CZ195197A3 - N-(4-£n,n-bis(2-iodoethyl)amino|phenoxycarbonyl)-l-glutamic acid of extreme purity - Google Patents

Description

Vynález se týká známého profarmaka použitelného v protilátkou řízené therapii, při které se z profarmaka uvolňuje léčivo působením enzymu (Antibody Directed Enzyme Prodrug Therapy - ADEPT) , v nové vysoce vyčištěně formě a nové soli tohoto profarmaka, farmaceutických prostředků a způsobů přípravy této soli.

Dosavadní stav techniky

Profarmakum, N-(4- [Ν,Ν-bis(2-jodethyl)amino]fenoxykarbonyl)-L-glutamová kyselina, bylo popsáno 3. února 1994 v mezinárodní patentové přihlášce WO 94/02 450, viz příklad 33, kde se popisuje sůl s trifluoroctovou kyselinou (TFA sůl), která se připraví ve formě gumovité látky. Tuto gumovitou formu profarmaka není možno dobře vyčistit, protože jsou známy potíže při zpracovávání sloučenin gumovitého typu. Není vůbec nikde popsána sůl s jodovodíkovou kyselinou tohoto profarmaka nebo toto profarmakum jako takové o vysoké čistotě.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je N-(4 -[N,N-bis(2-jodethyl)amino]fenoxykarbonyl)-L-glutamová kyselina ve v podstatě čisté formě.

Výrazem v podstatě čistá forma se rozumí profarmakum o čistotě alespoň 95 % (s výhodou o čistotě alespoň 96 %, výhodněji o čistotě alespoň 97 %, ještě výhodněji o čistotě alespoň 98 %) ve vztahu k reakčním příměsím, včetně roz-2pouštědel, zanesených z jakékoliv syntesy profarmaka. Těchto vysokých hodnot čistoty lze dosáhnout pouze podle tohoto zde popsaného vynálezu soli profarmaka s jodovodíkovou kyselinou, kterou lze připravit v krystalické formě. Krystalická forma profarmaka umožňuje snadno získat profarmakum ve vysoce čistém stavu, protože tuto sůl lze účinně oddělit z reakčni směsi a promýt rozpouštědlem k odstranění znečištěnin, včetně rozpouštědel, ze syntetického postupu. Výhodně se v podstatě čisté profarmakum získá v suché formě smíšené s pufrem vhodným po zředění pro intravenosní aplikaci.

Dále je podstatou vynálezu sůl N-(4-[N,N-bís(2-jodethyl)amino]fenoxykarbonyl)-L-glutamové kyseliny s jodovodíkovou kyselinou. Výhodně je tato sůl ve v podstatě čisté formě. Výhodně je sůl N-(4 -[N,N-bis(2-jodethyl)amino]fenoxykarbonyl)L-glutamové kyseliny s jodovodíkovou kyselinou v krystalické formě. Výhodně má tato krystalická forma teplotu tání 142 až 145 °C. Výhodně má krystalická forma rentgenové práškové difrakční spektrum v podstatě takové, jak je uvedeno na obr. 2.

Tato sůl má následující výhody: dobrou tepelnou stabilitu, snadnější syntesu a čištění, protože ji lze účinně oddělit z reakčni směsi, zvýšenou čistotu a snížené hygroskopické/delikvescenční vlastnosti, které usnadňují další zpracovávání.

I když se není nutno vázat teoretickými úvahami, předpokládá se, že přítomnost Hl nějak napomáhá zvrátit degradaci profarmaka v oblasti N-alkylované části molekuly. Předpokládá se, že tyto produkty odvozené od aziridenového meziproduktu mohou vznikat při skladování nebo tepelném zatížení, je-li profarmakum skladováno v suchém stavu. Hl sůl profarmaka je výhodně stabilní, je-li rozpuštěna ve vodném roztoku, snad následkem in sítu uvolňovaného jodidového iontu. Odbornici v daném oboru by pravděpodobně pro farmaceutické použití (jedině známé použití) nepřidávali k tomuto profarmaku vysoké koncentrace Nal vzhledem k farmaceutickým účinkům těchto sloučenin jako takových.

