SK6495A3

SK6495A3 - Method of microorganism killing

Info

Publication number: SK6495A3
Application number: SK64-95A
Authority: SK
Inventors: Kenneth L Rabone; Ziya Haq
Original assignee: Unilever Nv
Priority date: 1992-07-22
Filing date: 1993-07-14
Publication date: 1995-07-11
Also published as: HU9500176D0; CA2140896A1; TW272114B; AU4577493A; CN1086255A; KR950702386A; WO1994002022A1; HUT70688A; JP3133336B2; CZ14595A3; ES2130276T3; BR9306767A; DE69324015D1; PL173758B1; JPH07509236A; EP0652709A1; EP0652709B1; KR100252797B1; PL307168A1; DE69324015T2

Description

Oblasť techniky

Tento vynález sa týka germicidnych prípravkov, zvlášť na povrchové použitie, t.j. prípravkov, ktoré sú schopné rozrušovať alebo inaktivovať mikroorganizmy, najmä mikroorganizmy naviazané na povrchu.

V širšom poňatí vynález poskytuje povrchový germicídny prípravok s obsahom farbiva, ktoré je schopné fotodynamicky inaktivovať mikroorganizmy.

Doterajší stav techniky a podstata vynálezu

Odporúča sa použiť farbivo, ktoré vyvíja singletový kyslík pri expozícii svetla. Pri absorpcii svetelnej energie sa molekula farbiva konvertuje do energeticky vyššieho alebo vzbudeného stavu (S^») zo svojho východzieho elektrónového stavu (S_o). Elektrónové špiny sú párové a tak sú tieto v singletovom štádiu v zmysle spektroskopie, obsahujúc jednoduchý energetický stupeň v magnetickom poli.

Vzbudené štádium je krátkodobé a môže strácať energiu pri návrate do východzieho štádia množstvom spôsobov: emisiou kvanta svetla ako fluorescenciou; vnútornou konverziou, pretože energia je degradovaná na teplo; zrážkou s molekulou odlišnej látky (zhášacia fluorescencia).

Krátkodobé singletové štádium môže tiež podstúpiť proces nazývaný intersystémové skríženie na dlhšie trvajúce vzbudené štádium, tripletové štádium. Štádium je označené termínom tripletové, pretože elektrón na vyššom energetickom stupni nie je ďalej spinovo párovaný s elektrónom na nižšom stupni a vzbudené štádium má tri energetické hladiny v magnetickom poli.

Interakcia vzbudeného tripletového štádia s molekulárnym kyslíkom vo východzom štádiu, ktorý existuje normálne v tripletovom štádiu, regeneruje východzí stav farbiva, keď2 že energia je prenesená na kyslík, ktorý je podporovaný k elektronicky vzbudenému singletovému štádiu. To znamená, že za ideálnych podmienok jednoduchá molekula fotosenzibilizátora môže viacnásobne obnovovať svoju vlastnú koncentráciu singletového kyslíka.

Singletový kyslík je vysoko reaktívny a fotocitlivý, oxidačný proces touto cestou je známy ako fotooxidácia typu

II. Fotooxidácia typu II je nezávislá na fotosenzibilizátore použitom na obnovu singletového kyslíka. Dôležitým znakom fotosenzibilizátora je, aby mal vysoký kvantový výťažok tripletovej formácie, čo predstavuje, že ideálne, tripletové štádium, by malo byť utvorené pre každý absorbovaný fotón. Intersystémové skríženie na tripletové štádium je uľahčené v prítomnosti ťažkých atómov v molekule.

Fotooxidácia ktorejkoľvek vitálnej zložky organizmu môže mať za následok smrť buniek, bielkovina, polypeptid, aminokyseliny, lipidy s alylovými vodíkmi, tokoferoly, cukry a celulóza.

V súčasnosti sa dáva prednosť farbivám zahrňujúcim bengálsku ružovú (červená kyselina 94, Index farieb č. 45440), Erytrozín B (červená kyselina 51, Index farieb č. 45430)

- a sulfonáty ftalokyanínu, ako ftalokyanínsulfonát hlinitý (APS), ftalosulfonát zinočnatý (ZPS).

-í Bengálska ružová a Erytrozín B sú známe farbivá v potravinárstve (Bengálska ružová je potravinárska červeň č. 105 a Erytozín B je potravinárska červeň č. 14), a Erytrozín B je na zozname farbív EEC povolený pre použitie v kozmetických prípravkoch, takže tieto dve farbivá sú dobre vhodné na použitie v prípravkoch určených na použitie v domácnosti. Možno používať zmesi farbív a v niektorých prípadoch môže byť požadované, aby v zmesi bolo farbivo, ktoré zostane viditeľné na konci fotodynamického procesu.

Koncentrácia farbiva v prípravku nie je ohraničená a typicky až do 100 ppm, dobré výsledky sa získali s koncentráciami v rozmedzí lOppm až 20ppm. Nižšie koncentrácie, až do lppm by mali tiež vykazovať významné výsledky.

Singletový kyslík má krátku životnosť a preto krátku dĺžku dráhy rozptylu, takže kvôli účinnosti musí byť fotosenzitívne farbivo vyvíjajúce singletový kyslík v blízkosti cieľového substrátu. Preferované farbivá sú preto priamymi farbivami pre mikroorganizmy, t.j. schopné naviazania, typicky väzbou na bunkový proteín na povrchu organizmu alebo na iné bunkové zložky , ako napríklad bunkové tuky.

Preferované vyššie uvedené farbivá vyvíjajú singletový kyslík po expozícii svetla a sú priame pre proteín a tak sú schopné naviazať sa na mikroorganizmy prostredníctvom bunkového proteínu. Takýmto spôsobom je možné cielené usmrcovanie organizmov a teda germicídny účinok.

Tiež je výhodné použiť farbivo, ktoré sa po pôsobení svetla vybieli. Použitím foto-bieliaceho farbiva, ktoré je pre mikroorganizmy priame, je možné viditeľne usudzovať, že sú prítomné mikroorganizmy. Keďže sa farbivo vybieli, foto-dynamický účinok spôsobuje usmrtenie alebo inaktiváciu mikroorganizmov. V prítomnosti nízkych hladín svetla, tak bieliaca, ako aj fotodynamická aktivita sa prejavuje pomalšie, zatiaľčo pri vyšších intenzitách svetla pôsobia obidva procesy rýchlejšie. Teda, v závislosti na relatívnych rýchlostiach bieliacej a foto-dynamickej aktivity, prítomnosť • viditeľného farbiva naznačuje používateľovi, že foto-dynamická inaktivácia akýchkoľvek prítomných mikroorga4 nizmov je nekompletná.

Fotodynamická inaktivácia mikroorganizmov v suspenzii farbivami, ako bengálska ružová, je známa. Viď napríklad Journal of Applied Bacteriology 1985, (58), s. 391-400, Photochemistry and Photobiology 1988, (48), s. 607-612 (Necker et al.), a Shokuhin Eiseigaku Zasshi 1962, 10 (5), s.

