SK55293A3 - Recombinant insect virus and method to produce this virus - Google Patents
Recombinant insect virus and method to produce this virus Download PDFInfo
- Publication number
- SK55293A3 SK55293A3 SK552-93A SK55293A SK55293A3 SK 55293 A3 SK55293 A3 SK 55293A3 SK 55293 A SK55293 A SK 55293A SK 55293 A3 SK55293 A3 SK 55293A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- virus
- gene
- insect
- function
- viral
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 305
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 title claims abstract description 134
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 53
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 135
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 71
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 21
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 76
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 52
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims description 51
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 claims description 30
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 26
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 26
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 23
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 17
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 12
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 9
- 230000000051 modifying effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 7
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 7
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 claims description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 6
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 claims description 5
- 108090000189 Neuropeptides Proteins 0.000 claims description 4
- 230000004075 alteration Effects 0.000 claims description 3
- 241000700572 Entomopoxvirinae Species 0.000 claims description 2
- 241000701945 Parvoviridae Species 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 2
- 238000005204 segregation Methods 0.000 claims description 2
- 241000701378 Ichnovirus Species 0.000 claims 1
- 241000701377 Iridoviridae Species 0.000 claims 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 claims 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 claims 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 15
- 238000001890 transfection Methods 0.000 abstract description 8
- 230000007547 defect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract 2
- 230000001524 infective effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 abstract 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 96
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 45
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 45
- 241000201370 Autographa californica nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 37
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 33
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 30
- 241000701366 unidentified nuclear polyhedrosis viruses Species 0.000 description 26
- 230000006870 function Effects 0.000 description 25
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 25
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 24
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 24
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 22
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 19
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 19
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 19
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 13
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 13
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 10
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 9
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 9
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 8
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 8
- 241000894007 species Species 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 7
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 7
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 6
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 6
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 6
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 6
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 6
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 6
- 230000034994 death Effects 0.000 description 6
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 6
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 6
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 6
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 6
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 230000001418 larval effect Effects 0.000 description 6
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 6
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 6
- 208000018591 proliferative vasculopathy and hydranencephaly-hydrocephaly syndrome Diseases 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 5
- 108010001515 Galectin 4 Proteins 0.000 description 5
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 5
- 241000255993 Trichoplusia ni Species 0.000 description 5
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 5
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 5
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 4
- 101000608765 Homo sapiens Galectin-4 Proteins 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 4
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- 241001367049 Autographa Species 0.000 description 3
- 241001203868 Autographa californica Species 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 241000255601 Drosophila melanogaster Species 0.000 description 3
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 3
- 241000256244 Heliothis virescens Species 0.000 description 3
- 101710145242 Minor capsid protein P3-RTD Proteins 0.000 description 3
- 101150031940 P74 gene Proteins 0.000 description 3
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 3
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 3
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 3
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 3
- 241000209149 Zea Species 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 210000000087 hemolymph Anatomy 0.000 description 3
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 3
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- 108020005098 Anticodon Proteins 0.000 description 2
- 241000145903 Bombyx mori cypovirus 1 Species 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091062157 Cis-regulatory element Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 241001135545 Cydia pomonella granulovirus Species 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 2
- 241000256257 Heliothis Species 0.000 description 2
- 241001599018 Melanogaster Species 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 102000003797 Neuropeptides Human genes 0.000 description 2
- 206010029412 Nightmare Diseases 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 2
- 239000004721 Polyphenylene oxide Substances 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 241000256248 Spodoptera Species 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 241000700566 Swinepox virus (STRAIN KASZA) Species 0.000 description 2
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 230000002728 bioinsecticidal effect Effects 0.000 description 2
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 102000017941 granulin Human genes 0.000 description 2
- 229920000140 heteropolymer Polymers 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 229920000570 polyether Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N tungsten Chemical compound [W] WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010937 tungsten Substances 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BZXMNFQDWOCVMU-UHFFFAOYSA-N 2-[dodecanoyl(methyl)amino]acetic acid;sodium Chemical compound [Na].CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC(O)=O BZXMNFQDWOCVMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150033839 4 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- 208000002874 Acne Vulgaris Diseases 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 101800002326 Adipokinetic hormone Proteins 0.000 description 1
- 241000256118 Aedes aegypti Species 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000702419 Ambidensovirus Species 0.000 description 1
- 241000670670 Amsacta Species 0.000 description 1
- 241000239239 Androctonus Species 0.000 description 1
- 241001219494 Androctonus australis hector Species 0.000 description 1
- 241001550224 Apha Species 0.000 description 1
- 241000239290 Araneae Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000702628 Birnaviridae Species 0.000 description 1
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 1
- 101100263837 Bovine ephemeral fever virus (strain BB7721) beta gene Proteins 0.000 description 1
- 229910052686 Californium Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000701379 Campoletis sonorensis ichnovirus Species 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241001124093 Chironomus luridus Species 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000260524 Chrysanthemum balsamita Species 0.000 description 1
- 235000005633 Chrysanthemum balsamita Nutrition 0.000 description 1
- 235000008733 Citrus aurantifolia Nutrition 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 241000254173 Coleoptera Species 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000120509 Corriparta virus Species 0.000 description 1
- 241000710127 Cricket paralysis virus Species 0.000 description 1
- 241001634817 Cydia Species 0.000 description 1
- 101150042515 DA26 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- 101100125027 Dictyostelium discoideum mhsp70 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710158332 Diuretic hormone Proteins 0.000 description 1
- 241000233482 Drosophila X virus Species 0.000 description 1
- 108091054442 EV proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710160636 Eclosion hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000000564 Elongation Factor 2 Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010016831 Elongation Factor 2 Kinase Proteins 0.000 description 1
- 101100316840 Enterobacteria phage P4 Beta gene Proteins 0.000 description 1
- 241000701867 Enterobacteria phage T7 Species 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000710781 Flaviviridae Species 0.000 description 1
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 1
- 241000255890 Galleria Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101150031823 HSP70 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000258937 Hemiptera Species 0.000 description 1
- 241000257303 Hymenoptera Species 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 241000256602 Isoptera Species 0.000 description 1
- 241000254022 Locusta migratoria Species 0.000 description 1
- 241000721696 Lymantria Species 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241000555303 Mamestra brassicae Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 1
- 235000010624 Medicago sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241000922538 Melanoplus sanguinipes Species 0.000 description 1
- 241000254099 Melolontha melolontha Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108700011325 Modifier Genes Proteins 0.000 description 1
- 101100521130 Mus musculus Prelid1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000723741 Nodaviridae Species 0.000 description 1
- 108091060545 Nonsense suppressor Proteins 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241000150800 Nudaurelia Species 0.000 description 1
- 101150093715 P4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000150350 Peribunyaviridae Species 0.000 description 1
- 241000907661 Pieris rapae Species 0.000 description 1
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 description 1
- 239000004353 Polyethylene glycol 8000 Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101710093543 Probable non-specific lipid-transfer protein Proteins 0.000 description 1
- 241000238709 Pyemotes tritici Species 0.000 description 1
- 101000658304 Pyemotes tritici Toxin TxP-I Proteins 0.000 description 1
- 241001456341 Rachiplusia ou Species 0.000 description 1
- 241000702247 Reoviridae Species 0.000 description 1
- 241000253973 Schistocerca gregaria Species 0.000 description 1
- 241000239226 Scorpiones Species 0.000 description 1
- 241000710960 Sindbis virus Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000187392 Streptomyces griseus Species 0.000 description 1
- 101710181863 Structural DNA-binding protein p10 Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 235000011941 Tilia x europaea Nutrition 0.000 description 1
- 241000710924 Togaviridae Species 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 101710097943 Viral-enhancing factor Proteins 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 101710086987 X protein Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 206010000496 acne Diseases 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 210000001172 blastoderm Anatomy 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- HGLDOAKPQXAFKI-UHFFFAOYSA-N californium atom Chemical compound [Cf] HGLDOAKPQXAFKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 101150052825 dnaK gene Proteins 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- XUFQPHANEAPEMJ-UHFFFAOYSA-N famotidine Chemical compound NC(N)=NC1=NC(CSCCC(N)=NS(N)(=O)=O)=CS1 XUFQPHANEAPEMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009313 farming Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 150000008282 halocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004571 lime Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- YIEDSISPYKQADU-UHFFFAOYSA-N n-acetyl-n-[2-methyl-4-[(2-methylphenyl)diazenyl]phenyl]acetamide Chemical compound C1=C(C)C(N(C(C)=O)C(=O)C)=CC=C1N=NC1=CC=CC=C1C YIEDSISPYKQADU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004492 nuclear pore Anatomy 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000002420 orchard Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 101150004203 plc gene Proteins 0.000 description 1
- 229940085678 polyethylene glycol 8000 Drugs 0.000 description 1
- 235000019446 polyethylene glycol 8000 Nutrition 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 241000700570 unidentified entomopoxvirus Species 0.000 description 1
- 241000701451 unidentified granulovirus Species 0.000 description 1
- 239000002435 venom Substances 0.000 description 1
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 description 1
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 description 1
- 230000004095 viral genome expression Effects 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000006490 viral transcription Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/033—Rearing or breeding invertebrates; New breeds of invertebrates
- A01K67/04—Silkworms
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/40—Viruses, e.g. bacteriophages
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14051—Methods of production or purification of viral material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
- C12N2710/14121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
- C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Oblasť techniky , . .