-3Dále je podstatou vynálezu farmaceutický prostředek obsahující N- (4-[N,N-bis(2-jodethyl)amino]fenoxykarbonyl)-Lglutamovou kyselinu ve v podstatě čisté formě a farmaceuticky přijatelný nosič.

Výhodný prostředek je dodáván v suché formě. Výhodným nosičem je pufr, zejména hydrogenuhličitan sodný. Výhodně je prostředek rekonstituován krátce před použitím jako ADEPT složka, a to sterilním ředidlem.

Další podstatou vynálezu je dvousložkový farmaceutický prostředek, který spočívá v tom, že obsahuje jako první složku súl N-(4-[N,N-bis(2-jodethyl)amino]fenoxykarbonyl)-L-glutamové kyseliny s jodovodíkovou kyselinou v suché formě a jako druhou složku sterilní ředidlo. Výhodně je sůl obsažena v krystalické formě.

Další podstatou vynálezu je způsob přípravy soli N-(4[N,N-bis(2-jodethyl)amino]fenoxykarbonyl)-L-glutamově kyseliny s jodovodíkovou kyselinou, který spočívá v tom, že se odstraní chránící skupiny ve sloučenině obecného vzorce I

O

O ΡΠ (I) kde Prl a Pr2 jsou chránící skupiny (výhodně jsou Prl a Pr2 terč.butylesterové skupiny nebo trimethylsilylové skupiny, zejména trimethylsilyl) . Odstranění chránících skupin se s výhodou provádí za kyselých podmínek v inertní atmosféře v přítomnosti kyseliny jodovodíkové, čímž vznikne súl N-(4[N,N-bis(2-jodethyl)amino]fenoxykarbonyl)-L-glutamové kyseliny s kyselinou jodovodíkovou. Výhodně se odstranění chránících skupin provádí v přítomnosti aprotického rozpouštědla, výhodně

-4díchlormethanu nebo toluenu, zejména dichlormethanu. Výhodně probíhá odstranění chránících skupin ve dvou stupních, při kterém se skupiny Pri a Pr2 nahradí jinými chránícími skupinami Pr3 a Pr4, avšak jednostupňové odstranění chránících skupin kyselinou jodovodíkovou lze také uvažovat. Výhodně se pro dvoustupňové odstranění chránících skupin sloučenina obecného vzorce I nechá reagovat s jodtrimethylsilanem (TMSI). Skupiny Pr3 a Pr4 jsou výhodně trimethylsilylové chránící skupiny (TMS), které se potom výhodně odstraní za kyselých podmínek, s výhodou s obsahem zárodečného krystalu. Dvoustupňové odstranění chránících skupin se provádí tak, že první stupeň obecně trvá 30 minut až 24 hodin, zejména 4 až 6 hodin, a druhý stupeň trvá obecně 1 až 48 hodin, výhodně 12 až 18 hodin, při teplotě místnosti (15 až 30 °C). Pro krystalisaci je důležité důkladné míchání, s výhodou po dobu alespoň asi 14 hodin (zejména alespoň asi 18 hodin), s výhodou při teplotě místnosti.

Předložený vynález je dále blíže ilustrován následujícími příklady, které jeho rozsah nijak neomezují. Obr. 1 znázorňuje syntetický postup přípravy soli profarmaka N-(4-[N,N-bis(2-jodethyl) amino] fenoxykarbonyl) -L-glutamové kyseliny s kyselinou jodovodíkovou a obr. 2 znázorňuje rentgenové práškové difrakční spektrum soli profarmaka N-(4-[N,N-bis(2-jodethyl)amino] fenoxykarbonyl)-L-glutamové kyseliny s kyselinou jodovodíkovou v krystalické formě.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava soli N-(4 -[N,N-bis(2-jodethyl)amino]fenoxykarbonyl)L-glutamové kyseliny s kyselinou jodovodíkovou (viz obr. 1)

Diterc.butylester N-(4-[N,N-bis(2-jodethyl)amino]fenoxykarbonyl ) -L-glutamové kyseliny vzorce 5

