SK55295A3 - Bacteriocins from streptococcus thermophilus - Google Patents

Bacteriocins from streptococcus thermophilus Download PDF

Info

Publication number
SK55295A3
SK55295A3 SK552-95A SK55295A SK55295A3 SK 55295 A3 SK55295 A3 SK 55295A3 SK 55295 A SK55295 A SK 55295A SK 55295 A3 SK55295 A3 SK 55295A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
bacteriocins
seq
strain
streptococcus thermophilus
bacteria
Prior art date
Application number
SK552-95A
Other languages
English (en)
Other versions
SK280696B6 (sk
Inventor
Jacques E Germond
Olivier Marciset
Beat Mollet
Original Assignee
Nestle Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nestle Sa filed Critical Nestle Sa
Publication of SK55295A3 publication Critical patent/SK55295A3/sk
Publication of SK280696B6 publication Critical patent/SK280696B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C19/00—Cheese; Cheese preparations; Making thereof
    • A23C19/02—Making cheese curd
    • A23C19/032—Making cheese curd characterised by the use of specific microorganisms, or enzymes of microbial origin
    • A23C19/0323—Making cheese curd characterised by the use of specific microorganisms, or enzymes of microbial origin using only lactic acid bacteria, e.g. Pediococcus and Leuconostoc species; Bifidobacteria; Microbial starters in general
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C19/00—Cheese; Cheese preparations; Making thereof
    • A23C19/097—Preservation
    • A23C19/10—Addition of preservatives
    • A23C19/11—Addition of preservatives of antibiotics or bacteriocins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
    • A23C9/123—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt
    • A23C9/1238—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt using specific L. bulgaricus or S. thermophilus microorganisms; using entrapped or encapsulated yoghurt bacteria; Physical or chemical treatment of L. bulgaricus or S. thermophilus cultures; Fermentation only with L. bulgaricus or only with S. thermophilus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L3/00—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs
    • A23L3/34—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals
    • A23L3/3454—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals in the form of liquids or solids
    • A23L3/3463—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
    • A23L3/3571—Microorganisms; Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q11/00—Preparations for care of the teeth, of the oral cavity or of dentures; Dentifrices, e.g. toothpastes; Mouth rinses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/11—Lactobacillus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/21—Streptococcus, lactococcus
    • A23V2400/249—Thermophilus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/885—Streptococcus

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

Oblasť techniky
Vynález sa týka dvoch (S.) thermophilus, kmeň S tieto bakteriocíny, spôsobu z uvedeného druhu, ako aj a/alebo týchto druhov pri kozmetických výrobkov.
bakteriocínov zo Streptococcus thermophilus, ktorý produkuje prípravy týchto bakteriocínov použitia týchto bakteriocínov príprave potravinárskych alebo
Doterajší stav techniky
Bakteriocín je protibakteriálna látka alebo činidlo, ktoré je účinné proti baktériám obsahujúcich proteínovú časť, v ktorej nastáva protibakteriálny alebo antibiotický účinok. Bakteriocín má všeobecne úzke spektrum účinnosti, alebo inhibičné spektrum je často obmedzené na druhy blízke druhom baktérií, ktoré ho produkujú.
V súčasností sú známe štyri bakteriocíny od 5. thermophilus.
Prvý má relatívnu molekulovú hmotnosť 10 až 20 kD, je tepelne nestály pri 90 °C a citlivý na pepsín ( Smaczny et al. , Deutsche Molkerei-Zeitung, 105,15. 460-464(1984)) .
Druhý, ktorý je opísaný najmä podlá jeho inhibičného spektra voči baktériám v EP 443 543, má osobitnú schopnosť zamedziť rastu baktérií rodov Staphylococcus a Pseudomonas, a neschopnosť zamedziť rastu baktérií rodov Lactococcus a Enterococcus a druhu Bacillus cereus.
Tretí, ktorý opísal Pulusani et al. (J. of Food Science, 44.2, 575-578(1979)), silne inhibuje Pseudomonas, nie je citlivý na pepsín a obsahuje zvyšky cukrov.
Nakoniec štvrtý, ktorý opísal Gilano et al. (Mikrobiológie-Aliment-Nutrítion, 8., 21-30(1990)), nie je citlivý na pepsín, obsahuje zvyšky cukrov a neprechádza membránou o pórovitosti 100 kD.
Teraz je S. thermophilus dôležitý hlavne v potravinár2 skom odvetví, kde je využívaný najmä pri príprave mliečnych výrobkov ako sú napríklad jogurty a niektoré syry. Jestvuje však len veľmi málo bakteriocínov, ktoré sú účinné súčasne proti Bacillus, Clostridium a Listeria. Bolo by preto veľmi užitočné mať, inými slovami existuje požiadavka mať, širší okruh bakteriocínov, produkovaných zástupcami týchto druhov, ktoré by mali širšie spektrum protibakteriálnej účinnosti, najmä v súvislosti s uvedeným typom výrobkov.
Cieľom tohto vynálezu je odozva na uvedenú požiadavku.
Podstata vynálezu
Jeden z predmetov tohto vynálezu je charakterizácia sekvencie aminokyselín dvoch nových bakteriocínov S. thermophilus, ako aj ich signálneho peptidu, ktorý umožňuje ich sekréciu.
Sekvencie nukleotidov, ktoré kódujú uvedené bakteriocíny, sú tiež ďalším predmetom tohto vynálezu.
Kmene Streptococcus thermophilus, ktoré produkujú najmenej jeden bakteriocín podľa tohto vynálezu, sú tiež ďalším predmetom vynálezu, najmä kmeň CNCM 1-1351 S. thermophilus, opísaný ďalej, ktorý je schopný produkovať dva bakteriocíny podľa tohto vynálezu.
Spôsob prípravy extraktu najmenej jedného bakteriocínu podľa tohto vynálezu je tiež predmetom tohto vynálezu.
Konečne posledným predmetom tohto vynálezu je použitie bakteriocínov podľa vynálezu a použitie ich nukleovej ako aj ich signálnej sekvencie.
Kmeň CNCM 1-1351 S. thermophiLus sa izoloval z ferraentovaných mliečnych výrobkov z (býv.) Československa a s prekvapením sa spozorovalo, že má významnú vlastnosť zamedzovať rastu širokému rozsahu baktérií. Podľa Budapeštianskej Dohody bol tento kmeň uložený 05.08.93 v národnej zbierke v Paríži (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, PASTEUR INŠTITÚTE, Rue du Docteur Roux, F-75724
PARIS CEDEX 15, Francúzsko), kde bol. zaznačený pod číslom 1-1351.
Podrobné údaje o tomto kmeni, vzťahujúce sa najmä na morfológiu, fermentáciu cukrov a podobné údaje sú uvedené ďalej:
Nie bielkové reťazce tvoriace koky. Netvorí spóry.
Grampozitívne mikroorganizmy, negatívne na katalázu a fakultatívne anaeróbne.
Fermentácia cukrov:
Produkcia kyseliny mliečnej z D-glukózy, laktózy, sacharózy, rafinózy. Kyselinu mliečnu netvorí z manózy, fruktózy a galaktózy.
Iné:
Kmeň produkuje najmenej dva bakteriocíny, jeden proteín na imunitu voči bakteriocínom, exopolysacharidy s textúrnymi vlastnosťami.
Kultivačná tekutina kmeňa CNCM 1-1351 má preto relatívne široké spektrum protibakteriálnej účinnosti. Medzi baktérie citlivé k tejto kultivačnej tekutine možno napríklad zahrnúť Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis, Lactococcus lactis biovar diacetylactis, Lactoccocus cremoris, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus brevis, Leuconostoc cremoris, Leuconostoc mesenteroides, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium i nfantí s, Propionibacteríum, Listeria innocua, Listeria monocytogenes, Micrococcus varians a. spóry a vegetatívne bunky Clostridium botulinum, Clost ridium tyrobutyricum, Clostridium bifermentans, Clostridium sporogenes, Bacillus subtilis, Bacilus pumilus a Bacillus cereus (Bactéries lactoques, Vol. 1, 1994, Lorica edition).
Potom bolo možné z tohto kmeňa CNCM I.-1351 izolovať dva proteínové faktory, označené ako bakteriocíny, ktoré sú príčinou protibakteriálneho účinku.
Prvý bakteriocín podľa tohto vynálezu, ktorý je tu označený termofilín 1, má sekvenciu SEQ ID NO:1, opísanú v ďalej uvedenom prehľade sekvencií.
Naviac možno predpokladať, že tento bakteriocín môže mať protibakteriálnu účinnosť širšiu, alebo viac špecifickú pre jeden rod alebo druh baktérií, ako má termofilín 1, ak posledný uvedený bude mať odlišnú sekvenciu od SEQ ID NO:1, napríklad v dôsledku náhrady, vynechania a/alebo vloženia najmenej jednej aminokyseliny. V skutočnosti je už známe z EP 521 240, že nizín Z má oveľa výhodnejšie spektrum účinnosti ako nizín A, pričom sa od nizínu A odlišuje len substitúciou aminokyseliny.
To je dôvod, pre ktorý všetky bakteriocíny, v ktorých je najmenej jedna aminokyselina nahradená, vynechaná a/alebo vložená do jej pôvodnej sekvencie SEQ ID NO:1, môžu sa považovať za bakteriocíny podľa tohto vynálezu.