. 1' . . ,'·.''.· I;
.. λ’·'. ‘ /·
Tento vynález sa týka neinfékčného hmyzieho vírusu so zmeneným.genetickým základom, ktorého funkčnosť sá obnoví génovou kompleinentáciou, čím sa opäť pripraví f^orma vírusu infekčná pre hmyz. Tento vynález sa Šalej zaoberá inzerciou heterológneho génu do vírusového genómu, pričoidtouto inzerciou sa dosiahne to, že vírus produkuje látku s potláčajúcimi ale' · · v * · · bo modifikačnými .účinkami na hmyz, a tým sa.zlepši.bioinsekticídny účinok a genetická stabilita žiadaných vlastností. .
' Í'· /
Doterajší stav^techniky ? V tomto popise sa používajú nasledujúce skratky:
t
f. ť
A. cäl. - Autographa čalifornica ' t
AcMNPV - jadrový polyedrický vírus Autographá“ calif.orňica bp - . páry báz
ECV 7 extracelulárný vírus · ( .
C-V - granulózny vírus ' | kO - kilodaltony. ť , < f · ý ·
MOI 7 multiplicita infekcie |· ; .
> . , · ,·* C ' ť
FTPV - jadrový polyedncky vírus
CB - oklúzne teleso ' ;
. ’ . ·' , ' ·. A.. . ·
CV -okludovaný vírus J
PGR 7 reťazová polymerizačná reakcia
PDV r vírus odvodený od polyedrického vírusu?
p.i. - po infekcii* . . |
PIB - polyedrické inklúzne teleso /známe tiež ako: Q B - oklúz· ne teleso/ ľ
- 2 5 UTR sekvencia mRMA alebo génová sekvencia zodpovedajúcej :oblasti, ktorá začína od štartové^' miesta transkripcie génu a pokračuje až k poslednej báze alebo poslednému páru báz, ktorá /ktorý/ predbieha ini/ i ciačný' kodón pre syntézu proteínu h'
UTR - ..sekvencia mRNA alebo génová sekvencia zodpovedajúcej í : oblasti, ktorá začína od prvej bázy alebo prvého . páru báz za terminačným kodónom pre syntézu oroteínu a pokračuje až.k poslednej báze kódovanej génom na 3*konci mRNA /+/-ýlákno - vlákno DNA génu a jeho; lemujúce sekvencie·, ktoré má rovnaký zmysel čítania ako RNA, kto• ; í' rá je od tohto génu odvodená /-/-vlákno .vlákno DNA génu a; jeho lemujúce sekvencie, ktoré je komplementárne k /+/ňvláknu.
Vynález sa vzťahuje na všetky hmyzie; vírusy, včítane DNA ,.a- RNA. vírusov. Medzi DNA vírusy, sa zahŕňajú entomopox ví-· · _ ť t. í. y ' ' ' rusy? /EPV/ a vírusy čelade Bhculoviridae, ako sú,jadrové polyedrické vírusy /.NPV/. a granulózne vírusy /GV/ a podobné. Medzi RNA vírusy sa zahŕňajú togavírusy, flavivírusy, picornavíŕusy, cytoplazmatické polyedrické vírusy?/CPV/ a oodôbne. poďčplaädvojvláknových DNA vírusov, Eubaculov'írinae obsahuje dva rody, vírusy typu MPV. a vírusy typu GV, ktoré sú obzvlášť •, · ί ' užitočné pre biologickú kontrolu, pretože voísvojom životnom cykle vytvárajú oklúzne telesá /CB/· t
V bezstavcových živočíchoch bola zistená prítomnosť viacjt než 4C0 druhov baculovírusov. Jadrový pjplyedrický vírus Autographa caliŕornica /ACMNPV/ je prototypoví vírusu čelade 3aculoviridae, ktorý pôsobí na mnoho hostiteľov. A.cMNPV vírus :,bol pôvodne -izolovaný z druhu nočného m.oiýla Autographa .-K “ ' ' . ’ ' y, californica /A· cal./, z larválneho štádia .'/vo svojom dospelom štádiu je tento druh nočná mora /. Larvy druhu A. calZ sú všeobecne známe ako húsenice žijúce ne lucerne.
;$'ť ' i'· . '’· <,· :·.· fy'4Λ· i·''· .' fí
Vírus.AcMNPV napadá 12 čeíadí a viac než 30 druhov radu hmyzu· Lepidoptera /motýle/ /Granados, H. R.,i,a Federici, B. A., The . . / V !
Biológyov Baculóviruses (Biológia baculovírušov) 1, 99 /1986//. t Nie je známe, že by teryto<vírus iíčinne infikoval akýkolvek iný druh okrem tohto radu. i ' 'ť 3 ' K . .
Použitie baculovírušov ako bioinsekticídov je velmi .·> slubhé. Jednou z hlavných prekážok, ktorá bráni ich širokému použitiu v polňohospodárstve, je časové zdržanie medzi infikovaním hmyzu a jeho;smrťou; Toto zdržanie môže trval niekolko dní až niekolko týždňov. Počas tejto doby sa>hmyz stále živí, a tým spôsobuje na rastlinách ďalšiu škodu. Rad vedcov sa snažil tento nedostatok prekonal vložením heterôlógneho génu do vírusového genómu tak, aby sa v napadnutom hniyze exprimovala riadiaca alebo pozmeňujúca látka ore hmyz, aic<o je toxín /Tomalski, M...D,., a Pilier, L·. .K·., Náture, 352, *82-85 /199V, Federici, 3. A., In Vitro, 28, 50A /1992/, Mariens, J. W. M., a' ďalší, App. 4 Envir. Microbiology, 56, 2764-2770 /1990/7, neu:<,·· . · , . '7 ropeptid a hormón /Menn, J. J., a Borkovec, A. B., J· Agric. . Food Chem., 37, 271-278 /1989/, Sldridge, R. a ďalší, Inse.ct Biochem., 21, 34I-35I /1992/7, alebo enzým /Hammock, 3- D., a. ďalší, Náture, 34.4, 458-46Í /199C//· Í
Génové ižinierstvo poskytuje prostriedky na prekonanie i' .