(25,9 g) se rozpustí v dichlormethanu (173 ml) v atmosféře dusíku při teplotě místnosti. K tomuto roztoku se přidá jodtrimethylsilan (26,2 ml) a reakční směs se míchá po dobu 4 až 6 hodin. Po skončení reakce se roztok pomalu naleje do směsi diethyletheru (834 ml) a kyseliny octové (43 ml), která výhodně obsahuje zárodečné krystaly konečného produktu (poprvé dodané ještě během reakce) . Vzniklá suspense se nechá míchat po dobu 18 hodin při teplotě místnosti, čímž se získá krystalická forma. Pro dosažení krystalisace je důležité dlouhé míchání. Požadovaný konečný produkt, sůl N-(4-[N,N-bis-(2-jodethyl)amino]fenoxykarbonyl)-L-glutamové kyseliny s kyselinou jodovodíkovou, sloučenina vzorce 6

I v krystalické formě se odfiltruje, promyje diethyletherem (2 x 150 ml) a vysuší se ve vakuové sušárně do konstantní hmotnosti. Hmotnost produktu 22,1 g. Teplota tání 142 až 145 °C (rozkl.), optická rotace [a] D²⁵ -21,1 ⁰ (c = 1, dimethylf ormamid) ,

-6NMR (DMSOdJ : δ 7,93 (d, 1H) , 6,91 (d, 2H) , 6,63 (d, 2H) , 4,0 (m, 1H), 3,69 (t, 4H), 3,28 (t, 4H), 2,33 (m, 2H), 2,0 (m, 1H), 1,8 (m, 1H).

¹³C chemické posuny (vzhledem k DMSO při 39,6 δ) : 3,9, 52,9,

143,0, 112,1, 122,6, 142,0, 154,9, 53,2, 26,1, 30,1, 173,6,

173,2.

Elementární analysa pro C₁₆H₂₀I₂N₂O₆. HI nalezeno: 26,9 % C, 3,1 % H, 3,8 % N, 52,7 % I teorie: 26,7 % C, 3,0 % H, 3,9 % N, 52,9 % I

Diterc.butylester N-(4-[N,N-bis(2-jodethyl)amino]fenoxykarbonyl)-L-glutamové kyseliny vzorce 5 se připraví následujícím způsobem.

a) Příprava N-(4-nitrofenoxykarbonyl)-L-glutamové kyseliny vzorce 1

H i

O

O

OH (1)

L-glutamová kyselina vzorce b

O

(b) (73,6 g) se suspenduje ve dvoulitrové baňce v dichlormethanu (750 ml) v atmosféře dusíku. V jedné dávce se přidá N,N-diísopropylethylamin (193,9 g) a potom se během 20 minut přidá chlortrimethylsilan (135,8 g), přičemž se teplota reakční

-Ίsměsi udržuje při teplotě varu nebo pod touto teplotou (viz poznámka 1) . Po skončení přidávání se reakční směs zahřívá k varu pod zpětným chladičem po dobu 1,5 hodiny a potom se ochladí na 1 °C a získá se bis-trimethylsilylester (TMS) L-glutamové kyseliny.

V čistém suchém třílitrovém reaktoru se v atmosféře dusíku rozpustí p-nitrofenylchlorformiát vzorce a