Druhý bakteriocín podľa tohto vynálezu, tu označovaný ako termofilín 2, má sekvenciu SEQ ID N0:2, opísanú v ďalej uvedenom prehľade sekvencií. Tiež možno predpokladať, že tento bakteriocín môže mať protibakteriálnu účinnosť, ak bude mať sekvenciu odlišnú od sekvencie SEQ ID NO:2, napríklad v dôsledku náhrady, vynechania a/alebo vloženia najmenej jednej aminokyseliny. Konečne, všetky bakteriocíny, ktoré majú najmenej jednu z hore opísaných zmien v ich pôvodnej sekvencii SEQ ID NO: 2 možno považovať za bakteriocíny podľa tohto vynálezu.
Naviac, nukleotidové sekvencie s kódom termofilínu 1 a termofilínu 2 sú tiež ďalším predmetom tohto vynálezu, pretože každá z nich môže transformáciou napríklad na baktérii, kvasinke alebo rastline udeliť schopnosť inhibície niektorých baktérií. Tieto nukleotidové sekvencie môžu potom byť relatívne premenné, pretože môže nastať degenerácia genetického kódu a môžu pozostávať najmä z operónu kmeňa CNCM 1-1351, ktorý má nukleovú sekvenciu SEQ ID NO:3, opísanú v ďalej uvedenom prehľade sekvencií.
Bližšie, možno použiť nukleovú sekvenciu, pozostávajúcu z nukleotidov 221 až 475 sekvencie SEQ ID NO:3, ktorá kóduje termofilín 1 s jeho signálnym peptidom. Ale je výhodnejšie použiť len sekvenciu nukleotidov 221 až 288 zo sekvencie SEQ ID NO:3, kódujúcu signálny peptid, zabudovať ju do predmetného génu, aby bol schopný umožniť exkréciu kódovaného pro5 teínu týmto génom kmeňom Streptococcus thermophilus. Podobne je výhodnejšie použiť iba sekvenciu, kódujúcu vylučovaný termofilin 1, pozostávajúcu z nukleotidov 289 až 475 sekvencie SEQ ID NO:3, aby bola schopná zabudovania do signálnej sekvencie, napríklad vylučovaného plazmidu, a tak ju zabudovať do iného mikroorganizmu ako je Streptococcus thermophi1 us.
Podobne sa môže použiť nukleová sekvencia, obsahujúca nukleotidy 495 až 686 sekvencie SEQ ID NO:3, ktoré kódujú termofilin 2, s jeho signálnym peptidom. Je však výhodnejšie použiť iba sekvenciu kódujúcu signálny peptid z nukleotidov 495 až 557 sekvencie SEQ ID NO:3, aby bola schopná umožniť exkréciu druhom Streptococcus thermophilus ktoréhokoľvek proteínu pripojeného k uvedenému peptidu. Podobne je výhodnejšie použiť iba sekvenciu nukleotidov 558 až 686 sekvencie SEQ ID NO:3, kódujúcu vylučovaný termofilin 2, aby bola schopná zabudovania do signálnej sekvencie, napríklad vylučovaného plazmidu, a tak ju zabudovať do iného mikroorganizmu ako je Streptococcus thermophilus .
Konečne, v niektorých kmeňoch Streptococcus thermophilus, iných ako bol CNCM 1-1351 sa pozorovalo, že vykazujú podobné inhibičné spektrum spektru kmeňa CNCM 1-1351 a odolnosť k poslednému (najmä kmene Sfil2 a 25, opísané ďalej), a preto je veľmi pravdepodobné, že tieto kmene môžu produkovať najmenej jeden z bakteriocínov podľa tohto vynálezu, ako aj súčasne imunitný proteín prejavujúci uvedenú odolnosť. Nakoniec, všetky kmene, schopné produkovať najmenej jeden z bakteriocínov, uvedených hore, sú zahrnuté do tohto vynálezu.
Spôsob prípravy záleží v príprave extraktu, obsahujúceho najmenej jeden bakteriocín podľa tohto vynálezu; kultivuje sa kmeň Streptococcus thermophilus, ktorý produkuje najmenej jeden z uvedených bakteriocínov v prostredí a v podmienkach vhodných na rast Streptococcus thermophilus až dovtedy, kým prostredie neobsahuje 10 - 10 mikroorganizmov vyžadovaného druhu v 1 ml. Potom sa získaná kultúra odstredí a zo supernatanta sa pripraví extrakt, ktorý obsahuje najme6 nej jeden z uvedených bakteriocínov.
Na prípravu uvedeného extraktu sa môže v prostredí a v podmienkach vhodných na rast Streptococcus thermophilus kultivoval: kmeň Streptococcus thermophilus , ktorý produkuje najmenej jeden z uvedených bakteriocínov podlá tohto vynálezu, najmä kmeň CNCM 1-1351 Streptococcus thermophilus. Môže sa kultivoval najmä v prostredí MSK (odstredené kravské mlieko doplnené extraktom z kvasiniek), alebo napríklad v prostredí HJ (kravský mliečny u'ltraf iltračný permeát, doplnený kvasničným extraktom a sójou). Kultivácia sa výhodne vykonáva v prostredí, ktoré je selektívne pre Streptococcus, ako je prostredie M17, opísané P.E. Terghazim et al., J. Appl. Microbiol., 29, 807-813(1975), doplnené s 0,5 - 2 % cukru, ktorý môžu fermentoval Streptococcus thermophilus , najmä, napríklad, sacharózou, laktózou alebo glukózou.
Toto prostredie sa môže pripravil zmiešaním 95 ml roztoku základného kultivačného prostredia a 5 ml roztoku, obsahujúceho 10 g fermentovateľného cukru v 100 ml vody. Každý z týchto roztokov sa osobitne sterilizoval pri 121 °C počas 15 minút, pričom základné prostredie sa pripravilo rozpustením nasledovných zložiek v 950 ml vriacej vody:
-trypsínový hydrolyzát kazeínu 2,5 g
-pepsínový hydrolyzát mäsa 2,5 g
-papainový hydrolyzát sóje 5,0 g
-extrakt z kvasiniek 2,5 g
-mäsový extrakt 5,0 g
-β-glycerolfosfát .19,0 g
-síran horečnatý 0,25 g
-kyselina askorbová 0,5 g
Uvedený kmeň sa môže kultivoval v tomto prostredí, vhodnom na rast S. thermophilus, napríklad pri 37 až 48 °C i 7 počas 2 až 8 hodín, kým prostredie nebude obsahovat 10 az
8 10J mikroorganizmov príslušného druhu v 1 ml. Hodnota 10 mikroorganizmov/ml zodpovedá na jednej strane optickej hustote prostredia, meranej pri 600 nm (ΟΟ^θθ) asi 3,6, a na druhej strane je to koncentrácia, ktorá sa dosahuje v kráv7 skom mlieku vtedy, keď koaguluje účinkom okyslenia, vyvolaného kultivovaným kmeňom.
Na prípravu surového extraktu z uvedeného supernatantu možno použiť ktorýkoľvek zrážací spôsob, ako je napríklad zrážanie kyselinou trichlóroctovou, vysolenie alebo rozpúšťadlové zrážanie. Pri príprave tohto surového extraktu sa prednostne nastaví pH supernatanta na 1,0 až 2,0 pomocou H3PO4, zrazenina sa odstráni a vykonajú sa ešte jedno alebo dve opakované zrážania s kyselinou trichlóroctovou, vždy s následným resuspendovaním vo, vodnej suspenzii s kyselinou trifluorooctovou.
Použitie bakteriocínov a/alebo kmeňa Streptococcus thermophilus, ktorý tieto bakteriocíny produkuje podľa tohto vynálezu, je zamerané na oblasť prípravy potravinárskych alebo kozmetických výrobkov.
Kultúra uvedeného kmeňa Streptococcus thermophilus sa bližšie môže použiť ako štartovacia kultúra napríklad pri príprave syrov, najmä syrov typu mozzarella (na zamedzenie dier, tvorených Bacillus polymixa, ktorých spóry prežívajú ferinentáciu) , syrov švajčiarskeho typu (ako je Gruyére alebo ementál, na zničenie kontaminácie druhom Clostridium tyrobutyricuni) , typu vacherin (na zničenie kontaminácie druhom Listeria monocytogenes), a typu séré (francúzske meno pre mäkké alebo krémové syry), alebo na prípravu kyslých mliečnych výrobkov, najmä jogurtov, alebo práškového mlieka, určeného pre malé deti1.
Bližšie, uvedený kmeň Streptococcus thermophilus sa môže kultivovať v mlieku v kombinácii s kmeňom Lactobacillus bulgaricus, ktorý je stredne citlivý na termofilín (napríklad kmeň YL5, opísaný ďalej), na predídenie prekyslenia jogurtov, spôsobovaného L.bulgaricus.
Uvedené bakteriocíny, najmä vo forme surového alebo čisteného extraktu, alebo uvedený druh mikroorganizmov, môžu sa napríklad použiť tiež ako prísada alebo aktívna látka proti patogénnym baktériám, najmä pri príprave šľahaných mäsových výrobkov, ako aktívne činidlo proti, rastu spór klostrídií, najmä C'lost ridium botulinum, alebo pri príprave krémov a pleťových vôd, ako aktívna látka proti patogénnym baktériám kože, alebo alternatívne pri výrobe prípravkov na ústnu hygienu, ako je činidlo proti patogénnym baktériám ústnych dutín, najmä proti Streptococcus sobrinus.
