KR100252797B1 - 개선된살균조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명의 표면 살균 조성물은 미생물을 광역학적으로 불활성화시킬 수 있는 염색 물질로 이루어져 있다. 그 염색 물질은 바람직하게는 노광시에 싱글렛 산소를 발생시키며, 미생물에 대하여 견고하고, 편리하게는 로즈 벵갈, 에리스로신 B 및 프탈로시아닌 술포네이트로 이루어진 군으로부터 선택된다. 본 조성물은 임의로 세정 목적을 위해 1종 이상의 계면 활성제 및/또는 1종 이상의 용매 등의 기타 성분을 포함할 수 있다.

Description

[발명의 명칭]

개선된 살균 조성물

[발명의 분야]

본 발명은 특히 표면에 사용되는 살균 조성물, 즉 미생물, 특히 표면에 결합된 미생물을 멸균시키거나 불활성화시킬 수 있는 조성물에 관한 것이다.

[발명의 요약]

가장 넓은 의미에 있어서, 본 발명은 미생물을 광역학적(光力學的)으로 불활성화시킬 수 있는 색소를 포함하는 표면 살균 조성물을 제공한다.

노광시(露光時)에 단일상태(singlet) 산소를 발생시키는 색소를 사용하는 것이 바람직하다. 광에너지 흡수시에 색소 분자는 전자적 바닥 상태(So)로부터 더욱 활동적 또는 들뜬 상태(S₁ ^*)로 전환된다. (전자 스핀은 짝을 이루고 있으며, 따라서, 분광학 용어로 이들은 자기장 내에서 단일 에너지 준위(準位)를 갖는 단일 상태이다).

들뜬 상태는 존재 기간이 짧으며 열 방식, 즉 형광으로 광양자를 방출, 에너지가 열로 분해됨에 따른 내부 전환, 다른 물질 분자와의 충돌(형공 퀀칭)에 의하여 에너지를 잃고 바닥 상태로 돌아갈 수 있다.

존재 기간이 짧은 단일 상태는 존재 기간이 긴 들뜬 상태인 삼중상태(triplet)로 옮아가는 상호계(intersystem)라 부르는 과정을 거칠 수도 있다. (이 상태는 에너지 준위가 높은 전자는 에너지 준위가 낮은 전자와 더 이상 스핀 짝을 이루지 않으므로 "삼중상태"라 부르며, 들뜬 상태는 자기장내에서 세가지 에너지 준위를 갖는다.)

들뜬 삼중상태와 바닥 상태의 분자 산소(보통 삼중상태로 존재한다)와의 상호작용은 에너지가 전자적으로 들뜬 단일상태로 향상된 산소에 전달되므로 색소의 들뜬 상태를 재생시킨다. 이는 이상적인 환경하에서, 단일 광감화제 분자가 단일상태 산소의 자신의 농도를 수회 발생시킬 수 있다는 거을 의미한다.

단일상태 산소는 반응성이 높고, 이 과정을 통하여 진행되는 광감성화 산화 과정은 타입 II 광산화로 알려져 있다. 타입 II 광산화는 단일상태 산소를 발생시키기 위해 사용되는 광감화제와는 무관하다. 광감화제의 중요한 특징은 이것이 삼중상태 형성의 양자 수율이 높아야 한다는 것이다 (즉, 이상적으로는, 흡수된 각 광자에 대해 삼중상태가 생성되어야 한다). 삼중상태로 옮아가는 상호계는 분자 내의 무거운 원자의 존재에 의해 조장된다.

생물체의 생명 유지 성분(단백질, 폴리펩티드, 아미노산, 알릴성 수소가 있는 지질, 토코페롤, 당 및 셀룰로즈)의 광산화는 세포사(細包死)를 일으킬 수 있다.

현재 바람직한 색소에는 로즈 벵갈(Rose Bengal)(애시드 레드(Acid Red) 94, 색지수 45440), 에리스로신(Erythrosin) B(애시드 레드 51, 색지수 45430) 및 알루미늄 프탈로시아닌 술포네이트(APS) 및 아연 프탈로시아닌 술포네이트 (ZPS)와 같은 프탈로시아닌 술포네이트가 있다. 로즈 벵갈 및 에리스로신 B는 알려진 식용색소이고 (로즈 벵갈은 식용 색소 레드 105호이고, 에리스로신 B 식용 색소 레드 14호임), 에리스로신 B는 화장품에 사용될 수 있는 색소제의 EEC 목록에 있으므로, 이 두 가지 색소는 가정용품 조성물에 사용하기에 적합하다. 색소 혼합물들이 사용될 수 있으며, 어떤 경우에는 광역학적 과정이 끝났을 때 여전히 눈에 보일 수 있는 색소를 혼합물에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다.

조성물 중의 색소의 농도는 중요하지 않으며, 보통 100ppm 이하인데, 10내지 20ppm 범위에서 양호한 결과를 얻게 된다. 1ppm 정도의 저농도 또한 괜찮은 결과를 가져온다.

단일상태 산소는 존재 기간이 짧으므로 확산 과정이 짧은데, 효과적이기 위해서는 단일상태 산소를 생성하는 감광화 색소를 목표 물질에 근접시켜야 한다. 그러므로, 바람직한 색소는 통상 생물체 표면의 세포 단백질 또는 기타 세포 성분, 예컨대 세포 지방질 등에 결합시킴으로써, 미생물에 대해 견고하다(즉, 결합할 수 있다).

위에 언급된 바람직한 색소는 노광시에 단일상태 산소를 발생시키며 단백질에 대해 결합하므로, 세포 단백질을 통해 미생물에 결합할 수 있다. 이러한 방식으로, 목표로하는 미생물의 박멸과 따라서 살균 작용이 가능해진다.