(100,8 g) v dichlormethanu (375 ml) a roztok se ochladí na -3 °C. Během 15 minut se potom přidá předem připravený roztok bis-TMS esteru L-glutamové kyseliny, přičemž se teplota udržuje pod 10 °C. Po skončení přidávání se směs míchá po dobu 15 minut a pak se ochladí na asi 5 °C. Připraví se roztok zředěné HCl z vody (750 ml) a koncentrované HCl (148 ml) . K tomu se potom během 15 minut přidá dichlormethanový roztok, přičemž se teplota udržuje okolo 20 °C. Po skončení přidávání se směs míchá při 2 0 °C po dobu 3 0 minut a potom se nechá 3 0 minut usazovat, čímž se získají tři vrstvy. Vrstva u dna se odpustí a vyleje a produkt se extrahuje dvakrát methylisobutylketonem (MIBK, 1000 ml, 500 ml). Obě organické vrstvy se spojí, promyjí nasyceným NaCI (250 ml) a rozpouštědlo se odstraní za sníženého tlaku (teplota lázně 40 °C) a získá se bílá pevná látka. Tento produkt se rozpustí v ethylacetátu (600 ml) při teplotě 40 °C, potom se přidá hexan (600 ml) , směs se ochladí na 20 °C za míchání, načež se míchá přes noc a potom se isoluje filtrací. Požadovaný produkt 12 6 g (výtěžek 77 %) se promyje směsí ethylacetátu a hexanu 1:1 (300 ml), pak se vysuší při 50 °C do konstantní hmotnosti.

Poznámka 1

-8Přidávání chlortrimethylsilanu způsobuje zvýšení teploty od 13 °C do 40 °C, jestliže se neprovádí chlazení. Charakterisace sloučeniny:

NMR (DMSOdg) : δ 8,45 (d, IH) , 8,25 (d, 2H) , 7,4 (d, 2H) , 4,07 (m, IH), 2,35 (m, 2H), 2,05 (m, IH) , 1,85 (m, IH). b) Příprava diterc.butylesteru N-(4-nitrofenoxykarbonyl)-Lglutamové kyseliny vzorce 2

Produkt ze stupně a) vzorce 1 (2120 g) se vloží do stolitrového reaktoru a přidá se methylisobutylketon (24 1) .

Vzniklá suspense se zahřívá na 50 °C, čímž nastane rozpuštění a potom se roztok ochladí na 0 až 5 °C a během 10 minut se při teplotě 0 až 5 °C přidává koncentrovaná kyselina sírová (700 ml) .

Isobutylen se zkondensuje do desetilitrové předem připravené prázdné nádoby při teplotě -25 až -30 °C a za použití proudu argonu, načež se během 18 minut isobutylen přenese do reakčni směsi při teplotě 0 až 5 °C. Směs se zahřívá na 18 až 20 °C po dobu 2 hodin a potom se nechá míchat při teplotě 18 až 20 °C po dobu 18 hodin.

Roztok hydrogenuhličitanu sodného (2332 g v 27,1 1 vody) se ochladí na 0 až 5 °C za použití ledové lázně a během 20 minut se přidá výše uvedená reakčni směs. Směs se míchá a zahřívá na 18 až 20 °C a potom se nechá stát, čímž se oddělí dvě vrstvy. Organická fáze (vrchní vrstva) se oddělí a promyje 9,87 litry 0,36 M pufru dihydrogenorthofosfátu draselného

-9(který se připraví rozpuštěním 530 g dihydrogenorthofosfátu draselného v 9,87 1 vody).

Organická fáze se oddělí a potom se odpaří na rotačním odpařováku, čímž se získá jantarově zbarvený olej (2334 g) obsahující požadovaný produkt.

NMR (DMSOdJ : δ 7,33 (d, 2H) , 8,24 (d, 2H) , 5,90 (d, 1H) , 4,32 (m, 1H), 2,0 až 2,04 (m, 4H), 1,50 (s, 9H), 1,46 (s, 9H). c) Příprava diterc.butylesteru N-(4-aminofenoxykarbonyl)-Lglutamovš kyseliny vzorce 3

Do vhodně připravené hydrogenační nádoby se vnese 10% palladium na uhlí (200 g ve formě vodou zvlhčené pasty), potom se přidá roztok sloučeniny vzorce 2 (1,0 kg) v n-butylacetátu (5 1). Míchaná suspense se ochladí na 15 °C, potom se hydrogenuje za použití mírného přetlaku (0,01 MPa) vodíku, přičemž se teplota udržuje na 15 až 25 °C vnějším chlazením (poznámka 1) . Když absorpce vodíku ustane, katalysátor se odfiltruje a promyje se n-butylacetátem (2 x 500 ml) . Spojené filtráty se promyjí roztokem 100 Tw hydroxidu sodného (0,114 1, specifické hustoty 1,5 g/ml, 46 až 48 hmot./obj.) upraveným vodou na 2 litry a potom vodou (2 x 2 1) . Organická vrstva (přibližně 71) se odpařuje za sníženého tlaku při teplotě 35 až 45 °C až na objem přibližně 2 1. Míchaný roztok se zahřeje na 50 až 55 °C a potom se přidá rozpouštědlo Essochem Solvent 30™ (5 1, uhlovodíkové rozpouštědlo dostupné od firmy Exxon Chemical Ltd, PO Box 122, 4600 Parkway, Fareham, Hampshire PO15 7AP, Velká Británie, lze též ovšem použít alternativní

