SK80897A3

SK80897A3 - High purity n-(4-£n,n-bis(2-iodoethyl)amino|phenoxycarbonyl)-l- -glutamic acid

Info

Publication number: SK80897A3
Application number: SK808-97A
Authority: SK
Inventors: David W Heaton; Susan Dines; Robert I Dowell
Original assignee: Zeneca Ltd
Priority date: 1994-12-23
Filing date: 1995-12-21
Publication date: 1997-11-05
Also published as: JPH10511383A; GB2309031B; AU4270096A; NO972883D0; TR199501625A2; CN1171100A; ZA9510936B; US5981791A; HUT77288A; BR9510463A; FI972630A0; GB9426133D0; IL116510A0; DE69518439T2; TW382632B; PL320880A1; NO972883L; FI972630A; GB2309031A; GB9708977D0

Description

Kyselina N-(4-[N,N-bis(2-jódetyl)amino]fenoxykarbonyl-L-glutámová s vysokou čistotou

Oblasť techniky

Vynález sa týka známeho profarmaka použiteľného v protilátkou riadenej terapii, pri ktorej sa z profarmaka uvoľňuje liečivo pôsobením enzýmu (Antibody Directed Enzýme Prodrug Therapy - ADEPT), v novej vysoko vyčistenej forme a novej soli tohto profarmaka, farmaceutických prostriedkov a spôsobov prípravy tejto soli.

Doterajší stav techniky

Profarmakum, kyselina N-(4-[N,N-bis(2-jódetyl)amino]fenoxykarbonyl-L-glutámová, bolo opísané 3. februára 1994 v medzinárodnej patentovej prihláške WO 94/02 450, viď príklad 33, kde je opísaná soľ s trifluóroctovou kyselinou (TFA soľ), ktorá sa pripraví vo forme gumovitej látky. Táto gumovitá forma profarmaka sa nedá dobre vyčistiť, pretože sú známe ťažkosti pri spracovaní zlúčenín gumovitého typu. Nikde sa neopisuje soľ tohto profarmaka s jodovodíkovou kyselinou alebo toto profarmakum ako také s vysokou čistotou.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je kyselina N-(4-[N,N-bis(2-jódetyl)amino]fenoxykarbonyl-L-glutámová v podstate čistej forme. Výrazom ”v podstate čistá forma sa rozumie profarmakum s čistotu aspoň 95 % (výhodne s čistotou aspoň 96 %, výhodnejšie s čistotou aspoň 97 %, ešte výhodnejšie s čistotou aspoň 98 %) vo vzťahu k reakčným prímesiam, vrátane rozpúšťadiel, zanesených z akejkoľvek syntézy profarmaka. Tieto vysoké hodnoty čistoty je možné dosiahnuť iba podľa tohto tu opísaného vynálezu soli profarmaka s kyselinou jodovodíkovou, ktorú je možno pripraviť v kryštalickej forme. Kryštalická forma profarmaka umožňuje ľahko získať profarmakum vo vysoko čistom stave, pretože túto soľ je možné účinne oddeliť od reakčnej zmesi a premyť rozpúšťadlom na odstránenie znečisťujúcich látok, vrátane rozpúšťadiel zo syntetického postupu. Výhodne sa v podstate čisté profarmakum získa v suchej forme zmiešané s pufrom vhodným po zriedení na intravenóznu aplikáciu.

Ďalej je podstatou vynálezu soľ kyseliny N-(4-[N,N-bis(2- jódetyl)amino]fenoxykarbonyl-L-glutámovej s kyselinou jodovodíkovou. Výhodne je táto soľ v v podstate čistej forme. Výhodne je soľ kyseliny N-(4-[N,N-bis(2-jódetyl)amino]fenoxykarbonyl-L-glutámovej s kyselinou jodovodíkovou v kryštalickej forme. Výhodne má táto kryštalická forma teplotu topenia 142 až 145°C Výhodne má kryštalická forma rôntgenové práškové difrakčné spektrum v podstate také, ako je uvedené na obr.2.

Táto soľ má nasledujúce výhody: dobrú tepelnú stabilitu, ľahšiu syntézu a čistenie, pretože je túto soľ možné účinne oddeliť z reakčnej zmesi, zvýšenú čistotu a znížené hygroskopické/delikvescenčné vlastnosti, ktoré uľahčujú ďalšie spracovanie.