344-347. Akokoľvek, teraz sa zistilo, že vhodné farbivá sú schopné foto-dynamickej inaktivácie mikroorganizmov na povrchoch a toto je základom predkladaného vynálezu. Je dobre známe, že mikroorganizmy sú oveľa viac citlivé na biocídy vo svojom planktónovom alebo suspendovanom stave: oveľa ťažšie sa inaktivujú ak sú prichytávané na povrchy, čo predstavuje ich obvyklý alebo uprednostnený stav. Mikroorganizmy sú normálne na povrchoch vo forme biofilmov, ktoré sú včlenené do matrice extracelulárneho materiálu. Tento extracelulárny materiál môže byť niekedy označený v literatúre ako adhezin. Preto nie je obvyklé, aby proces, ktorý pôsobí na mikroorganizmy v ich planktónovom štádiu, pôsobil na povrchovo naviazaných organizmoch bez potreby modifikácie. Povrchovo naviazané mikroorganizmy predstavujú dôležitý a podstatný prameň kontaminácie v domácnostiach, v inštitucionálnych a premyselných prostrediach, a predkladaný vynález môže umožniť cielený germicídny účinok na takéto mikroorganizmy.

Prípravky podľa predkladaného vynálezu sú zvlášť vhodné na použitie na tvrdých povrchoch v domácnosti a v priemysle, ako sú sklo, plasty, keramické a kovové povrchy. Prípravky sú zvlášť účinné na použitie na povrchoch, ktoré môžu zachytávať zeminu, ktorá je potencionálne kontaminovaná baktériami na povrchových nerovnostiach, na miestach spojov a v iných relatívne ohraničených oblastiach.

Prípravok je výhodne kyslej povahy, t.j. má pH v rozmedzí 3 až 5, t.j. pH asi 4, keďže sa zistilo, že kyslé prípravky majú podstatne zvýšenú účinnosť proti

Gram-negatívnym (G-) mikroorganizmom, v porovnaní s neutrálnymi prípravkami. Zdá sa, že účinnosť proti Gram-pozitívnym • (6+) mikroorganizmom nie je významne ovplyvnená pH. Prípravky sa môžu jednoducho acidifikovať použitím relatívne sla* bých organických kyselín, ako je kyselina octová.

Necker et al. (vyššie) uvádzajú prehľad, ktorý je v rozpore s tvrdením, že penetrácia bengálskej ružovej sama o sebe cez bunkovú stenu je základom pre inaktiváciu. Uvádzajú, že ich vlastné výsledky podporujú hypotézu o penetrácii farbiva primárne na báze rozdielnej inaktivácie G+ a Gdruhov. Obal G- baktérií má ďalšiu vonkajšiu membránu zloženú v podstate z lipopolysacharidu, ktorý Necker et al. označujú ako bariéru pre potenciálne toxické látky. Možným vysvetlením je, množstvo bielkoviny exponovanej v bunkových membránach je veľmi rozdielne u G+ a G- druhov, väčšie u G+ ako u G-, s väzbovou afinitou k farbivu, ktorá sa mení podľa pH. Koncentrácia farbiva naviazaného na bunkovú stenu by preto mohla byť funkciou pH. Táto interpretácia by mohla vysvetľovať naše zistenia v rozdieloch v miere usmrcovania podía pH (ale nie zjavnú rezistenciu G+ druhov B. subtilis a B. megaterium).

Nie je žiadny rozdiel medzi druhom B. subtilis tvoriacim endospóry a S. aureus , ktorý endospóry netvorí, pokiaľ ide o ich citlivosti voči fotodynamickému účinku bengálskou ružovou v neprítomnosti endospór. Zjavné rozdiely, ktoré ukázali naše štúdie sú podľa predpokladu zapríčinené prítomnosťou endospór u B.subtilis a B. megaterium. ktoré sú jasne viac rezistentné na singletový kyslík ako vlastné baktérie. Spóry prežívajú expozíciu voči bengálskej ružovej a svetlu a následne klíčia, aby vytvorili početné kolónie. Je známe, že spóry sa ťažko farbia a pravdepodobne nevykazujú afinitu voči bengálskej ružovej za žiadnych z použitých podmienok. V literatúre sa objavuje málo údajov o toxicite singletového kyslíka na spóry. Zo štúdií o možno menej rezistentných konídiách Neurospora crassa (Photochem Photobiol., 33, 349 (1981) je singletový kyslík z tohto aspektu účinný.

Prípravok môže ľubovoľne obsahovať ďalšie ingrediencie, ako jednu alebo viac povrchovo aktívnych látok, z dôvodov čistiacich účinkov a/alebo jedno alebo viac rozpúšťadiel.

- Povrchovo aktívna látka je výhodne alkoxylovaná, výhodnejšie etoxylovaná, napríklad je vo forme etoxylovaných al* koholov. Alkohol má výhodne 4 až 15 uhlíkových atómov, je v nerozvetvenej alebo rozvetvenej konfigurácii a jeho HLB hodnota, hydrofilno-1 ipofi Iná rovnováha, je v rozmedzí 10 až 14, napríklad 12.

Komerčne je dostupná široká paleta vhodných povrchovoaktívnych látok, jednou z nich je látka známa pod obchodným názvom Imbentin 91-35, od fy Kôlb , je to neionóvý alkoholetoxylát, ktorý má v priemere 5 molov etylénoxidu na 1 mol alkoholu.

Možno tiež použiť primárne etoxysulfáty.

Ak sa požaduje, môžu sa tiež použiť zmesi povrchovoaktívnych látok.

Povrchovoaktívna látka je výhodne neiónová alebo aniónová, alebo zmes oboch typov.

Výhodné aniónové povrchovoaktívne látky pre tento účel zahrňujú primárne alkylsulfáty (PAS), výhodne sodnú soľ dodecylsulfátu (SDS). Komerčné zmesi obsahujúce podstatný podiel dodecylsulfátu, napríklad Empicol LX, sú zvlášť výhodné. Dodecylsulfát je známy denaturačný prostriedok bielkovín, je vhodný na odstránenie bielkovín z povrchov a je biocídny.

Prípravok je s výhodou podstatne zbavený katiónovej povrchovoaktívnej látky, ale môže obsahovať menšie množstvo katiónového germicídu.

Povrchovo aktívna látka predstavuje množstvo v rozmedzí 0,05 až 2,5 % vztiahnuté na celkovú hmotnosť prípravku, typicky 0,5 % až 1,5 %, napríklad 0,7 % vztiahnuté na hmotnosť neiónovej povrchovoaktívnej látky, s ľubovoľným množstvom do 0,2 % vztiahnuté na hmotnosť aniónovej povrchovoaktívnej látky.

