CZ14595A3

CZ14595A3 - Method of liquidation of surface unbound microorganisms

Info

Publication number: CZ14595A3
Application number: CZ95145A
Authority: CZ
Inventors: Kenneth Leslie Rabone; Ziva Haq
Original assignee: Unilever Nv
Priority date: 1992-07-22
Filing date: 1993-07-14
Publication date: 1995-10-18
Also published as: HUT70688A; WO1994002022A1; BR9306767A; CA2140896A1; CN1086255A; JP3133336B2; HU9500176D0; KR950702386A; AU4577493A; PL173758B1; PL307168A1; SK6495A3; JPH07509236A; DE69324015D1; EP0652709A1; EP0652709B1; KR100252797B1; ES2130276T3; TW272114B; DE69324015T2

Description

Způsob hubení povrchově navázaných mikroorganismů.

Oblast techniky

Vynález se týká germicidních' prostředků, zvláště k povrchovému použití, t j . prostředků schopných ničit nebo inaktivovat mikroorganismy, zejména takové, které jsou vázány na povrch.

Podstata vynálezu

V širším pojetí poskytuje předkládaný vynález povrchový germicidní prostředek, obsahující barvivo, které je schopno fotodynamicky inaktivovat mikroorganismy.

Přednost se dává použití barviva, které po vystavení světlu vytváří singletní kyslík. Absorbci světelné energie je molekula barviva ze svého základního elektronového stavu (Sq) přeměněna do energeticky náročnějšího nebo excitovaného stavufSjL*). (Elektronové spiny jsou párové a toto jsou tedy v jazyce spektroskopie singletní stavy, mající jednoduchou energetickou hladinu v magnetickém poli.

Excitovaný stav má krátké trvání a může ztrácet energii a vrátit se do základního stavu mnoha různými způsoby: emisí světelného kvanta ve formě fluorescence; vnitřní konversi, při níž je energie převedena na teplo; srážkou s molekulou odlišné látky (fluorescenční quenching).

Singletní stav s krátkou životností může rovněž procesem, nazývaným mezisystémový přestup (intersystem Crossing) přejit do déle trvajícího excitovaného stavu, stavu tripletního. (Tento stav je nazýván tripletním, nebo“ párován s elektronem na nižší hladině a excitovaný stav má v magnetickém poli tři energetické hladiny).

Interakce kyslíku v excitovaném tripletním stavu s molekulárním kyslíkem v základním stavu (který v tripletním stavu existuje běžně) regeneruje' barvivo do základního stavu, nebot dojde k převodu energie na kyslík, který je povýšen do elektronově excitovaného singletniho stavu. To znamená, že za ideálních okolností může jedna molekula fotosensitisační látky vytvářet singletní kyslík v mnohonásobku své vlastní koncentrace.

Singletní kyslík je vysoce reaktivní a fotosensitisační oxidace, probíhající tímto způsobem, je známa jako fotooxidace typu II. Fotooxidace typu II závisí na fotosensitisační látce, použité k vytvoření singletniho kyslíku. Důležitým rysem fotosensitisační látky je to, že by měla vytvářet velké množství tripletní formace (což ideálně znamená, že by tripletní stav měl být vytvořen pro každý absorbovaný foton). Mezisystémový přechod na tripletní stav je usnadněn přítomností těžkých atomů v molekule.

Fotooxidace kterékoli životné organismu může způsobit buněčnou polypeptidů, aminokyselin, lipidů s tokoferolů, cukrů a celulosy).

složky jakéhokoli smrt (bílkoviny, allylovými vodíky,

Mezi barviva, kterým se obvykle dává přednost, patří bengálská červeň (Kyselá červeň 94, v indexu barev číslo 45440), Erythrosin B (Kyselá červeň 51, v indexu barev číslo 45430) a ftalocyaninové sulfonáty, jako jsou sulfonát ftalocyaninu hlinitého (APS) a zinečnatého (ZPS). Bengálská červeň a Erythrosin B jsou známými potravinovými barvivý (bengálská červeň je potravinářská červeň č. 105 a Erythrosin B je potravinářská červeň číslo 14), a k používání v kosmetických výrobcích, takže jsou tal< dve barviva vhodná k použití v prostředcích, určených pro používání v domácnostech. Směs barviv může být rov; ěž použita a v některých případech může být žádoucí přimíchat do smési barvivo, které zůstane viditelné i po zkončení fotodynamického procesu.

Koncentrace barviva v prostředku není rozhodující a typicky bývá vyšší než 100 ppm. Dobré výsledky se získávají při použití koncentrací v rozmezí 10 až 20 ppm. Nižší koncentrace, do 1 ppm, by rovněž mohly poskytovat přijatelné výsledky.

Singletní kyslík má malou životnost a tím i krátkou dráhu difuse, takže k tomu, aby bylo fotosensitisacní barvivo, vytvářející singletní kyslík, účinné, musí se nacházet v blízkosti cílového substrátu. Barviva, jimž se dává přednost, jsou proto substantivní vůči mikroorganismům {tj. schopná se na ně vázat) a obvykle se vážou na buněčnou bílkovinu na povrchu organismu, nebo na jiné buněčné složky, jako jsou buněčné tuky.

Výše zmíněná barviva, jimž se dává přednost, vytvářejí singletní kyslík po vystaveni substantivní k bílkovině a tím mikroorganismus prostřednictvím umožňuje cílené zahubení mikroorganismu působení.

účinku světla a jsou jsou schopna navázán, na buněčné bílkoviny, To a tedy germicidní

Přednost se dává také použití barviva, které bledne po vystavení světlu. Při použití barviva blednoucího na světle, které je substantivní k mikroorganismům, může být prováděna visuální kontrola přítomnosti mikroorganismu. Se ztrátou barevnosti barviva probíhá fotodynamická akce, působící smrt nebo jinou inaktivaci mikroorganismů. Při nízké hladině postupují pomaleji, zatímco za vysoké intensity světla probíhají oba děje rychleji. V závislosti na relativních rychlostech blednutí a fotodynamické aktivity tedy přítomnost viditelného barviva ukazuje uživateli, že fotodynamická inaktivace kteréhokoli přítomného mikroorganismu není dokončena.