Bakteriocíny podľa tohto vynálezu sú podrobnejšie charakterizované d’alej v texte prostredníctvom rôznych mikrobiologických, biochemických a genetických údajov, ktoré ilustrujú ich vlastnosti. Percentuálne údaje sú vzťahované na hmotnosť.
Jednotka protibakteriálnej účinnosti - Agarová jamková skúška.
V rámci tohto vynálezu sa protibakteriálna účinnosť vyjadruje pomocou zvolených jednotiek.
Jedna zvolená jednotka (au) sa definuje ako recipročná hodnota najväčšieho zriedenia, pri ktorom vzorka ešte vykazuje protibakteriálnu účinnosť pri skúške, známej odborníkom v danej oblasti pod názvom agarová jamková skúška - agar well test, v ktorom anglické vyjadrenie doslovne znamená skúšku, pri ktorej sa používa jamka vyrezaná v agare.
Štandardná vzorka supernatanta kultúry 5. thermophilus podľa tohto vynálezu, pripravená pri štandardných podmienkach, ktoré sú uvedené v príklade 1, má typicky účinnosť 32 au pre objem 70 mikrolitrov. To potom znamená účinnosť 460 au/ml.
Štandardný surový extrakt bakteriocínu, získaný z kultivačného supernatanta, ilustrovaného v príklade 1, vyčírením a následným postupným dvojitým zrážaním kyselinou trichlóroctovou a potom vždy resuspendovaný vo vodnej suspenzii s trifluorooctovou kyselinou,! má typicky účinnosť asi. 1,4.10^ au/ml. !
Bolo už uvedené, že pomocou agátového jamkového testu sa má určiť, či ešte má vzorka· pri danom zriedení protibakteriálnu účinnosť.
Na tento cieľ sa pripraví 35 ml prostredia 1417 naliatím do Petriho misky a pridá sa 1 % sacharózy a 1,5 % agaru.
ml prostredia 1417, ku ktorému sa pridalo 1 % sacharózy a 0,75 % agaru sa zaočkovalo s 5 mikrolitrami kultúry S.
thermophilus , pripravenej v priebehu predošlého dňa; použije sa kmeň, ktorý je typicky citlivý na prítomnosť bakteriocínu (typický indikátor), v tomto prípade napríklad druh
S.fi3.
Uvedených 5 ml sa preleje na uvedených 35 ml a ponechá sa schnúť počas 15 minút pod laminárnym prúdením. V kultivačnom prostredí sa vytvoria otvory s priemerom 5 mm.
Skúšané vzorky v množstve po 70 mikrolitrov/otvor sa nalejú do otvorov a inkubujú sa 6 hodín pri anaeróbnych podmienkách pri 42 ’C. Počas inkubácie rastie indikačný kmeň a zviditeľnia sa inhibičné kruhové pásma - halos . Zr.iedovací pomer, pri ktorom už vzorka nevykazuje protibakteriálnu účinnosť je zriedenie, pri ktorom sa už halo nedá rozlíšiť.
Inaktivácia enzýmami.
Pomocou uvedenej agarovej jamkovej skúšky po očkovaní uvedeným typickým indikátorovým druhom, ako je; uvedené hore, sa stanoví, či sú alebo nie sú prítomné bakteriocíny inaktivované rôznymi enzýmami.
Všetky enzýmy s výnimkou lipázy sa pridávali v množstvách 1 mikrogram/ml až 10 mikrogramov/ml enzýmu k štandardnému surovému extraktu, zriedenému 33x v pufr.i, odporúčanom dodávateľom enzýmu, aby sa tak získali 70 raikrogramové vzorky pri 300 au. Enzým sa potom ponechal pôsobiť počas 30 minút pri teplote odporúčanej dodávateľom enzýmu, a potom sa celý preniesol do jamky agarovej jamkovej skúšky.
Na druhej strane sa k 100 mikrolitrom komerčnej lipázy, obsahujúcej 200 mikrogramov lipázy v 1 mí , pridal 1 mikroliter zmesi inhibítorov (1,25 M EDTA, 0,25 % pepstatínu A (p4265 Sigma), 0,25 % E-64 (E3132 Sigma) a 0,25 % aprotínu (A1153 Sigma)). Inhibítory sa nechali pôsobiť 45 minút pri teplote miestnosti, potom sa pridalo 5 mikrol.itrov (450 au) zriedeného štandardného surového extraktu a ponechttlo sa reagovať 30 minút pri 37 ’C a potom sa 70 mikrolitrov zmesi prenieslo do jamky agarovej jamkovej skúšky. Použili sa zrieďovacie pufre;
pH 2,0; 100 mM roztok kyseliny malelnovej, nastavený
pomocou NaOH,
pH 7,0: 100 mM roztok fosfátového pufra
(k2hpo4 /kh2po4),
pH (K9HP04 7,5: /KH2P04), 100 mM roztok fosfátového puf ra
pH 7,75: 100 mM roztok Tris-Cl.
Priemer inhibičnéhu kruhového pásma sa porovnával s priemerom kontrolného pásma, získaného bez prídavku enzýmov, ktoré - pre každý pufer a pri každej inkubačnej teplote - bolo asi 14 mm.
Nasledujúca tabuľka I uvádza uvádza výsledky, získané so skúšanými enzýmami. V tejto tabuľke sú enzýmy označované ich typom, označením dodávateľa a číslom dodávateľa. Inaktivác.ia bakteriocínov sa javí ako závislá od koncentrácie pridaného enzýmu. Číslo 0 znamená, že inhibičné pásmo už nie je zreteľné, inými slovami že protibakteriálna účinnosť prítomného bakteriocínu bola eliminovaná inkubáciou s enzýmom. Obraz 14 poukazuje na to, že stále je zrejmé 14 mm inhibičné pásmo, ktoré zodpovedá plnej protibakteriálnej účinnosti prítomného bakteriocínu.
Tabuľka I
Enzýmy Koncentrá- cia(gg/ml) pH pufra Inkubačná teplota C Inaktivácia (mm)
Pepsín 10 2,0 37 0
(SIGMA P-700)
Proteináza K 4 7,0 37 0
(MERCK 1000 144)
Ficín 10 7,0 37 0
(SIGMA F 3266) Pronáza E 10 7,5 37 0
(SIGMA P-8038) Nagaráza 10 7,5 25 0
(SIGMA P-4789) Trypsín 10 7,5 25 0
(SIGMA T-8128) a-chymotripsín 1 7,75 25 14
(SIGMA C-7762) Kataláza 104 7,75 25 14
(SIGMA C-10) a-amyláza 1 7,75 25 14
(SIGMA A-0521) Lipáza(SIGMA L 200 7,75 37 14
-0382) +p.roteázové .inhibítory
Všetky proteázy potláčajú protibakteriálnu účinnosť supernatanta, čo poukazuje na to, že v tejto aktivite je zapojená proteínová časť.
Skutočnosť, že sa nepozoruje nijaký vplyv katalázy na protibakteriálnu účinnosť bakteriocínov tiež poukazuje nti to, že inhibícia rastu typického indikátorového kmeňa nie je dôsledkom protibakter.iálnej účinnosti H2O2, o ktorom je známe, že má podobnú účinnosť ako bakteriocíny, hoci H2O2 môže byť degradovaný katalázou.
Podobne aj skutočnosť, že sa nepozorovala žiadna α-amylázou spôsobovaná inaktivácia protibakteriálnej účinnosti poukazuje na neprítomnosť α-amylázou hydrolyzovateľných cukrov, týkajúcich sa tejto protibakteriálnej účinnosti.
Naviac skutočnosť, že lipáza nemá žiadny vplyv na protibakteriálnu účinnosť, poukazuje tiež na neúčasť lipidického podielu v tejto účinnosti.
Inhibičné spektrum
Pomocou agarovej jamkovej skúšky naočkovanim rôznych druhov sporov alebo baktérií sa určuje, či kultivačný supernatant kmeňa CNCM 1-1351, ktorý produkuje dva baktériocíny podlá tohto vynálezu, má inhibičnú účinnosť na rast týchto rôznych baktérií, inými slovami, stanovuje sa inhibičné spektrum tohto supernatanta.
Na to slúži pozorovanie inhibičného účinku na rast skúšaného kmeňa, vyvolávaného vzorkou supernatanta, vykazujúceho účinnosť okolo 300 au pri pH 7,0, vo vzťahu k inhibičnému účinku rovnakej vzorky, ale pred tým deaktivovanej inkubáciou pri 37 °C počas 30 minút za prítomnosti 5 mikrogramov/ml proteinázy K; Inhibičný účinok deaktivovanej vzorky je normálne nulový.
Na vykonanie týchto skúšok sa použili mnohojamkové tkanivové kultivačné platne FALCON 3046. 6 ml prostredia M17, ktoré obsahovalo naviac 1 % laktózy a 1,5 % agaru (prostredie M17 L) sa prekrylo s 700 mikrolitrami prostredia M17, ktoré obsahovalo naviac 1 % laktózy a 0,6 % agaru a ktoré bolo naočkované s 1 % kultúry skúšaného kmeňa, pripraveného predchádzajúci deň a zriedeného na hodnotu ODggg asi 0,1.