technických prekážok komerčného využitia vírusov ako bioinsekticíáov, avšak zároveň rastie pocit, že tu môže byl ďalšia potenciálna prekážka brániaca ich širokému orijatiu. Jedná sa najmä o predpoklad, že uvolnenie týchto geneticky manioulovaných 'rvírusov do 'životného prostredia môže má% népredvídatelné následky pre efcosy’štém, v ktorom sa tieto vírusy reolikujú a . í šíria /'Villiamson, M., Náture, 353, 394 /1991/, Hammock, 3·, Náture, 355, 119 /1992//· Tento predpoklad by sa až doteraz mohol vzťahoval na všetky ŕekombinačné vírusy hmyzu, vytvorené pre biologické potláčanie hmyzu, pretože, .^.šetky tieto vírusy sú schopné prenosu, z hmyzu na hmyz, Preto íje potrebné vy ' ' í :- * ' í' ’ ŕ. f- /7 í? . ' .7/, * \ ' ,:
tvoriť rekombínačné vírusy špecifické pre hmyz, ktoré majú 3 i zníženú schopnosť, pre -prenos fz,i hmyzu “ha hmyz s/z hosti tela na·, hostitela/ po svojom uvolnení do životného prostredia. ; ;,ť Životný cyklus baculovírusov, ukázaný na príklade víru- ’ su AčMNPV, sa skladá z dvoch štádií. V každom: štádiu životného cyklu má vírus špecifickú formu:, extraluldrne vírusové partikuly /ECV/, ktoré nie sú okludované a okludpvané vírusové partikuly /OV/ /luckow, V. a., a Summers, M·;. D., Bio/Technology,. 6, 47-53 /1988/, Miller, L. K·, Ann. Reý. Microbiol.,.
42, Ϊ77-199 /1988//· Extracelulárne i okludovíané vírusové for- , -T my majú rovnaký génom, ale vykazujú odlišné biologické vlastnosti. zrenie každej z obidvoch foriem vírusu je riadené sepaf ... · . ;
rátnými sadami vírusových génov, pričom niekt-oré z týchto sád ΐ ,·'-.’!.·.. 1 j sú jedinečné pre každú formu. , '> · , r f vo svojej prirodzene sa vyskytujúcej ppdobe, infekčnej pre Hmyz, sa pomriožené virióny nachádzajú zabalené v Darakryštalickej proteínovej matrici a sú známe áko óklúzne' teleso /C-E /OB/, alebo tiež oolyedric.ké inklúzne-teleso//PIB/. Proteínové! vírusové oklúzie sa nazývajú oolyédre, mnohosteny /jednotné . číslo je polyéder, mnohosten/. Hlavným štruktúrnym oroteínom vírusových oklúzií,- ktorý je kódovaný vírusom, je polyhedrín,· s molekulovou hmotnosťou 29 kD /Luckow, V. Aa Summers,. M.
D., B'ic/Technology,. 6, 47-53/1988/, Smith, Q. -E. , a Summers-,
M· -D<, US patent «Č.- 4 745 <051/· /Podobne vírusy GV vytvárajú ... OB, ktoré sú zložené najmä z granulínu, skôr fnež z poly.hedrx- .
nu/· ;
/ .- ' P ' -
V v .;·.·· i'. .
/ Vírusové oklúzie sú dôležitou častou Prirodzeného životného cyklu baculovírusov, poskytujúcich oijostriedok pre horizontálny prenos /z hmyzu na hmyz/ medzi suáceotibilnými druh druhmi hmyzu. V životnom prostredí susceptib/lný hmyz /obvykle . v larválnom štádiu/ pozrie vírusové oklúzie z kontaminovaného ' t - - ' [ ľ B' ·.- : I- ' ) ; | ' . i; - ' · . > .' ·. ‘ X ' : ' > · ' ' ' * 1 „· _ tí
ΐ , ; L· ‘ b · ' .
zdroja potravyako napríklad z rastliny. Kryštalické oklúzie, sa v tráviacom trakte susceptibilného hmyzu rozpadnú, a tým ' fv V , , ® 1 sa uvolnuju infekčné vírusové častice. Tieto yírusy odvodené od polyedrických vírusov /?DV/ napádajú ťkaniVové bunky vnú- , tornctetí a replikujú sa v nich /Luckow, V. M, a Summers, M.
. D·, Bio/Technology, 6* 47-53 /1938//. ! | ?· * v \ ’ 1, ,?*' ' ‘s >·· . ' V
Vírusové častice pravdepodobne vstupujú do bunky endocytózpu alebo fúziou a vírusová DNA sa v bunke vyskytuje nezabaleria v jadrovom póre alebo v jadre. Replikácia vírusovej DNA sa v bunke objaví do šiestich hodín po vstupe)vírusu. V dobe do 1C> až 12 hodín po infekcii /p.i./ sa sekundárna infekcia rozšíri do iných hmyzích tkanív pučaním extraeelulárneho vírusu /ECV/ z povrchu bunky. ECV forma vírusu je·zodpovedná za šírenie vírusu z bunky do bunky v infikovanom!jedincovi hmyzu, j; · ’ -j · - !Í -t 7 rovnako ako za Drenos infekcie v bunkovej kultúre.
V neskoršej fáze infekčného cyklu /12 hodín d.i./sa dá v infikovaných bunkách zistiť protein.polyhedŕín. Až no uolynutí 18 až 24 hodín p.i. sa v jadre infikovanej bunky nroteín polyhedrín zoskuDÚje a vírusové častice sa zabalia do Droteín nových oklúzií. počas 4 až s dní s oostuoom lýzy buniek narastá počet vírusových oklúzií do velkých; hodnSti Tieto polyédre i J . ' | nemajú aktívnu úlohu prifšírení infekcie v larve. Vírusy v ECV forme;sa množia a šíria v hemolymfe, a· tým spôsobujú smrí larvy /Luckow, V. A.,' a Summers, M. D·, Sio/Techriology, β, 47-53 . /1988/, Miller, L· K., Ann. Rev. Microbiol., 42, 177-199 ľ ·- : i ' · · t ŕ .
1 /1988/, Smith, G· E·, á Summers, M. D., US patent č. 4 745 / * . , i . 1 · É '! 5 051/·; , ' 7 .<5 . ‘ j;.
T · · ' ‘ ' V•v i Ked infikovaná larva zahynie, v rozkladajúcom sa tkanive zostanú milióny polyédrov, zatial čo ECV .formy vírusu sa V rozložia, cyklus sa opakuje, ked je iná larvajvystavená vplyvu týchto polyédrov: napríklad tým, ze požrie kontaminované
- 6 rastliny alebo inú kontaminovanú pótravu/Luckow, V. A., a Summers,M. D·, 3io/?echnolcgy, 6, 4^-53 /1983//.
' ' - , *
Súhrnom sa dá povedať, že okludované formy vírusu zodpovedajú za počiatočné infikovanie hmyzu prostredníctvom tráviacich ústrojov a tiež za stabilitu vírusu v| životnom orosí ’ ' ·' ' ' stredí. PDV formy vírusu nie sú v zásade infekčné pri injekčnom podávaní, ale sú vysoko infekčné pri orálnom podávaní. Neokludované formy vírusu /t.j. ECV formy/ zodpovedajú za ae-kundárnu infekciu a. prenos infekcie medzi bunkami. ECV formy vírusu sú vysoko infekčné pre bunky v kultúre, alebo pre vnútorná: hmyzie: tkanivové bunky, ak sú do: nich vpravené injekciou, ale nie sú v /zásade infekčné, pri orálnom podávaní.
Λ ‘ ý ' - ý'·.., 1 ’ŕ . , ŕ použitie rekombinačných baculovírusóv ,V ktoré exprimujú cudzie proteíny, toxické pre hmyz, je ulahčené tým, že tieto z í' ' , vírusy nie su patogénne pre stavovce alebo rastliny. Ckrem to' . , f 4, ’ í ho môžu baculovírusy všeobecne napádať úzky okruh hostitelov. Mnoho kmeňov parazituje iba na jednom druhu hinyzu. alebo na niekolkých hmyzích druhoch. <
t • i, ; - ' . , j’ ý- .