Rozpúšťadlo je s výhodou polárne a s nerozvetveným alebo rozvetveným reťazcom C2 až C5 alkoholu, ako etanol, butanol, izopropanol (propan-2-ol) (IPA), N-butoxypropan-2-ol (propylénglykol n-butyléter), 2-butoxyetanol (etylénglykol monobutyléter). V súčasnosti je výhodným rozpúštadlom IPA.

Možno tiež použiť dvojsýtny alkohol, ako etylénglykol, s vodou miešateľné étery, ako dimetoxyetán.

Zmesi rozpúšťadiel možno použiť, ak je to vhodné, napríklad zmesi etanolu a N-butoxypropan-2-olu.

Rozpúšťadlo je výhodne prítomné v rozmedzí množstva 2 až 20 % hmotn. z celkovej hmotnosti prípravku.

Aspoň niektoré z týchto rozpúšťadiel, napríklad etanol, oslabujú bunkové steny mikroorganizmov, zvyšujúc ich premeabilitu a tým sa mikroorganizmy stávajú citlivejšími na penetráciu singletového kyslíka. Toto predstavuje zvyšovanie usmrcovacieho účinku farbiva na mikroorganizmy.

Zistilo sa, že začlenenie povrchovoaktívnej látky môže znižovať foto-dynamický účinok farbív, pravdepodobne solubiLizáciou farbiva a zabraňovaním adsorpcie na bunkovú stenu, a použitie rozpúšťadla môže tiež znižovať foto-dynamický účinok farbív, možno kompetiticiou o singletový kyslík. Av šak, sa zistilo, že v trojzložkových prípravkoch, obsahujúcich farbivo, povrchovoaktívnu látku a rozpúšťadlo, je zníženie foto-dynamického účinku na farbivá menšie, ako by sa dalo očakávať od kombinovaných účinkov povrchovoaktívnej látky a rozpúšťadla. Povrchovoaktívna látka a rozpúšťadlo majú teda spolu synergický účinok, výsledkom ktorého je zníženie redukcie fotodynamického účinku farbiva.

Vo výhodnom uskutočnení teda predkladaný vynález poskytuje povrchovo čistiaci a germicídny prípravok, obsahujúci farbivo, ktoré je schopné foto-dynamicky inaktivovať mikroorganizmy, ďalej obsahujúci povrchovoaktívnu látku a rozpúšťadlo .

Prípravok môže obsahovať množstvo ľubovoľných zložiek, ktoré zahrňujú:

1. Detergentové aktivátory, výhodne chelátové činidlá kovov, ako napríklad kyselina etyléndiaminotetraoctová (EDTA). U chelátov zahrňujúc EDTA) sa vyžaduje, aby permeabilizovali bunkové steny, t.j., aby zvyšovali citlivosť organizmov voči biocídom.

2. Elektrolyt ako pufer alebo soľ, napríklad Na2S04, ktorý sa zúčastňuje na naväzovaní farbiva na bielkovinu podporením pohybu farbiva z vodnej fázy do soli bielkoviny. Elektrolyt je spoločne prítomný v rôznych vyrobených prípravkoch farbív, komerčne dostupných, hoci, ak je to potrebné, možno pridať ďalší elektrolyt. Celkové množstvo elektrolytu v prípravku by sa vo všeobecnosti malo pohybovať v rozmedzí od 0 do 1 % hmotn., výhodne okolo 0,1 %.

3. Vonné látky.

4. Zahusťovadlá.

Prípravok je vo forme izotropného, jednofázového preparátu a používa sa hlavne ako germicíd, s možnosťou využitia aj čistiacich schopností, na tvrdých povrchoch, so širokým spektrom aplikácií, zahŕňajúc domácnosti, napríklad povrchy v kuchyni a kúpeľni, vrátane záchodovej misy, v inštirúciach, ako sú školy, nemocnice, apod.., v priestoroch závodov, tovární, úradov, hotelov, apod.

Pre použitie v domácnosti je prípravok výhodne uspôso bený na aplikáciu zo spreja, je vhodne adjustovaný v zásobníku, napríklad s ručne ovládaným ventilom alebo s dávkovačom aerosólu. Výhodne je zásobník neprístupný prechodu svetla.

Pri použití je prípravok aplikovaný na povrchu, ktorý má byť ošetrený bežným spôsobom, napríklad spreiovanim z vhodného dávkovača, utieraním pomocou nosiča, ako je látka alebo špongia, alebo vyliatím zo zásobníka, apod. Tento spôsob, najmä pri čistení v priemysle, by mohol byť nasledovaný expozíciou svetelnému zdroju, napríklad bielemu svetelnému zdroju ako napríklad kremíková halogénová výbojka alebo fLuoresvenčný zdroj denného svetla. Spôsob by mohol predstavovať alternatívu oproti použitiu nebezpečnej germicídnej radiácie, napríklad z nízkotlakovej ortuťovej výbojky emitujúcej rezonančné žiarenie pri 254 nm. Takéto žiarenie je nebezpečné pre nechránený zrak. Za týmto vo všeobecnosti nasleduje oplachovací krok, napríklad utieraním s nosičom, aplikáciou prúdu tečúcej vody, apod.

V ďalšom, vynález teda poskytuje spôsob usmrcovania baktérií na povrchu, zahrňujúci aplikáciu prípravku na povrch, podľa vynálezu.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Vynález bude ďalej opísaný ilustračne na nasledovných prik Ladoch a pomocou údajov, ktoré sprevádzajú obrázky, v ktorých:

Obr. 1 znázorňuje dva pásové diagramy log (redukcia) hodnôt, znázorňujúcich letálny účinok bengálskej ružovej a svetla na rôzne mikroorganizmy v suspenzii pri pH 4 a pH 7, na obr. la sú znázornené výsledky pre Gram-pozitívne mikroorganizmy a na obr. lb výsledky pre G-negatívne organizmy a pre kvas inky;

Obrázok 2 predstavuje pár grafov log (redukcia) versus pH vyjadrujúcich biocídny účinok bengálskej ružovej a svetla na

S.aureus a E. coli ako funkciu pH, na obr. 2a sú vyjadrené výsledky po 20 minútach expozícii svetla, na obr. 2b výsled ky po 60 minútovej expozícii;

Obrázok 3 predstavuje pár grafov podobných tým na obr. 2, s tým rozdielom, že bengálska ružová je nahradená Erytrozínom B;

Obrázok 4 predstavuje dva pásové diagramy log (redukcia) znázorňujúcich fotohygienický účinok rôznych kombinácií bengálskej ružovej (RB), Imbentinu C91-35 (AE), izopropanolu (IPRA) a Empikolu LX (PAS), pričom obr. 4a vyjadruje výsledky získané bez expozície svetla a obr. 4b výsledky získané s expozíciou svetla;

Obrázok 5 predstavuje grafické znázornenie adsorpcie bengálskej ružovej u E. coli s adsorbovaným množstvom (nanomoly) versus rovnovážna koncentrácia (mikromoly / 1), s výsledkami pri pH 4 znázornenými štvorčekmi a s výsledkami pri pH 7 znázornenými krížikmi;

