографии , а также результаты спектрального и химического анализа фракций.

320,3 49,2-65,4 9,989: 1,12

425,6 71,8-87,7 8,205 1,98

527,0 94,2-116,6 7,782 3,21

5-мононуклеотиды 5 -динуклеотиды

5 тринуклеотиды

Claims (1)

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 5 ' · -ДЕЭОК- СИРИБОМОНОНУКЛЕОТИДОВ из дезоксирибонуклеиновой кислоты, включающий ее гидролиз в присутствии нуклеаз при нагревании с последующим выделением цепового продукта, отличающийся тем, что, с целью одновременного получения 5 ’ -дезоксирйбоди-и 5^f -дезоксирйботринуклеотидов, гидролиз осуществляют в присутствии нуклеазы, выделенной из бактерии Serratia пкягсепэсепБ» при 25 - 37°C, pH 8,1 - 8,5, времени инкубации 2 - 18 ч. в соотношении исходного сырья и нуклеазы 1:200.

   >