Ί\'βjskúmanejším baculovírusom je AcMNPV·'vírus. Je známe, že vírus AcMNPV infikuje 12 čeladí a viac než, 30 druhov hmyzieho’rádu Lepidoptera /motýle/ /C-ranados’, A; R.;, a Eederici,
B· A·', The Biology ofBaculoviruses (Biológia baculovírusóv) I ; *· · , ' - ' í
I, 99/1986//· Nie je známe, žeby tento vírus mohol účinne m- ; fikovať akýkolvek iný druh okrem tohto radu. yerejnosť i rôzne úrady diskutovali o možných následkoch, ktoré' by malo uvtlnenie kmeňa AcMŇPV, obsahujúceho cudziu sekvenciu DNA /Williamsoh,
M., Náture, 353/ 394 /l9$l/> Hammock, B., Nátere, . 355< 119 /1992//· Diskusia sa týka možnosti, žeby sa manipulovaný vírus mohol rozšíriť i na iné druhy radu Lepičoptera, proti ktorým nebol;určený. ĎälŠím uvažovaným faktorom je známa stabilita týchto vírusov v životnom prostredí.
' ·'(·
Preto je potrebné vytvoril rekombinačpý vírus, špecifický· pre určitý hmyz, s obmedzenou schopnosťou šíŕit sa z hmyzu na hmyz /z hostiteľa na hostiteľa/;. Tieto vírusy by mali byť schopné infikoval hmyz, ale mali by mal významne zníženú schopnosť prenosu z hmyzu na hmyz, ;a tým i schopnosť udržal sa v životnom prostredí. í
- . s‘ '¥ ' í i'. &
Podstata vynálezu / e ·.·. '
Vynález sa týka konštrukcie a pestovania rekombinač-. ných vírusových kmeňov proti·, hmyzu, ktoré majú zníženú schopnosť .šíril sa z(hmyzu na hmyz, t.j. majú zníženú schopnosť prenosu medzi hostiteľmi v životnom prostredí. Vírusy čeľade 3aculoviŕidae sú obzvášl vhodné na konštrukciu takých kmeňov,. vzhľadom na dve štádiá qyojho životného cyklu, ako je to popísané vyššie v texte.
> Tieto vírusové kmene sa získajú tak, že sa najprv zrne-: ní genetický základ takým spôsobom, že vírus. sa. stane pre hmyz neinfekčným. Termín genetický základ neznamená v kontexte tohto vynálezu iba gény, ktoré kódujú trans-pôsobiace .
'Í· , v . * · látky, ako sú RNA. alebo proteínové molekuly, ale zahŕňa i cis-pôsobiace elementy alebo regulačné sekvencie, ako sú tranškripčné enhacery, promotóry, ’iné transkpipené, translačné a replikáciu genómu .riadiace elementy a baliace sekvencie vírusovej DNA /alebo RNA/· í
Zmena genetického základu môže mal podobu delécie,· posunu čítacieho rámca, inzercie, pre'Šffiyku, bodovej mutácie alebo iného porušenia funkcie génu. Iné formy zmeny zahŕňajú ŕ spôsoby, ktoré zabraňujú fungovaniu vírusu, =ako je potlačenie transkripcie alebo translácie, použitie antikodónovej RNA, inzercia prídavného génového elementu a inzercia prídavného regulačného elementu, ako je napríklad kvasinková aktivačná
. 4 ' / ' sekvencia, nachádzajúca sa pred cieľovým génom, ktorá vyžaduje prítomnosť GAL 4 proteínu pre svoju aktivitu /UAS-,.T/.
>· $ GAL
Cieľ obnoviť infekčnosť rekombinačného vírusu, pričom prenos z hostiteľa na hostiteľa je významne znížený, sa-dosiahne komplŕementáciou génov produktom alebo funkcií, ktoré v zmenenom víruse chýbajú alebo sú defektné.
Tento vynález zahŕňa rôzne spôsoby produkcie infekčnej podoby rekombinačného hmyzieho vírusu komplementáciou génov, a to; /1/ produkciu infekčného rekombinačného vírusu v kultúre tkanivových buniek hmyzu, transfekovaňých .fragmentom DNA, poskytujúcim produkt alebo funkciu, ktoré v zmenenom víruse chýbajú alebo sú defektné; /2/ produkciu infekčného rekombinačného vírusu v líniách buniek hmyzu, ktoré-boli stabilne, transformované fragmentom DNA j poskytujúcim produkt alebo funkciu,* ktoré.v zmenenom víruse chýbajú alebo sú defektné; /3/ produkciu infekčného rekombinačného vírusu v transgénnych jedincoch hmyzu, ktoré obsahujú fragment DNAj. poskytujúci prodúkt alebo funkciu, ktoré v:zmenenom víruse chýbajú alebo sú defektné.
V závislosti na poskytnutom produkte -alebo funkcii rnô' ΐ -i · · ' ’· l '& ' že byť nutné alebo žiadúce použiť iheterológný vírusový alebo bunkový promótor nä riadenie expresie daného,?DNA fragmentu, Použitie promótora môže byť vynútené ohľadmi na dávkovanie alebo času. · · ; k · ! k, . ý
Bunky hmyzu používané na spôsob prípravy infekčného rekombinačného vírusu podľa spôsobu /1/ a /2/ a transgénne druhy hmyzu podľa spôsobu /3/ fungu’j’ú teda ako pomocníci pri obnove infekčnosti vírusu. Vírusové častice /virióny/ pripravené podľa týchto spôsobov spôsobujú infekciu, ak sú v prírode požité hmyzom. Virióny utvorené v infikovaných larť r
U 5 / i.'· V,, >
' ' f'.. . í. ,· vách sú defektné,; pretože nie sú komplementované, a infekcia sa pr^eto nešíri ľahko na iné jedince hmyzu. V neprítomnosti koinfikujúceho divého vírusu preto životný cyklus rekombinačného vírusu končí po tejto jedinej infekcii. , • Pri prednostnej aplikácii tohto vynálezu sa do víruso·· , · t vého genómu vloží gén, kódujúci látku, ktorá má riadiace alebo modifikačné účinky na hmyz. Tento gén sa vloží na akékoľvek vhodné miesto do genómu zmeneného vírusu,’ Látkami, ktoré majú riadiace alebo modifikačné účinky na hmyz, môžu byť toxíny,** neuropeptidy a hormóny a enzýmy. Expre^ia takej látky zvyšuje bioinsekticídny účinok.
? Vhodné je najmä, keó sa tento gén vloží priamo do miesta zmeny genetického základu, ktoré;zodpovedá za zníženú schopnosť prenosu z hostiteľa na hostiteľa, alebo na pozíciu, ktorá; s týmto miestom susedí m Vloženie héterológneho génu do miesta zmeny genetického nákladu alebo do jeho blízkosti za- braňuje alebo velmi obmedzuje rekombinádiu génov, ktorá by·' mohla dať vzniknúť forme daného vírusu, majúcej fenotyp divej podoby vírusu i gén s potláčajúcimi účinkami na hmyz alebo modifikačný gén pre prenos z hostiteľa na hostiteľa.
Prehľad obrázkov,na výkresoch J •1 κ A·. . \ . . · -1 Obr. 1 zobrazuje lineárnu mapu známych baculovírusových génov A.CMNPV genómu /Blissard, G. a F.ohrmann, G. F., Ann.
Rev. Entomol., 35, 127-155 /1990/7·
Obr. 2 ukazuje detail konštrukcie plažmidu p74-l, ktorý obsahuje deléciu v p74 géne z vírusu AcMNPV.