Fotodynamická inaktivace mikroorganismů v suspensi pomocí barviv jako je bengálská červeň je již známá. Viz například Journal of Applied Bacteriology 58, 391-400, 1985, Photocheiaistry and Photobiology 48, 607-612, 1988 (Neckers se spoluautory) a Shokuhin Eiseigaku Zasshi 10(5), 344-347, 1962. Nyní ovšem bylo zjištěno, že vhodná barviva jsou schopna fotodynamické inaktivace mikroorganismů na površích, a to je také základem předkládaného vynálezu. Je velmi dobře známo, že mikroorganismy jsou mnohem citlivější vůči biocidům, pokud se nacházejí v planktonovém nebo suspendovaném stavu: mnohem obtížněji se inaktivují, pokud jsou přichyceny na povrchy, což je jejich obvyklý nebo upřednostňovaný stav. Mikroorganismy obvykle ve formě biofilmú, tedy extracelulárního materiálu. Tento extracelulární materiál může být někdy v literatuře označován jako adhesin. Není proto obvyklé, že by proces, který účinkuje na mikroorganismy jejich planktonovém stavu, účinkoval i na povrchově vázané organismy, aniž by byla nutná jeho modifikace. Povrchově vázané mikroorganismy představují důležitý a podstatný zdroj znečištění (kontaminace) v prostředí domácností, institucí i průmyslu a tento vynález je schopen umožnit cílený germicidní zásah vůči takovým mikroorganismům.

budou na površích usazeny v matrixu

Prostředky podle předkládaného vynálezu jsou zvláště vhodné pro použití na tvrdé povrchy v domácnostech a v průmyslu, jako jsou skleněné, plastové, keramické a kovové povrchů, znečištění, kontaminaci spojovacích které mohou které by (zamoření) být příznivým prostředím pro mohlo působit bakteriologickou v povrchových poškozeních, a jiných poměrně nedostupných místech.

Prostředek je s výhodou kyselý, tj . o pH v rozmezí od 3 do 5, jako o pH přibližně 4, protože bylo zjištěno, že kyselé prostředky mají zásadně zvýšenou účinnost vůči Gram-negativním (G-) mikroorganismům ve srovnáni s prostředky neutrálními. Účinnost vůči Gram-positivním (G+) mikroorganismům se nezdá být významně ovlivněna hodnotou pH. Prostředky jsou obvykle okyseleny pomocí poměrně mírných organických kyselin, jako je kyselina octová.

Neckers se spoluautory (zmiňovaný výše) uvádí rozporné důkazy, že pronikání samotného barviva bengálské červeni buněčnou stěnou je základním předpokladem pro inaktivaci. Zmiňuje, že jeho vlastní výsledky prvotně podporují hypotesu pronikání barviva primárně na základě odlišné inaktivace Ga G- druhů. Obal G-bakterií má přídavnou vnější membránu, tvořenou v podstatě lipopolysacharidem, o němž Necker se spoluautory předpokládá, že slouží jako překážka vůči případně toxickým látkám. Jiným možným vysvětlením může být, že množství bílkoviny, vystavené na buněčných stěnách, je velmi rozdílné u G+ a G- druhu, u G+ větší než u G- a ε vazebnou afinitou pro barvivo, která se liší podle hodnoty pH. Tento výklad by nasvědčoval pozorováním autorů vynálezu, která se týkají rozdílů v rychlosti zabíjení v závislosti na pH (ne však zjevné odolnosti druhů G+ B. subtilis a B. mecraterium) .

Mezi druhem B. subtilis, vytvářejícím endospóry, a druhem 5. aureus, který spory nevytváří, není žádný rozdíl v citlivosti vůči fotodynamickému působeni bengálské červeně v nepřítomnosti endospór. Zřejmé rozdíly, prokázané studiemi autorů vynálezu, jsou zřejmě způsobeny přítomností endospór odolnější vůči singletnímu kyslíku než samotné bakterie. Spory přežívají účinek bengálské červeně a světla a následně klíčí a poskytují počitatelné kolonie. 0 sporách je známo, že se obtížně barví a předpokládá se, že nemají za jakýchkoli použitých podmínek žádnou afinitu k bengálské červeni. Zdá se, že o toxicitě singletního kyslíku vůči sporám je v literatuře málo údajů. Podle pokusů s pravděpodobné méně odolnými konidiemi Neurospora crassa (Photochem. Photobiol. 33, 349 (1981) se singletní kyslík v tomto směru určitě uplatňuje.

Prostředek může volitelně obsahovat další přísady jako jednu či více povrchově aktivních látek (pro čistící účely), a/nebo jedno či více rozpouštědel.

Povrchově aktivní látka je s výhodou alkoxylovaná a ještě lépe ethoxylovaná, například ve formě ethoxylovaných alkoholů. Alkohol s výhodou obsahuje 4 až 15 uhlíkových atomů, má přímý nebo větvený řetězec a hodnotou HLB (hydrofilně-lipofilní rovnováhy, hydrophilic lipophilic balance) v rozmezí od 10 do 14, rovnající se například 12.

Komerčně dostupná je široká škála vhodných povrchově aktivních látek. Jednou z nich je povrchově aktivní látka, dostupná pod firemním jménem Imbetin 91-35 firmy Kolb, která je neiontovým ethoxylátem C9-11 alkoholu, který má průměrně 5 molů oxidu ethylnatého na 1 mol alkoholu.

Použity mohou být také primární ethoxysulfáty.

Pokud je to žádoucí, mohou být použity směsi povrchově aktivních látek.

Povrchově aktivní látka je s výhodou neiontová či aniontová, anebo je směsí obou typů.

Aniontové povrchově aktivní látky, kterým se pro tento účel dává přednost, zahrnují primární alkylsulfáty (PAS), s výhodou dodecylsulfát sodný (SDS). Zvláštní přednost se dává komerčně připraveným směsím, obsahujícím podstatný podíl dodecylsulfátu (například Empicolu LX). Dodecylsulfát je známým činidlem, denaturujícím bílkoviny, hodí se k očistění bílkoviny z povrchů a působí biocidně.

Prostředek s výhodou v zásadě neobsahuje kationtovou povrchově aktivní látku, může ale obsahovat menší množství kationtového germicidu.

Povrchově aktivní látka s výhodou představuje množství v rozmezí 0,05 až 2,5 hmotnostního procenta celkové hmotnosti prostředku, typicky 0,5 až 1,5 hmotnostního %, například 0,7 hmotnostního % neiontová povrchově aktivní látky s volitelným množstvím do 0,2 hmotnostního % aniontové povrchově aktivní látky.

Rozpouštědlo je s výhodou polární a přednost se dává rovnému nebo větvenému řetězci alkoholu o 2 až 5 uhlíkových atomech jako ethanolu, butanolu, isopropanolu (propan-2-olu, IPA), N-butoxypropan-2-olu (n-butylether propylenglykolu) či 2-butoxyethanolu (monobutylether ethylenglykolu). Přednost se jako rozpouštdlu obvykle dává isopropanolu (IPA).