Ak mal skúšaný kmeň rásť zo sporov, potom sa naočkovanie vykonalo s 10$ - 10^ sporov na ml prekrývajúceho prostredia .
Ak skúšané kmene neboli Lactoccocus, Streptococcus ani Entérococcus, nahradilo sa prostredie M17L štandardným prostredím, vhodným na rast príslušných baktérií, najmä prostredie MRS, obsahujúce naviac 2 % glukózy pre Lactobacillus,
Pediococcus, Leuconostoc a Bifidobacterium (Sanofi Diagnostics Pasteur, Francúzsko), prostredie RCM pre spóry alebo vegetatívne bunky druhu Clostridium (Oxoid, Anglicko), a prostredie BHI (Difco, USA) pre ostatné skúšané baktérie.
V každej platničke sa vytvorili dva otvory s priemerom 5 mm a hlboké tiež 5 mm. Do jedného otvoru sa vnieslo 70 mikrolitrov vzorky s 300 au prítomného bakteriocínu a do druhej jamky sa vniesla rovnaká vzorka, ale pred tým deaktivovaná. Inkubácia sa vykonala pri vhodnej teplote pre rast skúšaného druhu počas nevyhnutnej doby na pokrytie platničky s viditeľným bakteriálnym povlakom.
Účinok alebo stupeň inhibície je charakterizovaný priemerom pozorovaného inhibičného kruhového pásma. Za veľmi vysokú inhibíciu (++++) sa považuje pásmo s priemerom 16 - 18 mm, vysoká inhibícia (+++) má priemer asi 11,5 až 15,5 mm, priemerná (++) má priemer 7,5 - 11 mm, slabá ( + ) je pre priemer 5 - 7,5 mm a nulová (-), ak sa nijaké inhibičné pásmo nespozorovalo.
Skúšalo sa viac ako 74 kmeňov baktérií rôznych druhov, produkujúcich kyselinu mliečnu, a zistilo sa, že len asi 7 % z nich je odolných k supernatantu. Podrobnosti o výsledkoch týchto skúšok sú zhrnuté v ďalej uvedenej tabuľke II. V tabuľke II, ako aj v ďalších nasledujúcich tabuľkách uvedený názov druhu alebo uvedené číslo je číslo, ktoré je zaevidované v zbierke Nestlé (adresa: NESTEC S.A., Research Centre, Vers-chez-les-Blanc, CH-1000 Lausanne 26, Švajčiarsko). Uvedená teplota je teplota inkubácie pri skúške.
Tabuľka II
Druh Č. T/°C Inhibícia
Streptococcus thermophilus YS3 42 +4--+-
(Druhy Sf.il2 a 25 vykazujú odol- YS4 42 +++
nosť k druhu CNCMI-1351 a spektrum YS11 42 +++
protibakteriálnej účinnosti podob- YS7 4 2 +++
né ako tento druh). YS8 42 +++
YS20 42 +++
Sf i3 42 4· 4-4-
Sfil8 42 +++
(Druh STU má odolnosť len k druhu Sfil9 42 +++
CNCM 1-1351; zdá sa však, že iba Sfi2O 4 2 +++
menej ako 5 % streptokov je schop- Sfilô 42 +++
ných vykázať túto odolnosť). STU 42 -
Sfil2 42 -
Sfi25 42 -
Lactococcus lactis SL2 30 ++
(producenti nizínu) SL13 30 ++
SL16 30 ++
SL25 30 4-4-
SL31 30 ++
SL63 30 4-4-
Lactococcus lactis SLP26 30 ++
SLP29 30 ++
SLP24 30 ++
SL64 30 ++
SL58 30 ++
SL40 30 ++
Lactococcus lactis biovar SD39 30 ++
diacetylacti s SD80 30 ++
SD57 30 ++
SD11 30 ++
SD113 30 ++
14a -
Druh Č. T/ ’ C Inhibícia
Lactococcus cremoris SC20 30 ++
SC15 30
SC11 30 ++
SC145 30 -H-
SC63 30 -H-
SC28 30 ++
Encerococcus faecalis SFS1 30 +
SFS2 30 +
SFS10 30 +
Encerococcus faecium SFM1 30 ++
SFM3 30 ++
SFM6 30 ++
SFM10 30 ++
SFM14 30 -H-
SFM9 30 +
Lactobacillus fermencum L26 30 -H-
L50 30 +4-
L28 30 -H-
LF16 30 4—b
LF15 30 ++
Laccobacillus helvecieus LH91 40 ++++
LH2 40 +++
LH3 40 +++
LH1 40 +++
Laccobacillus ac idophilus LQ1 40 ++
LQ3 40 +
LQIO 40 4-1-
LQ21 40 +
LQ23 40 +-H-+
UQ26 40 -
Laccobacillus brevis LB2 30 +++
LB10 30 -
LB13 30 +++
Druh Č. T/C Inhibícia
Lactobacillus bulgaricus YL12 40
YL2 40 +
YL5 40 ++
LB32 40 +++
Leuconostoc cremoris LCC1 30 ++
LCC7 30 ++
LCC2 30 ++
Leuconostoc mesenceroides LCM9 30 ++
LCM10 30 ++
LCM18 30 4-+
Z tabuľky II možno zistiť, že inhibičné spektrum supernatanta je úzke v rom zmysle, že napríklad pre určité druhy Lactobacillus, ako je Lactobacillus acidophilus, Lactobacilus brevis a Lactobacílus bulgaricus nie je stupeň inhibície rovnorodý. Avšak pre ostatné druhy, ako je napríklad L. fernentun, L. helveticus a Lactococcus je stupeň inhibície rovnorodý .
Toto je výhodné z hľadiska skutočnosti, že je veľmi ťažké rozlíšiť jeden kmeň od druhého v rámci toho istého druhu. Preto je možné predpokladať výhodné využitie supernatanta alebo čistených bakteriocínov na rozlišovanie medzi priemyselnými kmeňmi.
Možno tiež predpokladať použitie kmeňa, produkujúceho najmenej jeden z bakteriocínov podľa tohto vynálezu, v kultúre spolu s iným kmeňom mliečnych baktérií, ktorý je prirodzene odolný, alebo len slabo citlivý na bakteriocín(y), vzniklými v prostredí. Tak sa môžu napríklad vyrábať jogurty, najmä jogurty vykazujúce znížené dodatočné zvyšovanie kyslosti..
Pozorovalo sa tiež, že supernatant inhibuje rast šiestich nizín produkujúcich kmeňov L. lactis. To dokazuje, že uvedený bakteriocín nie je nizín. Je to potvrdené aj skutočnosťou, že uvedený bakteriocín je inaktivovaný trypsínom pri 10 mikrogramoch v 1 militri (porovnaj v tab.I), čo neplatí pre nizín.
Inhibičné spektrum supernatantu kultúry, produkujúcej dva bakteriocíny podľa vynálezu, je však tiež široké v tom zmysle, že nie je obmedzené na druhy baktérií mliečneho kvasenia, ale zasahuje do ďalších druhov grampozitívnych baktérií, najmä potravinárskych baktérií Bifidobacterium, Listeria innocua, Listeria monocytoggen.es a Micrococcus varians, a do sporov a buniek mnohých patogénnych baktérií, napríklad rodov Clostridium a Bacillus, ako sa uvádza výsledkami v ďalej uvedenej tabulke III.
Tabuľka III
Druh Č. T/ c Inhibícia
3ifi doba c Cerí um breve BBR27 37 +++
BBR4 37 +++
BBR39 37 +++
Bifidobacterium longum BL20 37 +++
3L13 37 +++
BL22 37 +++
Bifidobacterium b.ifidum BB7 37 +++
BB9 37 +++
B312 37 +++
Bifidobacterium infantis B16 37 +++
Bil 37 +++
Propionibacterium PP1 30 +++
Clostridium botulinum CB1 30 ++
(spóry a vegetatívne bunky) CB2 30 ++
Clostridium tyrobutiricum 107001 30 +
(spóry a vegetatívne bunky) 107002 30 ++
Zmes sporov
Clostridium sporogenes 100021
Clostridium fermentum 100022 30 ++
Clostridium but i 1inum A-69; B-213; BKA40; B-73 211;
6 kmeňov A-BO - 12icíovis; B-l-KCA
- 17'-
Druh Č. T/ C Inhibícia
Listeria innocua 24 30 +
25 30 +
27 30 +
39 30 +
40 30 +
41 30 +
Listeria monocytoaenes 57 30 ++
58 30 ++
59 30 + +
60 30 ++
61 30 ++
62 30 ++
Bacillus subtilis : A2 30 ++
(Spóry a vegetatívne bunky) A3 30 ++
A13 30
A14 30 ++
A15 30 ++
Bacillus pumilus
(Spóry a vegetatívne bunky) B2 30
Bacillus cereus
(Spóry a vegetatívne bunky) C14 30 ++
Micrococcus varians MCV1 30 ++
Micrococcus luteus
(nizínovv indikátor) MCL1 30 -
Výsledky predložené v tejto tabuľke I. II dovoľujú predpokladať, inter alia, výhodné použitie tohto supernat anta, alebo uvedených čistených bakteriocinov, ako aditíva, napríklad pri príprave potravinárskych výrobkov, ako aktívne činidlo proti patogénnym baktériám, najmä v mäsových výrobkoch proti CLostridium, v syroch proti Li 5· teria nonocytogenes a C. tyrobutyricum, alebo do čerstvých krémov alebo štiav pre čerstvé nátierky proti BaciLlus, v ktorých uvedené druhy samozrejme vznikajú. ·
Nakoniec, uvedené bakteriocíny nevykazujú inhibičný vplyv na rast gramnegatívnych baktérií, ako možno vidieť z výsledkov v tabuľke IV, uvedenej ďalej.