Obr. 3 ukazuje detail delécie v p74 géne /v plazmide ;p74/ z vírusu AcMNPV, z kmeňa A40CO·
Ý ·, - · '' · · · y . .
r ' - 10 s ΐ Obr. 4 ukazuje reštrikčnú mapu časti expresného vektora zo sérií PMEV, na ktorej je zobrazený promótor, polylinker a oblasť 3'uTR. .
.. \ · ' . , F ' '
Nasleduje podrobný popis vynálezu. , •v’ ' > ·
Výsledkom genetickej, manipulácie vírusu hmyzu so zníženou schopnosťou šíril sa z jedného jedinca hmyzu na iného je zvýšená rýchlosť vymiznutia infekčného vírusu z prostredia, presahujúca rýchlosti prirodzených procesov abiotickej a biotickej degradácie. Preto sa manipulovaný vírus sám neoresadí v • · ! ' životnom prostredí.
: . ‘ ; '
Tento vynález sa týka všetkých vírusov hmyzu včítane DNA a RNA vírusov. DNA vírusy zahŕňaj ú vírusy.obsahujúce zabálenú ,dvo jvláknovú DNA, ako' napríklad /najprv uvedená čelad, potom druh/ Entomopoxvirinae. /poxyírus radu /coleoDtera /chrobáky//, gubaculovirinae /Autographa californica MŇFV; Heliocoverpa zea 3NPV/, Nudibaculovirinae /Heliocoverpa zea NCB/, Ichnovlrus /Campoletis sonorensis virus/, a .Sracovirus /Co.tesi sia melanoscela virus/ a tisž vírusy obsahujúce nezahalenú dvo jv-láknovú DNA, ako 'napríklad Iridoviridae /Chilo' iridescent ' vírus/, a víruôy obsahujúce nezabalenú jednovláknovú DNA, ako napríklad Parvóviridae /Gallériá densovirus/.
RNA vírusy zahŕňajú vírusy, obsahujúce zabalenú dvoj- .· vláknovú RNA, ako napríklad Togaviridae /Sindbis virus/, Bunyaviridae /repný vírus krútenia listov/ a Flaviviridae /Wesselbron virus/ a tiež vírusy obsahujúce nezahalenú dvojvláknovú RNA, ako napríklad Reoviridae /Corriparta virus/, a Birnaviridae /Drosophila X virus/, a tiež vírusy obsahujúce nezabalenú jednovláknovú RNA, ako napríklad·picornaviridae /Cricket paralysis virus/, T.etraviridae /Nudaurelia beta virus/ a Nodaviridae .4 e
Fodčelaá vírusov obsahujúcich dvojvláknovú ĎNA, Eubaculovirinae, obsahuje dva rody, jadrové polyedričké vírusy /NPV/ a granulezne vírusy /GV/, ktoré sú obzvlášť užitočné ná biologické potláčanie, Dretože vo svojom životnom cykle tvoria o^klúzne telesá. Príklady NPV vírusov sú Lymantria d i spar»
NPV /NPV vírus červenej mory/, Autographa californicá MNPV, Anagr.apha falcifera NPV /NPV vírus piadivky zelerovej/, Spodoptera litturalis NPV, Spodoptera, frugiperda NPV, Heliothis ármi ger a NPV, Mamestra brassicae NPV, Choristoneura fumiferana NPV, TTrichoplusia ni NPV, Helioéoverpa zea NPV» Rachiplusia ou NPV, ,atd. Príklady GV vírusov sú Cydia pomonéila GV /GV vírus víjačky jablčnej/, pieris brassicae GV, Tričhoplusia ni GV, Artogeia rapae GV, Plodia interpunctella GV /víru3 kukuričnej mory/, atd. Príklady entomopox vírusov sú Melolontha melolontha. EPV, Amsacta moorei SPV, Locusta migratoria SPV, Melanoplus sanguinipes EPV, Schistocerca gregaria EPV, Aedes aegypti EPV, Chironomus luridus EPV, atd.
- .......MU II·· · , I - - v í Použitím tohto vynálezu 3a docieli ochrana poľnohospodárskych plodín, stromov, kerov, sadov a okrasných rastlín pred útokom hmyzu, .obzvlášť hmyzu z radu Lepidopt era, Crthóotera.', Diptéra, Isoptera, Hymenoptera, .H'ómoptera, Hemiptera a. coleo- , ptera.
Aj ked vynález je ilustrovaný na príklade vírusu NPV /ACMNPV/ pre druh Autographa californica, je samozrejmé, že tu popísané námety sa dajú použiť pre všetky -hore uvedené hmyzie vírusy. Ďalej sa predpokladá, že tento vynáľléz bude velmi užitočný pri zlepšovaní nových hmyzích vírusov,, ktoré doteraz neboli identifikované a klasifikované v literatúre.
f ' ,· ’ Α. ' . ’ 5 Výsledkom infekcie vírusom AcMNPV je najprv tvorba pučiacej formy vírusu, ktorá je známa ako ECV. ECV forma spôsobuje šírenie' vírusu z bunky do bunky v napadnutom jedincovi hmyzu, a tiež počas rastu v bunkovej kultúre. V prípade vírusov NPV začne infikovaná bunka v neskoršej fáze infekčného cyklu‘tvoriť PDV formu vírusu. PBV forma je zabalená v kryštalickom oklúznom telese /OB/» ktoré sa tiež niekedy nazýva polyedrické inklúzne teleso./PIB/· /Podobne GV vírusy tvoria
V ' ' · ť . Λ ·
OB, ktoré sa skladajú hlavne z proteínu granulínu, skôr než'z polyhédrínu./ Táto PBV,forma vírusu spôsobuje počiatočnú infekciu hmyzu vnútornosťami a tiež stabilitu vírusu v životnom prostredí. f
Taká zmena funkcie, ktorá spôsobuje tvorbu intaktných infekčných OB, ktorá neovplyvňuje pučiacu formu vírusu /ECV/, je obzvlášť užitočná. ' ; '
Vo víruse AcMNPV boli nájdené také mutácie, /partington, S·, a ďalší, virology, 175, 91-102 /1990//. Fo uskutočnení mnohých mutačných pokusov boli identifikované génové lokusy,<ktoré spôsobujú tvorbu pučiacej formy vírusu, ale'ne-, zodpovedajú za tvorbu intaktných infekčných polyédrov. Jedným z'· najzaujímave jších potenciálne užitočných lokusov, ktorý, bol identifikovaný, je p74 gén, nachádzajúci sa v Hind 111 fragmente P genómu vírusu AcMNÉV /kuzio, J·.·, a äalší, Virology, 173, 759-763 /1989/7· P74 je proteín produkovaný v ne- í skoršej fáze infekcie baculovírusom a v relatívne malých množstvách /kuzio, J., a dalšf, Virology, 173, 759763 /1989//. , . .