Použity mohou	být také dvojsytné	alkoholy	jako
ethylenglykol, a	s vodou mísitelné	ethery	jako
dimethoxyethan.
Pokud je to	vhodné, mohou být	použity	směsi

rozpouštědel, například směsi ethanolu a N-butoxypropan-2-olu.

Rozpouštědlo je s výhodou přítomno v množství od 2 do

Přinejmenším některá z těchto rozpouštědel, jako ethanol, oslabují buněčné stěny mikroorganismu tím, že je činí průstupnějšími a tak i citlivějšími k pronikání singletního kyslíku. To má za následek zvýšení letálního účinku barviva na mikroorganismus.

Je zjištěno, že přítomnost povrchově aktivní látky může snižovat fotodynamický účinek barviv (pravděpodobně rozpouštěním barviva a zabráněním vazbě na buněčnou stěnu) a také přidání rozpouštědla může snižovat fotodynamický účinek barviv (pravděpodobně kompetováním, soutěžením o singletní kyslík). Je ovšem zjištěno, že u přípravků, obsahujících tři složky, barvivo, povrchově aktivní látku a rozpouštědlo, dochází k menšímu sníženi fotodynamického účinku barviva, než jaký by bylo možné očekávat při spojení účinků povrchově aktivní látky a rozpouštědla. Povrchově aktivní látka a rozpouštědlo tady společně vykazují synergické působení, který se projevuje zmenšením poklesu fotodynamického účinku barviva.

Upřednostňovaným aspektem vynálezu je tedy poskytnutí povrchově čistícího a germicidního prostředku, který obsahuje barvivo, schopné fotodynamické inaktivace mikroorganismů, povrchově aktivní látku a rozpouštědlo.

Prostředek může obsahovat množství volitelných přísad, včetně následujících:

1. Detergentní zesilovače účinku, s výhodou kovová chelatační činidla, jako je ethylendiamin kyseliny (EDTA). Kovová chelatační činidla (včetně rovněž potvrzena jako látky, zvyšující průstupnost (permeabilitu) buněčných stěn a činící tak organismy citlivějšími k působení biocidních látek.

tetraoctové EDTA) byla pomáhají při vazbě barviva na bílkovinu tím, že podporují pohyb barviva z vodné fáze k bílkovinné soli. Elektrolyt je obecně přítomen v přípravcích jako komerčně používaný;

žádoucí, může být doplněn přídavným elektrolytem. Celkový obsah elektrolytu v prostředku bude typicky v rozmezí od 0 do 1 hmotnostního %, s výhodou asi 0,1%.

různých barevných pokud je to však

3. Parfémy

4. Zahušfovací látky

Prostředek je ve formě isotropního jednofázového prostředku a zvláště se používá jako germicidní látka (s možností také čistícího účinku) na tvrdé povrchy, mající široké možnosti použití, včetně použití v domácnostech, například na kuchyňské a koupelnové povrchy, včetně toaletních mís, použití v institucích jako jsou školy, nemocnice a podobně, a v komerčních provozech, jako jsou továrny, kanceláře, hotely atd.

Přinejmenším pro domácí použití se prostředek s výhodou upravuje do formy výrobku, určeného k nanášení sprejem, a je výhodně plněn do vhodné nádoby, která má například ruční rozprašovač nebo patentní aerosolové pouzdro. Nádoba je s výhodou neprůhledná.

Při použití se prostředek nanáší na povrch, který má být vyčištěn, jakýmkoli vhodným způsobem, jako sprejovým nástřikem z vhodné nádoby, roztíráním pomocí nosiče jako je tkanina či houba, nebo nalitím ze zásobní nádoby apod. Poté může v některých případech, zvláště při průmyslovém čištění, následovat ozáření světelným zdrojem, například zdrojem bílého světla jako je křemíková halogenová lampa nebo fluorescenční zdroj denního světla. (Postup by mohl ozáření, například nízkotlakou rtuéovou výbojkou, vyzařující resonanční zářeni při 254 mn. Takové záření je škodlivé pro nechráněný zrak.) Poté múze obecně následovat, pokud je to potřeba, fáze umývání, jako vytírání pomocí nosiče, použití proudu tekoucí vody a podobně.

V dalším aspektu tedy vynález poskytuje metodu hubení bakterií na površích, zahrnující nanesení prostředku podle vynálezu na daný povrch.

Vynález bude pro dokreslení dále popsán následujícími Příklady a pomocí doprovodných Obrázků.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 znázorňuje dva sloupcové grafy logaritmu redukovaných hodnot, vyjadřujících letální účinek bengálské červeně a světla na různé mikroorganismy v suspensi při pH 4 a pH 7, přičemž Obrázek la znázorňuje výsledky u Gram-positivních mikroorganismů a Obrázek lb znázorňuje výsledky u Gram-negativních organismů a kvasinek;

Obrázek 2 je dvojicí grafů logaritmu redukce v závislosti na hodnotě pH, znázorňující biocidní účinek bengálské červeně a světla na S. aureus a E. coli jako funkci pH, přičemž Obrázek 2a vyjadřuje výsledky, získané po 20 minutách vystavení světlu a Obrázek 2b výsledky po 60 minutách vystavení účinku světla.

Obrázek 3 je dvojicí grafů, podobných Obrázku 2, získaných za použití Erythrosinu B místo bengálské červené.

Obrázek 4 znázorňuje dva sloupcové grafy logaritmu redukovaných hodnot, vyjadřujících fotohygienický účinek různých kombinaci bengálské červeně (RB), Imbentinu kde Obrázek 4a ukazuje výsledky, získané bez ozáření světlem a Obrázek 4b výsledky, získané po vystaveni účinku světla.

Obrázek 5 je grafem adsorpce bengálská červeně tyčinkou E. coli, udávjící adsorbované množství v nanomolech oproti rovnovážné koncentraci (v ínikromolech /1), přičemž výsledky, získané při pH 4, jsou znázorněny čtverečky a výsledky, získané při pH 7, jsou znázorněny křížky.

Obrázek 6 je dvojicí grafů, podobných Obrázku 5, které ukazují účinek elektrolytu, přičemž Obrázek 6a znázorňuje výsledky, získané při pH 4 a Obrázek 6b výsledky, získané při pH 7. Výsledky, naměřené bez přidání elektrolytu, jsou vyznačeny čtverečky, výsledky, získané za přítomnosti 1¾ síranu sodného jsou vyznačeny křížky a výsledky, získané za přítomnosti 5% síranu sodného, jsou vyznačeny hvězdičkami.