-10rozpouštědlo, jako je hexan), přičemž se teplota udržuje na 50 až 55 °C. Směs se ochladí na +5 °C a přefiltruje se. Isolovaná pevná látka se promyje dvakrát směsí n-butylacetátu (250 ml) a Essochem Solvent 3 0™ (750 ml) , vymačká se do sucha a suší se při teplotě místnosti za sníženého tlaku a získá se 0,54 kg požadovaného produktu.

Poznámka 1

Hydrogenace je exothermní.

NMR produktu (DMSOd_s) : δ 7,80 (d, ÍH) , 6,45 až 6,75 (m, 4H) ,

4,95 (široký s, 2H) , 3,95 (m, ÍH) , 2,4 (m, 2H) , 1,7 až 2,0 (m, 2H), 1,4 (18 H).

FAB MS [MH+]3 95

d) Příprava diterc.butylesteru N-(4-[Ν,Ν-bis(2-hydroxyethyl)amino]fenoxykarbonyl)-L-glutamové kyseliny vzorce 4

Produkt ze stupně c) vzorce 3 (60 g) se rozpustí v kyselině octové (430 ml) a přidá se voda (430 ml), čímž vznikne zakalený roztok. Míchaný roztok se nechá reagovat s plynným ethylenoxidem (78 g) po dobu několika hodin, přičemž se teplota udržuje pod 30 °C. Pro jímání nadbytku plynu se použije vymražovák s pevným CO₂. Směs se nechá míchat alespoň 18 hodin, potom se ke konci reakce odebírají vzorky pro stanovení pomocí chromatografie v tenké vrstvě. Směs se potom odpaří k suchu za sníženého tlaku za použití rotačního odpařováku Buchi s chlazeným prstem. Vzniklý olej se rozpustí v ethylacetátu

-11i (600 ml), promyje se roztokem hydrogenuhličitanu sodného (25 g) [ ve vodě (350 ml). Oddělená organická vrstva se promyje dvakrát h vodou (250 ml), vysuší se síranem hořečnatým, přefiltruje se a | potom se odpaří za sníženého tlaku na olej (77 g) , který | obsahuje požadovaný produkt (přibližně 50% koncentrace).

| Požadovaný produkt se překrystaluje následujícím způsobem.

I !' Produkt (57 g přibližně 82% koncentrace) se rozpustí při teplotě 40 °C v ethylacetátu (228 ml) , potom se ochladí na 22 | °C a přidá se aktivní uhlí Darko KB (5,7 g, dostupné od firmy | , Nořit UK Ltd, Clydesmill Plače, Cambuslang Industrial Estate, k

I Glasgow G32 8RF) . Směs se míchá po dobu 90 minut, potom se í přefiltruje přes celit a filtrační koláč se promyje ethylacetátem (57 ml) . Vzniklý roztok se zahřeje na 50 °C a í během 45 minut se přidává hexanová frakce (570 ml) při teplotě í 45 až 50 °C. Po skončení přidávání se roztok nechá samovolně l ochladit, naočkuje se při 35 °C a potom se přes noc míchá. Směs i se chladí na 15 °C po dobu 1 hodiny a pak se přefiltruje a i promyje směsí hexanové frakce a ethylacetátu 2:1 (45 ml) a | potom hexanovou frakcí (45 ml) před vysušením při teplotě 50 t °C. Hmotnost produktu 35,7 g (výtěžek 76 %), teplota tání 91 až ’ 93 °C.