s Homológne sekvencie p74 génu boli identifikované v iných NPV vírusoch, včítane Qhoristoneura fumeiferana NPV /Hill.,,. J. E·., a, ďalší , Biochimica et Biophysica Acta, 1172, 1-2 /1993// a Qrgyia pseudotsugata NPV /Leisý, B. J., a dal\ ší, virology, 153, 157-I67 /1986//· Homológna sekvencia génu
4r- ,· - 13 ··. . χ ,
P74 by; sa mala vyskytoval vo všetkých druhoch, rodu NPV. Vzhladom na podobnosti medzi životnými cy&lami NPV vírusov a životnými cyklami vírusov príbuzného rodu granulóznych vírusov /GV/ je velmi pravdepodobné, že tieto GV vírusy obsahujú gén s vlastnosťami podobnými génu p74· .«
Výsledkom rozsiahlych delécií, ktorými sa odstráni tento p74 gén a susedný plC gén, je vírus tvoriaci polyédre, ktoré ýšak, ak sú súčasťou potravy lariev, nepôsobia infekčne. Pretože výsledkom delécie iba v géne plO je tvorba orálne infekčných poíyéďrov, predpokladá sa, že uvedená zmena fenotypu je spôsobená deléciou génu p74 /Kuzio, J., a ďalší, Virologý, 173, 759-763 /1989/7·
Ako jepôpísané ďalej v texte, v príklade 1, bol vytvoΪ reny transferový vektor /pomenovaný Δρ74-1/, ktorý po rekombinácii s genómom vírusu divého typu spôsosbí, deléciu v samotnom géne p74 /Δ.ρ74/ /obr. 3/. Vzorky E. coli kmeňa HB101, ne··'.·, · ' . . ' v. . · .. , súce tento transferový vektor Ap74-1, boli ulóženéýgl. mája •T*'íý
1992 .v Americkej zbierke typov kultúr, /American Týpe, Culture Collec.tion/ 123C1 parklawn Prive, Rockville, ’s/iaryiánd· 20852, ’ USA, a dostali ATCC prírastkové číslo 68 988· 2l« mája 1992 bolí y tejto zbierke uložené tiež vzorky AcMNPV kmeňa označeného Á4000 /v tomto kmeni, je gén p74 poškodený deléciou/, ktorý dostal ATCC prírastkové číslo VR 2373· t·.· Je potvrdené a popísané v príklade 2 ďalej v texte, že je to práve delécia ONA segmentu, kódujúceho pý4 gén, ktorá spôsobuje tvorbu PIB telies neinfekčných pre larvy,' ktoré ich požijú. Stále sa však tvorí pučiaca forma vírusu, a tá pôsobí infekčne, ak je injekciou vpravená do hemocoéíu hmyzu..
''•Jednoduchá delécia PMA segmentu nie je jediným typom zmeny, používaným na porušenie funkcie cielového genetického , h > Á ~ U· ” : ?· 7 základu vírusu. Na účely tohto vynálezu termírt genetický základ neznamená iba gény, ktoré kódujú trans-pôsobiace látky, ako’ .sú, RNA alebo proteínové molekuly, ale zahŕňa aj cis-pôsobiace elementy alebo regulačné sekvencie, ako. sú transkripčné enhacéry, promótôry, iné transkripčné, translačné a replikácíu genómu riadiace elementy a baliace sekvencie vírusovej DNA /alebo RNA/· , 7 .Zmena môžéimaí tiež/podobu posunu čítacieho rámca, inzercie, preskupenia; génov, bodovej mutácie alebo iného porušenia funkcie génu. Do tohto súpisu spadá posun čítacieho rámca, í; ktorý spôsobí buč predčasné ukončenie tvorby proteínu alebo •ľ · t . . ' , · · tvorbu zmeneného nefunkčného proteínu. Ďalej tento vynález zahŕňa inzerciu terminačného kodónu do oblasti, génu kódujúcej proteíin a vsadenie; génu pre vhodnú·, supresoŕoVu tRNA do 'pomocnej helper’’ bunkovej línie.
.· . Iné formy zmeny genetického základu zahŕňajú spôsoby, ktoré, zabraňujú fungovaniu vírusu, ako je potlačenie transkripcie alebo translácie, použitie ántikodónovej RNA, inzercie prídavného génového elementu do vírusového genómu a poskytnutie žiadaného regulačného elementu pre trans-posobiace látky.. Príkladom tohto spôsobu je použitie kvasinkovej akti- · í vačnej sekvencie, uloženej pred cielovým; génom, závislej od '
GAL 4 proteínu AASgal/·
A 7·' vloženié tejto.'kvasinkovej sekvencie ^.aktivovane j pro-. teínom GAL 4 /UASGAL/, pred cielový vírusový· gén spôsobí, že transkripcia vírusového génu je závislá od prítomnosti GAL 4 proteínu. Pomocná bunková línia /helper/ obsahuje kódujúcu oblasí pre GAL 4 gén pod kontrolou jedného z heterológhych promótorov, popísaných dalej v texte. Tento vynález zahŕňa aj iné možné UAS. elementy, ako sú napríklad UAS elementy vyskytujúce ? sa pri párovaní /mating/ kvasiniek. Ďalej tento vynález zahŕňa sekvencie regulačných elementov, ktoré vyžadujú navi.av , ŕ-s
- 15 zanie-proteín,u pre svoju aktiváciu, ako su receDtory pre ste. ·. » . Ž - , ., , >. f?
roidy a ich vazbôvé miesta v DNA. * ; Vynález sa tiež vzťahuje na použitie promótorov, ktoré fungujú:iba v -prítomnosti špecifických proteínov. Príkladom . takého promótora je T7 promótor bakteriofágu T7, ktorý na za- . čatie, transkripcie vyžaduje T7 špecifickú RNA polymerázu. Vlo-r ženie-T7 promótora pred P74 gén' ha miesto jeho prirodzeného promótora spôsobí,\že transkripcia vírusového, génu je závislá ·· ' - . · . · ti,·. .
od prítomnosti T 7, RNÁ polýmerázy. Bunková línia helper pre · * v yľ , tento* vírus obsahuje gén pre T7 RNA polymerázu pod kontrolou heterológneho promótora, ako je IE-1 vírusový promótor. 'Ä
Okrem génu p74 a jeho.funkčných homológov sa môžu zmenil funkcie prídavných'génov, čo spôsobjí zamedzenie γ šírenia rekombinačného vírusu /napríklad 14/.. Z tohto hľadiska sú. obzvlášť užitočné gény ovplyvňujúce funkcie, nevyhnutné pre tvorbu intaktných infekčných CB· Príklady týchto génov; sú génový element,, riadiaci reguláciu prepínania /switch/ z tvorby ECV.na tvorbu CB', gén,kódujúci funkciu žiadanú pre priame ' zoskupovanie alebo zrenie vírusovej častice a gén kódujúci štruktúrny proteín vírusovej častice.
Ďalšími príkladmi génov, ictoré sa môžu meniť podľa tohto vynálezu, sú gény, kto^é tvoria FP /few pôlyhedra, t. j. mlalé mnfožstvo polyédrov/ mutanty, ako je 25K gén /Beames, 3., a Summers, M. D.| Viroí|)gý, 168, 344-353 /l989/Í/>- a tiež gény,; ktorých funkcia po ich porušení vedie k vzniku žiadaného fenotypu J ako sú vírusové transkripčné faktory špecifické pre fungovanie neskorých a veľmi neskorých génov, gény pre polyedric'ké obalové proteíny /s hmotnosťou 32 až 36,5' kľ)/, gén ore P EV protein, ijctorý interaguje s receptorom v tráviacich ústrojoch a je zodpovedný za počiatočné infikovanie buniek tráviacich ústrojov, gén alebo génový element zodpovedný za zoskupovanie •ty».·--r · ••'V·* f ' r .
í.
.h · ” 16 ’ < ‘ . ' -'B '' ľ' '7 - ' . 1 i ; , ir X.
f·· , · ' .
P DV nukleokapsidu, gén zodpovedný za organizáciu polyédra a gén kódujúci NPV funkčný ekvivalent vírusového zosilňovacieho /enhancing/ faktora /Gallo, L· G·, a ďalší, -j. Invertebrate Path., 58, 203-210 /1991/4» ktorý bol nájdený'v GV vírusoch.