Obrázek 7 je dvojicí grafů, podobných obrázku 5, které ukazují účinek povrchově aktivní látky, přičemž Obrázek 7a znázorňuje výsledky, získané při pH 4 a Obrázek 7b výsledky, získané při pH 7. Výsledky, naměřené bez přidání povrchově aktivní látky jsou vyznačeny čtverečky, výsledky, získané za přítomnosti neiontové povrchově aktivní látky (NI, 0,7%), jsou vyznačeny křížky a výsledky, získané za přítomnosti PAS (0,7%) jsou vyznačeny hvězdičkami.

Obrázek 8 je grafem, podobným obrázku 5, ukazujícím účinek rozpouštědla při pH 4, přičemž výsledky, získané bez přidání rozpouštědla, jsou vyznačeny malými čtverečky, výsledky, získané za přítomnosti 10% IPA, jsou vyznačeny křížky, výsledky, získané za přítomnosti 0,7% Imbentinu, jsou vyznačeny hvězdičkami a výsledky, získané za přítomnosti 10% IPA a 0,7% Imbentinu, jsou vyznačeny širokými čtverečky.

Obrázek 9 je grafem, který udává závislost logaritmu redukce na době vystavení světlu (v minutách), vyjadřující vliv pH na rychlost zabíjeni E. coli bengálskou červení. Výsledky, získané při pH 4, jsou vyznačeny čtverečky a výsledky, získané při pH 7, jsou vyznačeny křížky.

Obrázek 10 je grafem, podobným Obrázku 9, vyjadřujícím účinek elektrolytu na rychlost zabíjení E. coli bengálskou červení při pH 7. Výsledky, získané bez přítomnosti elektrolytu jsou vyznačeny čtverečky a výsledky, získané za přídavku síranu sodného, jsou vyznačeny křížky.

Příklady

Pokusné postupy

Příprava inokula

Následující mikroorganismy (obecně bud z Národní sbírky typových kultur, National Collection of Type Cultures, NCTC, nebo z Americké sbírky typových kultur, American Collection of Type Cultures, ACTC) byly používány v popisovaných pokusech:

Bakterie:

Staphylococcus aureus	NCTC	6538	(Gram-positivní)
Eschericbia coli	NCTC	8196	(Gram-negativní)
Pseudomonas aerupinosa	NCTC	5940	(Gram-negativní)
Enterobacter sp.	NCTC	3281	(Gram-negativní)
Klebsiella sp.	ACTC	11677	(Gram-negativní)
Bacillus subtilis	NCTC	6432	(Gram-positivní)
Bacillus mecrateriuis	NCTC	7581	(Gram-positivní)

Kvasinky:

Organismy byly napěsovány inkubací přes noc v živném bujónu při 37*C, pokud se jednalo o bakterie (při 28 °C pokud šlo o Ps. aeruoinosa). anebo v bujónu SABS při 28'C, pokud se jednalo o kvasinky (SABS = Sabourand Dextrose Agar, Sabourandúv dextrosový agar; v případě bujónu SABS s kapalným médiem je dodáván firmou Oxoid Ltd.). Kultury byly isolovány vakuovou filtrací za použití filtru Millipore o průměru pórů 0,45 μπι, promyty čtyřnásobně zředěným Ringerovým roztokem a resuspendovány v Ringercvé roztoku (10 ml). Organismy v suspensi byly spočítány na základě postupného ředění a nanesení na živný agar (bakterie) nebo na SABS agar (kvasinky) a celkový počet živoucích buněk (TVC total viable count) byl vyjádřen jako dekadický logaritmus počtu jednotek, tvořících kolonie (cfu, colony-forming units) v 1 mililitru.

Pokusy byly prováděny, pokud není uvedeno jinak, při pH o hodnotě 7.

1. METODA DISKOVÉ DIFUSE V AGARU

Připraveny byly vodné roztoky, obsahující 100 ppm barviva. Alikvoty o objemu 10 ml každého roztoku barviva byly sterilisovány ve skleněných lahvičkách se šroubovacím uzávěrem. Sterilisovány byly také disky (13 mm kotoučky od firmy BDH) ke stanovení pomoci antibiotik. Všechny organismy byly pěstovány přes noc v živném nebo SABS bujónu (10 ml).

Pro každý mikroorganismus byly naočkovány dvě živné agarové plotny (SABS agar v případě kvasinek) pomocí 10 μΐ přes noc pěstované kultury, aby byl na celé plotně docílen souběžný růst. Pomocí aseptických postupů byl antibiotikový disk namočen do prvního roztoku barviva a umístěn na povrch naočkované agarové plotny. Tento postup byl opakován se dvěma roztoky dalších barviv k získáni tří disků na

Jedna z každé dvojice duplicitních ploten byla okamžitě při vhodné teplotě umístěna do inkubátoru, přičemž byla minimálně vystavována světlu. Zbývající plotny byly po dobu 3 hodin pQloženy na vršek světelného boxu. Osvěcování ze světelného boxu bylo zajišťováno rozptýleným bílým světlem o průměrné intensitě 4 000 luxů z fluorescentních děních trubic (2 x 15 wattů, od firmy Exal X-ray Accessories Ltd, Hemel Hempstead). Světelné intensity byly měřeny na povrchu rozptylovaciho stínítka za použití měřiče světla Megatron DA10 light meter. Po exposici byly plotny přes noc inkubovány a poté na nich byly zjišťovány zóny kolem disku, vykazující inhibici. Tímto postupem byly dosaženy následující výsledky:

Příklad 1 (Disková metoda)

Výsledky získané v agaru s vodnými roztoky barviv bengálské červeně, Erythrosinu B a sulfonátu ftalocyaninu hlinitého (APS), (100 ppm), při pH 7 a po vystavení účinku světla na 180 minut, jak bylo dříve popsáno, jsou shrnuty v Tabulce 1. Výsledky jsou v Tabulce vyjádřeny jako rozdíl (v milimetrech) mezi poloměrem čisté zóny, v niž došlo k inhibici (oblast nulového bakteriálního růstu na agarové plotně) a poloměrem použitého disku. Tedy čím je větší hodnota, tím silnější bylo hubení bakterií.

Metoda diskové difuse v agaru určila bengálskou červeň jako méně účinnou než strukturně podobný Erythrosin B. Je lákavé přičíst toto zařazení rozdílu v množství, které je potřeba k tvorbě singletního kyslíku. V prostředí methanolu činí množství, potřebné k tvorbě singletního kyslíku, 0,76 u červeně bengálské a 0,6 u Erythrosinu B. Lze ovšem očekávat, že k pozorovaným rozdílům může přispívat množství dalších faktorů, jako je rychlost difuse barviva nebo rozdíly ve vazbě barviva k agarovému gelu nebo k látce disku

Obzvláštním jasné rozlišení Gram-negativních rysem výsledků metody diskové difuse je citlivosti Gram-positivních (G+) a (G-) organismů vůči fotodynamickému účinku, přinejmenším při hodnotě pH rovné 7. Možné důvody poměrné odolnosti G- organismů jsou diskutovány jinde.