Tabuľka IV
Druh Číslo T/°C Inhibícia
Escherichia coli BZ234 37 -
Sa lmonel la thyphimurium 274 37 -
273 37 -
Pseudomonas ae rugi nosa 5 37 -
13 37 -
Pseudomonas fluorescens 11 37 -
12 37 -
Tepelná odolnosť, stálosť
Bakteriocíny prítomné v extrakte, získanom za podmienok uvedených v príklade 1, nemajú dobrú stálosť pri uchovávaní pri 4 °C , ak extrakt nebol pred tým zahriatý. Na druhej strane však vykazujú dobrú stálosť pri uchovávaní, ak sa extrakt intenzívne zahrieval, napríklad pri 90 až 121 °C počas nejmenej 15 minút.
Podrobne sa napríklad overilo, že sa zachovala viac ako 50 %-ná účinnosť extraktu po piatich mesiacoch uchovávania pri 4 °C , ak bol uvedený extrakt pred tým zahrievaný počas 20 minút na vodnom kúpeli pri teplote 94 “C . Overilo sa tiež, že sa zachovala 100 percentná účinnosť po zahrievaní uvedeného extraktu počas 60 minút pri 100 C (skúška sa vykonala na termostatovanom olejovom kúpeli s 1 ml supernatanta, koncentrovaného alebo iného z kultúry kmeňa S. thermopphilus spôsobom podľa tohto vynálezu).
Na druhej strane si ale uvedené bakteriocíny zachovávajú napríklad iba asi tretinovú účinnosť po sterilizácii počas 30 minút pri 121 °C (skúška sa vykonala s 40 ml neskoncentrovaného supernatanta kultúry kmeňa S. thermophilus spôsobom podľa tohto vynálezu ).
Nakoniec., ultrafiltračnými skúškami na filtroch Amicon a nasledujúcou elektrofoŕézou (SDS-PAGE) sa pozorovalo, že uvedené bakteriocíny podľa tohto vynálezu sú v supernatante kultúry 5. thermophilus, najmä v supernatante štandardnej kultúry získanej v príklade 1, vo forme agregátov s molekulovou hmotnosťou (MV) väčšou ako 10 kDa, z ktorých 67 % vykazuje MV menšiu ako 100 kDa a 33 % má MV väčšiu ako 100 kDa. ί
t.
Čistenie bakteriocínov j
V nasledujúcom texte sa koncentrácia kyseliny trifluorooctovej a acetonitrilu udáva v objemových percentách.
Pripraví sa 1 liter kultúry kmeňa CNCM 1-1351 v prostredí M17, doplnenom 1 % sacharózy a kultivuje sa počas 6 hodín pri 42 °C v anaeróbnych podmienkách.
Potom sa priamo do kultúry pridá 20 g živice XAD-7 (Sigma) a všetko sa intenzívne mieša 1 hodinu pri 4 °C Zmes sa potom filtruje filtrom č. 604 Schleicher & Schuell (Nemecko), potom sa na filtri zachytená živica premyje 1 litrom roztoku kyseliny octovej koncentrácie 50 mM a pH
5,2, aby sa odstránili baktérie. Živica sa potom prenesie na stĺpec kolóny a bakteriocíny sa eluujú s 45 ml roztoku obsahujúceho 70 % acetonitrilu a 0,1 % trifluorooctovej kyseliny (TFA). Získa sa tak eluát, ktorý obsahuje oba bakteriocíny.
Tieto dva eluované bakteriocíny sa potom oddelia nasledovne .
Najprv sa zníži objem eluátu na 24 ml odstredením/vymrazovaním (Speedvac, Savant Inštrument), získaný objem sa potom nastaví na koncentráciu NaCl cNaci= 2 M a na koncentráciu Tris.Cl Cp = 250 mM a na pH = 8 do objemu 50 ml, potom sa tento objem nastriekne na stĺpec hydrofóbnej Phenyl Superose HR 16/10 kolóny (Pharmacia), vopred ustálenej s pufrom, obsahujúcim 50 nM roztok Tris.Cl, pH 8 a 2 M NaCl. Kolónou sa nechá postupne pretiecť 200 ml uvedeného pufra, ďalej sa 100 mililtrami vytvára lineárny gradient koncentrácií počínajúc predchádzajúcim pufrom a končiac 50 mM roztokom Tris.Cl s pH 8, so 100 militrami predošlého roztoku a 60 militrami vody, potom 60 ml roztoku 50 mM Tris.Cl o pH 8, a nakoniec 60 ml čistej vody. Rýchlosť prietoku je 4 ml/min.
Na výstupe z kolóny sa z každej frakcie potom odoberie vždy 50 mikrolitrov, zriedi vždy s 50 mikrolitrami 0,1 %-ného roztoku TFA a agarovou jamkovou skúškou, opísanou hore, sa z každej zmesi zhodnotí protibakteriálna účinnosť. Tak sa pozorovalo, že podiely eluátu v intervale od 470 ml do 490 ml majú protibakteriálnu účinnosť. Tieto podiely sa potom zmiešali, objem týchto zmesí sa potom znížil odstredením/vymrazovaním na 1 ml, potom sa tento znížený objem nastriekol na PeP RPC HR 5/5 kolónu (Pharmacia), vopred ustálenú s 0,2 %-ným roztokom TFA, ktorý je v tomto zverejnení označovaní ako roztok A. Pripravil sa t.iež eluačný roztok B, ktorý obsahoval 70 % acetonitrilu a 0,097 % TFA. Kolóna sa postupne eluovala rýchlosťou 1 ml/min roztokmi: 1 ml roztoku A, 9 ml roztoku vytvárajúceho lineárny koncentračný gradient počínajúc roztokom A a končiac zmesou 50/50 roztokov A a B, 2 mililitrani posledne uvedenej zmesi, 7 mililitrami roztoku vytvárajúceho linerárny gradient koncentrácií počínajúc posledne uvedenou zmesou a končiac druhou zmesou 20/80 roztokov A a B, 2 ml roztoku vytvárajúceho linerárny gradient počínajúc od posledne uvedenej druhej zmesi a končiac roztokom B a nakoniec 2 ml posledne uvedeného roztoku .
Stanovovala sa protibakteriálna účinnosť jednotlivých podielov z výstupu kolóny s použitím agarovej jamkovej skúšky, opísanej hore. Všetky podiely od 14 ml do 22 ml vykazovali prot ibakteriálnu účinnosť. Na druhej strane sa pri. sledovaní absorbancie pri 215 nm rozlíšili dva hlavné proteínové piky v podieloch 15 a 21 ( uvedené v ml) .
Sekvencia bakteriocínov
Dusíkatá terminálna časť proteínov, ktoré sa nachádzali v podieloch 15, 18, 20, 21 a 22, sa analyzovala na sekvenciu zoskupení použitím automatického analyzátora sekvencií Applied Biosystems 4774.
Takto sa zistilo, že v podieli 15 je prítomný peptid, ktorý má sekvenciu 48 aminokyselín zhodnú s N-terminálovou časťou sekvencie SEQ ID NO:1. Ďalší peptid, prevážne pritom21 ný v podiel! 21, má sekvenciu 23 aminokyselín , ktorá je zhodná so sekvenciou N-terminálovej časti sekvencie SEQ ID NO: 2
Tieto výsledky preto ukazujú, že kmeň CNCM 1-1351 produkuje dva peptidy, ktoré majú protibakteriálnu účinnosť. Avšak rôzny vzhľad inhibičného kruhového pásma, získaného z podielov 15 a 21 dovoľuje predpokladať rozdielnu protibakteriálnu účinnosť termofilínu 1 v porovnaní s termofilínom 2, oba z tohto vynálezu.
Na druhej strane sa podiely 15 a 21 analyzovali vzhľadom na prítomné aminokyseliny. Použil sa známy spôsob dabsyl chlorid derivatization po predchádzajúcej hydrolýze pomocou 6 M HCl pri 100 °C počas 24 hodín. Výsledky poukazujú, že každý podiel pozostáva z aminokyselín, ktoré zodpovedajú príslušnej sekvencii peptidu.
Konečne, podiely 15 a 21 sa analyzovali tiež pomocou hmotnostnej spektroskopie. Pre termofilín 1 sa stanovila molekulová hmotnosť na úrovni 5800 Daltonov a pre termofilín 2 na úrovni 3900 Daltonov.
Sekvencia génov bakteriocínov
Bežným spôsobom sa pripravili degenerované nukleové sekvencie SEQ ID NO:6 a SEQ ID NO:7, opísané v ďalej uvedenom prehľade sekvencií, ktoré zodpovedajú príslušným N-terminálnym a C-terminálnym častiam vopred sekvencovaného peptidu termofilínu 1.