I keď nie je nutné sa viazať teoretickými úvahami, predpokladá sa, že prítomnosť Hl nejako pomáha zvrátiť degradáciu profarmaka v oblasti N-alkylovanej časti molekuly. Predpokladá sa, že tieto produkty odvodené od aziridénového medziproduktu môžu vznikať pri skladovaní alebo tepelnom zaťažení, ak je profarmakum skladované v suchom stave. Hl soľ profarmaka je výhodne stabilná, ak je rozpustená vo vodnom roztoku, snáď následkom in situ uvoľňovaného jodidového iónu. Odborníci v danom odbore by pravdepodobne na farmaceutické použitie (jediné známe použitie) nepridávali k tomuto profarmaku vysoké koncentrácie Nal, vzhľadom na farmaceutické účinky týchto zlúčenín ako takých.

Ďalej je podstatou vynálezu farmaceutický prostriedok obsahujúci kyselinu N-(4-[N,N-bis(2-jódetyl)amino]fenoxykarbonyl-L-glutámovú v v podstate čistej forme a farmaceutický prijateľný nosič.

Výhodný prostriedok sa dodáva v suchej forme. Výhodným nosičom je pufor, hlavne hydrogénuhličitan sodný. Výhodne je prostriedok rekonštituovaný krátko pred použitím ako ADEPT zložka, a to sterilným riedidlom.

Ďalej je podstatou vynálezu dvojzložkový farmaceutický prostriedok, ktorý spočíva v tom, že obsahuje ako prvú zložku sol kyseliny N-(4-[N,N-bis(2-jódetyl)amino]fenoxykarbonyl-L-glutámovej s kyselinou jodovodíkovou v suchej forme a ako druhú zložku sterilné riedidlo. Výhodne je sol obsiahnutá v kryštalickej forme.

Ďalej je podstatou vynálezu spôsob prípravy soli kyseliny N- (4- [N, N-bis (2-jódetyl) amino ] fenoxykarbonyl-L-glutámovej s kyselinou jodovodíkovou, ktorý spočíva v tom, že a odstránia ochranné skupiny v zlúčenine všeobecného vzorca I

O

PH (I) kde Pr a Pr2 sú ochranné skupiny (výhodne sú Pri a Pr2 terc-butylesterové skupiny alebo trimetylsilylové skupiny, najmä trimetylsilyl). Odstránenie ochranných skupín sa výhodne uskutočňuje v kyslých podmienkach v inertnej atmosfére v prítomnosti kyseliny jodovodíkovej, čím vznikne soľ kyseliny N- (4- [ N, N-bis (2- jódetyl) amino ] f enoxykarbonyl-L-glutámove j s kyselinou jodovodíkovou. Výhodne sa odstránenie ochranných skupín uskutočňuje v prítomnosti aprotického rozpúšťadla, výhodne dichlórmetánu alebo toluénu, najmä dichlórmetánu. Výhodne prebieha odstránenie ochranných skupín v dvoch stupňoch, pri ktorom sa skupiny Pri a Pr2 nahradia inými ochrannými skupinami Pr3 a Pr4, avšak je možné tiež uvažovať o jednostupňovom odstránení ochranných skupín kyselinou jodovodíkovou. Vý hodne sa na dvojstupňové odstránenie ochranných skupín zlúčenina všeobecného vzorca I nechá reagovať s jódtrimetylsilánom (TMSI). Skupiny Pr3 a Pr4 sú výhodne trimetylsilylové ochranné skupiny (TMS), ktoré sa potom výhodne odstránia v kyslých podmienkach, výhodne s obsahom zárodočného kryštálu. Dvojstupňové odstránenie ochranných skupín sa uskutočňuje tak, že prvý stupeň všeobecne trvá 30 minút až 24 hodín, najmä 4 až 6 hodín, a druhý stupeň trvá všeobecne 1 až 48 hodín, výhodne 12 až 18 hodín, pri laboratórnej teplote (15 až 30°C). Na kryštalizáciu je dôležité dôkladné miešanie, výhodne počas aspoň 14 hodín (najmä aspoň asi 18 hodín), výhodne pri teplote miestnosti.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 znázorňuje syntetický postup prípravy soli profarmaka kyseliny N-(4-[N,N-bis(2-jódetyl)amino]fenoxykarbonyl-L-glutámovej s kyselinou jodovodíkovou a obr. 2 znázorňuje rontgenové práškové difrakčné spektrum soli profarmaka kyseliny N-(4-[N,N-bis(2-jódetyl)amino]fenoxykarbonyl-L-glutámovej s kyselinou jodovodíkovou v kryštalickej forme.