2. POVRCHOVÝ TEST

Testovací roztoky

Bengálská červeň (20 ppm) v pufru o pH 4 a:

1. Bez další přídavné látky

2. Ethanol (10 % objem/objem) a Imbentin C91-35 (0,7%).

3. Propan-2-ol (10% objem/objem) a Imbentin C91-35 (0,7%)

Jako positivní kontrola byl použit roztok chlornanu sodného (0,125%).

Stanovení počtu organismů, adherovaných ke dnu Petriho misky

Suspense mikroorganismu (0,5 ml), například S. aureus, byla přidána k alikvotům (100 ml), čtyřnásobně zředěného Ringerova roztoku a bylo stanoveno průměrné množství cfu v 1 ml (TVC). Alikvoty těchto roztoků o objemu 20 ml byly napipetovány na sterilní petriho misky a ponechány 5 hodin při laboratorní teplotě. Poté bylo inokulum přeneseno pipetou do sterilní baňky a v 1 ml bylo stanoveno průměrné množství cfu, zbývajících v suspensi. Počet mikroorganismů (jako cfu) na cm², adherovaných na petriho misku, byl vypočítán z rozdílu koncentrací roztoku.

Metoda testu

Ringerova roztoku, neředěného na čtvrtinovou koncentraci, byly napipetovány na sterilní petriho misky, které pak byly ponechány 5 hodin při laboratorní teplotě. Poté bylo odebráno inokulum, misky byly jednou promyty Ringerovým roztokem za mírného zakroužení promývacím roztokem v misce a poté byl tento roztok vylit. Dvojice bakteriálně kontaminovaných ploten byly zkoušeny testovacími roztoky. Alikvot o objemu 20 ml testovaného roztoku byl nalit do misky a roztok byl po 30 sekundách odstraněn dekantací. Miska byla vypláchnuta pufrem o pH 4 a umístěna na světelný box po dobu 20 minut. V odděleném pokusu byl roztok ve druhé misce vystaven na světelný box před tím, než byl dekantován a před opláchnutím misky pufrem o pH 4. Oba pokusy byly prováděny dvojmo.

Po ozáření světlem byla jedna z dvojice ploten překryta tryptonovým sojovým agarem, obsahujícím 1% glukosy a 0,015% neutrální červeně, ochlazeným na asi 50°C. Druhá ze dvojice ploten byla barvena 0,01% akridinovou oranží po dobu 30 sekund, opláchnuta a mikroskopicky sledována (mikroskopem Nikkon Optiphot, vybaveným 100 x zvětšujícím apochromatickým olejově imersním objektivem, 10 x zvětšujícím okulárem a epifluorescenčním přídavným zařízením s B2-A kombinovaným blokem filtru/dichroického zrcadla a super vysokotlakou rtuťovou lampou). Plotny překryté agarem byly. inkubovány 48 hodin při 37 “C a během této doby vyrostly kolonie z adherovaných bakterií, které nebyly zahubeny. Kolonie zachytily neutrální červeň, což umožňuje je pod agarem na povrchu misky vidět a spočítat (A.M.R. MacKenzie a R.L. Rivera-Calderon, Agar Overlay Method to Measure Adherence of Staphylococcus epidermidis to Four plastic Surfaces, Applied and Environmental Microbiology 50, 1322, 1985).

Plotny, barvené akridinovou oranží, byly testovány a fotografovány. Počet obarvených bakterií byl počítán v zorném poli (skupiny byly počítány jako jedna), které bylo

Příklad 2 (Povrchový test)

Povrchové testy kontrolního pokusu, využívající jak dříve popsanou přímou epifluorescenční mikroskopii, tak i vyčerpání suspense, poskytly podobné hodnoty počtu barterií (5. aureus}, které mohou být přichyceny na povrch plastové misky (řádově 1 milion na cm²).

Smrštěním povrchu positivní kontroly (roztokem chlornanu sodného, 30 sekund) se snížil počet životných bakterii na nulu. výsledky, týkající se fotodynamické inaktivace bakterií jsou shrnuty v Tabulce 2 jako dekadický logaritmus redukce (log(redukce)) životných bakterií před a po vystavení světlu, tj. log(počátečního počtu) log(konečného počtu).

Příklad 3

Přípravky: bengálská červeň (20 ppm), neiontová povrchově aktivní látka (Imbentin C91-35, 0,7%), propan-2-ol (10%) (pH 4).

Pokusný postup odpovídal předchozímu popisu, kromě toho, že zachycení bakterií na povrchu vyžadovalo, aby byly v exponenciální fázi růstu. Toho bylo dosaženo inkubací v živném agaru (u bakterií) nebo SABS bujónu (u kvasinek) po 3 hodiny v plastové petriho misce, v Příkladu 2 byla suspense bakterií nerostoucích v Ringerově roztoku ponechána jednoduše stát po dobu 5 hodin. Tento způsob funguje v případě S. aureus, ale ne u jiných bakterií. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 3.

Předcházející zkušenosti s používáním přímé epifluorescenční mikroskopie ukazují, že pokud bylo dosaženo souběžného růstu, odpovídal by výchozí povrchové hustotě

O použitých Petriho misek činila asi 57 cm², takže postup ve všech případech redukoval hladinu povrchové kontaminace (znečištění) nejméně o pět řádů (log 5).

Povrchové testy se obtížněji provádějí než testy v suspensi, a proto byla většina experimentální práce prováděna v suspensi k prokázání účinku odlišných podmínek.

TEST V SUSPENSI

Příprava roztoků

Zásobní roztoky dále uvedených látek byly připraveny navážením a sterilisací (kromě těch, které obsahují rozpouštědlo):

- bengálská červeň (0,2%) v propan-2-olu (95%)

- neiontová povrchově aktivní látka (Imbentin C91-35, 14%) (někdy uváděná zkratkou AE, alkohol ethoxylát)

- aniontové povrchově aktivní látka (Empicol LX, 14%) (někdy uváděná jako PAS)

- pufr o pH 4 (kyselina citrónová /0,1 M, 307 ml/ + dvojsytný fosforečnan sodný /0,2 M, 193 ml/)

- pufr o pH 7 (orthofosforečnan sodný /0,4 M, 468 ml/ + dekahydrát orthofosforečnanu dvojsodného /0,4 M, 732 ml/)

- pufry o pH 5, 6, 8 a 9 byly připraveny podle návodu v CRC

Handbook of Chemistry and Physics 8-36, 73. vydání, CRC

Press 1992-1993

Konečné koncentrace v testovacích roztocích byly obvykle:

bengálská červeň - 20 ppm ethanol - 10,0% (objem/objem) povrchově aktivní látka - 0,7% (hmotnost/objem)

V některých příkladech byly použity odlišné koncentrace, tak jak jsou udány.