Časť zmesi so sekvenciami SEQ ID NO:6 sa potom účinkom T4 polynukleotidovej kinázy rádioaktívne označila, ako je opísané v laboratórnej príručke Molécular cloning, a laboratory manual (2.vydanie, Sambrook et al., Cold Spring Harbor, Laboratory Press, 1989), ktorá je v tomto zverejnení, ďalej označovaná ako Maniatis.
S pomocou dvoch nerádioaktívnych zmesí degenerovaných sekvencií SEQ ID NO:6 a SEQ ID NO:7 sa vykonala PCR (polymerázová reťazcová reakcia) na chromozomálnej DNA z kmeňa CNCM 1-1351, ako je opísané v príručke PCR Technology (H.A. Erdlich, editor, M.Stockton Press, London).
Na géli z elektroforézy sa objavil pás 128 základných párov (base pairs, v ďalšom pb), ktorý sa potom eluoval podľa Maniatis. Časť sa potom klonovala priamo do plažmidu pGEM-T (Promega) postupom podľa odporúčania dodávateľa a potom sa sekvencovala dideoxynukleotidovým postupom podľa Maniatis, za použitia univerzálnych vzoriek pUC19. Tak sa získala vzorka, ktorá mala sekvenciu SEQ ID NO:8, opísanú v ďalej uvedenom prehľade sekvencií, zodpovedajúcu sekvencii kódu aminokyslín 9 až 47 termofilínu 1. Konečne, ďalšia časť eluovaného pása 128 pb sa rádioaktívne označila postupom podľa Maniatis, označeným ako random priming.
Popri uvedenom sa vykonala digescia chromozomálnej DNA z kmeňa CNCM ΙΊ351 s EcoRI a HindlII postupom odporučeným dodávateľom enzýmu. Potom sa vykonala analytická gélová elektroforéza z 10 mikrogramov produktu digescie, DNA sa v alkalickom prostredí preniesla z gélu na membránu Zeta próbe (B.iorad) . Membrána sa predhybridizuje pri 54 °C cez noc v prostredí, obsahujúcom 6X SSC, 1 % SDS a 1 % odstredeného mlieka, potom sa táto membrána hybridizuje na rádioaktívnu degenerovanú vzorku SEQ ID NO:6 v predošlom hybridií začnom médiu, najprv počas 18 hodín pri 54 “C a pri znižovaní teploty o 2 “C vždy každé 3 hodiny, potom počas 24 hodín pri teplote 42 °C . Membrána sa potom premýva 2 minúty trikrát za sebou v 6X SSC pri! teplote miestnosti a počas 1 minúty v 6X SSC pri teplote ^7 °C . Nakoniec sa membránou exponuje autoradiografický fijlm. Všetky uvedené kroky sa vykonali podľa príručky Maniatis.
i;
Kmeň BZ234 EscherichLa coli (Biocentre Coliection, University of Bale, Švajčiarsk
ô), vopred príslušne označený, sa potom bežným spôsobom transformoval s väzbovým prostredím.
potom vyselektovali postupu, označovaného ako v príručke Maniatis, preTransf ormované bunky sa a-komplementáciou. Potom 'podľa colony lift, ktorý je uyedený nieslo sa 300 kolónií na ; filter, kde sa podrobili lýzii a hybridizácii na rádioaktívnu sekvenciu SEQ ID NO:8 a potom sa filtrom exponoval autoradiografický film.
Na filme sa potom zistilo 13 kolónií, ktoré mali plaz23 mid schopný hybridizácie so sekvenciou SEQ ID NO:8. Dve z týchto kolónií sa oddelili, extrahoval sa z nich bežným spôsobom plazmid DNA. Fragment DNA klonovaný do dvoch vybraných pUC19 plazmidov sa podrobil sekvencionovaní dideoxynukleotidovým postupom a š pomocou pUC19 vzoriek a tak sa získali vzorky na báze uvedených sekvencii.
Z dvoch vybraných plazmidov sa tak obdržala sekvencia identická s nukleovou sekvenciou SEQ ID NO:3, opísaná v ďalej uvedenom prehľade. Táto sekvencia tak obsahuje operon, kódujúci dva proteíny, ktoré majú aminokyselinové sekvencie SEQ ID NO:4, ktoré zodpovedajú termofilínu 1 pred vyzretím a SEQ ID NO:5, zodpovedajúca termofilínu 2 pred vyzretím (pozri ďalej uvedený prehľad sekvencii). Tretí voľný rad hodnôt začína tiež z nukleotidu 679 tejto sekvencie a mal by s určitosťou zodpovedať imunitnému génu.
Porovnaním N-terminálných peptidových sekvencii čistených bakteriocínov a aminokyselinových sekvencii proteínov kódovaných v rámci kódu operonu SEQ ID NO:3 možno stanoviť, že proteín aminokyselinovej | sekvencie SEQ ID NO:4 (termofilín 1) má hlavný peptid; z 23 aminokyselín, ktorý má glycín-glycínovú jednotku, charakteristickú pre skupinu bakteriocínov bektérií mliečnfej kyseliny. Konečne, molekulová i
hmotnosť termofilínu 1, [vypočítaná z nukleovej sekvencie i
zodpovedá hodnote molekulovej hmotnosti, stanovenej spektrometricky, čo je povedzme na úrovni 5 800 Daltonov.
Podobne, proteín aminokyselinovej sekvencie SEQ ID NO: 5 (termofilín 2) má hlayný pept id z 21 aminokyselín, ktorý má glycín-glycínovú jednotku, charakteristickú pre triedu bakteriocínov z baktérií mliečnej kyseliny. Konečne, molekulová hmotnosť termofilínuj 2, vypočítaná z jeho nukleovej sekvencie zodpovedá hodnote, zistenej spektrometrieky, čo je, povedzme, na úrovni 3 900 Daltonov.
Úloha rôznych bakteriocínov.
• i
Zistila sa homológia| sekvencie termofilínu 1 s prvým peptidom operonu lactokoceínu M (Klaenhammer et a'l. , FEMS
Micro.Rev.,12, 39-86(1993)
Táto homológia sa vzťahuje na
- 24 i opakovanie GA jednotky. V banke údajov GenEMBL za použitia TFASTA programu z GCG sa podobne zistila homológia pre termofilín 2 s génom operonu laktacínu F (Klaenhammer et al. , citované hore).
Uvedené dva laktokoceín M a laktacín F operony v skutočnosti kódujú komplexy, zahrnujúce niekoľko peptidov. Preto je možné, že vpredu opísané operony môžu kódovať peptidy, spolupôsobiace v týchto komplexoch.
Nie je však vylúčené, že uvedené dva bakteriocíny pôsobia každý nezávisle, pretože sa prejavujú trocha rozdielnymi inhibičnými kruhovými pásmami uvedených dvoch termofilínov pri agaŕovej jamkovej skúške, uvedenej vpredu.
Ďalej sú uvádzajú príklady ako znázornenie postupu prípravy a použitia bacteriocínu podľa tohto vynálezu. Uvedené percentuálne údaje sa vzťahujú na hmotnosť, pokiaľ nie je uvedené inak. j
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Kultivačné prostredie M17 , ku ktorému sa pridalo 1 % sacharózy, sa naočkovalo s 1 % (objem/objeni) kultúry, obsaO hujúcej 10 mikroorganizmov kmeňa CNCM 1-1351 5. thermophilus v 1 mililitri. Inkubácia prebiehala počas 6 hodín pri 42 °C v anaeróbnych podmienkách. Potom prostredie obsahovalo
O asi 10 mikroorganizmov v 1 ml a malo 3,6.
Takto získaná štandardná kultúra sa odstredila. Supernatant (štandard) sa okyslil na pH 1,5 s kyselinou fosforečnou, získala sa zrazenina, ktorá sa odstránila odstredením, a kyslý supernatant.
Bakteriocíny obsiahnuté v posledne uvedenom sa vyzrážali s 10 %-nou kyselinou trichlóroctovou. Vyzrážané bakteriocíny sa potom resuspendovali vo vodnej suspenzii 0,2 %-nej kyseliny trifluorooctovej (objem/objem).
Bakteriocíny sa ζηονει vyzrážali 10 %-nou trichlóroctovou kyselinou. Vyzrážané bakteriocíny sa oddelili, premyli s 100 %-ným acetónom a resuspendovali vo vodnej suspenzii s kyselinou trifluorooctovou (objem/objem).
Získaný štandardný surový extrakt prítomných bakteriocínov mal účinosť 1,4.105 au/ml.
Tabuľka VI, uvedená ďalej, uvádza niektoré podrobnosti o charaktere jedného litra štandardného supernatanta a o 18 ml štandardného surového extraktu, inými slovami jeho koncentrátu, najmä z hľadiska obsahu proteínu a protibakteriálnej účinnosti.
Tabulka VI
Supernatant Surový extrakt
Objem (ml) 1000 18
Celkový proteín (mg):
(Súpravou PIERCE) 6700 83
au/ml 4,6.102 1,4.105
au/mg proteínu 68 2,5.105
au/mg sušiny - 1,4.105
Celková účinnosť (au) 4,6.103 2,1.103
Príklad 2
Pripravila sa násada ;jogurtov, obsahujúca kmeň podľa vynálezu 5. thermophilus CNGM 1.-1351 a kmene STU z S. thermophilus (ktorý je odolný voči baktériocínom podľa tohto vynálezu, ale nevykazuje protibakteriálnu účinnosť) a YL5 z L. bu'lgaricus, spomínaný už v predchádzajúcom texte.
