SU1048705A1 - Аналог Энкефалина,обладающий пролонгированной анальгетической активностью - Google Patents

Description

Изобретение относитс  к. новому биологически активному соедииению аналогу энкефа шна, обладающему про лонгирован«ой анальгс тической актив ностью, которое может иай1« примене ние в медшщ е Известны природные метионин- и лейцин - знкефади ы Н Туг GlyGly-Phe-Het Ш и Н llyr - Gly-GlyPhe-Leu ОН, соответственно 1} I , про вл ющие мор гноподобную активность в отштах на спехщфических модел х опиатного рецептора и подавл шф{е стереоспе1ц 4 1ческ6е св зыва .вне с рецепторе опиатного антагониста налоксона в гомогенатах мозга Однако известные метионин- и лей Щ1Н - энкефалины про вл ют слабую и кратковременную (5-15 мин) анальгезио при внутрижелудочковом ёведении в мозг мыши 2J и не активны при внутривенном, пероральном и других способах введени . Наиболее близким но химической структуре к описываемому соединению  вл етс  аналог знкёфалина - (D Arg ) лейцинэнкефалин, про вл н ций анальгетическую активность при внутримозговом введении. При внутри венном введен1Ш зтоТ аналог анальгезией не обладае 3J . изобретени  - расширение ар сенала средств воздействи  на живой организм. Поставленна  цель достигаетс  описываемым аналогом знкёфалина формулы H-Tyr-D Arg - Gly - Phe ОН, обладающим пролонгированной анальге тической активностью. (D-Arg2, дез-L eu) - энкефалин синтезирован известными методами пептидной химии в растворе согласно приведенной схеме с использованием качестве конденсирующего агента дициклогексилкарбодиимида (ДСС), а та же пентафтррфениловых эфиров третбутипоксикарбонипаминоКИслот . Гуани динова  функци  D-аргинина была защшцена нитрогрунпой, гидроксил тиро зина-бензильшда ра дикалом. Карбоксильную группу глицина защищали этерификацией. Вос-группы в синтезе пептида удал ли 50%-ным раствором трифторуксусной кислоты (TFA) в хлористом метилене. Нитро- и.бензильную защиты снимали каталитическ гидро г е ноЛИЗ ом. схема синтеза, приведена на чертеже. П р им ё р. Дл  синтеза (D-Arg, дез-L ей )-энкефалина используют аминокислоты и их производные фирмы Reanal (Венгри ). .Все аминокислоты кроме D-аргинина имеют 1-конфигурацию . Температуру плавлени  веществ определ ют в капилл ре (без коррекции ) . Индивидуальность промежуточных соединений контро,лируют с помощью тех на пластинках Silufо1 (ЧССР) в следуют их системах растворителей: хлороформ-зтанол-уксусна  кислота, (АсОй), 85:10:3 (А), н-бутанол-пйридин-AcOH-HjO , 15:10:3:6 (В), н-бутанол-AcOH-HjO , 4:1:1 (С). Аналог энкефалина хроматографируют на пластинках фирмы Meek в системах: хлороформ-метанол- АсОН-Н О, 30:20:4:6 (Д). Удельное оптическое вращение пептидов измер ют на пол риметре Регkin-Eiffler 141 С (ФРГ). Кислотный гидролиз Провод т в запа нных ампулах в 6 Н. сол ной кислоте при 120 С в те сение 24 ч. Аминокислотш 1Й состав определ ют на анализаторе Ieol-3. Дл  всех соединений данные элементного анализа удовлетворительно совпадают с вычисленным содержанием С, Н, N, Этиловый зфир N-трет-бутилоксикарбонил-N -нитро-В-аргинилглицина (1). К раствору 6,38 г (20 ммоль) N -трет-бутилоксикарбойнл-М -нитроD-аргинина и. 3,24 г (24 миоль). 1оксибензотриазола в 20 мл диМетилфосмамида () при охлаждении до прибавл ют 4,12 г (20 ммоль) дициклогексилкарбодш1мида (ДОС) в 8 мл ДМФА, перемешивают 3 ч при , затем добавл ют 3,07 г (22 у моль) зьтилового зфира глицина гидрохлорида, 3,08 мл (22 ммоль) трИзтиламина и перемешивают 24 ч пщ . Реакционную массу разбавл ют зтипацетатом и водой (до разделени  слоев). Этилацетатный;слой отдел ют и пршьшают. последовательно 5%-ным растворе KHSO, 5%-ным раствором NaHCOj, водой, насыщенным раствором NaCl, сушат над безводным Na SO. Растворитель отгон ют, остаток пеJ}eкpиcтaллизoвывaют из зтилацетата. Выход: 6,24 г(77%), т.пл. 119°С (разм гчаетс  при ) , -13,5° (с 1, ДМФА); ,68 (В). Этиловый эфир N-трет-бутило.ксикарбонил-О-бензил-Ь-тирозил-Н -нитpo-D-аргинилглицина . 