{ NMR (DMSOd₆) : δ 6,85 (d, 2Η) , 6,6 (d, 2H) , 4,65 (m, 1H) .

( e) Příprava diterc.butylesteru N-(4-[N,N-bis(2-jodethyl)amino]fenoxykarbonyl)-L-glutamové kyseliny vzorce 5 i Trifenylfosfin (32,6 g) se rozpustí v dichlormethanu (200 ' · ml) v atmosféře dusíku, přidá se imidazol (8,4 g) a po získání úplného roztoku se tento roztok ochladí na 5 °C. Po částech se přidává jod (31,5 g), přičemž se teplota udržuje pod 21 °C. Po skončení přidávání se reakční směs nechá ohřát na teplotu místnosti během 1 hodiny. Přidá se roztok produktu ze stupně d) (20,0 g) v dichlormethanu (50 ml), přičemž se teplota udržuje pod 2 6 °C a reakční směs se nechá míchat přes noc až do skončení reakce. Po ochlazení na 5 °C se přidá 10% roztok jodidu draselného (120 ml) , přičemž se teplota udržuje pod 10

-12°C. Po usazení asi za 10 minut se organická vrstva oddělí. Rozpouštědlo se odstraní odpařením a olejovitý zbytek se rozpustí v ethylacetátu (100 ml) . Ke směsi se pomalu přidává cyklohexan (200 ml) , čímž se vysráží trif enylf osf inoxid a po alespoň lOminutovém míchání se pevná látka odfiltruje a promyje směsí cyklohexanu a ethylacetátu 2:1 (60 ml). Filtrát se odpaří a zbytek se rozmělní v terč.butylmethyletheru (MTBE) (200 ml). Tato suspense se přefiltruje přes kolonu silikagelu (100 g) , promyje se terč.butylmethyletherem (2 x 100 ml). Spojené organické fáze se odpaří, čímž se získá požadovaný produkt ve formě bezbarvého oleje (26,0 g).

NMR (CDC1J : δ 7,0 (d, 2H) , 6,6 (d, 2H) , 5,4 (d, IH) , 4,3 (m, IH), 3,7 (t, 4H), 3,2 (t, 4H), 2,4 až 1,9 (m, 4H), 1,5 (s, 9H),

1,45 (s, 9H).

Příklad 2

Farmaceutický prostředek

Pro přípravu konečné dávkové formy se použijí 3 x 20 ml skleněné lékovky typ 1, které vždy obsahují 610 mg profarmaka a tři ampule, které vždy obsahují 11 ml 2,15% hmot./obj. hydrogenuhličitanu sodného. Pro odvzdušňování lékovek se použijí jehly (3 x 18G) a hydrofobní filtry a pro vodné roztoky se použijí 3 x sterilní 0,22 μπι filtry pro jedno použití. Všechny materiály musí být skladovány v ledničce (2 až 8 °C).

Tyto pracovní postupy se s výhodou provádějí za sterilních podmínek. Ne více než 1 hodinu před podáváním se jedna lékovka s profarmakem odvzdušní pomocí jehly a hydrofobního filtru. Potom se přímo zátkou pomocí injekční stříkačky a jehly přidá sterilní roztok 2,15% hmot./obj. hydrogenuhličitanu sodného (10 ml). Za stálého odvzdušňování se lékovka jemně rozvíří, čímž se získá čirý roztok (ten obsahuje 50 mg/ml ve formě volné base). Požadovaný dávkový objem se natáhne do sterilní injekční stříkačky přes sterilní filtr. Filtr se potom nahradí sterilní

-13jehlou s ochranným pouzdrem a injekční stříkačka se udržuje v chladu až do podávání. Každá zbylá lékovka se připravuje stejným způsobem v intervalech jedné hodiny, aby mohly být například podávány tři oddělené dávky po jedné hodině. Toto se používá v kombinaci s vhodným ADEPT protilátka-enzym konjugátem, jako je protilátka A5B7 a karboxypeptidasa G2, jak je popsáno v mezinárodní patentové přihlášce WO 94/02 450 a v US patentu 5 405 990.