Pripravila sa mliečna báza, založená na plnotučnom mlieku, ktorá obsahovala 3,7 % tuku a 2,5 % práškového odstredeného mlieka. 40 litrov tohto mliečneho základu sa pasteurizovalo 6 minút pri 92; °C, potom sa homogenizovalo pri í
75°C a 150 baroch (dvojstupňovo) a konečne.sa ochladilo na teplotu asi 42 °C .
V sterilnom MSK živnom prostredí (10 % rekonštruovaného práškového odstredeného mlieka, obsahujúceho 0,1 % komerčného extraktu z kvasiniek) sa neaktivovali vymrazením súše26 né kmene S. termophilus CNCM 1-1351, 5. thermophilus STU a L. bulgaricus YL5 niekoľkými následnými predkultiváciami.
Sterilný mliečny základ sa potom naočkoval v množstve 1 % (objem/objem) tretími pre-kultúrami z obidvoch kmeňov S. thermophilus, odobratých v štádiu koagulácie prostredia, a treťou pre-kultúrou L. bulgaricus v množstve 2 % (objem/objem), ktorá sa odobrale tiež v štádiu koagulácie prostredia. Mlieko sa potom .inkubovalo pri 42 °C až do hodnoty pH 4,65 a potom sa vzorky ochladili na 4 °C .
Na porovnávanie sa pripravila tradičná násada jogurtov rovnakým spôsobom, ako je opísané v predchádzajúcom odseku, s kmeňmi YS8 a SFi3 S. thermophilus, ktoré tiež už boli uvedené v texte, a s kmeňom YL18 L. bulgaricus, ktoré sú tradične používané na výrobu jogurtov.
V ďalej uvedenej tabuľke sú uvedené charakteristiky získaných výrobkov, najmä ich pH v priebehu ich uloženia pri 4 “C .
Príklad čas potrebný na okyslenie na pH 4,65 pH výrobku po 1 dni (pri 4’C ) pH výrobku po 24 dňoch (pri 4’C )
Príklad 2 8 h 30 min. 4,6 4,6
Porovnávací
príklad 6 h 4,34 4,3
Príklad 3
Tradičným spôsobom sa pripravil syr Mozzarella s pomocou kultúry kmeňa S. thermophilus CNCM 1-1531.
Príklad 4
Vyrobilo sa 10 litrov kultúry kmeňa CNCM 1-1351 S. thermophilus v M17 prostredí, doplnenom 1 %-ora sacharózy šesťhodinovou kultiváciou pri 42 ’C a za anaeróbnych podmienok. Ku kultúre sa potom priamo pridalo 200 g živice XAD-7 (Sigma), celé sa intenzívne miešalo 1 hodinu pri 4 ’C. Zmes
- 27 sa potom filtrovala filtrom No.604 Schleicher & Schuell (Nemecko) , na filtri zachytená živica sa potom premyla 10 litrami 50 mM roztoku kyseliny octovej o pH 5,2 na odstránenie baktérií. K živici sa potom pridalo 450 ml roztoku obsahujúceho 100 %-ný etanol a 20 mM octan amónny, živica sa zachytila na filtri a fiitrát sa vysušil vymrazovaním až sa získal prášok, pozostávajúci z bakteriocínov podľa tohto vynálezu, ktorý sa môžu použiť v potravinárskom priemysle.
Protibakteriálna účinnosť tohto prášku, vopred zriedeného vodou, sa potom stanovovala agarovou jamkovou skúškou, i 7 opísanou už skôr. Tento prášok mal účinnosť 10' au na 1 g prášku.
Nakoniec sa 0,5 g/kg hore uvedeného prášku pridalo do mäsovej nátierky počas jej prípravy tradičným spôsobom. Tak-5 to získaná nátierka, obsahujúca 5.10 au/g bakteriocínov, bola schopná celkom inhibovať rast patogénnych baktérií, najmä rast Clostridium.
Príklad 5 ;
Tento príklad sa vzťahuje na prípravu hydratačného krému na ochranu pleti, obsahujúceho 0,05 kg/kg prášku, opísa9 ného v príklade 4, čo teda znamená 5.10 au/g bakteriocínov schopných inhibovať rast na koži nežiaducich baktérií.
Na výrobu tejto emulzie sa zmiešali zložky tukovej fázy A a zahriali sa na 75 °C . Pripravila sa vodná fáza B a tiež sa zahriala na 75 °C , potom sa za mierneho miešania pridala k tukovej fáze A, zmes sa potom ochladila za pomalého miešania na teplotu miestnosti, čo je asi 25 °C . Podľa predpisu sa pri tejto teplote a za mierneho miešania pomaly pridali zložky C.
Tuková fáza A:
Peg-6-stearát, glycerát a peg-20-cetyl éter 15 (peg: polyetylénglykol)
Vazelínový olej 5
Olej z pšeničných klíčkov s 0,1 % fenylindans (antioxidant) a 1 % sójových fosfolipidov (pozri EP 941 09 355.1) 3
Sladké mandľové oleje 2
Cetyl alkohol 1
Izostearylizostearát 2
2-oktyl-dodecyl-myristát 1
Lanolínový vosk 1
Vodná fáza B
Metylizotiazolín 0,1 Demineralizovaná voda 59,6 Protein ľudskej placenty 2
Prísady C %
Propylén glykol a extrakt z nechtíka 2 % rozpustný kolagén v demineralizovanej vode 5,8
2,5 % prášok bakteriocínov podľa P.r.íkl.4 v demineralizovanej vode 0,2
Príklad 6
Do tekutého prostriedku na čistenie zubov sa pridá 0,5 kg/kg bakteriocínového prášku, opísaného v príklade 4. Tento ústny prostriedok je tak schopný inhibovaf rast patogénnych baktérií ústnej dutiny, najmä baktérií Streptococcus sobri29
Príklad 7
Roztok obsahujúci bakteriocínový prášok z príkladu 4, zriedený vo vode v množstve 1 % sa rozpráši na potravinársky výrobok určený na sterilizáciu, aby sa zabránilo následnej kontaminácii počas balenia.

Claims (21)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Bakteriocín baktérií Streptococcus thermophilus, ktorý má sekvenciu aminokyselín SEQ ID N0:l.
  2. 2. Bakteriocín baktérií Streptococcus thermophilus , ktorý má sekvenciu aminokyselín SEQ ID NO: 2.
  3. 3. Baktériocíny podľa nárokov 1 a 2, vyznačujúce sa tým, že sa odlišujú od sekvencie SEQ ID NO:1 alebo SEQ ID NO: 2 substitúciou, vynechaním a/alebo vložením nejmenej jednej aminokyseliny.
  4. 4. Nukleotidová sekvencia kódujúca jeden z bakteriocínov baktérií Streptococcus thermophilus podľa jedného z nárokov 1 až 3 .
  5. 5. Sekvencia podľa nároku 4, ktorá má nukleotidovú sekvenciu SEQ ID NO:3, kódujúca baktériocíny podľa nárokov 1 a 2.
  6. 6. Nukleotidová sekvencia podľa nároku 5, vyznačujúca sa tým, že obsahuje nukleotidy 221 až 475 sekvencie SEQ ID NO: 3 .
  7. 7. Nukleotidová sekvencia podľa nároku 6, vyznačujúca sa tým, že obsahuje nukleotidy 289 až 475 sekvencie SEQ ID NO: 3
  8. 8. Nukleotidová sekvencia podľa nároku 5, vyznačujúca sa tým, že obsahuje nukleotidy 495 až 686 sekvencie SEQ ID NO: 3 .
  9. 9. Nukleotidová sekvencia podľa nároku 8, vyznačujúca sa tým, že obsahuje nukleotidy 558 až 686 sekvencie SEQ ID NO: 3 .
  10. 10. Nukleotidová sekvencia podľa nároku 6, vyznačujúca sa tým, že obsahuje nukleotidy 221 až 288 sekvencie SEQ ID NO: 3.
  11. 11. Nukleotidová sekvencia podľa nároku 8, vyznačujúca sa tým, že obsahuje nukleotidy 495 až 557 sekvencie SEQ ID NO: 3.
  12. 12. Signálny peptid baktérií Streptococcus thermophilus, kódovaný nukleotidovými sekvenciami podľa nárokov 10 a 11.
  13. 13. Kmeň Streptococcus thermophilus , ktorý produkuje najmenej jeden z bakteriocínov podľa nárokov 1 až 3, najmä kmeň CNCM 1-1351 Streptococcus thermophi lus, ktorý produkuje bakteriocíny podľa nárokov 1 a 2.
  14. 14. Spôsob prípravy najmenej jedného bakteriocínu podľa nárokov 1 až 3, vyzačujúci sa tým, že kmeň Streptococcus thermophilus, produkujúci najmenej jeden z uvedených bakteriocínov, je kultivovaný v prostredí a v podmienkách vhodných na rast Streptococcus thermophilus, až prostredie obsahuje 10 az 10 mikroorganizmov uvedeného kmeňa per ml, získaná kultúra sa odstredí a pripraví sa extrakt supernatanta, obsahujúci najmenej jeden z uvedených bakteriocínov.