노광에 의하여 표백되는 색소를 사용하는 것도 역시 바람직하다. 미생물에 결합한 광표백 색소를 사용함으로써, 미생물이 존재한다는 가시적인 표시를 얻는 것이 가능하다. 색소가 표백됨에 따라, 광역학적 작용이 진행되어 미생물의 박멸 또는 불활성화가 일어난다. 광량이 낮을 경우, 표백 작용 및 광역학적 작용은 더 느리게 진행될 것으로 믿어지며, 반면에 높은 광도하에서는 두 작용이 보다 빨리 일어난다. 따라서, 표백 작용 및 광역학적 작용의 상대 속도에 따라 가시적인 색소의 존재는 존재하는 임의 미생물의 광역학적 불활성화가 불완전하였음을 사용자에게 표시하여 주게 된다.

로즈 벵갈과 같은 색소에 의한 현탁액 상태의 미생물의 광역학적 불활성화는 알려져 있다. 예를 들면, 문헌(Journal of Applied Bacteriology 1985, [58] 391~400 페이지; Photochemistry and photobiology 1988, [48] 607~612 페이지 (Neckers et al) 및 쇼쿠힌 아이세이가꾸 자씨(Shokuhin Eiseigaku Zasshi) 1962, 10(5), 344~347페이지 등)을 참조하라. 그러나, 적합한 색소류는 표면의 미생물을 광역학적으로 불활성화시킬 수 있다는 것을 밝혀냈고, 이것이 본 발명의 토대이다. 미생물들은 플랑크톤 상태나 현탁 상태에서 살생제에 훨씬 더 민감하다는 것은 잘 알려져 있다. 즉, 미생물들은 통상의 상태 또는 바람직한 상태로 표면에 부착되어 있을 때에는 불활성 시키는 것이 훨씬 어렵다. 미생물들은 보통 "바이오 필름"의 형태로 표면상에 있는, 즉 외세포 물질의 매트릭스내에 묻히게 된다. 이러한 외세포 물질은 문헌에서 "아드헤신(adhesin)"이라고도 일컫어지는 경우가 있다. 따라서, 플랑크톤 상태의 미생물에 작용하는 공정은 변형이 요구되는 일이 없이 표면 결합 미생물에 작용한다는 것은 분명하지 않다. 표면 결합 미생물은 가정, 연구소 및 산업 환경에서 중요하고 실질적인 오염원이며, 본 발명은 이러한 미생물을 목표로한 살균 작용을 가능케 하는 것이다.

본 발명에 다른 조성물은 유리, 플라스틱, 세라믹 및 금속 표면 등의 경질(硬質)의 가정용 또는 산업용 표면에 사용하기에 특히 적합하다. 상세히 말하자면, 이 조성물은 표면 결함, 조인트 및 기타 비교적 한정된 부분에 있어서의 세균 감염의 잠재성이 있는 항만 토양일 수 있는 표면에 사용하는 데 효과적이다.

산성 조성물이 중성 조성물에 비해 그람 음성 균(G-)에 대해 효과가 상당히 높다는 것이 밝혀져 있으므로, 그 조성물은 바람직하게는 예컨대 pH 3 내지 5 예너대 pH 약 4의 산성이다. 그람 양성 균(G+)에 대한 효과는 그다지 pH에 의해 영향을 받지 않는 것으로 보인다. 이들 조성물은 비교적 순한 유기산 예를 들면, 아세트산을 사용하면 쉽게 산성화된다.

넥커(Neckers) 등 (상기 참조)은 로즈 벵갈 색소 자체가 세포벽을 통해 침투하는 것이 불활성화에 필수적이라는 상반되는 증거를 검토하였다. 이들은 그들 스스로의 결과가 G+ 및 G- 종의 구별되는 불활성화에 주로 기초한 색소 침투 가설을 뒷받침한다고 제안하였다. G- 균의 껍질은 넥커 등이 잠재적으로 독성 물질에 대해 방벽으로 작용한다고 여긴 리포폴리사카리드로 실질적으로 구성된 부가적 외세포막을 지닌다. 또 다른 해석은 세포벽에 노출된 단백질의 양이 pH에 따라 변화하는 색소의 결합 친화력으로 G+와 G-종 간에 매우 다르며, G+가 G-보다 크다는 것이다. 따라서, 세포벽에 결합된 색소의 농도는 pH의 함수일 것이다. 이러한 해석은 pH에 따른 사멸 속도의 차이를 설명하기는 하나, G+ 종인 비. 서브틸리스(B. subtilis) 및 비. 메가테리움(B. megaterium)의 현저한 내성을 설명하지는 못하고 있다.

내생포자가 없을 경우의 로즈 벵갈에 의한 광역학적 작용에 대한 감수성에 있어서 내생포자 형성종인 비. 서브틸리스와 내생포자 비형성종인 에스. 아우레우스(S. aureus) 사이에는 아무 차이도 없다. 우리의 연구에서 나타난 분명한 차이는 세균 그 자체보다도 단일상태 산소에 대해 분명히 내성이 더 큰 비. 서브틸리스와 비.메가테리움에서의 내생포자의 존재에 기인한 것으로 추정된다. 포자는 로즈 벵갈에 대한 노출 및 노광에도 살아 남고, 이어서 발아하여 셀 수 있는 콜로니를 형성한다. 포자는 염색하기 어렵다고 알려져 있으며, 사용된 어떠한 조건 하에서도 로즈 벵갈에 대한 친화력이 없는 것으로 추정된다. 포자에 대한 단일상태 산소의 독성에 대한 기록은 문헌에 거의 나와 있지 않다. 가능하게는 내성이 적은 뉴로스 포라 크라싸(Neurospora crassa)의 코니디아(conidia)에 대한 연구(Photochem. Photobiol., 33, 349(1981))에 의하면 단일상태 산소는 이러한 점에서 가능성이 있다.

조성물은 1종 이상의 (세정용) 계면 활성제 및/또는 1종 이상의 용매 등의 기타 성분을 임의로 포함할 수 있다. 계면 활성제는 바람직하게는 알콕시화되며, 더욱 바람직하게는 에톡시화되며, 예컨데 에톡시화 알콜 형태 등으로 된다. 알코올은 탄소 원자 수가 바람직하게는 4 내지 15이고, 직쇄 또는 분지쇄 배치이며, HLB값이 10 내지 14의 범위, 예컨대 12 (친수성 친유성 평형)이다.