\ Aj keď na zmenu genetického základu je tiež možné použil gén pre polyhedrín, existujú pre toto použitie významné praktické obmedzenia. Výsledkom vysokej rýchlosti transkripcie/iranslácie ;;ígénu pre polyhedrín, spojenej s veľkou amplifi-; káciou vírusového genómu, ktorá sa odohráva pri replikácii vírusu, je fakt, že množstvo proteínu polyhedrínu dosahuje 50 až 75 % celkového množstva farbiteľných proteínov v napadnutej bunke. Toto velké množstvo proteínov môže spochybnil možnost, aby obmedzené množstvo extravírusových kópií génu pre polyhedrín kompenzovalo deletovaný vírusoyý gén pre- polyhedrín. .Avšak kompíementácia polyhedríní-mínus vírusu /vírusu netvoriaceho polyhedrín/ by,sa mala získal, s použitím regulačných elementov alebo.faktorov, ktoré by sa iba mali dodal v'menšom množstve. Fríkiadom je manipulácia^ vírusového génu pre' polyhedrín tak, aby obsahoval gén pre s.upresorovú tRNA alebo zmena regulačných elementov génu pre polyhedrín a pestovanie vírusu vo vhodnej i i ' ’ . < .j ' .
bunkovej línii helper alebo kmeni hmyzu, ako1 je to popísané vyššie v texte.
Zdá sa, že na rozdiel od polyhedrínufje p?4 protein žiadaný v omnoho menšom mnó'žstve. Aj keď sa gén p74 prepisuje v nebkoršej fáze infekcie vírusom, kedy vírusový genóm je už'· výrazne amplifikovaný, hladina p74-špecifick;ej mRNA je pomerne nízka. Malo by teda byl možné manipuloval... p74, konštrukt tak,;aby len obmedzené množstvo extravírusových kópií mohlo zaistil dostatočné fungovanie génu p74 pre Komplemeŕitáíŕiu vírusu, abysa docielila jeho orálna infekčnost. . ·,
Vynález: je:· demonštrovaný na príklade ,-vírusu AčMNPV.
fc k , · .· ' - · ’·.· Λ
- 17 / ' ť '/ ' ;/·.> ' / / / - ' ' · /' í . ?
Gén vykazujúci homológnu funkciu s génom.p74?by mal byť prítomný vo všetkých vírusoch patriacich do NpV ía GV skupín baculovírusov. V druhoch baculovírusov, ktoré äú blízko príbuzné vírusu AcMNPV, sa dajú identifikovať homológy p74 génu pomocou hybridizácie s p74 fragmentom vírusu AcMNPV za podmienok zníženej stringencie. Tento prístup je najmä vhodný, preli .
toze dostupné údaje ukazujú, že p74 gén je jédným z najviac zachovaných baculovíruspvých génov /ftill, J./E·, a óalší, Biochimica et Biophysica Acta, 11720.-2 /1993//· Pre vzdialenejšie príbuzné vírusy, ako sú GV vírusy, sa tento prístup nemôže použiť. Alternatívny spôsob identifikácie génov; kódujúci homológnu funkciu k identifikovanému génu vírusu AcMNPV,. je. popísaný v príklade 14. Pri tomto súbore pokusov;sa AcMNPV kmeň 30 známym genetickým defektom transfekuje spoločne s ' x h' fragmentárni vírusového genómu, ktorý je predmetom záujmu. Komplementácia defektu identifikuje gén, ktorý je predmetom záujmu. Tento spôsob sa úspešne použil pri.identifikácii génu v‘granulóznom víruse Cydia pomonella s funkciou homológnou. k p35 apoptose, inhibujúcej gén vírusu AcMNPV /Crppk, N. E., a další, J. Virology, 67, 2l68-2l74 /1993/7· /'.
Môžu sa tiež použiť iné spôsoby identifikácie funkcií äalších nevyhnutných neskorých génov. Passarelli ä Miller ; /Passarelli, A. L·, a Miller, L· K·, J· Virology, 67, 2149£ '2158 /1993/7 nedávno publikovali spôsob identifikácie transkripčných faktorov pre neskoré/velmi neskoré gény. Pri tomto spôsobe sa fragmenty AcMNPV vírusového genómu transfekujú í spoločne 3 konštruktami, ktoré na riadenie expresie CAT génu i používajú neskoré alebo velmi neskoré vírusové.promóťôry. 5 . Fragmenty AcMNPV genómu, ktoré obsahujú g’ény; zúčastňujúce sa pri normálnej transkripcii vírusových neskorých alebo velmi neskorých génov, sa identifikujú podlá svojej stimulácie CAT aktivity nad obvyklú úroveň.
' Pre hmyz sa infekčná forma’ vírusu vytvorí dodaním
Ό ' ' , íc
- 18 - * . · , . / .
·. , v , Ί- · h · · · . '.γ' . ť zmenenej génovej funkcie technikou génovej kompleméntácie Táto pre hmyz infekčná forma, zmeneného vírusu sa.neprenáša lahkoz hostiteľa na hostiteľa. Génová komplementácia poskytne génu schopnosť konvertoval mutačný fenotyp na fenotyp divého Wypu v trans-podmienkach. 4
'.i. Tento vynález zahŕňa rôzne spôsoby produkcie infekčnej formy .rekombinačného vírusu,, hmyzu, menovite: (/1/ produkciu tohto vírusu v kultúre tkanivových buniek’ hmyzu transfekovaných fragmentom DŇA,, poskytujúcim produkt alebo funkciu, ktoré ’ v‘zmenenom víruse chýbajú alebo sú-defektné; /2/ produkciu tohto vírusu v líniách buniek hmyzu stabilne’transfekovaných fragmentom DNA, poskytujúcim produkt alebo funkciu, ktoré v zmenenom víruse chýbajú alebo sú defektné; /3/ produkciu tohto vírusu v transgénnych jedincoch hmyzu obsahujúcich fragment DNA, poskytujúci produkt alebo funkciu,.ktoré, v zmenenom víruse chýbajú alebo sú defektné. Bunková lípia použitá pri spôsobe /1/ alebo /2/ poskytuje chýbajúcu funkciu, a tak slúži ako bunková línia helper. '
Napríklad p74 gén vírusu AcMNPV sa deletuje, ako je popísané vyššie v texte. p74 gén divého typu komplementuje deficienciu zmeneného vírusu pri troch špecifických usporiadaniach, práve popísaných vyššie v texte, nasledujúcimi spôsobmi: /1/ Vírus sa pestuje v bunkách hmyzu, ((ktoré obsahujú extrachromôzómové.. kópie funkčného p74 génu. (Týmito extra-? chromozómovými kópiami môžu byl DNA fragmenty, plazmidy obsahujúce p74 gén alebo plazmidy schopné replikácie počas bunkového fdelenia alebo, ako odpoved na vírusovú infekciu. /2/ Vírus sa pestuje v línii buniek hmyzu obsahujúcej jednu alebo .viac ..funkčných kópií p74 génu, pričom tieto kópie sú stabilne integrované do bunkového genómu. /3/ Vírus sa cestuje v transgénnych hmyzových jedincoch;obsahujúcich jednu alebo viac funkčných kópií p74 génu v hmyzovom genpme.
, ., .- , -íΐ9 - - . ‘ .
/. Pri všetkých troch spôsoboch sa, funkčný p74 gén môže dodat · z vírusu A.cMNPV alebo z akéhokolvek iného jedinca čeľade Eubaculoviridae, ak tento jedinec navraciá infekčnosti Kľúčovú úlohu hrá fakt, že funkčný p74 gén jé prítomný v trans-podmienkach á p'cs kytu je látku schopnú /difúzie, ktorá, regeneruje fenotyp divého typu. t ;
. ·' < y ľ j
A ‘ A 1 8
Fri jednom spôsobe produkcie komplementovanej formy vírusu sa vírus pestuje v bunkovej línii, ktorá mu poskytuje chýbajúcu funkciu. Napríklad sa p74 vírus tvorí v bunkovej línii, ktorá exprimuje produkt p74 génu. Transfekcioú plázmidu obsahujúceho Hind III fragment P vírusu AcMMPV /hlavne sa jedná o p74 gén ..s malým množstvom natívnych lemujúcich sekvéncií AcMNPV. genómu/, spoločne s Δρ74 vírusom, sa dosiahne prechodne regenerácia infekčnej formy vírusu. Vzorky E. coli kmeňa HBlOl nesúceho' tento plazmid s označením ACOO28.3, obsahujúce p74 gén a lemujúce sekvencie, áko/bolo práve popísané,,*;boli uložené 2l. mája 1992 v Americkéj^zbierke, typoý kultúr a bolo im udelené AŤCC prírastkové čí{slo 68 987· Pretože ,len 0,1 až 5:,0 % buniek použitých na túto spoločnú transfekciu obsahuje funkčný p74 gén aj ad?4 vírusový genóm, je tento spôsob v podstate neúčinný.