Predložený vynález je ďalej bližšie ilustrovaný nasledujúcimi príkladmi, ktoré jeho rozsah nijako neobmedzujú.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Príprava soli kyseliny N-(4-[N,N-bis(2-jódetyl)amino]fenoxykarbonyl-L-glutámovej s kyselinou jodovodíkovou (viď obr. 1)

Diterc-butylester kyseliny N-(4-[N,N-bis(2-jódetyl)amino]fenoxykarbonyl-L-glutámovej vzorca 5 (5)

(25,9 g) sa rozpustí v dichlórmetáne (17 ml) v atmosfére dusíka pri laboratórnej teplote. K tomuto roztoku sa pridá jódtrimetylsilán (26,2 ml) a reakčná zmes sa mieša počas 4 až 6 hodín. Po skončení reakcie sa roztok pomaly naleje do zmesi dietyléteru (834 ml) a kyseliny octovej (43 ml), ktorá výhodne obsahuje zárodočné kryštály výsledného produktu (prvýkrát dodané ešte počas reakcie). Vzniknutá suspenzia sa nechá miešať počas 18 hodín pri laboratórnej teplote, čím sa získa kryštalická forma. Na dosiahnutie kryštalizácie je dôležité dlhé miešanie. Žiadaný produkt, soľ kyseliny N-(4-[N,N-bis(2-jódetyl )amino]fenoxykarbonyl-L-glutámovej s kyselinou jodovodíkovou zlúčenina vzorca 6

(6) v kryštalickej forme sa odfiltruje, premyje dietyléterom (2 x 150 ml) a vysuší sa vo vákuovej sušiarni do konštantnej hmotnosti. Hmotnosť produktu 22,1 g. Teplota topenia 142 až 145°C (rozkl.), optická otáčavosť [ot]D^2S -21,1° (c = 1, dimetylformamid),

NMR (DMSOd_e): S 7,93 (d,lH), 6,91 (d, 2H), 6,63 (d, 2H), 4,0 (m, 1H) 3,69 (t, 4H), 3,28 (t, 4H), 2,33 (m, 2H), 2,0 (m, 1H),

1,8 (m, 1H).

¹³C chemické posuny (vzhladom na DMSO pri 39,6 δ): 3,9, 52,9, 143,0, 112,1, 122,6, 142,0, 154,9, 53,2, 26,1, 30,1, 173,6,

173,2,.

Elementárna analýza pre C H I N O .Hl

2 O 2 2 6 j nájdené: 26,9 % C, 3,1 % H, 3,8 % N, 52,7 % I teória: 26,7 % C, 3,0 % H, 3,9 % N, 52,9 % I

Diterc-butylester kyseliny N-(4-[N,N-bis(2-jódetyl)amino]fenoxykarbonyl-L-glutámovej vzorca 5 sa pripraví nasledujúcim spôsobom.

a) Príprava kyseliny N-(4-nitrofenoxykarbonyl)-L-glutámovej vzorca 1

H O

Kyselina L-glutámová vzorca b

(b) (73,6 g) sa suspenduje v dvojlitrovej banke v dichlórmetáne (750 ml) v atmosfére dusíka. V jednej dávke sa pridá N, N-diizopropyletylamín (193,9 g) a potom počas 20 minút sa pridá chlórtrimetylsilán (135,8 g) pričom sa teplota reakčnej zmesi udržiava pri teplote varu alebo pod touto teplotou (viď. poznámka 1). Po skončení pridávania sa reakčná zmes zohrieva do varu pod spätným chladičom počas 1,5 hodiny a potom sa ochladí na 1°C a získa sa bis-trimetylsilylester (TMS) L-glutámovej kyseliny.