넓은 범위의 적합한 계면 활성제가 시판되고 있는데, 그러한 것으로는 콜브(Kolb) 제품으로서 임벤틴(Imbentin) 91-35이라는 상품으로 시판되는 계면 활성제가 있는데, 비이온계 C9~11 알콜 에톡실레이트로서, 알콜 1몰당 평균 5몰의 산화 에틸렌을 갖는다.

일급 에톡시 술페이트 역시 사용될 수 있다.

필요한 경우 계면 활성제의 혼합물이 사용될 수도 있다.

계면 활성제는 바람직하게는 비이온계 또는 음이온계, 또는 이들 두가지의 혼합물이다.

이 목적에 바람직한 음이온계 계면 활성제에는 일급 알킬 술페이트(PAS) , 바람직하게는 소듐 도데실 술페이트(SDS)가 있다. 상당량의 도데실 술페이트를 함유하는 시판 혼합물(예, 엠피콜(Empicol) LX)이 특히 바람직하다. 도데실 술페이트는 공지의 단백질 변성제로서 단백질을 표면에서 제거시키는데 좋으며, 살균성이 있다.

조성물은 바람직하게는 양이온계 계면 활성제가 실질적으로 없는 것이 좋지만, 양이온계 살균제를 소량 함유할 수 있다.

계면 활성제는 바람직하게는 조성물 전체 중량에 대해 0.05 내지 2.5%, 통상적으로 0.5% 내지 1.5%를 조성하는데, 예컨데 0.7 중량%의 비이온계 계면 활성제와 최대 0.2 중량%인 임의량의 양이온계 계면 활성제로 이루어져 있다.

용매는 극성인 것이 바람직하며, 에탄올, 부탄올, 이소프로판올(프로판-2-올)(IPA), N-부톡시 프로판-2-올(프로필렌 글리콜 n-부틸 에테르), 2-부톡시 에탄올 (에틸렌 글리콜 모노부틸 에테르) 등의 직쇄 또는 분지쇄 C₂내지 C₅알코올이다. IPA가 현재로서는 바람직한 용매이다.

에틸렌 글리콜 등의 디히드로 알콜 및 디메톡시에탄 등의 물 혼화성 에테르도 역시 사용될 수 있다.

적절한 경우, 에탄올과 N-부톡시 프로판-2-올의 혼합물 등의 용매 혼합물이 사용될 수 있다.

용매는 바람직하게는 조성물 총 중량의 2 내지 20%의 양으로 존재한다.

이들 용매 중 적어도 일부, 예컨대 에탄올은 미생물의 세포벽을 약화시켜 침투를 더 좋게하고 단일상태 산소에 의한 침투에 더 감수성이 되게 한다. 이는 색소의 멸균 효과를 향상시키는 효과가 있다.

계면 활성제의 포함으로 색소의 광역학적 효과가 감소될 수 있고 (색소를 용해시키고 세포벽에의 흡착을 방지 함으로써 가능), 또한 용매의 포함으로 색소의 광역학적 효과가 감소될 수 있다(단일상태 산소와 경쟁에 의하여 가능)는 사실이 밝혀지게 되었다. 그러나 색소,계면 활성제 및 용매로 이루어진 3성분 제제를 사용하면, 색소의 광역학적 효과의 감소는 계면 활성제와 용매의 효과를 합한 것으로부터 예상되는 감소에는 미치지 못한다. 따라서, 계면 활성제와 용매가 함께 상승 작용 효과를 갖게 되고 그 결과 색소의 광역학적 효과의 감소가 낮아지게 된다.

바람직한 특징에 있어서, 본 발명은 따라서 미생물을 광역학적으로 불활성화 시킬 수 있는 색소와 계면 활성제 및 용매로 이루어진 표면 세정 및 살균 조성물을 제고한다.

상기 조성물은 다음 물질을 비롯한 다수의 임의 성분을 포함할 수 있다.

1. 세제 촉진제, 바람직하게는 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 등의 금속 킬레이트제, 또한, 금속 킬레이트제(EDTA를 비롯한)는 세포벽을 침투화시키는 것으로 주장되어 왔으며, 따라서 미생물을 살균제에 더욱 감수성으로 되도록 해준다.

2. 수상으로부터 단백질 염으로의 색소의 이동을 촉진시켜 단백질에 대한 색소의 결합을 돕는 작용을 하는 완충액 또는 황산나트륨 등의 염 등의 전해질, 전해질은 시판되고 있는 여러 종류의 색소 제제에 통상 존재하며, 필요한 경우 추가 전해질이 가해질 수는 있다. 조성물의 전체 전해질 함량은 통상적으로 0 내지 1중량%, 바람직하게는 약 0.1 중량%이다.

3. 향료.

4. 농후제.

본 발명의 조성물은 등방성의 단일상 조성물 형태이며, 주방과 화장실 변기를 비롯한 욕실 표면 등의 가정용 용도, 학교, 병원 등의 공공 기관에서의 용도와, 공장, 사무실, 호텔 등의 상용 건물에서의 용도 등 광범위한 범위의 용도를 비롯한 경질 표면에 대한 살균제로서 (또한 가능하게는 세정 효과를 가짐) 특별한 용도가 있다.

적어도 가정용 용도로, 바람직하게는 상기 조성물은 분무에 의한 용도로 만든 제품 형태로 조성되며, 적당한 용기, 예컨대 수동 조작용 방아쇠형 스프레이 또는 에어로졸 추진 분배기 등으로 간편하게 포장된다. 용기는 빛을 통과시키지 않는 것이 바람직하다.

사용시, 상기 조성물은 간편한 방식으로 처리되도록, 예컨대 적당한 분배기로 부터 분무하거나, 천이나 스폰지 등의 운반체로 닦아내거나 용기로부터 부어 내는 등의 방식으로 표면에 도포된다. 이러한 조작 다음에는 경우에 따라 특히 공업적 세정의 경우에는, 광원, 예컨대 석영 할로겐 램프 또는 형광 "일광" 광원 등의 백색 광원 등에 노출시킬 수도 있다(이 과정은 예를 들면 254nm에서 공명 방사선을 방출하는 저압 수은 방전 램프로부터 나오는 위험한 살균 방사선의 사용에 대한 대체 방안이 될 수 있다. 이러한 방사선은 가리개를 안한 눈에 해롭다). 일반적으로. 필요하다면 예컨대 담체, 흐르는 물 줄기 등을 이용하여 닦아냄으로써 헹구는 단계가 뒤따른다.