  15. 15. Spôsob podľa nároku 14, vyzačujúci sa tým, že na prípravu extraktu najmenej jedného z uvedených bakteriocínov, obsiahnutých v supernatante, sa upraví pH supernantanta na hodnotu 1,0 - 2,0 kyselinou fosforečnou, zrazenina sa odstráni, vykoná sa jedno alebo viac postupných prezrážaní kyselinou trichlóroctovou, vždy s následovným resuspendovaním vo vodnej suspenzii s kyselinou trifLuorooctovou .
  16. 16. Spôsob podľa nároku 14, v y z a č u j ú c i sa tým, že kmeň Streptococcus thermophilus je kmeň CNCM 1-1351, ktorý produkuje uvedené bakteriocíny.
  17. 17. Použitie najmenej jedného bakteriocínu podľa nárokov 1 až 3, najmä vo forme extraktu, získaného podľa nároku 14, a/alebo kmeňa Streptococcus thermophilus , ktorý produkuje najmenej jeden z uvedených bakteriocínov, na prípravu potravinárskych alebo kozmetických výrobkov.
  18. 18. Použitie podľa nároku 17 kultúry uvedeného kmeňa Streptococcus thermophilus ako štartéra pri príprave syrov alebo pri príprave kyslých mliečnych výrobkov.
  19. 19. Použitie podľa nároku 17 najmenej jedného z baktériocínov alebo kmeňov ako prísady alebo aktívnej látky proti patogénnym baktériám, najmä pri príprave mäsových výrobkov ako sú nátierky, ako aktívnu látku proti Clostridium botulinum, alebo pri príprave krémov a pleťových vôd ako aktívnu látku proti patogénnym baktériám kože, alebo pri príprave prostriedkov na ústnu hygienu ako aktívnu látku proti patogénnym baktériám ústnej dutiny, najmä proti Streptococcus sobrinus.
  20. 20. Použitie najmenej jednej z nukleových sekvencií podľa nároku 4 až 9 na získanie schopnosti, transformáciou na baktérie, kvasinky alebo rastliny, inh.ibovať určité baktérie .
  21. 21. Použitie jednej z nukleových sekvencií podľa nárokov 10 a 11 ako signálnej sekvencie, ktorti. sa vloží do príslušného génu na udelenie, transformáciou, na kmeň Streptococcus thermophilus , schopnosť vylučovať proteín kódovaný uvedeným príslušným génom.
SK552-95A 1993-09-03 1995-04-28 Bakteriocíny zo streptococcus thermophilus, spôsob SK280696B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CH262893 1993-09-03
PCT/EP1994/002805 WO1995006736A1 (en) 1993-09-03 1994-08-24 BACTERIOCINS FROM $i(STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS)

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK55295A3 true SK55295A3 (en) 1995-08-09
SK280696B6 SK280696B6 (sk) 2000-06-12

Family

ID=4238040

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK552-95A SK280696B6 (sk) 1993-09-03 1995-04-28 Bakteriocíny zo streptococcus thermophilus, spôsob

Country Status (26)

Country Link
US (1) US5683890A (sk)
EP (1) EP0643136B1 (sk)
JP (1) JP3031716B2 (sk)
KR (1) KR0183187B1 (sk)
CN (1) CN1065568C (sk)
AT (1) ATE207960T1 (sk)
AU (1) AU677100B2 (sk)
BR (1) BR9405576A (sk)
CA (1) CA2148223C (sk)
CZ (1) CZ284978B6 (sk)
DE (1) DE69428854T2 (sk)
ES (1) ES2165860T3 (sk)
FI (1) FI952080A (sk)
HU (1) HU217216B (sk)
MX (1) MX194616B (sk)
MY (1) MY113279A (sk)
NO (1) NO951688D0 (sk)
NZ (1) NZ273567A (sk)
PH (1) PH31943A (sk)
PL (1) PL308541A1 (sk)
RU (1) RU2153505C2 (sk)
SK (1) SK280696B6 (sk)
TR (1) TR27735A (sk)
UA (1) UA43326C2 (sk)
WO (1) WO1995006736A1 (sk)
ZA (1) ZA946620B (sk)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE234924T1 (de) * 1995-08-07 2003-04-15 Nestle Sa Bakteriozin
AU2874697A (en) * 1995-12-22 1997-07-17 Innogenetics N.V. Sequences coding for new bacteriocins
NZ533636A (en) 2001-11-29 2007-03-30 Univ Bruxelles A food grade lantibiotic from streptococcus macedonicus and uses thereof
US7556833B2 (en) * 2003-11-26 2009-07-07 Kraft Foods Global Brands Llc Cheese flavoring systems prepared with bacteriocins
US7988958B2 (en) * 2005-04-05 2011-08-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Enterococcus and Streptococcus strains and bacteriocins
US20100034924A1 (en) * 2006-06-16 2010-02-11 Christophe Fremaux Bacterium
WO2008066931A2 (en) * 2006-11-29 2008-06-05 Novozymes, Inc. Bacillus licheniformis chromosome
EP1972207B1 (en) * 2007-03-21 2018-02-28 Nestec S.A. Safety System For Powdered Nutritional Compositions
FR2916759B1 (fr) * 2007-05-29 2009-07-10 Adisseo France Sas Soc Par Act Peptide rumc presentant une activite antimicrobienne
WO2010001580A1 (ja) * 2008-06-30 2010-01-07 明治乳業株式会社 発酵乳の製造方法，及び発酵乳
DE202009011379U1 (de) * 2009-08-24 2010-12-30 Khalifa, Samir Orale Präparate zur Mund- und Zahnpflege und Bekämpfung von Mundgeruch
ES2762445T3 (es) * 2011-04-29 2020-05-25 Gervais Danone Sa Uso de cepas mutantes resistentes a la nisina de lactobacilos para reducir la post-acidificación en productos alimenticios
RU2492231C2 (ru) * 2011-07-28 2013-09-10 Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ) Способ выделения бактериоцинов
LT6142B (lt) 2013-05-15 2015-04-27 Uab "Biocentras" Sėklinių grūdų ir sėklų apdorojimo būdas
CN106010996B (zh) * 2016-04-29 2020-04-24 周礼红 一种醋酸杆菌及其培养分离方法、筛选方法和应用
CN111248277A (zh) * 2018-11-30 2020-06-09 内蒙古伊利实业集团股份有限公司 一种高蛋白低脂肪酸奶及其制备方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0732702B2 (ja) * 1990-02-23 1995-04-12 雪印乳業株式会社 新規乳酸菌、その産生する抗菌物質、この乳酸菌を含有する発酵乳用スターター及びそれを用いた発酵乳の製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP0643136B1 (fr) 2001-10-31
NO951688L (no) 1995-05-02
MX194616B (es) 1999-12-15
KR0183187B1 (ko) 1999-04-01
ATE207960T1 (de) 2001-11-15
CA2148223A1 (en) 1995-03-09
JP3031716B2 (ja) 2000-04-10
RU2153505C2 (ru) 2000-07-27
FI952080A0 (fi) 1995-05-02
KR950704499A (ko) 1995-11-20
AU677100B2 (en) 1997-04-10
HU9501259D0 (en) 1995-06-28
DE69428854T2 (de) 2002-04-11
ZA946620B (en) 1995-04-03
JPH08503140A (ja) 1996-04-09
CN1114112A (zh) 1995-12-27
HUT72547A (en) 1996-05-28
DE69428854D1 (de) 2001-12-06
PL308541A1 (en) 1995-08-21
EP0643136A1 (fr) 1995-03-15
RU95109910A (ru) 1997-03-27
CZ113995A3 (en) 1995-11-15
ES2165860T3 (es) 2002-04-01
FI952080A (fi) 1995-05-02
CA2148223C (en) 2001-10-02
NO951688D0 (no) 1995-05-02
SK280696B6 (sk) 2000-06-12
BR9405576A (pt) 1999-05-25
AU7691194A (en) 1995-03-22
CN1065568C (zh) 2001-05-09
HU217216B (hu) 1999-12-28
PH31943A (en) 1999-05-14
TR27735A (tr) 1995-07-07
US5683890A (en) 1997-11-04
CZ284978B6 (cs) 1999-04-14
UA43326C2 (uk) 2001-12-17
NZ273567A (en) 1997-05-26
MY113279A (en) 2002-01-31
WO1995006736A1 (en) 1995-03-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0821736B1 (en) Bacteriocins
US6689750B1 (en) Bactericide compositions prepared and obtained from microccus varians
SK55295A3 (en) Bacteriocins from streptococcus thermophilus
MXPA96003127A (en) Bacterioc
US5173297A (en) Bacteriocin from lactococcus lactis subspecies lactis
US7449311B2 (en) Method of producing macedocin by culturing Streptococcus macedonicus
US5232849A (en) Bacteriocin from lactococcus lactis subspecies lactis
JPH10500012A (ja) 溶解素による乳酸バクテリアの培養物を溶解する方法および得られる溶解培養物の使用
Van der Vossen 4th Symposium on Lactic Acid Bacteria: Genetics, Metabolism and Applications