V čistom suchom tro j litrovom reaktore sa v atmosfére dusíka rozpustí p-nitrofenylchlórformiát vzorca a

(a) (100,8 g) v dichlórmetáne (375 ml) a roztok sa ochladí na -3°C. Počas 15 minút sa potom pridá vopred pripravený roztok bis-TMS esteru kyseliny L-glutámovej, pričom teplota sa udržiava pod 10°C. Po skončení pridávania sa zmes mieša počas 15 minút a potom sa ochladí na asi 5°C. Pripraví sa roztok zriedenej HC1 z vody (750 ml) a koncentrovanej HC1 (148 ml). K tomu sa potom počas 15 minút pridá dichlórmetánový roztok, pričom sa teplota udržiava okolo 20°C. Po skončení pridávania sa zmes mieša pri 20°C počas 30 minút a potom sa nechá 30 minút usadzovať, čím sa získajú tri vrstvy. Vrstva pri dne sa odpustí a vyleje a produkt sa extrahuje dvakrát metylizobutylketónom (MIBK, 1000 ml, 50 ml). Obidve organické vrstvy sa spoja, premyjú sa nasýteným NaCl (250 ml) a rozpúšťadlo sa odstráni pri zníženom tlaku (teplota kúpela 40°C) a získa sa biela pevná látka. Tento produkt sa rozpustí v etylacetáte (600 ml) pri teplote 40°C, potom sa pridá hexán (600 ml), zmes sa ochladí na 20°C počas miešania, potom sa mieša cez noc a potom sa izoluje filtráciou. Žiadaný produkt 126 g (výťažok 77 %) sa premyje zmesou etylacetátu a hexánu 1 : 1 (300 ml), potom sa vysuší pri 50°C do konštantnej hmotnosti.

Poznámka 1

Pridávanie chlórtrimetylsilánu spôsobuje zvýšenie teploty od 13°C do 40°C, ak sa neuskutočňuje chladenie.

Charakterizácia zlúčeniny:

NMR (DMSOd₆): 8 8,45 (d, 1H), 8,25 (d, 2H), 7,4 (d, 2H), 4,07 (m, 1H) 2,35 (m, 2H), 2,05 (m, 1H), 1,85 (m, 2H).

b) Príprava diterc-butylesteru kyseliny N-(4-nitrofenoxykarbonyl)-L-glutámovej vzorca 2

Produkt zo stupňa a) vzorca 1 (2120 g) sa vloží do stolitrového reaktora a pridá sa metylizobutylketón (24 1). Vzniknutá suspenzia sa zohrieva na 50°C, čím nastane rozpustenie a potom sa roztok ochladí na 0 až 5°C a počas 10 minút sa pri teplote 0 až 5°C pridáva koncentrovaná kyselina sírová (700 ml).

Tzobutylén sa skondenzuje do desaťlitrovej vopred pripravenej prázdnej nádoby pri teplote -25°C až -30°C a s použitím prúdu argónu, sa potom počas 18 minút izobutylén prenesie do reakčnej zmesi pri teplote 0 až 5°C. Zmes sa zohrieva na 18 až 20°C počas 2 hodín a potom sa nechá miešať pri teplote 18 až 20^eC počas 18 hodín.

Roztok hydrogénuhličitanu sodného (2332 g v 27,1 1 vody) sa ochladí na 0 až 5°C s použitím ľadového kúpeľa a počas 20 minút sa pridá vyššie uvedená reakčná zmes. Zmes sa mieša a zohrieva na 18 až 20°C a potom sa nechá stáť, čím sa oddelia dve vrstvy. Organická fáza (vrchná vrstva sa oddelí a premyje 9,87 litrami 0,36 M pufra dihydrogénortofosfátu draselného (ktorý sa pripraví rozpustením 530 g dihydrogénortofosfátu draselného v 9,87 1 vody).

Organická fáza sa oddelí a potom sa odparí na rotačnej odparke, čím sa získa jantárovo zafarbený olej (2334 g) obsahujúci žiadaný produkt.