Způsob testování

Testovací roztoky byly připraveny ve sterilních plastových petriho miskách ve vrstvě 5 mm (30 ml). Ke každému roztoku byla přidána suspense mikroorganismů (0,3 ml) a mírně vmíchána. Pokud měl testovaný roztok obsahovat červeň bengálskou, byla přidána jako poslední, aby se minimalisovalo její vystavení světlu. Roztoky byly bud’ vystaveny na světelný box, umístěný ve tmě (podmínky sníženého vystavení světlu), nebo ponechány na pracovním stole. Průměrná intensita na povrchu rozptylovacího stínítka světelného boxu byla 4 000 luxů, měřeno přístrojem Megatron DA 10 light meter (firmy Megatron Ltd). Po určené době exposice byly přežívající bakterie sečteny jako jednotky, tvořící kolonie (cfu/ml), poté co byly inkubovány po postupném zředění a naočkování na agar. Byl stanoven dekadický logaritmus počtu zbývajících bakterii (jako cfu/ml) a srovnán s počtem před vystavením světlu jako log (výchozího počtu) - log (konečného počtu). Čím větší byla jeho hodnota, tím větší bylo vyhubení bakterií.

Testy v suspensi byly prováděny s rozmanitými mikroorganismy za různých podmínek k optimalisování fotodynamického účinku vůči spektru mikroorganismů, včetně Gram-negativních organismů a kvasinek. Charakteristické výsledky jsou shrnuty v připojených Tabulkách. Výsledky jsou v nich vyjádřeny jako dekadický logaritmus poměru mezi výchozím počtem cfu/ml a počtem, zbývajících po ozáření světlem, logaritmem redukce. Při použití tohoto označení nulová hodnota znamená, že nedošlo ke změně v počtu organismů po vystaveni daným podmínkám. Označení před hodnotou log(redukce) znamená, že nelze pozorovat žádný růst

Příklad 4

Testované roztoky byly zkoušeny podle výše popsaného postupu k prokázání letálního_ účinku bengálské červeně a světla na mikroorganismus v suspensi; zvláště pak-synergie nízké hodnoty pH a ethanolového rozpouštědla. Testy byly prováděny za použití bengálské červeně (20 ppm) samotné nebo s ethanolem (10%, objem/objem) a při vystavení světlu po dobu 20 minut (světelný box). Výsledky, vyjádřené v hodnotách logaritmu redukce, jsou uvedeny v Tabulce 4.

Delší doby vystavení světlu (60 a 100 minut) zlepšily v případě Gram-negativních mikroorganismů účinek, zejména při pH 7.

Ukazuje se, že účinek v případě Gram-negativních mikroorganismů je výrazněji zlepšen při pH 4 ve srovnání s pH 7.

Příklad 5

Testy v suspensi byly prováděny podle dříve popsaného postupu při pH 4 a pH 7 k prokázáni letálního účinku bengálské červeně (20 ppm) a světla (20 minutová exposice na světelném boxu) na různé Gram-positivní a Gram-negativní mikroorganismy a kvasinky v suspensi. Výsledky, vyjádřené jako log(redukce), jsou graficky znázorněny na Obrázcích la a lb, přičemž Obrázek la udává výsledky u Gram-positivních mikroorganismů a Obrázek lb u Gram-negativních mikroorganismů a kvasinek.

Příklad 6

Testy v suspensi byly prováděny podle dříve popsaného postupu při různých hodnotách pH k prokázáni biccidního ^a £- coli (G-) jako funkce pH. Výsledky, vyjádřené jako log(redukce) , jsou graficky znázorněny na Obrázku 2a (doba vystavení světlu 20 minut) a 2b (doba vystavení světlu 60 minut). Křížky v Obrázcích označují výsledky u kontrol (G-), hvězdičky označují výsledky u E. coli, na špičku postavené trojúhelníčky označují výsledky’ u kontrol (G+) a normální trojúhelníčky výsledky u S. aureus.

Podobné testy v suspensi byly provedeny k prokázání biocidního účinku Erythrosinu B a světla na S. aureus a E. coli jako funkce pH. Výsledky jsou graficky znázorněny na Obrázcích 3a a 3b, které jsou jinak shodné s Obrázky 2a a 2b. Je na nich ukázáno, že Erythrosin B účinkuje, pokud jde o fotobiocidni profil v závislosti na pH, obdobně jako bengálská červeň.

Příklad 7

Další testy v suspensi byly prováděny dříve popsaným postupem při pH 7 za použití následujících roztoku:

- neiontové povrchově aktivní látky Imbentin C91-35 (0,7%)

- Imbentinu C91-35 (0,7%) s bengálskou červení (100 ppm)

- aniontové povrchově aktivní látky Empicol LX (0,7%)

- Empicolu LX s bengálskou červení (100 ppm)

- Imbentinu C91-35, Empicolu LX (obojí 0,7%) a bengálské červeně (100 ppm)

Výsledky jsou shrnuty níže v Tabulce 5. Výraz tma v Tabulce označuje podmínky sníženého vystavení světlu spíše než úplnou trnu, nebot z praktického hlediska je obtížné vyloučit jakékoli vystavení světlu. Výraz světlo v Tabulce označuje výsledky, které jsou průměrem z několika pokusů, prováděných v různém časovém rozmezí (20 minut, 1 hodina, 3 hodiny) ve statisticky uspořádaném pokusu.

Výsledky, získané podobným 2působem s E. coli při pH 7, jsou graficky znázorněny ve sloupcových grafech na Obrázku 4. V tomto Obrázku je termín PAS používán jako zkratka pro Empicol LX, IPA pro isopropanol a AE je zkratkou Imbentinu C91-35. Tento obrázek představuje průměrné hodnoty pro AE 0,7%, PAS 0,7% a IPA 10%.

Příklad 8

Další testy v suspensi byly prováděny při pH 4 s £. coli za použití jedné nebo více z následujících látek: benfálské červeně 40 ppm, povrchově aktivní látky 0,7% (Imbentinu 091-35 nebo Empicolu LX), IPA (isopropanolu) 10%. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 6.

Následující příklady se týkají testů v suspensi, obecně prováděných výše popsaným způsobem, ale při pH 4. Pokud byla používána bengálská červeň, byla přítomna v koncentraci 20 ppm, i když v některých případech byly vystaveny světlu kontrolní roztoky, neobsahující bengálskou červeň a příslušné výsledky jsou uvedeny ve sloupci s nadpisem bez bengálské červeně.