다른 특징에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따른 조성물을 표면에 도포하는 것을 포함하는 표면 세균을 사멸시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 다음의 실시예 및 첨부 도면을 참조하여 더욱 상세히 예시의 방법으로 설명하겠다.

상기 도면에 있어서,

제1도는 pH 4 및 pH 7의 현탁액 상태의 각종 미생물에 대한 로즈 벵갈과 빛의 사멸 효과를 설명하는 로그(감소치) 값의 두개의 막대 그래프를 보여주는데, 제1a도는 그람 양성균에 대한 결과이고, 제1b도는 그람 음성균 및 효모에 대한 결과이다.

제2도는 pH의 함수로 에스. 아우레우스 및 이. 콜라이(E. coli)에 대한 로즈벵갈 및 빛의 생독성 효과를 나타내는 1조의 로그(감소치) 대 pH의 그래프인데, 제2a도는 빛에 20분간 노출시킨 후의 결과이고, 제2b도는 60분간 노출시킨 후의 결과이다.

제3도는 로즈 벵갈 대신에 에리스로신 B를 사용하여 얻은 제2도와 유사한 1조의 그래프이다.

제4도는 로즈벵갈(RB), 임벤틴 C91-35(AE), 이소프로판올(IPA) 및 엠피콜 LX(PAS)의 각종 배합물의 광학적 위생 효과를 설명하는 로그(감소치)의 두개의 막대 그래프인데, 제4a도는 빛에 노출시키는 일이 없이 얻은 결과이고, 제4b도는 빛에 노출 후에 얻은 결과이다.

제5도는 이. 콜라이에 의한 로즈 벵갈의 흡착량(나노몰) 대 평형 농도(마이크로몰/l)의 그래프로서, pH 4에서의 결과는 정사각형, pH 7에서의 결과는 집자형으로 나타내었다.

제6도는 전해질의 효과를 표시한 것으로서 제5도와 유사한 1조의 그래프인데, 제6a도는 pH 4에서의 결과를 제6b도는 pH 7에서의 결과를 나타내고, 첨가제가 없는 경우의 결과는 정사각형, 1%의 황산나트륨을 첨가한 결과는 십자형, 그리고 5% 황산나트륨을 첨가한 결과는 쌍십자형으로 표시하였다.

제7도는 계면 활성제의 효과를 표시한 것으로서 제5도와 유사한 1조의 그래프인데, 제7a도는 pH 4에서의 결과를, 제7b도는 pH 7에서의 결과를 나타내고, 첨가제가 없는 경우의 결과는 정사각형, 비이온계 계면 활성제(0.7%)(NI)를 첨가한 결과는 십자형, 그리고 PAS(0.7%)를 첨가한 결과는 쌍십자형으로 표시하였다.

제8도는 pH 4에서의 용매의 효과를 나타낸 것으로서 제5도와 유사한 그래프이며, 첨가제가 없는 경우의 결과는 작은 정사각형, 10% IPA에 대한 결과는 십자형, 0.7% 임벤틴에 대한 결과는 쌍십자형, 그리고 10% IPA와 0.7% 임벤틴에 대한 결과는 큰 정사각형으로 표시하였다.

제9도는 로즈 벵갈에 의한 이. 콜라이의 사멸 속도에 대한 pH의 영향을 나타내는 로그(감소치) 대 노출 시간(분)의 그래프인데, pH 4에서의 결과는 정사각형, 그리고 pH 7에서의 결과는 십자형으로 표시하였다.

제10도는 로즈 벵갈에 의한 이. 콜라이의 살균 속도에 대한 pH 7에서의 전해질의 영향을 나타내는, 제9도와 유사한 그래프인데, 전해질이 없는 때의 결과는 정사각형, 그리고 황산나트륨이 있을 때의 결과는 십자형으로 표시하였다.

[실시예]

실험법

접종물의 준비

다음 미생물(일반적으로, National Collection of Type Culture(NCTC) 또는 American Type Culture Collection(ATCC)로 부터 분양됨)을 기재된 실험에 사용하였다.

세 균:

스타필로코커스 아우레우스 NCTC 6538 (그람 양성)

(Staphylococcus aureus)

에스케리키아 콜라이 NCTC 8196 (그람 음성)

(Escherichia coli)

슈도모나스 아에루기노사 NCTC 5940 (그람 음성)

(Pseudomonas aeruginosa)

엔테로박터 종 NCTC 3281 (그람 음성)

(Enterobacter sp.)

클렙시엘라 종 ATCC 11677 (그람 음성)

(Klebsiella sp.)

바실루스 서브틸리스 NCTC 6432 (그람 양성)

(Bacillus subtilis)

바실루스 메가테리움 NCTC 7581 (그람 양성)

(Bacillus megaterium)

효 모 :

칸디다 알비칸스

(Candida albicans)

세균의 경우 37℃에서 (슈도모나스 아에루기노사의 경우 28℃) 영양 브로스에서, 또는 효모의 경우 28℃에서 SABS 브로스 [SABS는 옥소이드사 (Oxoid Ltd.)에서 생산하는 SABS 브로스의 경우 액체 배지가 있는 사보란트 덱스트로즈아가(Sabrand Dextrose Agar)임]에서, 밤새 배양시켜 성장시켰다. 배지는 0.45㎛ 밀리포어(Millipore) 여과기를 사용하여 진공 여과로 분리시키고, 1/4 분 농도 링거(Ringer) 용액으로 세척한 후, 링거 용액 (10ml)에 재현탁시켰다. 현택액 중의 생물체를 연속 희석하고 영양 아가(세균의 경우) 또는 SABS 아가(효모의 경우)를 사용하여 평판에 도말함으로써 계수하고, 전체 생존 수(TVC)는 1ml당 콜로니 형성 단위(cfu) 수의 상용 로그 값으로 표시하였다.

달리 명시되어 있지 않는 한, 실험은 pH 7에서 수행하였다.