NMR (DMSOd_e): δ 7,33 (d, 2H), 8,24 (d, 2H), 5,90 (d, 1H), 4,32 (m, 1H) 2,0 až 2,04 (m, 4H), 1,50 (s, 9H), 1,46 (s, 9H).

c) Príprava diterc-butylesteru kyseliny N-(4-aminofenoxykarbonyl)-L-glutámovej vzorca 3

Hl· N

Do vhodne pripravenej hydrogenačnej nádoby sa vnesie 10 % paládium na uhlí (200 g vo forme vodou zvlhčenej pasty), potom sa pridá roztok zlúčeniny vzorca 2 (1,0 kg) v n-butylacetáte (5 1). Miešaná suspenzia sa ochladí na 15°C, potom sa hydrogenuje s použitím mierneho pretlaku (0,01 MPa) vodíka, pričom sa teplota udržiava na 15 až 25°C vonkajším chladením (poznámka 1). Keď adsorpcia vodíka ustane, katalyzátor sa odfiltruje a premyje s n-butylacetátom (2 x 500 ml). Spojené filtráty sa premyjú roztokom 100 Tw hydroxidu sodného (0,114 1, špecifickej hustoty 1,5 g/ml, 46 až 48 hmotn./obj.) upraveným vodou na 2 litre a potom vodou (2 x 2 1). Organická vrstva (približne 7 1) sa odparuje pri zníženom tlaku pri teplote 35 až 45°C až na objem približne 2 1. Miešaný roztok sa zohreje na 50 až 55°C a potom sa pridá rozpúšťadlo Essochem Solvent 30™ (5 1, uhľovodíkové rozpúšťadlo dostupné od firmy Exxon Chemical Ltd, PO Box 122, 4600 Parkway, Fareham, Hampshire PO15 7AP, Veľká Británia, môže sa tiež použiť alternatívne rozpúšťadlo ako je hexán), pričom sa teplota udržiava na 50 až 55°C. Zmes sa ochladí na +5°C a prefiltruje sa. Izolovaná pevná látka sa premyje dvakrát zmesou m-butylacetátu (250 ml) a Essochem Solvent 30™ (750 ml), vytlačí sa do sucha a suší sa pri laboratórnej teplote pri zníženom tlaku a získa sa 0,54 kg žiadaného produktu.

Poznámka 1

Hydrogenácia je exotermná.

NMR (DMSOd ): 8 7,80 (d, 1H), 6,45 až 6,75 (m, 4H), 4,95 (široký s, 2H), 3,95 (m, 1H) 2,4 (m, 2H), 1,7 až 2,0 (m, 2H) ,

1,4 (18H).

FAB MS [MH+]395

d) Príprava diterc-butylesteru kyseliny N-(4-[N,N-bis(2-hydroxyety1)amino]fenoxykarbony1-L-glutámo vej vzorca 4

(4)

Produkt zo stupňa c) vzorca 3 (60 g) sa rozpustí v kyseline octovej (430 ml) a pridá sa voda (430 ml), čím vznikne zakalený roztok. Miešaný roztok sa nechá reagovať s plynným etylénoxidom (78 g) počas niekoľkých hodín, pričom sa teplota udržiava pod 30°C. Na prijímanie nadbytku plynu sa použije vymrazovačka s pevným C0₂. Zmes sa nechá miešať aspoň 18 hodín, potom sa ku konci reakcie odoberajú vzorky na stanovenie pomocou chromátografie na tenkej vrstve. Zmes sa potom odparí do sucha pri zníženom tlaku s použitím rotačnej odparky Buchi s chladeným prstom. Vzniknutý olej sa rozpustí v etylacetáte (600 ml), premyje sa roztokom hydrogénuhličitanu sodného (25 g) vo vode (350 ml). Oddelená organická vrstva sa premyje dvakrát vodou (250 ml), vysuší sa síranom horečnatým, preflitru je sa a potom sa odparí pri zníženom tlaku na olej (77 g), ktorý obsahuje žiadaný produkt (približne 50 % koncentrácie).

Žiadaný produkt sa prekryštalizuje nasledujúcim spôsobom. Produkt (57 g približne 82 % koncentrácie) sa rozpustí pri teplote 40°C v etylacetáte (228 ml), potom sa ochladí na 22^eC a pridá sa aktívne uhlie Darko KB (5,7 g, dostupné od firmy Norit UK Ltd, Clydesmill Plače, Cambuslang Industrial Estate, Glasgow G32 8RF). Zmes sa mieša počas 90 minút, potom sa pre filtruje cez celit a filtračný koláč sa premyje etylacetátom (57 ml). Vzniknutý roztok sa zohreje na 50°C a počas 45 minút sa pridáva hexánová frakcia (570 ml) pri teplote 45 až 50°C. Po skončení pridávania sa roztok nechá samovoľne ochladiť, naočkuje sa pri 35^eC a potom sa cez noc mieša. Zmes sa chladí na 15°C počas 1 hodiny a potom sa prefiltruje a premyje zmesou hexánovej frakcie a etylacetátu 2 : 1 (45 ml) a potom hexánovou frakciou (45 ml) pred vysušením pri teplote 50°C.. Hmotnosť produktu 35,7 g (výťažok 76 %), teplota topenia 91 až 93°C.