Obrázok 6 predstavuje dvojicu grafov podobných tým na obr. 5, ktoré vyjadrujú účinok elektrolytu, pričom obr. 6a znázorňuje výsledky pri pH 4 a obr. 6b výsledky pri pH 7, výsledky bez aditíva vyjadrujú štvorčeky, výsledky so sulfátom sodným (1%) vyjadrujú krížiky a výsladky so sulfátom sodným (5%) znázorňujú dvojité krížiky;

Obrázok 7 vyjadruje dvojicu grafov podobných tým na obr. 5, ktoré znázorňujú účinok povrchovoaktívnej látky, pričom obr. 7a predstavuje výsledky pri pH 4 a obr. 7b výsledky pri pH 7, výsledky bez aditíva znázorňujú štvorčeky, výsledky s ne-iónovou povrchovoaktívnou látkou (0,7%) (NI) vyjadrujú štvorčeky a výsledky s PAS (0,7%) predstavujú dvojité štvorčeky ;

Obrázok 8 predstavuje dvojicu grafov podobných tým na obr. 5, ktoré znázorňujú účinok rozpúšťadla pri pH 4 , výsledky bez aditíva vyjadrujú malé štvorčeky, výsledky pre 10% IPA vyjadrujú krížiky , výsledky pre 0,7% Imbentin dvojité krížiky a výsledky pre 10% IPA a 0,7% Imbentin vyjadrujú veľké štvorčeky;

Obrázok 9 graficky znázorňuje log (redukcia) versus expozičný čas (min.) a vyjadruje účinok pH na rýchlosť usmrcovania E, coli bengálskou ružovou, výsledky pri pH 4 sú vyjadrené štvorčekmi a výsledky pri pH 7 krížikmi; a

Obrázok 10 predstavuje graf podobný tomu na obr. 9 a vyjadruje účinik elektrolytu pri pH 7 na rýchlosť usmrcovania E. coli bengálskou ružovou, výsledky bez elektrolytu vyjadrujú štvorčeky a výsledky so sulfátom sodným vyjadrujú krížiky.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Experimentálne postupy

Príprava inokula

Nasledovné mikroorganizmy ( vo všeobecnosti každý z národnej zbierky typizovaných kultúr (TCTC) alebo z americkej zbierky typizovaných kultúr) boli použité na opísané experimenty :

Baktérie:

Staphvlococcus aureus	NCTC 6538	(G+)
Escherichia coli	NCTC 8196	(G-)
Pseudomonas aeruginosa	NCTC 5940	(G-)
Enterobacter sp.	NCTC 3281	(G-)
Klebsiella sd.	ATCC 11677	(G-)
Bacillus subtilis	NCTC 6432	(G+)
Bacillus megaterium	NCTC 7581	(G+)

Kvasinky:

Candida albicans

Organizmy rástli inkubáciou vo výživnom bujóne pre baktérie cez noc pri 37 °C (28 °C pre Ps. aeruginosa) a alebo v SABS bujóne (SABS je Sabourandov dextrózny agar, s tekutým médiom v prípade SABS bujónu, od Oxoid Ltd.) pri 28 C pre kvasinky. Kultúry boli izolované vákuovou filtráciou za použitia 0,45 gm filtra Millipore a boli premyté štvrtinovou koncentráciou Ringerovho roztoku pred resuspendovaním v Ringerovom roztoku (10 ml). Organizmy v suspenzii boli vypočítané sériovým riedením a nanesené na výživný agar (baktérie) alebo na SABS agar (kvasinky) a celkový životaschopný počet (TVC) bol vyjadrený ako dekadický logaritmus počtu jednotiek tvoriacich kolónie (CFU) v ml. Experimenty sa vykonávali pri pH 7, pokiaľ nebolo špecifikované inak.

1) Disková metóda agarovej difúzie

Pripravili sa vodné roztoky s obsahom 100 ppm farbiva.

• Alikvotné množstvá (10ml) každého roztoku farbiva boli sterilizované v sklenených univerzálnych ampulkách so závitom.

* Antibiotické testovacie disky (13 mm z BDH) boli tiež sterilizované. Všetky organizmy vyrástli cez noc v nutričnom alebo SABS bujóne (10 ml).

Pre každý mikroorganizmus boli dve živné agarové platne (SABS pre kvasinky) naočkované kultúrou vyrastenou cez noc (10μ1), aby sa dosiahol rast pokrývajúci celú platňu. Použitím aseptickej techniky bol disk s antibiotikom ponorený do roztoku prvého farbiva a bol umiestnený na povrch naočkovanej agarovej platne. Toto sa opakovalo s ďalšími dvoma roztokmi farbiva, aby sa získali tri disky na duplikátoch platní .

z každého páru duplikátov platní bola okamžite do inkubátora pri vhodnej teplote s minimálnou svetla. Zostávajúce platne boli umiestnené na svetelnej skrinky na 3 hod. Osvetlenie zo svetelnej skrinky predstavovalo difúzne biele svetlo priemernej intenzity 4 000 luxov z fluorescenčných trubíc denného svetla (2x 15 wattov, Exal X-ray Accessories Ltd, Hemel Hempstead).

Intenzity svetla boli merané na povrchu difuzéra za použitia svetlometra Megatron DA10. Po expozícii boli platne cez noc inkubované a potom sa hodnotili na inhibíčne zóny okolo disku.

Použitím tohto postupu sa získali nasledovné výsledky:

Príklad 1 (Disková metóda)

Výsledky pre vodné roztoky farbiva bengálskej ružovej, Erytrozínu B a ftalokyanínsulfonátu hliníka (APS) (100 ppm) na

Jedna umiestnená expozíciou vrchnú časť agare pri pH po expozícii svetla 180 minút, ako je opísané vyššie, sú zosumarizované v tab. 1. Výsledky v tabuľke sú vyjadrené ako rozdiel ( v mm) medzi polomerom čírej inhibíčnej zóny ( plocha bez bakteriálneho rastu na rozotrenej agarovej platni) a polomerom disku. Teda, čím vyššia hodnota, tým účinnejšie usmrcovanie baktérií.

Agarová disková difúzna metóda označila bengálsku ružovú za viac účinnú ako štrukturálne podobný Erytrozín B. Je presvedčivé pripísať toto poradie rozdielu v kvantovom výťažku pre tvorbu singletového kyslíka. V metanole je kvantový výťažok pre tvorbu singletového kyslíka 0,76 pre bengálsku ružovú v porovnaní s 0,6 pre Erytrozín B. Akokoľvek možno očakávať, že sa množstvo ďalších faktorov môže podieľať na zistených rozdieloch, ako napríklad difúzna rýchlosť farbiva alebo rozdiely vo väzbe farbiva na agarový gél alebo diskový materiál.