1) 아가 확산 원판법

색소 100 ppm을 함유하는 수용액을 제조하였다. 각 색소 용액 일정량(10ml)을 유리제의 만능식 나사 뚜껑 바이알 내에서 멸균시켰다. 항생제 분석용 원판(BDH로부터 13mm)도 역시 멸균시켰다. 모든 생물체를 영양 브로스 또는 SABS 브로스(10ml)에서 밤새 성장시켰다.

각 미생물에 대해 두 개의 영양 아가 평판(효모의 경우 SABS 아가)을 밤새 배양한 배지(10㎕)로 접종시켜 전체 평판에 걸쳐 풍부히 성장되도록 하였다. 무균법을 사용하여 한개의 항생제용 원판을 제1색소 용액에 담그고 접종된 아가 평판 표면에 올려 놓았다. 이것을 다른 두 색소 용액을 가지고 반복하여 같은 형태의 평판 위에 3개의 원판을 올려놓았다.

각조의 동일한 모양의 평판 중 한 개를 빛에 최소한 노출시키면서 적당한 온도의 배양기에 즉시 넣었다. 나머지 평판을 3시간 동안 광원 상자의 상부에 놓아 두었다. 광원 상자로부터의 조명은 형광 "일광" 튜브(2×15 와트, Exal X-ray Accessories Ltd., Hemel Hemstead로부터 평균 광도 4000 룩스의 백색광 조명을 확산시켰다. 광도는 메가트론(Megatron) DA 10 광도계를 사용하여 분산기 표면에서 측정하였다. 노광 후에 평판을 밤새 배양시키고 원판 주위의 억제 부위를 검사하였다. 이러한 방법을 사용하여, 다음의 결과들을 얻었다.

[실시예 1](원판 방법)

전술한 바와 같이 180분간 노광 후 pH의 로즈 벵갈, 에리쓰로신 B 및 알루미늄 프탈로시아닌 술포네이트(APS)(100 ppm)로 된 색소 수용액에 대한 아가에서의 결과를 표 1에 요약하였다. 이 표에 있어서, 결과들은 억제의 청정(淸淨) 부위(도말된 아가 평판 위에서 세균 성장이 없는 부위)의 반경과 원판 반경간의 차이(밀리미터)로서 표현하였다. 따라서, 수치가 클수록, 멸균량이 많다.

아가 확산 원판법에서는 로즈 벵갈이 구조적으로 비슷한 에리쓰로신 B보다 더 효과적인 것으로 나타냈다. 이는 단일상태 산소 형성에 대한 양자 수율의 차이에 기인한 것으로 보인다. 메탄올 중에서, 단일상태 산소 형성에 대한 양자 수율은 에리쓰로신 B가 0.6인데 비하여 로즈 벵갈은 0.76이다. 그러나, 기타 다수의 요인은 색소 확산 속도 또는 아가 젤이나 원판 재료에 대한 색소의 결합력 차이와 같은 관찰되는 차이에 기인하는 것으로 생각될 수 있다.

원판법에서 얻은 결과의 특징은 적어도 pH 7에서의 광역학적 작용에 대한 그람 양성균과 그람 음성균의 감수성이 현저히 구분된다는 점이다. 그람 음성균의 상대적 내성에 대한 가능한 이유는 추후 논의된다.

2) 표면 시험

시험 용액

pH 4의 완충 용액 중의 로즈 벵갈(20 ppm) 및,

1. 기타 첨가물 없음.

2. 에탄올 (10% v/v) 및 임벤틴 C91-35 (0.7%).

3. 프로판-2-올 (10% v/v) 및 임벤틴 C91-35 (0.7%).

차아염소산나트륨 용액 (0.125%)을 양성 대조군으로 사용하였다.

페트리 접시(Petri Dish) 바닥에 부착된 생물체 수의 평가

에스. 아우레우스 등의 미생물 현탁액(0.5ml)을 1/4 농도의 링거 용액의 분액 (100ml)에 첨가하고 평균 cfu/ml(TVC)를 측정하였다. 이들 용액의 분액(20ml)을 피펫을 사용하여 멸균 페트리 접시에 옮기고 5시간 동안 실온에 놓아두었다. 이어서, 피펫으로 접종물을 멸균된 병에 옮겨 현탁액 상태로 남아있는 평균 cfu/ml를 측정하였다. 페트리 접시에 부착되어 있는 cm²당 생물체의 수(cfu)로서 용액의 농도 차이로부터 계산하였다.

시험 방법

1/4 농도의 링거 용액 (20ml) 중의 세균 현탁액을 피펫으로 멸균 플라스틱 페트리 접시로 옮기고 실온에서 5시간 동안 놓아두었다. 이어서, 접종물을 제거하고, 그 접시를 손으로 약하게 흔들면서 링거 용액으로 1회 세척하고, 용액을 부어내어 버렸다. 세균으로 오염된 각조의 접시들을 시험 용액으로 처리하였다. 시험 용액의 분액(20ml)을 하나의 접시에 붓고 30초 후에 용액을 따라 버렸다. 접시를 pH 4 완충액으로 헹구고 20분간 광원 상자에 놓아두었다. 별도의 실험에서는, 상기 용액은 따라 버리기 전에 제2접시 내에서 20분간 광원 상자에 노출시키고, 그 접시는 pH 4 완충액으로 헹구어내었다. 양실험을 이중으로 하였다.

노광 후, 한쌍의 평판들 중의 하나에 약 50℃로 냉각시킨 1% 글루코즈와 0.015% 뉴트럴 레드(Neutral Red)가 함유된 트립톤 소야(Triptone Soya) 아가를 깔아주었다. 다른 한 쌍의 평판은 30초간 0.01% 아크리딘 오렌지로 염색시키고 헹구어 현미경(100배 아포크로맷 오일에 침지시킨 대물 렌즈, 10배 아이피스 및 B2-A 결합 필터/2 색성 거울 블럭 및 초고압 수은 램프가 있는 에피플루오레슨 부속품이 장착된 니콘 "옵티폿(Optiphot)" 현미경)으로 검색하였다. 깔려진 아가 평판들을 48시간 동안 37℃에서 배양하였고, 이때까지 사멸되지 않았던 부착 세균으로부터 콜로니가 성장되었다. 이들 콜로니는 뉴트럴 레드를 흡수하므로 식별될 수 있으며, 접시 표면의 아가 하에 계수하였다. [A M R MacKenzie 및 R L Rivera-Calderon, Agar Overlay Method to Measure Adherence of Staphylococcus epidermidis to Four Plastic Surfaces, Applied and Environmental Microbiology 제50권, 1322쪽 (1985) 참조].