Příklad 3

Protinádorová účinnost

Protinádorová účinnost soli N-(4-[Ν,Ν-bis(2-jodethyl)amino]fenoxykarbonyl)-L-glutamové kyseliy s kyselinou jodovodíkovou (profarmakum) je demonstrována v následujícím modelu. LoVo nádorové buňky (10⁷) (ECACC č. 87060101) se injikuji podkožně do athymicky obnaženého boku myší. Jakmile jsou nádorové xenoimplantáty veliké v průměru 4 až 5 mm, aplikuje se F (ab) ₂A5B7-CPG2 konjugát (jak je popsáno v mezinárodní patentové přihlášce WO 94/02 450 a v US patentu 5 405 990) intravenosně v dávce 2,5 mg/kg (500U CPG2 účinnost/kg). Po časovém intervalu (72 hodin), kdy je umožněno konjugátu lokalisovat se na nádor a vyčistit se od krve a normální tkáně, se podává profarmakum (3 x 70 mg/kg) intraperitoneálně ve 3 pilulkových dávkách každou hodinu během dvouhodinového intervalu. Kombinace konjugátu a profarmaka způsobí, že nádor ustoupí a zpožďuje se růst nádoru >30 dní. S touto kombinací konjugátu a profarmaka byly pozorovány pouze malé účinky na tělesnou hmotnost a počet periferních bílých krvinek. V tomto modelu se dosáhne značné protinádorové účinnosti dávkami konjugátu v rozmezí od 0,25 do 10 mg/kg v kombinaci s profarmakem (3 x 50 až 90 mg/kg). Použití tří dávek profarmaka

-14během 2 hodin působí lepší protinádorovou účinnost než jednotlivá dávka.

Na základě těchto protinádorových dat může být klinická dávka konjugátu v rozmezí 0,025 až 1,0 mg/kg a výhodněji 0,5 až 1,0 mg/kg. Profarmakum by mělo být podáváno hned po lokalisaci konjugátu na nádor a vyčištění od krve a normálních tkání (hladina konjugátu v plasmě <1 μg/ml). Na základě klinických dat s konjugátem F (ab') ₂A5B7-CPG2 (Bagshawe, Clinical Pharmacokinetic Concepts 27, 368, 1994) je vhodné podávání po 48 až 96 hodinách po podání konjugátu. Dávka profarmaka by se měla podávat intravenosně jako 3 pilulkové dávky během dvouhodinového intervalu. Na základě dat xenoimplantátu u myši by bylo možno u pacientů očekávat protinádorovou účinnost s celkovou dávkou 15 až 150 mg/kg. Avšak pro stanovení optimální therapeutické dávky by se měly použít standarní studie zvyšování dávek profarmaka.

Příklad 4

Rentgenová prášková difrakce

Měření rentgenové práškově difrakce bylo prováděno v Siemens D5000™ difraktometru. Přibližně 1 g vzorku (súl N-(4[N,N-bis(2-jodethyl)amino]fenoxykarbonyl)-L-glutamové kyseliny s kyselinou jodovodíkovou v krystalické formě) (vzorek by měl být v jemně rozemleté fysikální formě za použití popřípadě tloučku a třecí misky, přičemž by měl být zajištěn minimální pracovní čas) se pečlivě čelně vnese na standardní podložku Siemens a vyrovná se pomocí standarního mikroskopického podložního sklíčka. Vzorek se otáčí při 30 otáčkách za minutu (to zlepšuje výpočetní statistiku) a ozařuje se rentgenovými paprsky generovanými měděnou dlouhou fokusovatelnou trubicí pracující při 40 kV a 40 mA, vlnová délka rentgenových paprsků