Zvláštnym rysom výsledkov získaných pomocou diskovej metódy je jasné rozlíšenie v citlivosti Gram-pozitívnych (G+) a Gram-negatívnych (G-) organizmov voči fotodynamickému účinku, prinajmenšom pri pH 7. Možné príčiny relatívnej rezistencie G-organizmov sú diskutované inde.

2) Povrchový test Testovacie roztoky

Bengálska ružová (20 ppm) v pufri pH 4 a:

1. Bez prídavnej látky

2. Etanol (10 % obj.) a Imbentin C91-35 (0,7%).

3. Propan-2-ol (10 % obj.) a Imbentin C91-35 (0,7%).

Ako kontrola bol použitý roztok chlórnanu sodného (0,125%).

Stanovenie počtu organizmov adherovaných na podklad v Petriho miske

Mikroorganizmus, napríklad S. aureus. suspenzia (0, 5 ml) bol pridaný k roztoku (100 ml) štvrtinovo silného Ringerovho roztoku a stanovil sa priemer cfu per ml (TVC). Podie ly týchto roztokov (20 ml) boli napipetované do sterilných Petriho misiek a nechali sa 5 hod. pri izbovej teplote cez noc. Potom sa inokulum prenieslo pipetou do sterilnej fľašky a priemer cfu per ml , ktorý zostal v suspenzii, bol Stanovený. Počet organizmov (ako cfu) na cm adherovaný na Petriho misku bol vypočítaný z rozdielu koncentrácií roztokov.

Testovacia metóda

Bakteriálne suspenzie v štvrtinovej sile Ringerovho roztoku (20ml) boli napipetované do sterilných plastických Petriho misiek, ktoré sa nechali stáť pri izbovej teplote 5 hod. Inokulum bolo potom odstránené, misky sa premyli jedenkrát Ringerovým roztokom jemným rozvírením rukou a roztok bol vyliaty. Párové bakteriálne kontaminované platne boli opracované testovacími roztokmi. Podiel testovacieho roztoku (20 ml) bol vliaty do jednej misky a roztok bol dekantovaný o 30 sekúnd. Miska bola premytá pufrom pri pH 4, umiestnená na svetelnej skrinke na 20 minút. V oddelenom experimente bol roztok v druhej miske exponovaný na svetelnej skrinke 20 minút predtým, ako bol dekantovaný a miska bola premytá pufrom pH 4. Obidva experimenty sa opakovali.

Po expozícii svetla bola jedna z párových platní prevrstvená tryptónovo-sójovým agarom s obsahom 1% glukózy 0,015 % neutrálnou červeňou ochladenou na asi 50°C. Ďalšie párové platne sa farbili 0,01% akridínovou oranžou 30 sek., boli premyté a hodnotoli sa mikroskopicky ( Nikon Optiphot mikroskopom vybaveným lOOx apochromatickým imerzným objektívom, lOx okulárom a fluorescenčným prídavným zariadením s B2-A kombinovaným filtrom/dichroickým zrkadlom a super vysokotlakovou ortuťovou lampou. Navrstvené platne boli inkubované pri 37 °C 48 hodín, pokiaľ vyrástli kolónie adherentných baktérií, ktoré neboli usmrtené. Kol=onie vychytávali neutrálnu červeň a boli viditeľné a spočítateľné v agare na povrchu misky. (AMR MacKenzie a R L Rivera - Calderon, Agarová vrstviaca metóda na meranie adherencie Staphvlococcus epidermidis na 4 plastické povrchy, Appl. Environ. Mic14 robiol., 50, 1322 (1985).)

Platne farbené akridínovou oranžou boli hodnotené a fotografované. Počet farbených baktérií bol spočítaný v zornom poli (zhluky počítané ako 1), ktoré bolo predtým stanovené odfotografovaním škály mikrometra.

Príklad 2 (Povrchový test)

Povrchové testy kontrolných experimentov používajúcich epifluorescenčnú mikroskopiu, ako je opísané vyššie a suspenznú depléciu poskytli podobné hodnoty pre počet baktérií (s. aureus), ktoré sa prichytili k povrchu plastickej misky (rádovo 1 milión na cm ).

V protiklade povrch s pozitívnymi kontrolami (roztok chlórnanu sodného, 30 sekúnd) znižoval počet prežívajúcich baktérií na nulu. Výsledky pre fotodynamicky inaktivované baktérie sú zosumarizované v tab. 2 ako dekadický logaritmus redukcie (log redukcia) prežívajúcich baktérií pred a po expozícii, t.j. log (východzí počet) - log (konečný počet).

Príklad 3

Zloženie: bengálska ružová (20ppm), neiónová povrchovoaktívna látka (Imbentin C91-35, 0,7%), propán-2-ol (10%) (pH 4).

Experimentálny postup zodpovedá tomu, ktorý bol opísaný predtým, s výnimkou, že povrchové prichytenie baktérií vyžadovalo, aby boli v exponenciálnej fáze rastu. Toto sa dosiahlo inkubáciou v nutričnom bujóne (pre baktérie) alebo v SABS bujóne (pre kvasinky) v plastickej Petriho miske 3 hodiny. V príklade 2 sa suspenzia nerastúcich baktérií v Ringerovom roztoku nechala jednoducho stáť 5 hodín. Toto sa osvedčilo pre S. aureus , ale nie pre iné baktérie. Výsledky vyjadruje tab. 3.

Predchádzajúca skúsenosť s použitím epifluorescenčnej mikroskopie naznačuje, že kde sa získal splývajúci rast,možno tento považovať za ekvivalentný východzej povrchovej hustote životaschopných mikróbov radovo 1 mil./ cm^. Povrchová plocha použitých Petriho misiek bola asi 57 cm^, takže opracovávanie vo všetkých prípadoch redukovalo hladinu povrchovej kontaminácie o najmenej 5 radov amplitúdy (log 5).

Vykonávanie povrchových testov je obtiažnejšie v porovnaní so suspenznými testami a z tohoto dôvodu väčšina expe* rimentov bola prevádzaná v suspenzii, aby sa demonštroval účinok za meniacich sa podmienok.

3) Suspenzný test

Príprava roztokov

Zásobné roztoky boli pripravované navažovaním a boli sterilizované ( s výnimkou tých, ktoré obsahovali rozpúšťadlo) :

Bengálska ružová (0,2 %) v propan-2-ole (95 %)

Neiónová povrchovoaktívna látka (Imbentin C91-35, 14 %) (niekedy označovaná skratkou AE, pre alkohol etoxylát) Aniónová povrchovoaktívna látka (Empicol LX, 14 %) (niekedy označovaná ako PAS) « pufer pH 4 (kyselina citrónová (0,0,1 M, 307 ml) + dihyd.rofosforečnan sodný (0,2 M, 193 ml) • pufer pH 7 (ortodihydrofosforečnan sodný (0,4 M, 468 ml) + dodekahydrát ortohydrofosforečnanu dvoj sodného, (0,4M, 732 ml)

Pufre pH 5, 6, 8, 9 boli pripravené , ako uvádza CRC Handbook of Chemistry and physics, 8-36, 73. vyd., CRC Press (1992-1993)

Konečné koncentrácie v testovacích roztokoch boli typicky :

bengálska ružová - 20 ppm etanol - 10,0 % obj./na celkový objem povrchovoaktívna látka - 0,7 % hmotn./na celkový objem

V niektorých prípadoch boli použité rozdielne koncentrácie podľa špecifikácie.