아크리딘 오렌지로 염색한 평판을 검사하여 촬영하였다. 미리 마이크로미터스케일로 촬영하여 평가해놓은 시야의 영역에서 염색된 세균의 수를 계수하였다(세균 덩어리는 하나로 계수한다).

[실시예 2](표면 시험)

전술한 직접식 에피플루오로레슨스 현미경과 현탁액 소모를 모두 이용하는 대조 실험인 표면 시험에서 cm²당 1백만의 차수 플라스틱 접시 표면에 부착시킬 수 있는 세균(에스. 아우레우스)의 수는 비슷한 값을 나타내었다.

표면을 양성 대조군(차아염소산나트륨 용액, 30초)으로 접촉시킨 결과 생존하는 세균의 수는 0으로 감소하였다. 광역학적으로 불활성화된 세균에 대한 결과는 노광 전 및 후의 생존하는 세균의 감소량의 상용 로그(로그 감소치), 즉 로그(초기 계수)-로그(최종 계수)로 표 2에 요약되어 있다.

[실시예 3]

조성 : 로즈 벵갈(20 ppm), 비이온계 계면 활성제(임벤틴 C91-35, 0.7%)

프로판-2-올 (10%) (pH 4).

세균의 표면 부착이 세균으로 하여금 지수 성장 단계에 있도록 할 필요가 있는 것을 제외하고는 전술한 실험 방법을 행하였다. 이것은 3시간 동안 플라스틱제 페트리 접시 중의 영양 브로스(세균의 경우) 또는 SABS 브로스(효모의 경우)중에 배양시킴으로써 달성하였다. 실시예 2에 있어서, 링거 용액 중의 미성장 세균 현탁액을 5시간 동안 단순히 방치해 두었다. 이는 에스. 아우레우스의 경우에 효과가 좋았으나, 다른 세균의 경우에는 그러하지 않았다. 결과는 표 3에 나타내었다.

직접식 에피플루오레슨스 현미경을 사용한 종전의 경험으로 비추어, 전면성장이 일어나는 경우, 이는 cm²당 1백만의 차수의 생존하는 미생물의 초기의 표면 밀와 동일하였다. 사용된 페트리 접시의 표면적은 약 57cm²이므로, 모든 경우에 처리에 의해 그 표면 오염의 수준이 양에서 5 치수 이상으로 (로그 5) 감소하였다.

표면 시험은 현탁액 시험보다 수행하기가 더 어려우며, 이러한 이유로 여러 조건에서의 효과를 입증하기 위한 대부분의 실험을 현탁액 중에서 수행하였다.

3) 현탁액 시험

용액의 제조

다음의 저장 용액을 무게를 재고 멸균하였다 (용매를 함유하는 것은 제외).

프로판-2-올(95%)중의 로즈 벵갈(0.2%)

비이온계 계면 활성제 (임벤틴 C91-35, 14%)(때로는 알코올 에톡실레이트는 AE로 약칭함)

음이온계 계면활성제(엠피콜 LX, 14%) (때론 PAS는 약칭함)

pH 4 완충액(시트르산 (0.1M, 307ml) + 이염기성 인산나트륨(0.2M, 193ml)

pH 7 완충액(소듐 디히드로겐 오르토포스페이트 (0.4M, 468ml + 디소듐히드로겐 오르토포스페이트 도데카히드레이트, (0.4M, 732ml)

pH 5, 6, 8, 9의 완충액을 문헌(CRC Handbook of Chemistry and Physics, 8-36, 73판, CRC Press (1992-1993))에 지시된 대로 제조하였다.

시험 용액에서의 최종 농도는 통상 다음과 같았다.

로즈 벵갈 - 20ppm

에탄올 - 10.0%(v/v)

계면 활성제 - 0.7%(v/v)

어떤 실시예에서는 특정된 다른 농도가 사용되었다.

시험 방법

시험 용액은 멸균 플라스틱 페트리 접시에 5mm 깊이로 (30mls) 제조하였다. 미생물 현탁액(0.3ml)을 각 용액에 넣고 온화하게 혼합하였다. 로즈 벵갈을 시험용액에 투입하여야 할 경우, 이는 노광을 최소한으로 하기 위해 최후에 첨가하였다. 용액을 광원 상자에 노출시켜 암소(暗所)(노광이 감소된 상태)에 놓아두거나 벤치에 놓아두었다. 광원 상자 확산기의 표면에서의 평균 광도는 메가트론(Megatron) DA 10 광도계(Megatron Ltd.)로 측정했을 때 4000 룩스이었다. 특정된 시간 동안 노광시킨 후에, 연속 희석시켜 아가에 평판 도말시킨 다음 배양시켜 콜로니 형성 단위 (cfu/ml)로서 생존하는 세균 수를 세었다. 남아 있는 세균의 수(ml당 콜로니 형성 단위로)의 상용 로그를 측정하고 로그 (초기 계수)-로그(최종 계수)로서 노광전의 수와 비교하였다. 값이 높을수록 더 많은 수의 세균이 사멸되었다.

그람 음성균과 효모를 비롯한 일련의 미생물에 대한 광역학적 작용을 최적화 시키기 위해 다양한 조건하에 다양한 생물체에 대해 현탁액 시험을 행하였다. 현저한 결과들은 관련된 표에 요약되어 있다. 이들 표에 있어서, 결과들은 노광 후 남은 수에 대한 ml당 콜로니 형성 단위의 초기 계수의 비율의 상용 로그 값(로그 (감소치))으로 나타내었다. 이러한 표시를 사용할 때, 0은 조건에 노출 후의 생물체 수에는 아무런 변 화도 없다는 것을 의미한다. 로그(감소치) 앞의 "+" 기호는 미생물 성장을 관찰할 수 없음 (모드 사멸되었음)을 의미한다.