V Příkladech 9, 10, 11 a 12 byl použit Gram-positivní mikroorganismus S. aureus a v Příkladech 13 a 14 Gramnegativní mikroorganismus E. coli. Ostatní reakční látky jsou uvedeny v Příkladech. Ve všech těchto případech byly vzorky vystaveny světlu po 20 minut na světelném boxu. Průměrná intensita na povrchu rozptylovacího stínítka světelného boxu byla 4 000 luxů, měřeno přístrojem Megatron DA 10 light meter (firmy Megatron Ltd).

Příklad 9

Testy v suspensi byly prováděny za použití bengálské

Dekadický logaritmus výchozí koncentrace, log (start), byl v případě S. aureus 6,8. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 7.

Příklad 10

Testy v suspensi byly prováděny za použití bengálské červeně, Dowanolu PnB a Imbentinu C91-35, se S. aureus. Log (start) byl 6,9. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 8.

Tento příklad ukazuje, že Dowanol PnB má určité biocidni vlastnosti.

Příklad 11

Testy v suspensi byly prováděny za použití bengálské červeně, ethylenglykolu a Imbentinu C91-35, se 5. aureus. Log (start) byl 6,8. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 9.

Příklad 12

Testy v suspensi byly prováděny za použití bengálské červeně, IPA a Lialetu 111, se S. aureus. Lialet 111 je firemní jméno ethersulfátového přípravku, dostupného komerčně od firmy Enichem, který má průměrnou délku řetězce 11 a průměrný stupeň ethoxylace 3. Log (start) byl 6,7. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 10.

Příklad Í3

Testy v suspensi byly prováděny za použití bengálské červeně, propan-2-olu a Imbentinu C91-35, se S. aureus.

Log (start) byl 6,8. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 11.

Přiklad 14 červené, ethanolu a Imbentinu C91-35, s E. coli. Log (start) byl 7,1, Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 12.

Příklad 15

Adosrpce bengálské červeně -byla stanovena z úbytku koncentrace roztoku. Koncentrace byly zjištěny spektroskopicky z absorbancí, naměřených při vlnové délce, vykazující maximální absorbancí (asi 549 nm) , za použití spektrofotometru WPA Linton S110 k měření supernatantových tekutin, zbavených mikroorganismů odstředěním.

Výsledky jsou znázorněny na Obrázcích 5 až 8.

Výsledky ukazují, že fotobiocidní účinek je závislý na adsorpcí barviva. Adsorpce barviva je:

a) zvyšována nízkým pH (Obrázek 4);

b) zvyšována neutrálním elektrolytem (který také zvyšuje fotobiocidní účinek vůči E. coli při neutrálním pH) (Obrázek 6);

c) snižována povrchově aktivní látkou (Obrázek 7);

d) zvyšována propanol-2-olem (Obrázek 8).

Výpočty ukazují, že množství, adsorbované k E. coli, má správnou řádovou velikost pro pokrytí monomolekulární vrstvou za předpokladu, že barviva agregují a vypočítaný povrch E- coli musí být podhodnocen (bez uvažování třepení a vlásnění). Detaily výpočtu jsou stručně uvedeny níže. Molekulární rozměry bengálské červeně byly získány z modelové stupnice (Catalin Ltd., Londýn).

plocha povrchu E. coli 1 x 10 nm⁴ plocha bengálské červeně 2 nm² (plocha) pokrytí monomolekulárni vrstvou měřená adsorpce počet molekul x 10^s (plocha) nebo 20 χ 10⁶ (strana)

2-8 x IO'¹⁶ molú/bakterii

120 - 480 χ 10⁶ na bakterii

Přiklad 16

Testy v suspensi byly prováděny dříve popsaným postupem ke stanovení účinku pH a přídavku elektrolytu (síranu sodného, 5%) při pH 7 na rychlost zabíjení E. coli. Výsledky jsou znázorněny graficky na Obrázcích 9 a 10.

Tabulka 1 (Příklad 1)

Fotobiocidní účinek zvýrazňujících činidel 2óna inhibice kolem disku

organismus typ	podle Grama	beng.červeň	Erythrosin B	APS
S. aureus	+	4	1.	2
B. subtilis	+	3	1	1
B. mecraterium	+	3	1	1,5
E. coli	-	0	0	0
K. pneumoniae	-	1,5	0	3
Ps. aerucinosa	-	0	0	0
Enterobacter sp.	-	0	0	0

C. albicans o

Tabulka 2 (Příklad 2)

Letální účinek bengálské červeně a světla na Staphylococcus Aureus. přichycený na plastový povrch roztok log (poměr) bengálská červeň 4,7 bengálská červeň +

Imbentin C91-35 + 6,0 ethanol

Tabulka 3 (Příklad 3) organismus

č.pokusu výsledky získané metodou překrytí agarem kontrola po vystavení světlu

S. aureus	1	souběžný růst	nulový růst
	2	souběžný růst	nulový růst
E. col i	1	značný růst	45 cfu
	2	souběžný růst	nulový růst
K. pneumoniae	1	souběžný růst	nulový růst
	2	souběžný růst	nulový růst
P. aerucrinosa	1	značný růst	5 cfu
	2	souběžný růst	nulový růst
C albicans	1	souběžný růst	5 cfu
	2	souběžný růst	4 cfu

Tabulka 4 (Příklad 4) podmínky vystavení světlu

organismus typ	dle Grama	bez rozpouštědla	s ethanolem
pH 7	pH 4	pH 7	pH 4
S. aureus	+	7,0	7,1	7,1	6,9
B. subtilis	+	0,6	2,1	3,1	0,8
B. mecraterium	+	1,3	0,3	1,1	0,3
E. coli	-	0,2	5,3	0,1	6,9
K. pneumoniae	-	0,9	5,6	0	7,0
Ps. aerupinosa	-	0	7,0	0	6,9
Enterobacter sp.	1,1	7,3	0	7,4
C. albicans		0	5,7	0	5,7
		kontroly	(bez bengálské	červeně)
E. coli	-		0,1		0,8

Tabulka	5 (Příklad	7)
organismus	Imbentin	Imbentin/RB	Empicol	Empicol/RB
	světlo	tma	světlo tma	světlo tma	světlo	tma
St. aureus	4,5	4,0	8,0	3,5	4,5 4,5	5,5	5,0
E. coli	9,0	9,5	10,5	10,0	5,5 5,0	6,5	6,0
Entero.	0	0	0	0	0 0	0	0
Klebsiella	7,0	6,0	6,0	7,0	6,0 6,0	6,0	6,0
Ps. aerucr.	0	0	0	0	0 0	0	0
C. albicans	0	0	1,0	1,0	2,5 1,5	3,0	0