Testovacia metóda

Testovacie roztoky boli doplnené v sterilných Petriho miskách do hĺbky 5 mm (30ml). Ku každému roztoku bola pridaná suspenzia mikroorganizmu (0,3 ml) a bola jemne vmiešaná. Ak mala byť v testovacom roztoku zahrnutá bengálska ružová, bola pridaná až nakoniec, aby sa minimalizovala expozícia svetla. Roztoky boli alebo exponované na svetelnej skrinke, umiestnenej v tme (podmienky zníženej svetelnej expozície) alebo boli nechané na laboratórnom stole. Priemerná intenzita na povrchu rozptylovača svetelnej skrinky bola 4 000 luxov a bola meraná svetlmetrom Megatron DA 10 (od fy Megatron Ltd.). Po špecifikovaných expozičných časoch, boli spočítané prežívajúce baktérie, ako jednotky tvoriace kolónie (cfu/ml) s následnou inkubáciou po sérii riedení a naočkovaní na agar. Stanovil sa dekadický logaritmus počtu baktérií zostávajúcich ako cfu/ml) a bol porovnaný s počtom pred expozíciou ako log ( východzí počet) - log (konečný počet). Čím je hodnota vyššia, tým je väčšie usmrcovanie baktérií.

Suspenzné testy boli vykonávané proti množstvu organizmov za rôznych podmienok, aby sa fotodynamický účinok voči záberu mikroorganizmov optimalizoval, vrátane Gram - negatívnych organizmov a kvasiniek. Výstupné výsledky sú zosumarizované v zodpovedajúcich tabuľkách. V týchto tabuľkách sú výsledky vyjadrené ako dekadický logaritmus pomeru počiatočného počtu jednotiek formujúcich kolónie k ich počtu po expozícii, log (redukcia). Použitím tohto označenia, hodnota 0 predstavuje, že po expozícii nedošlo k žiadnym zmenám v počte organizmov. Označenie + pred číslom log redukcie naznačuje, že sa nezistil žiadny rast mikroorganizmov (t.j. totálne usmrtenie).

Príklad 4

Suspenzné testy sa vykonávali, ako je opísané vyššie, z dôvodu, aby preukázali letálny účinok bengálskej ružovej a svetla na mikroorganizmy v suspenzii; najmä synergizmus nízkeho pH a etanolového rozpúšťadla. Testy boli vykonávané s bengálskou ružovou (20 ppm) samostatne alebo s etanolom (10 % obj./celkový objem, s expozíciou svetla 20 minút (svetelná skrinka). Výsledky vyjadrené ako hodnoty log (redukcia) uvádza tab. 4.

Dlhšie expozičné časy ( 60 a 100 minút) zvyšujú účinnosť voči Gram negatívnym organizmom, zvlášť pri pH 7.

Bude zrejmé, že účinnosť voči Gram negatívnym organizmom je výrazne zvýšená pri pH 4 v porovnaní s pH 7.

Príklad 5

Suspenzné testy boli vykonávané, ako je uvedené vyššie, pri pH 4 a pH 7, aby sa preukázal letálny účinok bengálskej ružovej (20 ppm) a svetla (20 minútová expozícia na svetelnej skrinke) u rôznych Gram-pozitívnych a Gram-negatívnych mikroorganizmov a kvasiniek v suspenzii, a výsledky vyjadrené ako log (redukcia) sú uvedené na obr. la a lb, obr. la uvádza výsledky pre Gram-pozitívne mikroorganizmy a obr. lb výsledky pre Gram-negatívne mikroorganizmy a kvasinky.

Príklad 6

Suspenzné testy boli vykonávané, ako je uvedené vyššie, v rozmedzí rôznych pH, aby sa preukázal biocídny účinok bengálskej ružovej (20 ppm) a svetla na S. aureus (G+) a E. coli (G-) ako funkcia pH a výsledky vyjadrené ako log (redukcia) sú graficky znázornené na obr. 2a (expozičný čas 20 minút) a 2b (expozičný čas 60 minút). Na obrázkoch krížiky ukazujú výsledky pre kontrolu (G-), dvojité krížiky pre E. coli. obrátené trojuholníky ukazujú výsledky pre S. aureus.

Podobné suspenzné testy sa vykonávali, aby sa preukázal biocídny účinok Erytrozínu B a svetla na S. aureus a E. coli ako funkcia pH, a výsledky sú graficky znázornené na obr. 3a a 3b, ktoré sú inak identické s obr. 2a a 2b. Tieto ukazujú, že Erytrozín B účinkuje podobne ako bengálska ružová, čo sa týka jeho fotobiocídneho profilu s pH.

Príklad 7

Ďalšie suspenzné testy boli vykonávané, ako je uvedené vyššie pri pH 7 za použitia nasledovných roztokov: Neiónová povrchovoaktívna látka Imbentin C91-35 (0,7%) Imbentin C91-35 (0 až 7 %) s bengálskou ružovou (100 ppm) Aniónová povrchovoaktívna látka Empicol LX (0,7%) Empicol LX s bengálskou ružovou (100 ppm)

Imbentin C91-35, Empicol LX ( oidva 0,7%) a bengálska ružová (100 ppm).

Výsledky sú vysvetlené v tabuľke 5. V tab. termín tma označuje podmienky redukcie svetelnej expozície lepšie ako totálna tma , kvôli praktickým problémom zabránenia nejakej svetelnej expozície.

V tabuľke termín svetlo označuje výsledky, ktoré sú priemerom niektorých pokusov prevádzaných v časových rozmedziach (20 minút, 1 hodinu, 3 hodiny) v štatisticky navrhnutom experimente.

Výsledky získané podobne pre E. coli pri pH 7 sú graficky znázornené v stĺpcových diagramoch na obr. 4. Na tomto obrázku je PAS použitá skratka pre Empicol LX, IPA je skratka pre izopropanol a AE je skratka pre Imbentin C91-35. Tento obrázok reprezentuje priemerné údaje pre AE 0,7%, PAS 0,7%, IPA 10%.

Príklad 8

Ďalšie suspenzné testy boli vykonávané pri pH 4 pre E. coli za použitia jednej alebo viacerých nasledovných látok: bengálska ružová 40 ppm, povrchovoaktívna látka 0,7% (Imbentin C91-35 alebo Empicol LX), IPA (izopropanol) 10%. Výsledky vyjadruje tab. 6.