4,04 г (10 ммоль) дипептида (1) раствор ют в 15 мл 50%-ного раствора TFA в дихлорметане и выдерживают 30 мин. Растворитель отгон ют, оста ток растирают с эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе над КОН. Получают 4,01 г (96%) трифторацетата (II), ,48 (В). 2 г (5 ммоль) трифторацетата (II раствор ют в 10 мл ДМФА, охлаждают до -5°С и при перемешивании добавл ют 0,7 мл (5 ммоль) триэтиЛамина в 2 мл ДМФА и 2,46 г (5 ммоль) п-нитро фенилового эфира Ы-трет-бутилоксикар бонш1-0-бензил-Ь-тирозина, растворен ного в 10 мл ДМФА. Смесь выдерживают 1 ч при , 24 ч при о С и еще 24 ч при комнатной температуре. Зате реакционную массу выливают в 500 мл воды со льдом, вьщелившеес  в осадок вещество отфильтровывают. Осадок раствор ют в этилацетате и промывают 5%-ным раствором KHSO, водой, 5%-ны раствором KHCOj, водой, насьщенным раствором NaCl и высушивают над безводным NajSO. Растворитель отгон из этилацетата. Получают этиловый эфир Ы-трет-бутилоксикарбоннл-О- бензил-Ь-тирозил-С-нитро-Ц-аргинилглицина Вьвсод: 1,77 (54%) трипептида (III Т.Ш1. 162-164°С, , (с 1, ДМФА); R 0,65(А).. N-трет-бутилоксикарбонил-О-бензил Ь-тирозил-Н -нитро-В-аргинилглицин (IV). 0,66 г (1 ммоль) трипептида (III) раствор ют в 15 мл метанола, прибавл ют 1 н. раствор NaOH до рН 10-11 и вьщерживают несколько минут до окончани  гидролиза (хроматографический контроль). Отгон ют растворитель, добавл ют воду и под- кисл ют 1 н НС1 до рН 3. Выпавший осадок отфильтровывают и хроматографируют на колонке с силика гелем в системе хлороформ-этанол-этилацетатAcOH-HjO , 85:5:8:2:0,25. Получают 0,34 г (54%) трипептида (IV), т.пл. , ,5 (с 1, ДМФА); ,60 (С). N-трет-бутилоксикарбоншт-О-бензил-l-тиpoзил-N -нитpo-D-аргинил- глицил-Ь-фенилаланин. 3,15 г (5 ммоль) трипептида (IV) раствор ют в 10 мл этилаЦетата, охлаждают до и при перемешивании добавл ют 1,01 г (5,5 ммоль) пентафторфенола и 1,13 г (5,5 ммоль) ДСС, растворенных в этилацетате. Через 2 ч смесь охлаждают до -10 С, выпавшую дициклогексилмочевину отфильтровывают , растворитель отгон ют , маслообразный остаток растирают с гексаном до затвердени . Получают 3,54 г пентафторфенилового эфира (V), ,90 (С). . 0,73 г (4,45 ммоль) L-фенилаланина (VI) раствор ют в 6 мл ДМФА и при перемешивании добавл ют 0,62 мл (4,45 ммоль) триэтиламина в 2 мл ДМФА и 3,54 г (4,45 ммоль) пентафторфенилового эфира (у), растворенного в 4 мл ДМФА. Реакционную массу перемешивают несколько часов, ДМФА отгон ют при 40 С, остаток раствор ют в этилацетате и обрабатывают аналогично соединен1ло (III). Продукт, полученный после отгонки раствори- тел , хран т в эксикаторе. Получают К-трет-бутилоксикарбонил-О-бензил-Ьтиррзил-С-нитро-D-аргинил-глицил-Lфениланин (VJ.I). Выход: 1,43 г (41,5%) защищенного тетрапептида (VII), ,27 (А, Merk). Ь-тирозил-1)-аргинил-глицил-Ьфенилаланин . 0,320 г (0,412 ммоль) тетрапептида (VII) раствор ют в 6 мл 50%-ного раствора TFA в дихлорметане и вьщёр- живают в течение 30 мин. Раствор упаривают, остаток растирают с эфиром , сушат в вакуум-эксикаторе над КОН. Получают 0,300 г трифторацетата тетрапептида (VIII) ,61 (Д). К раствору 0,300 г (0,380 ммоль) соединени  (VIII) в 5 мл метанола добавл ют палладиевую чернь, 0,2 мл уксусной кислоты и гидрируют 6 ч при 20 С. Катализатор отфильтровывают , фильтрат упаривают досуха, остаток растирают с эфиром, отфильтровывают , промывают эфиром на фильтре , сушат над КОН в вакууме. Полученный продукт (0,250 г) очищают на КМ-целлюлозе (СМ-32, фирма Whatman) в аммоний-ацетатном буфере (г адиентное элюирование). Поглощение раствора измер лось при 206 и 254 нм (Uvicord-III , I КБ, Швеци ). Соответствуювще фракции собирают и лиофилиз ют. Получают L-тирозил-Р-аргинил-гли цил-Ь-фенилаланин ,(1Х). -Выход: 0,135 г (52%) тетрапептида энкефал на (IX), .