[실시예 4]

현탁액 중의 미생물에 대한 로즈 벵갈 및 빛의 사멸 효과, 특히 낮은 pH 및 에탄올 용매의 상승 작용을 입증하기 위해 상기한 바와 같이 현탁액 시험을 행하였다. 로즈 벵갈(20ppm) 단독 또는 에탄올(10% v/v)을 함께 사용하여 20시간 노광(광원상자)시켜 시험을 행하였다. 로그(감소치)로 표현된 결과들은 표 4에 나타내었다.

노광 시간(60 및 100분)이 길수록 특히 pH 7에서 그람 음성균에 대한 작용이 개선되었다.

pH 7과 비교시, pH 4에서의 그람 음성균에 대한 작용은 훨씬 더 개선되었다는 것을 나타냈다.

[실시예 5]

현탁액 중의 다양한 그람 양성균과 음성균 및 효모에 대한 로즈 벵갈 및 빛 (광원 상자에 20분간 노광)의 사멸 효과를 입증하기 위해 pH 4 및 pH 7에서 상기한 바와 같이 현탁액 시험을 행하였고, 로그(감소치)로 표현된 결과는 제1a도 및 제1b도에 나타나 있는데, 제1a도는 그람 양성균에 대한 결과이고, 제1b도는 그람 음성균 및 효모에 대한 결과이다.

[실시예 6]

pH의 함수로 에스. 아우레우스 (G+) 및 이. 콜라이(G-)에 대한 로즈 벵갈(20ppm) 및 광독성 효과를 입증하기 위해 상이한 pH 범위에서 상기한 바와 같이 현탁액 시험을 행하였고, 로그(감소치)로 표현된 결과는 제2a도 (노출 시간 20분) 및 제2b도(노출 시간 60분)에 나타나 있다. 도면에서 십자는 대조 그람 음성균에 대한 결과이고, 쌍십자는 이. 콜라이에 대한 결과이며, 역삼각형은 그람 양성균에 대한 결과이고, 삼각형은 에스. 아우레우스에 대한 결과이다.

pH의 함수로 에스. 아우레우스 및 이. 콜라이에 대한 에리스로신 B 및 광독성 효과를 입증하기 위해 유사한 현탁액 시험을 행하고, 그 결과를 제3a도 및 제3b도에 나타내었는데, 이들 도면은 어느 면에서는 제2a도 및 제2b도와 동일하다. 이는 pH에 따른 광독성 효과면에서 에리스로신 B가 로즈 벵갈과 유사하게 작용한다는 것을 나타낸다.

[실시예 7]

하기 용액을 사용하여 pH 7에서 전술한 바와 같이 현탁 시험을 더 행하였다.

비이온계 계면 활성제 임벤틴 C91-35 (0.7%)

로즈 벵갈 (100ppm) 이 첨가된 임벤틴 C91-35 (0.7%)

음이온계 계면 활성제 엠피콜 LX(0.7%)

로즈 벵갈(100ppm)이 첨가된 엠피콜 LX

임벤틴 C91-35, 엠피콜 LX (둘 다 0.7%) 및 로즈 벵갈 (100ppm).

결과는 하기 표 5에 나타나 있다. 조금이라도 노광되는 것을 피하는 것은 실질적으로 어려운 일이므로, 표에서 "암"이라는 용어는 완전한 암소(暗所)라기보다는 약간은 노광되는 광량이 감소된 상태를 의미한다. 표에서 "명"이라는 용어는 통계학적으로 고안된 실험에서 일정 범위의 시간(20분, 1시간, 3시간)에 걸쳐 수행된 수회의 실험의 평균 결과를 의미한다.

pH 7에서 이. 콜라이에 대해 유사한 방식으로 얻어진 결과는 제4도의 막대 그래프에 나타나 있다. 이 그래프에서, PAS는 엠피콜 LX, IPA는 이소프로판올, AE는 임벤틴 C91-35의 약자로 사용되었다. 이 그래프는 AE 0.7%, PAS 0.7%, IPA 10%에 대한 평균 자료를 나타낸다.

[실시예 8]

하기의 물질 중 1종 이상을 사용하여 pH 4에서 이. 콜라이에 대한 현탁 시험을 더 행하였다. 로즈 벵갈 40ppm, 계면 활성제 0.7% (임벤틴 C91-35 또는 엠피콜 LX), IPA (이소프로판올) 10%. 결과는 표 6에 나타나 있다.

하기 실시예는 pH 4인 점을 제외하고는 대체로 전술한 바와 같이 수행된 현탁 시험에 관한 것이다. 어떤 경우에는 로즈 벵갈이 없는 대조 용액을 노광시키고, 이들에 대한 결과는 "로즈 벵갈 없음" 이라고 상단에 표기하였으나, 로즈 벵갈은 사용시 20ppm의 농도로 존재하였다.

실시예 9, 10, 11 및 12에서는 그람 양성균인 에스.아우레우스를 사용하였고, 실시예 13 및 14에서 그림 음성균인 이. 콜라이를 사용하였다. 사용된 다른 시약들은 실시예에 지시되어 있다. 이들 모든 실시예에 있어서, 시료는 20분간 광원 상자에 노출시켰다. 확산기 표면에서의 평균 광도는 메가트론 DA 10 광도계(Megatron Ltd.)로 측정시에 4000 룩스이었다.

[실시예 9]

로즈 벵갈, 에탄올 및 임벤틴 C91-35를 사용하여 에스. 아우레우스에 대한 현탁 시험을 행하였다. 에스. 아우레우스의 초기 농도의 상용 로그 값(로그 초기값)은 6.8이었다. 결과는 표 7에 나타나 있다.

[실시예 10]

로즈 벵갈, 도완올(Dowanol) PnB 및 임벤틴 C91-35를 사용하여 에스. 아우레우스에 대한 현탁 시험을 행하였다. 에스. 아우레우스의 초기 농도의 상용 로그값(로그 초기 값)은 6.9이었다. 결과는 표 8에 나타나 있다.