RB = bengálská červeň

organismus	Imbentin/Empicol Imbentin/Empicol/RB	RB
světlo	tma světlo	tma	světlo	tma
St. aureus	3,0	4,0 2,0	0	4,0	0
E, coli	4,0	4,0 4,0	4,5	0	0
Entero.	0	0 0	0	0	0
Klebsiella	3,5	3,5 4,0	2,5	0	0
Ps. aeruq.	0	0 0	0	0	0
C. albicans	0	0 0	0	0	0
RB = bengálská červeň

Tabulka 6 (Příklad 8)
		doba	vystavení	světlu
	1 hodina	2 hodiny	3 hodiny
	světlo	tma	světlo	tma	světlo	tma
beng. červeň	3,8	0,5	7,2	0,4	7,2	0,7
RB/Imbentin C91-35	0,2	0,2	1,0	0,3	3,8	0,5
RB/Empicol RX	1,7	0,4	3,9	0,7	7,2	0,7
RB/IPA	5,4	3,6	4,7	5,0	7,2	7,2
Imbentin C91-35	0,1		0,3		0,9
Empicol LX	0,1		0,6		1,0
IPA	0,3		1,7		4,4

Tabulka 7 (Přiklad 9) log (redukce) ethanol Imbentin po vystav.světlu bez beng.červeně % C91-35 %

5	0,2	+6,8
5	0,6	4,6
10	0,6	+6,8
15	0,6	+6,8
5	-	+6,8	0,1
10	-	+6,8	-0,4
15	-	+6,8	0,0
-	0,2	4,6	2,5
-	0,6	3,5	2,3
-	-	+6,8	2,3

	Tabulka 8 (Příklad 10)
			log (redukce)
Dowanol % Imbentin C91-35 %	po	vystav.světlu bez	beng
3	0,7		+6,9
3	-		+6,9	4,0
-	0,7		5,2	3,4
	-		+ 6,9

Tabulka 9 (Příklad 11) log (redukce)

ethylenglykol %	Imbentin po C91-35 %	vystav.světlu bez	beng.červené
10	0,7	+6,8
10	-	+6,9	-0,2
-	0,7	+6,8	3,4
-	-	+6,8
Tabulka 10 (Příklad	12)
		log (redukce)
propan-2· %	-ol Lialet 111 %	po vystav.světlu	bez beng.červen
15	0,5 '	+6,7
15	-	+6,7	4,9
-	0,5	+6,7	+ 6,7
-	-	+6,7

Tabulka 11 (Příklad 13) log (redukce) propan-2-ol Imbentin po vystav.světlu bez beng.červen

%	C91-35 %
5	0,1	2,3
10	0,1	+ 6,8
10	0,5	+ 6,8
10	0,7	+6,8
-	-	4,8
5	-	5,5	0,3
10	-	3,0	1,9
-	0,1	1,2	1,3
-	0,5	1,0	1,2

Tabulka 12 (Přiklad 14) log (redukce)

thanol %	Imbentin C91-35 %	po vystav.světlu	bez beng
5	0,2	4,1
15	0,6	+7,1
5	-	5,0	0,2
10	-	+7,1	0,2
15	-	+ 7,1	2,2
-	0,2	3,3	2,5
-	0,6	3,4	2,6
-	-	3,9

Zastupuje:

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob hubení povrchově navázaných mikroorganismů, vyznačující se tím, že zahrnuje nanesení prostředku, obsahujícího barvivo, které je schopné fotodynamické inaktivace mikroorganismů, na povrch.
2. Způsob hubení povrchově navázaných mikroorganismů podle nároku 1, vyznačující se tím, že barvivo vytváří při vystavení světlu singletní kyslík.
3. Způsob hubení povrchové navázaných mikroorganismů podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že barvivo je substantivní vůči mikroorganismům, tj. schopné se na ně vázat.
4. Způsob hubení povrchově navázaných mikroorganismů podle nároku 1, 2 nebo 3, vyznačuj ící se tím, že vystavením světlu je barvivo odbarvováno.
5. Způsob hubení povrchově navázaných mikroorganismů podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že barvivo je zvoleno ze skupiny, zahrnující bengálskou červen, Erythrosin B a ftalocyaninové sulfonáty.
6. Způsob hubení povrchově navázaných mikroorganismů podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tí. m, že barvivo je přítomno v množství v rozmezí 1 až 100 ppm.
7. Způsob hubeni povrchové navázaných mikroorganismů podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že dále obsahuje jednu nebo více
8. Způsob hubení povrchově navázaných mikroorganismů podle nároku 7, vyznačující se tím, že povrchově aktivní látka je alkoxylována.
9. Způsob hubení povrchově navázaných mikroorganismů podle nároku 8, vyznačující se tím, že povrchové aktivní látka je ethoxylována.
10. Způsob hubení povrchově navázaných mikroorganismů podle nároku 7, 8 nebo 9, vyznačuj ící se tím, že povrchově aktivní látka je přinejmenším převážně neiontové a/nebo aniontová.
11. Způsob hubení povrchově navázaných mikroorganismů podle kteréhokoli z nároků 7 až 10, vyznačující se tím, že povrchově aktivní látka je přítomna v množství v rozmezí 0.05 až 2,5 hmotnostního procenta celkové hmotnosti prostředku.
12. Způsob hubení povrchově navázaných mikroorganismů podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že dále obsahuje jedno nebo více rozpouštědel.
13. Způsob hubení povrchově navázaných mikroorganismů podle nároku 12, vyznačující se tím, že obsažené rozpouštědlo je polární.
14. Způsob hubení povrchově navázaných mikroorganismů podle nároku 13, vyznačující se tím, že rozpouštědlem je alkohol s rovným nebo nebo rozvětveným řetězcem o 2 až 5 atomech uhlíku.
15. Způsob hubení povrchově navázaných mikroorganismů podle nároku 12, 13 nebo 14, vyznačující se od 2 do 20 hmotnostních procent celkové hmotnosti prostředku.
16. Způsob hubení povrchově navázaných mikroorganismů podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že jeho pH leží v rozmezí od 3 do 5.
17. Způsob hubení povrchově navázaných mikroorganismů podle nároku 16, vyznačující se tím, že jeho pH je přibližně 4.
18. Způsob hubeni povrchově navázaných mikroorganismů, vyznačující se tím, že takového prostředku, který obsahuje fotodynamické inaktivace mikroorganismů, látku a rozpouštědlo, na povrch.