NMR (DMSOd₆): δ 6,85 (d, 2H), 6,6 (d, 2H), 4,65 (m, 1H).

e) Príprava diterc-butylesteru kyseliny N-(4-[N,N-bis(2-jódetyl)amino fenoxykarbonyl-L-glutámovej vzorca 5

Trifenylfosfín (32,6 g) sa rozpustí v dichlórmetáne (200 ml) v atmosfére dusíka, pridá sa imidazol (8,4 g) a po získaní úplného roztoku sa tento roztok ochladí na 5°C. Po častiach sa pridáva jód (31,5 g), pričom teplota sa udržiava pod 21°C. Po skončení pridávanie sa reakčná zmes nechá ohriať na laboratórnu teplotu počas 1 hodiny. Pridá sa roztok produktu zo stupňa d) (20,0 g) v dichlórmetáne (50 ml), pričom sa teplota udržiava pod 26°C a reakčná zmes sa nechá miešať cez noc až do skončenia reakcie. Po ochladení na 5°C sa pridá 10 % roztok jodidu draselného (120 ml), pričom sa teplota udržiava pod 10°C Po usadení asi za 10 minút sa organická vrstva oddelí. Rozpúšťadlo sa odstráni odparením a olejovitý zvyšok sa rozpustí v etylacetáte (100 ml). K zmesi sa pomaly pridáva cyklohexán (200 ml), čím sa vyzráža trifenylfosfínoxid a po aspoň 10 minútovom miešaní sa pevná látka odfiltruje a premyje sa zmesou cyklohexánu a etylacetátu 2 : 1 (60 ml) Filtrát sa odparí a zvyšok sa rozmelní v terc-butylmetyléteri (MTBE) (200 ml). Táto suspenzia sa prefiltruje cez kolónu silikagélu (100 g), premyje sa terc-butylmetyléterom (2 x 100 ml). Spojené organické fázy sa odparia, čím sa získa žiadaný produkt vo forme bezfarebného oleja (26,0 g).

NMR (CDC1₃): 6 7,0 (d, 2H), 6,6 (d, 2H), 5,4 (d, 1H), 4,3 (m,

1H) 3,7 (t, 4H), 3,2 (t, 4H), 2, až 1,9 (m, 4H), 1,5 (s, 9H),

1,45 (s, 9H) .

Príklad 2

Farmaceutický prostriedok

Na prípravu konečnej dávkovej formy sa použijú 3 x 20 ml sklenené liekovky typ 1, ktoré vždy obsahujú 610 mg profarmaka a tri ampule, ktoré obsahujú 11 ml 2,15 % hmotn./obj. hydrogénuhličitanu sodného. Na odvzdušňovanie liekoviek sa použijú ihly (3 x 18G) a hydrofóbne filtre a na vodné roztoky sa použijú 3 x sterilné 0,22 μτα filtre na jedno použitie. Všetky materiály sa musia skladovať v chladničke (2 až 8°C).

Tieto pracovné postupy sa výhodne uskutočňujú v sterilných podmienkach. Nie viac ako 1 hodinu pred podávaním sa jedna liekovka s profarmakom odvzdušní pomocou ihly a hydrofóbneho filtra. Potom sa priamo zátkou pomocou injekčnej striekačky a ihly pridá sterilný roztok 2,15 % hmotn./obj. hydrogénuhličitanu sodného (10 ml). Za stáleho odvzdušňovania sa liekovka rozvíri, čím sa získa číry roztok (ten obsahuje 50 mg/ml vo forme voľnej bázy Žiadaný dávkový objem sa natiahne do sterilnej injekčnej striekačky cez sterilný filter. Filter sa potom nahradí sterilnou ihlou s ochranným puzdrom a injekčná striekačka sa udržiava v chlade až do podania. Každá liekovka, ktorá zostane sa pripravuje rovnakým spôsobom v intervaloch jednej hodiny, aby sa mohli podávať napríklad tri oddelené dávky po jednej hodine. Toto sa používa v kombinácii s vhodným ADEPT protilátka-enzým konjugátom, ako je protilátka A5B7 a karboxypeptidáza G2, ako je opísané v medzinárodnej patentovej prihláške WO 9/02 450 a v US patent 5 405 990.