Nasledujúce príklady zahrňujú suspenzné testy vykonávané vo všeobecnosti, ako je opísané vyššie, ale pri pH 4. Bengálska ružová, ak bola použitá, bola v koncentrácii 20 ppm, hoci v niektorých prípadoch kontrolné roztoky bez bengálskej ružovej boli exponované svetlom a tieto výsledky sú uvedené v stĺpci s označením Žiadna bengálska ružová.

Príklady 9, 10, 11 a 12 použili Gram pozitívny organizmus S. aureus, a príklady 13 a 14 Gram negatívny organizmus E. coli.

Ďalšie použité reagensy sú uvedené v príkladoch. Vo všetkých týchto príkladoch boli vzorky exponované 20 minút na svetelnej skrinke. Priemerná intenzita na povrchu difuzéra bola 4 000 luxov meraných svetlometrom Megatron DA 10 (od fy Megatron Ltd.).

Príklad 9

Suspenzné testy sa vykonávali s použitím bengálskej ružovej , etanolu a Imbentinu C91-35, so S. aureus. Dekadický logaritmus východzej koncentrácie, log (štart) pre S. aureus bol 6,8. Výsledky znázorňuje tab. 7.

Príklad 10

Suspenzné testy sa vykonávali s použitím bengálskej ružovej , Dowanolu PnB a Imbentinu C91-35, so S. aureus. Log (štart) bol 6.9. Výsledky znázorňuje tab. 8.

Tento príklad ukazuje, že Dowanol PnB vykazuje určité biocídne vlastnosti.

Príklad 11

Suspenzné testy sa vykonávali s použitím bengálskej ružovej , etylénglykolu a Imbentinu C91-35, so S. aureus. Log (štart) bol 6,8. Výsledky znázorňuje tab. 9.

Príklad 12

Suspenzné testy sa vykonávali použitím bengálskej ružovej , IPA a Lialetu 111, so S. aureus. Lialet 111 je obchodný názov prípravku sulfátéteru, komerčne dostupného z Enichem-u , s priemernou dĺžkou reťazca 11 , s priemerným stupňom etoxylácie 3. Log (štart) bol 6.7. Výsledky vyjadruje tab. 10.

Príklad 13

Suspenzné testy sa vykonávali s použitím bengálskej ružovej , propan-2-olu a Imbentinu C91-35, s E, coli. Log (štart) bol 6.8.

Výsledky vyjadruje tab 11.

Príklad 14

Suspenzné testy sa vykonávali s použitím bengálskej ružovej , etanolu a Imbentinu C91-35, s E. coli. Log (štart) bol 7,1. Výsledky sú znázornené v tab. 12.

Príklad 15

Adsorpcia bengálskej ružovej bola stanovená z deplécie koncentrácie roztoku. Koncentrácie sa získali spektroskopicky z absorbancií nameraných pri vlnovej dĺžke maximálnej absorbancie (ca. 549 nm) za použitia VPA Linton S110 spektrofotometra na supernantantových kvapalinách zbavených mikróbov centrifugáciou.

Výsledky znázorňujú obrázky 5 až 8.

Výsledky ukazujú, že fotobiocídny účinok závisí od adsorpcie farbiva. Adsorpcia farbiva je:

a) zvýšená pri nízkom pH (obr. 4);

b) zvýšená pri neutrálnom elektrolyte (ktorý tiež zvyšuje fotobiocídny účinok pri neutrálnom pH na E. coli (obr. 6);

c) znížená povrchovoaktívnou látkou ( obr. 7);

d) zvýšená propan-2-olom (obr. 8).

Prepočty ukazujú, že množstvo naadsorbované na E. coli je v správnom poradí veľkosti pokrytia monovrstvy, ukazujú, že farbivá agregujú a prepočítaný povrch E. coli musí byt hodnotený nižšie (neuvažuje sa o fimbriách a pilusoch). Stručné detaily výpočtov sú uvedené nižšie. Molekulárne dimenzie bengálskej ružovej boli zobraté zo stupnicového modelu ( Catalin Povrchová plocha E. coli Plocha bengálskej ružovej

Pokrytie monovrstvy

Nameraná adsorpcia počet molekúl

Príklad 16

Ltd., Londýn).

1E7 nm²

O nm (rovná)

0,5 nm² ( bočná)

5E6 (rovná) alebo 2OE6 (bočná)

2-8 E-16 molov/baktérie

120 - 480 E6 per baktéria

Suspenzné testy sa vykonávali, ako je uvedené vyššie, aby stanovil vplyv na rýchlosť usmrcovania E. coli bengálskou ružovou (20ppm) na pH a pridanie elektrolytu (sulfát sodný, 5%) pri pH 7 a výsledky sú graficky znázornené na obr. 9 a 10.

Tabuľka 1 (Príklad 1)

Fotobiocídny účinok uvedených činidiel

Inhibičné zóny	okolo	disku
Mikroorganizmy	Gram typ	Bengálska ružová	Erytrozín B	APS
S.	aureus	+	4	1	2
B.	subtilis	+	3	1	1
B.	megaterium	+	3	1	1,5
E.	coli	-	0	0	0
K.	pneumoniae	-	1,5	0	3
Ps	aeruginosa	-	0	0	0
Enterobacter sp	.	0	0	0
C.	albicans		0	0	0

Tabuľka 2 (Príklad 2)

Letálny účinok bengálskej ružovej a svetla na Staphylococcus aureus prichytený na plastický povrch

Roztok	Log (pomeru)
Bengálska ružová	4,7
Bengálska ružová +
Imbentin C91-35 +
Etanol	6,0

Tabuľka 3 (Príklad 3)

Mikroor- Počet Výsledky ich rastu ganizmy experimentov pri agarovej technike

Kontrola Po expozícii

S.	aureus	1	splývajúci	rast	žiadny	rast
		2	splývaj úci	rast	žiadny	rast
E.	coli	1	veľký rast		45 cfu
		2	splývaj úci	rast	žiadny	rast
K.	pneumoniae	1	splývajúci	rast	žiadny	rast
		2	splývaj úci	rast	žiadny	rast
P.	aeruginosa	1	veľký rast		5 cfu
		2	splývaj úci	rast	žiadny	rast
C.	albicans	1	splývaj úci	rast	5 cfu
		2	splývaj úci	rast	4 cfu

Tabuľka 4 (Príklad 4)

Mikroorganizmy	Gram typ	Podmienky expozície
bez rozpúšťadla	s etanolom
pH 7	pH 4	pH 7	pH 4
S. aureus	+	7,0	7,1	7,1	6,9
B. subtilis	+	0,6	2,1	3,1	0,8
B. megaterium	+	1,3	0,3	1,1	0,3
E. coli	-	0,2	5,3	0,1	6,9
K. pneumoniae	-	0,9	5,6	0	7,0
Ps. aeruginosa	-	0	7,0	0	6,9
Enterobacter sp.	-	1,1	7,3	0	7,4
C. albicans		0	5,7	0	5,7
		Kontroly (bez Bengálskej	ružovej)
E. coli	-		0,1		0,8