+46,6° (с 1, н АсОЙ); ,4 (Д); ,5 (В) аминокислотного анализа удовлетворительны . Биологическа  активность (D-Arg дез-L eu)-энкефалина была исследована в cMtoTax in vivo по методу Ueda Н. at al. В работе использованы беспород . ные мьпви-самцы массой 20 г. Исследуемое вещество, растворенное в стерильном физиологическом растворе, ввод т при помощи 1-образной иглы в cisterna Hiagna мозга неанестезирован ным мышам в количестве 10 мкл. Был исследован диапазон доз: 0,05 100 ,0 мкг/жив. Контрольным животным ввод т to мкл стерильного физиологического раствора. Кажда  экспериментальна  группа состоит из 10 мьшей. Анальгетический эффект описываемого соединени  оценивайт по тесту tail pinch при помощи артериального зажи ма, накладьшаемого на основание хвоета . Определениеболевой реакции провод т через 5, 15, 30, 60, 90 мин после введени  и затем каждые 30 мин до исчезновени  анальгетической реакции. Результаты выражают альтернативным методом в проценте мышей, показавших анальгетическую реакцию. При вычислении ЕД (эффективна  доза исследуемого Вещества, котора  вызывает нальгетический эффект у 50% подопытных  йивотных) использзпот метод Литчфилда и Уилкоксона. Анальгетическа  активность исследованных соединений приведены в табл. 1, 2 и 3. Как видно . 1, 2 и 3 ( D-Arg , дез-L )-энкефалин обладает выраженной анальгетической активностью . Максимальный эффект наблю даетс  на 5-30 мин после введени . Днальгетическа  активность описываемого аналога энкефалина значительно превышает активность природных энкефалинов . (1,2) и в 12 раз превышает анальгетическую активность прототипа - (1)-Аг§)-лейцинэккефалина (3), а также в 4 раза превышает анальгезию морфина на мол рной основе (см. табл. 1). Более того, описывае мый аналог энкефалина в отличи своего структурного аналога акпшен при знутривенном введении (ЕД5.. 19,0 мг/кг). . Характерной особенностью синтезированного аналога  вл етс  значительна  пролонгаци  анальгетического эффекта . Продолжительность анальгетической реакции при ,g Jсоставл ет 1,5 ч против 15 мин у энкефалинов или, например, 30 мин у известного аналога энкефалина с длительным действием - (D-Ala)-метионинэнкефалинамвда . Описьшаемое соединение в дозе 25 мгк/животное вызывало анальгезию 88% в течение 5 ч при интрацистернальном введении, при внутривенном введении дозы 130 мг/кг продолжительность анальгезии превышала 6,5 ч. Токсических  влений при этих дозах не наблюдалось . Поскольку анальгетическа  активность описьшаемого аналога энкефалина была исследована в.диаг азоне доз от ,0,05 до 100 мкг/животное, то на основании этих данных (см. табл. 3) была вычислена эффективна  доза (ЕД5.р) ,. составивша  0,44 нмоль/животное или 0,3 мкг/жи-. вотное. Из данных т&блицы видно, что токсические признаки соединени  начинают про вл тьс  в дозах, превышающих эффективна в 333 раза . 100 мкг/животное ч ( ) следовательно, 0,3 мкг/животное терапевтический индекс ДЦ j. () составл ет в.еличину большую чем 333, и  вл етс  достаточно безопасным интервалом дл  лекарственного средства. Интервал между дозой, вызывающей минимальный анальгетический эффект, и дозой, вызывающей первые признаки токсичности (терапевтическа  широта), также достаточно велик. Он составл ет оппл / 100 мкг/животное -. 2000 (тгтТс7 ) что так0 ,05 мкг/животное же  вл етс  бозопасньм дл . лекарственного средства. Проведенные исследовани  показали что описьшаемый (D-Arp дез-Leu)энкефалин может найти применение в медицине в качестве анальгетика, f пролонгированным де ствием. Анальгетическа  активность энкефалина при интрацистернальном введении мьшам Таблица 1 и его аналогов (метод tail pinch)

1) ЕД - эффективна  доза, вызывающа  реакцию у 50% подопытных животных.2 ЕДьо-вр

3)в работе использовалс  морфин-гидрохлорид производства Ташкентского ХФЗ,

Анальгетическа  активность (D-itrg , дез-Ьеи-) энкефалинов при внутривенном введении мьшгам (метод tail pinch)

Таблида2

О

100% анальге зи  100% держалась более 6,5 ч Анальгетическа  активность (D-Arg, интрацистернальном введении

Соединение

, г, 5D-Arg - дез Leu

энкефалин

60% - анальгези  (6 мьш1ей из 10 показали анальгезию)

20% -.летальный исход (2 мыши из 10 умерли на 5-ой мин после введени ) ТаблицаЗ дез-Ьеи) энкефалина при мышам