이 실시예는 도완올 PnB가 생독성이 있음을 나타내고 있다.

[실시예 11]

로즈 벵갈, 에틸렌 글리콜 및 임벤틴 C91-35를 사용하여 에스. 아우레우스에 대한 현탁 시험을 행하였다. 로그 값(초기 값)은 6.8이었다. 결과는 표 9에 나타나 있다.

[실시예 12]

로즈 벵갈, IPA 및 리알렛(Lialet) 111를 사용하여 에스. 아우레우스에 대한 현탁 시험을 행하였다. 리알렛 111은 에니켐(Emichem)사의 에테르 술페이트 조성의 상품명이며, 평균 에톡시화 정도는 3이고, 평균 연쇄 길이는 11이다. 로그(초기값)은 6.7이었다. 결과는 표 10에 나타나 있다.

[실시예 13]

로즈 벵갈, 프로판-2-올 및 엠벤틴 C91-35를 사용하여 이. 콜라이에 대한 현탁 시험을 행하였다. 로그 (초기 값)은 6.8이었다. 결과는 표 11에 나타나 있다.

[실시예 14]

로즈 벵갈, 에탄올 및 임벤틴 C91-35를 사용하여 이. 콜라이에 대한 현탁 시험을 행하였다. 로그(초기 값)은 7.1이었다. 결과는 표 12에 나타나 있다.

[실시예 15]

로즈 벵갈의 흡착량을 용액 농도의 소모량으로부터 측정하였다. 원심 분리에 의해 미생물이 없는 상청액에 대하여 WPA 린톤(Linton) S110 분광광도계를 사용하여 최대 흡수 파장(약 549nm)에서 측정한 흡수도로부터 농도를 분광학적으로 구하였다.

결과는 제5도 내지 제8도에 나타나 있다.

이들 결과는 광생독성 효과가 색소 흡착량에 좌우된다는 것을 보여주고 있다.

색소 흡착량은

a) 낮은 pH에 의해 증가되고(제4도)

b) 중성 전해질에 의해 증가되며(이것은 중성 pH에서 이. 콜라이에 대한 광생독성 효과도 역시 증가됨)(제6도),

c) 계면 활성제에 의해 감소되고 (제7도),

d) 프로판-2-올에 의해 증가된다(제8도).

계산 값에 의하면 색소는 응집한다고 알려져 있고 계산된 이. 콜라이의 표면적을 과소 평가(섬모/선모는 불고려)하여야 하다고 가정한다면, 이. 콜라이에 대한 흡착량은 단층 작용 범위에 대해 충분한 차수의 양이라는 것을 보여준다. 그 계산의 상세한 내역을 아래에 간단히 나타낸다. 로그 벵갈의 분자 크기는 스케일 모델(Catalin Ltd., 런던)로부터 얻었다.

이. 콜라이의 표면적 1E7 nm²

로즈 벵갈의 면적 2nm²(평면)

0.5nm²(측면)

단층 작용 범위 5E6(평면) 20E6(측면)

측정된 흡착량 2-8 E-16 몰/세균

분자 수 120-480 E6/세균

[실시예 16]

상기한 바와 같이 현탁액 시험을 수행하여 pH의 로즈 벵갈(20ppm)과 pH 7에서 전해질(황산나트륨, 5%) 첨가에 의한 이. 콜라이의 사멸율에 대한 효과를 측정하고, 그 결과를 제9도 및 제10도에 각각 나타내었다.

[표 1] (실시예 1)

노출제의 광생독 효과

원반 주변의 억제 부위

[표 2] (실시예 2)

로즈 벵갈 및 빛의 플라스틱 표면에 부착된 스타필로코커스 아우레스(Staphylococcus Aureus)에 대한 사멸 효과

[표 3] (실시예 3)

[표 4] (실시예 4)

[표 5] (실시예 7)

[표 6] (실시예 8)

[표 7] (실시예 9)

[표 8] (실시예 10)

[표 9] (실시예 11)

[표 10] (실시예 12)

[표 11] (실시예 13)

[표 12] (실시예 14)

Claims (18)

1. 미생물을 광역학적으로 불활성화시킬 수 있는 색소를 포함하는 조성물을 미생물 부착 표면에 도포시키는 것을 포함하는 표면 부착 미생물의 사멸 방법.
2. 제1항에 있어서, 색소가 노광시 단일상태(singlet) 산소를 발생시키는 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 색소가 미생물에 결합가능한 것인 방법.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 색소가 노광에 의하여 표백되는 방법.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 색소가 로즈 벵갈, 에리스로신 B 및 프탈로시아닌 술포네이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 색소가 1 내지 100ppm의 양으로 존재하는 방법.
7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 조성물이 1종 이상의 계면 활성제를 더 포함하는 것인 방법.
8. 제7항에 있어서, 계면 활성제가 알콕시화된 것인 방법.
9. 제8항에 있어서, 계면 활성제가 에톡시화된 것인 방법.
10. 제7항에 있어서, 계면 활성제가 적어도 주로 비이온계 및/또는 음이온계인 것인 방법.
11. 제7항에 있어서, 계면 활성제가 조성물의 전체 중량에 대하여 0.05 내지 2.5% 범위의 양으로 존재하는 것인 방법.
12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 1종 이상의 용매를 더 포함하는 것인 방법.
13. 제12항에 있어서, 용매가 극성인 방법.
14. 제13항에 있어서, 용매가 직쇄 또는 분지쇄의 C2 내지 C5 알코올인 방법.
15. 제12항에 있어서, 용매가 조성물의 전체 중량에 대하여 2 내지 20% 범위의 양으로 존재하는 방법.
16. 제1항 또는 제2항에 있어서, 조성물의 pH가 3 내지 5 범위인 방법.
17. 제16항에 있어서, 조성물의 pH가 약 4인 방법.
18. 미생물을 광역학적으로 불활성화시킬 수 있는 색소, 계면 활성제 및 용매를 포함하는 조성물을 미생물 부착 표면에 도포시키는 것을 포함하는 표면 부착 미생물의 사멸 방법.