Tabuľka 5 (Príklad 7)

Mikroorganizmy s	IMBENTÍN	IMBENTÍN/RB	EMPICOL	EMPICOL/RB
vetlo	tma	svetlo	tma	svetlo	tma	svetlo	tma
St. aureus	4,5	4,0	8,0	3,5	4,5	4,5	5,5	5,0
E. coli	9,0	9,5	10,5	10,0	5,5	5,0	6,5	6,0
Entero.	0	0	0	0	0	0	0	0
KlebsieU a	7,0	6,0	6,0	7,0	6,0	6,0	6,0	6,0
Ps. aerug.	0	0	0	0	0	0	0	0
C. albicans	0	0	1,0	1,0	2,5	1,5	3,0	0

Tabuľka 5 (Príklad 7) pokračovanie

Mikroor- IMBENTÍN/EMPICOL	IMBENTÍN/EMPICOL/RB	BENGÁL.RUŽOVÁ
gánizmy	svetlo	tma	svetlo	tma	svetlo	tma
St.aureus	3,0	4,0	2,0	0	4,0	0
E. coli	4,0	4,0	4,0	4,5	0	0
Entero.	0	0	0	0	0	0
Klebsiella	3,5	3,5	4,0	2,5	0	0
Ps.aerug.	0	0	0	0	0	0
C.albicans	0	0	0	0	0	0

Tabuľka 6 (Príklad 8)

	EXPOZIČNÉ ČASY
1 HODINA	2 HODINY	3 HODINY
svetlo	tma	svetlo	tma	svetlo	tma
Bengálska ružová	3,8	0,5	7,2	0,4	7,2	0,7
RB/Imbentin
C91-35	0,2	0,2	1,0	0,3	3,8	0,5
RB/Empicol LX	1,7	0,4	3,9	0,7	7,2	0,7
RB/IPA	5,4	3,6	4,7	5,0	7,2	7,2
Imbentin
C91-35	0,1		0,3		0,9
Empicol LX	0,1		0,6		1.0
IPA	0,3		1.7		4,4

Tabuľka 7 (Príklad 9)

Etanol %	Imbentín C91-35 %	Po svetelnej «	Log (redukcia) Bez expozícii Bengálskej ružovej
5	0,2	+ 6,8
5	0,6	4,6
10	0,6	+ 6,8
15	0,6	+ 6,8
5	-	+ 6,8	0,1
10	-	+ 6,8	- 0,4
15	-	+ 6,8	0,0
-	0,2	4,6	2,5
-	0,6	3,5	2,3
-	-	+ 6,8	2,3
Tabuľka	8 (Príklad	10)

Log (redukcia)

Dowanol	Imbentín	Po	Bez
%	C91-35 %	svetelnej expozícii	Bengálskej ružovej
3	0,7	+ 6,9
3	-	+ 6,9	4,0
-	0,7	5,2	3,4
-	-	+ 6,9

Tabuľka 9 (Príklad 11)

Log (redukcia)

V	Etylénglykol %	Imbentín C91-35 %	Po svetelnej expozícii	Bez Bengálskej ružovej
	10	0,7	+ 6,8
	10	-	+ 6,9	- 0,2
	-	0,7	+ 6,8	3,4
	-	-	+ 6,8

Tabuľka 10 (Príklad 12)

Propan- 2-ol %	Lialet 111 %	Po svetelnej	Log (redukcia) Bez expozícii Bengálskej ružovej
15	0,5	+ 6,7
15	-	+ 6,7	4,9
-	0,5	+ 6,7	+ 6,7
-	-	+ 6,7

Tabuľka 11 (Príklad 13)

Propan- 2-ol %	Imbentin C91-35 %	Po svetelnej	Log (redukcia) Bez expozícii Bengálskej ružovej
5	0,1	2,3
10	0,1	+ 6,8
10	0,5	+ 6,8
10	0,7	+ 6,8
-	-	4,8
5	-	5,5		0,3
10	-	3,0		1,9
-	0,1	1,2		1,3
-	0,5	1,0		1,2
-	0,7	1,1		1,1

Tabuľka 12 (Príklad 14)

Etanol Imbentin % C91-35 %

Log (redukcia)

Po Bez svetelnej expozíci i Bengálskej ružovej

5	0,2	4,1
15	0,6	+ 7,1
5	-	5,0	0,2
10	-	+ 7,1	0,2
15	-	+ 7,1	2,2
-	0,2	3,3	2,5
-	0,6	3,4	2,6
-	-	3,9

P/

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Spôsob usmrcovania mikroorganizmov prichytených na povrchu^ vyznačujúci sa tým, že obsahuj káciu prípravku s obsahom farbiva na povrch, pričom farbivo má schopnosť fotodynamicky inaktivovať mikroorganizmy.
2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že farbivo generuje singletový kyslík po expozícii svetla.
3. Spôsob podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že farbivo je pre mikroorganizmy priame.
4. Spôsob podľa nároku 1, 2 alebo 3, vyznačujúci sa tým, že farbivo po expozícii svetla vybledne .
5. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že farbivo je vybrané zo skupiny zahrňujúcej bengálsku ružovú, Erytrozín B a sulfonáty ftalokyanínu.
6. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že farbivo je prítomné v množstve v rozmedzí 1 až 100 ppm.
7. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že prípravok ďalej obsahuje jednu alebo viac povrchovoaktívnych látok.
8. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že povrchovoaktívna látka je alkoxylovaná.
9. Spôsob podľa nároku 8, vyznačujúci sa tým, že povrchovoaktívna látka je etoxylovaná.
10. Spôsob podľa nároku 7, 8 alebo 9, vyznačujúci sa tým, že povrchovoaktivna látka je aspoň prevažne neiónová a/ alebo aniónová.
11. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 7 až 10, vyznačujúci sa tým, že povrchovoaktivna látka je prítomná v prípravku v množstve v rozmedzí 0,05 až 2,5 % hmotn. na celkovú hmotnosť prípravku.
12. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že prípravok obsahuje jedno alebo viac rozpúšťadiel.
13. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že rozpúšťadlo je polárne.
14. Spôsob podľa nároku 13, vyznačujúci sa t ý m, že rozpúšťadlo je C2 až C5 alkohol s Lineárnym alebo rozvetveným reťazcom.
15. Spôsob podľa nároku 12, 13 alebo 14, vyznačujúci sa tým, že rozpúšťadlo je prítomné v množstve v rozsahu 2 až 20 % hmotn. na celkovú hmotnosť prípravku.
16. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že pH prípravku je v rozmedzí 3 až 5.
17. Spôsob podľa nároku 16, vyznačujúci sa tým, že pH prípravku je asi 4.
18. Spôsob usmrcovania mikroorganizmov prichytených na povrchu, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje povrchovú aplikáciu prípravku s obsahom farbiva schopného fotodynamicky inaktivovať mikro-organizmy a s obsahom povrchovoaktívnej látky a rozpúšťadla.