Príklad 3

Protinádorová účinnosť

Protinádorová účinnosť soli kyseliny N-(4-[N,N-bis(2-jódetyl)amino]fenoxykarbonyl-L-glutámovej s kyselinou jodovodíkovou (profarmakum) je demonštrovaná v nasledujúcom modeli. LoVo nádorové bunky (10⁷) (ECACC č 87060101) sa injekujú podkožné do athymicky obnaženého boku myší. Hneď ako sú nádorové xenoimplantáty velké s priemerom 4 až 5 mm, aplikuje sa F(ab*)₂A5B7-CPG2 konjugát (ako je opísané v medzinárodnej patentovej prihláške WO 94/02 450 a v US patente 5 405 990) intravenózne v dávke 2,5 mg/kg (500U CPG2 účinnosť/kg). Po časovom intervale (72 hodín), keď je umožnené konjugátu lokalizovať sa na nádor a vyčistiť sa od krvi a normálneho tkaniva, sa podáva profarmakum (3 x 70 mg/kg) intraperitoneálne v 3 pilulkových dávkach každú hodinu počas dvojhodinového intervalu. Kombinácia konjugátu a profarmaka spôsobí, že nádor ustúpi a oneskoruje sa rast nádoru >30 dní. S touto kombináciou konjugátu a profarmaka sa pozorovali iba malé účinky na telesnú hmotnosť a počet periférnych bielych krviniek. V tomto modeli sa dosiahne značná protinádorová účinnosť dávkami konjugátu v rozsahu od 0,25 do 10 mg/kg v kombinácii s profarmakom (3 x 50 až 90 mg/kg). Použitie troch dávok profarmaka počas 2 hodín pôsobí lepšiu protinádorová účinnosť ako jednotlivá dávka.

Na základe týchto protinádorových údajov môže byť klinická dávka konjugátu v rozsahu 0,025 až 1,0 mg/kg a výhodnejšie 0,5 až 1,0 mg/kg. Profarmakum by sa malo podávať hneď po lokalizácii konjugátu na nádor a vyčistení od krvi a normálnych tkanív (hladina konjugátu v plazme <1 gg/ml). Na základe klinických údajov s konjugátom F(ab')_aA5B7-CPG2 (Bagshawe, Clinical Pharmacokinetic Concepts 27, 368, 1994) je vhodné podávanie po 48 až 96 hodinách po podaní konjugátu. Dávka profarmaka by sa mala podávať intravenózne ako 3 pilulkové dávky počas dvojhodinového intervalu. Na základe údajov xenoimplantátu u myší by bolo možné u pacientov očakávať protinádorová účinnosť s celkovou dávkou 15 až 150 mg/kg. Avšak na stanovenie optimálnej terapeutickej dávky by sa mali použiť štandartné štúdie zvyšovania dávok profarmaka.