-151,5406 A (Angstróm). Kolimovaný zdroj rentgenových paprsků se propouští štěrbinou Automatic Variable Divergence Slit při V20 pro ozáření konstantní celé plochy Theta-Theta skanovacího rozsahu a odražené záření prochází 2 mm antirozptylovou štěrbinou a 0,2 mm detekční štěrbinou. Každý vzorek byl exponován 4 sekundy po 0,02 stupních 2-theta inkrementu v rozmezí od 2 stupňů do 45 stupňů 2-theta (kontinuální skaň). Každý vzorek proto běží 2 hodiny, 23 minut a 20 sekund. Přístroj je opatřen Scintíllation Counter čítačem jako detektorem. Kontrola a sběr dat se provádí Dell 325P™ osobním počítačem opatřeným softwarem Diffrac AT™ (Socabim). Obr. 2 znázorňuje difrakční spektrum soli N-(4-[N,N-bis(2-jodethyl)amino]fenoxykarbonyl)-L-glutamové kyseliny s jodovodíkovou kyselinou.

Claims (15)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Sloučenina N-(4 -[N,N-bis(2 -jodethyl)amino]fenoxykarbonyl)-L-glutamová kyselina ve v podstatě čisté formě.
2. 2. Sloučenina N-(4-[N,N-bis(2-jodethyl)amino]fenoxykarbonyl)-L-glutamová kyselina čistá alespoň z 95 % vhledem k reakčním znečištěninám zaneseným během syntesy této sloučeniny.
3. 3. Sůl N-(4 -[N,N-bis(2-jodethyl)amino]fenoxykarbonyl)-Lglutamové kyseliny s jodovodikovou kyselinou.
4. 4. Sůl s kyselinou jodovodikovou podle nároku 3 ve v podstatě čisté formě.
5. 5. Sůl s kyselinou jodovodikovou podle nároku 3 nebo 4 v krystalické formě.
6. 6. Sůl s kyselinou jodovodikovou podle nároku 5, která má v krystalické formě teplotu tání 142 až 145 °C.
7. 7. Sůl s kyselinou jodovodikovou podle nároku 5 nebo 6, která má v krystalické formě rentgenové práškové difrakční spektrum, jak je uvedeno na obr. 2.
8. 8. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje N-(4-[N,N-bis(2-jodethyl)amino]fenoxykarbonyl)-L-glutamovou kyselinu ve v podstatě čisté formě a farmaceuticky přijatelný nosič.
9. 9. Farmaceutický prostředek podle nároku 8 v suché formě.
10. 10. Farmaceutický prostředek podle nároku 9, vyznačující se tím, že jako nosič obsahuje pufr.

    -1711. Farmaceutický prostředek podle nároku 10, vyznačující se tím, že jako pufr obsahuje hydrogenuhličitan sodný.
11. 12. Dvousložkový farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že jako první složku obsahuje farmaceutický prostředek, jak je definován v nárocích 9 až 11, a jako druhou složku obsahuje sterilní ředidlo pro rekonstituci první složky.
12. 13. Způsob přípravy soli N-(4-[Ν,Ν-bis(2-jodethyl)amino]fenoxykarbonyl)-L-glutamové kyseliny s jodovodíkovou kyselinou, vyznačující se tím, že se odstraní chránící skupiny ve sloučenině obecného vzorce I

    O

    I kde Prl a Pr2 jsou chránící skupiny, v přítomnosti kyseliny jodovodíkové za vzniku soli N-(4-[Ν,Ν-bis(2-jodethyl)amino]fenoxykarbonyl)-L-glutamově kyseliny s jodovodíkovou kyselinou.
13. 14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že Prl a Pr2 jsou terč.butylesterové skupiny.
14. 15. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že odstranění chránících skupin probíhá ve dvou stupních, přičemž Prl a Pr2 jsou nejprve terč.butylesterové skupiny, které se nahradí druhými chránícími skupinami, kterými jsou trimethylsilylové skupiny, načež se odstraní druhé

    -18chránící soli N- (· kyseliny
15. 16 .

    tím, skupiny v přítomnosti kyseliny jodovodíkové za vzniku -[N,N-bis(2 -jodethyl)amino]fenoxykarbonyl)-L-glutamové s kyselinou jodovodíkovou.

    Způsob podle nároku 13, vyznačující se že Pri a Pr2 jsou trimethylsilylové chránící skupiny.