Príklad 4

Rôntgenová prášková difrakcia

Meranie rontgenovej práškovej difrakcie sa uskutočňovalo v Siemens D5000™ difraktometri. Približne 1 g vzorky (soľ kyseliny N-(4-[N,N-bis(2-jódetyl)amino]fenoxykarbonyl-L-glutámovej s kyselinou jodovodíkovou v kryštalickej forme) (vzorka by mala byť v jemne rozomletej fyzikálnej forme s použitím prípadne tlčika a trecej misky, pričom by mal byť zaistený minimálny pracovný čas) sa starostlivo čelne vnesie na štandartnú podložku Siemens a vyrovná sa pomocou štandartného mikroskopického podložného sklíčka. Vzorka sa otáča pri 30 otáčkach za minútu (to zlepšuje výpočtovú štatistiku) a ožaruje sa rôntgenovými lúčmi generovanými dlhou medenou fokusovateľnou rúrkou pracujúcou pri 40 kV a 40 mA, vlnová dĺžka rontgenových lúčov 1,5406 A (Angstrôm). Kolimovaný zdroj rontgenových lúčov sa prepúšťa štrbinou Automatic Variable Divergence Slit pri V20 na konštantné ožiarenie celej plochy Theta-Theta snímacieho rozsahu a odrazené žiarenie prechádza 2 mm antirozptylovou štrbinou a 0,2 mm detekčnou štrbinou. Každá vzorka sa exponovala 4 sekundy po 0,02 stupňoch 2-theta inkrementu v rozsahu od 2 stupňov do 45 stupňov 2-theta (kontinuálne snímanie). Každá vzorka sa preto meria 2 hodiny, 23 minút a 20 sekúnd. Prístroj je vybavený Scintillation Counter čítačom ako detektorom. Kontrola a zber údajov sa uskutočňuje Delí 3 25P™ osobným počítačom vybaveným softwarom Diffrac AT™ (Socabim). Obr. 2 znázorňuje difrakčné spektrum soli kyseliny N-(4-[N,N-bis(2-jódetyl)ämino]fenoxykarbonyl-L-glutámovej s kyselinou jodovodíkovou.

Claims

1. Zlúčenina kyselina N-(4-[N,N-bis(2-jódetyl)amino]fenoxykarbonyl-L-glutámová v v podstate čistej forme.

2. Zlúčenina kyselina N-(4-[N,N-bis(2-jódetyl)amino]fenoxykarbonyl-L-glutámová čistá aspoň z 95 % vzhľadom na reakčné znečisťujúce látky zanesené počas syntézy tejto zlúčeniny.

3. Soľ kyseliny N-(4-[N,N-bis(2-jódetyl)amino]fenoxykarbonyl-L-glutámovej s kyselinou jodovodíkovou.

4. Soľ s kyselinou jodovodíkovou podľa nároku 3 v v podstate čistej forme.

5. Soľ s kyselinou jodovodíkovou podľa nároku 3 alebo 4 v kryštalickej forme.

6. Soľ s kyselinou jodovodíkovou podľa nároku 5, ktorá má v kryštalickej forme teplotu topenia 142 až 145°C.

7. Soľ s kyselinou jodovodíkovou podľa nároku 5 alebo 6, ktorá má v kryštalickej forme rontgenové práškové difrakčné spektrum, ako je uvedené na obr.2.

8. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kyselinu N-(4-[N,N-bis(2-jódetyl)amino]fenoxykarbonyl-L-glutámovú v v podstate čistej forme a farmaceutický prijateľný nosič.

9. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 8 v suchej forme.

10. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že ako nosič obsahuje pufor.

11. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že ako pufor obsahuje hydrogénuhličitan sodný.

12. Dvojzložkový farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že ako prvú zložku obsahuje farmaceutický prostriedok, ako je definované v nárokoch 9 až 11, a .ako druhú zložku obsahuje sterilné riedidlo na rekonštitúciu prvej zložky.

13. Spôsob prípravy soli kyseliny N-(4-[N,N-bis(2-jódetyl)~ amino]fenoxykarbonyl-L-glutámovej s kyselinou j odo vodíkovou, vyznačujúci sa tým, že sa odstránia ochranné skupiny v zlúčeniny všeobecného vzorca I

O kde Pri a Pr2 sú ochranné skupiny, v prítomnosti kyseliny jodovodíkovej a vzniká soľ kyseliny N-(4-[N,N-bis(2-jódetyl)amino]fenoxykarbonyl-L-glutámovej s kyselinou jodovodíkovou.

14. Spôsob podľa nároku 13,vyznačujúci sa tým, že Pri a Pr2 sú terc-butylesterové skupiny.

15. Spôsob podľa nároku 13,vyznačujúci sa tým, že odstránenie ochranných skupín sa uskutočňuje v dvoch stupňoch, pričom Pri a Pr2 sú najprv terc-butylesterové skupiny, ktoré sa nahradia inými ochrannými skupinami, ktorými sú trimetylsilylové skupiny, potom sa odstránia druhé ochranné sku piny v prítomnosti kyseliny jodovodíkovej a vzniká soľ kyseliny N—(4—[N,N—bis(2-jódetyl)amino]fenoxykarbonyl—L-glutámovej s kyselinou jodovodíkovou.

16. Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že Pri a Pr2 sú trimetylsilylové ochranné skupiny.