ľ j
Účinnejším spôsobom tvorby bunkovej línie helper je . vloženie kópie. p74 génu do bunky, tak, ;že sa tento gén stabilne integruje do bunkového genómu /vid príklad 6/· Tento postup bol použitý na vloženie nebaculovírusôvých génov do Sf9 línie buniek hmyzu /jarvis, D· L·, a další, Biotechnology, 8, 950-955 /1990//· Sf9 línia buniek hmyzu /AT2G prírastkové číslo CRL I7H/ je odvodená od druhu Spodopťera frugiperda 2l /Sf2l/· Plazmid obsahujúci kópiu génu, ktorý je oredmetom záujmu, sa transfekuje spoločne s plazmidom:obsahujúcim selekčňý marker. /· í 1 Selekčný marker je gén, ktorého expre^ia umožňuje ŕ
- 20 - ·. r
... ' £ i '· tf· .< . ' · ’·· · · v ' · ' .
J * · $.sf identifikáciu buniek, ktoré boli transformované vektorom obsahujúcim tento markerový gén a tiež gén, kto’rý je oredmetom záujmu. Medzi príklady.všeobecne užívaných aelekčnýchmarkerov patria gény pre tymidínkinázu /TK/ a pre hypoxantínguanínfosforihozyltransferázu /HGPRT/.a tiež gény, ktoré kódujú rezistenciu k antibiotikám, ako je neomycín a hygromycín. ; . f
Ma komplementáciu sa používa dvojnásobný až dvadsaťná- i sobný mólový prebytok komplementárnej DNA k DNA obsahujúcej selekčný marker. Tento prebytok maximalizuje pravdepodobnosť, že bunka, ktorá exprimuje selekčný marker, obsahuje tiež gén, o ktorý je záujem. Vybratá bunková línia musí< dovoliť vstup používaného vírusu. Pri prednostnom použití vírusu AcMNPV. je takou bunkovou líniou Šf9 alebo Sf2l línia. Pp transfekcii sa bunky pestujú za podmienok sélekčného tlaku, á tak sa pomnožia. bunky exprimujúce selektívny marker. Tieto pomnožené bunkové ·/ línie sa podrobiavýberu,.ktorého kritériom je schopnosť* tých- ; to línii kompléméntovať p74 deléciu v Ap74 víruse.
Tento spôsob sa používa na izoláciu 3f9\ bunkových línií obsahujúcich kópie plazmidu ACCC28.3» čo je plazmid obsahujúci p74 gén, popísaný vyššie v texte. Vzorky bunkovej línie označené 3f9 /28*3/ CL-2> obsahujúce kópie plazmidu ACOO28.3 stabilne integrované do bunkového genómu, boli uložené 7. apríla .1993 v Americkej zbierke typov kultúr ä dostali ATCC prírastkové číslo. CRL 11 322. Bolo potvrdené, akb je popísané v . príklade 7 Šalej v texte, že pestovanie defekíného orálne neinfekčného 4p74 vírusu v hore uvedenej bunkovej línii vedie k produkcii orálne infekčného ap74 vírusu. '
Komplementácia sa neobmedzuje na pestojžanie vírusu v bunkovej kultúre. Rovnako ako sa môže vytvoriť bunková línia typu-helper, môže sa tiež utvoriť kmeň hmyzu typu helper.
s
Λ ·
' , - 21 - /. ''á í.
\ ·< ' ( ý .
Napríklad P element transformácie druhu Drosoíphi.la je teraz / bežne používaný a podobný systém sa môže vytvoriť pre akýkoľvek druh hmyzu. Ckrem toho sa vykonáva bezvektorová transformácia hmyzu podobným spôsobom ako bezvektorová transformácia cicavcov. Na vytvorenie jedincov hmyzu nesúcich nevyhnutný gén sa môže použiť priame injekčné vpravenie génu do pre-blaštodermálnych vajíčok /Presnail, J. K·, aiHoý, M. A·,·' Proc. Natl. Acad. Sci., 39, 7732-7736 /1992// alebo balistická transformácia týchto vajíčok kovovými vláknami /Baldarelli F. M.., .a Lengyel, J, A.·, Nucleic Acids Fes., -15, 5903-5904.
/199í// f
Na tvorbu produktu p74 génu stačí relatívne slabý endogénny p74 promótor. Avšak môže byť žiaduce použiť silnejší alebo skôr pôsobiaci promótor pre urýchlenie .tvorby produktu p74 génu. Foužitie heterológneho promótoru by mohlo zlepšiť účinnosť komplementácie; Ap74 ' vírusu. Na toto .^použitie sa hodia vírusové promptory .akejkoľvek veľkosti. Príklady týchto .. promótorov sú 6,9K promótor /pre základný prô’teín/, DA26 promotor, promotor pre polyhednn, 35K promotor,. 39K promotor, plC promótor a ΙΞ-l promótor.
. ? Použitie kcnštruktov s heterológnymi· promótormi,, ako sú konštrukty popísané v príkladoch 4 a 5, má ďalšiu výhodu, v týchto konštruktoch sú odstránené takmer všetky- homológne sekvencie od 5 konca k delécii v p74 géne v A'4CC0 Δρ74 vírusu popísanom v príklade 1. Toto by malo vysoko znížiť akúkoľvek možnosť homológnej rekombinácie, odohrávajúcej sa medzi
H
P74 vírusom;,a'p74 sekvenciami, ktoré sú-integrované do bunkového genómu. Výsledkom tejto; homológne j rekombinácie by inak mohlo byť obnovenie p74 funkcie a obnovenie divého fenotypu vírusu /viď diskusie v príklade 7/· 5alším krokom, ako znížiť možnosť homológnej rekombinácie, jezvýšit veľkosť delécie. v p74 géne Δρ74 vírusu tak,, aby nezvyšovala žiadna kódujúca sekÝenCia. To. sa ľahko uskutoční modifikovaním postupu, ktorý je popísaný v príklade 1. ?
- 22 ;· ’ ‘ V·; ' )' , ‘' 'L *' ' - j ' · - ’ ŕ , Heterológnym promótorom nemusia byť vírusové Dromótory. Bunkové promótory sú tiež vhodné a existuje ich neobmedzený výber. Príklady takých promótorov sú Bombyx mori aktin . promótor a Erosophila melanogaster hsp 70 promótor. Dobré promótofý udržujú expresiu na strednej alebo vysokej úrovni vo . . vhodných hmyzových bunkách počas infekcie vírusom, 'ľieto charakteristiky neobmedzujú výber na hmyzov.é promótory. Týmto kritériám môžu vyhovovať rôzne cromótory zo stavovcov, kvasiniek <alebo z iných, tried vírusov. Akýkolvek z; hore uvedených promótorov tiež riadi expresiu selekčného markera.
'·'. pódia dálšieho spôsobu prevedenia tohto vynálezu: sa do ·;· vírusového genómu vloží heterológny gén pre latku, ktorá má ' ' í · · potláčajúce alebo, modifikačné. účinky na hmyz/Touto látkou je napríklad toxín, neuropeptid alebo hormón ale^o enzým. Vhodné je najmä, ked sa heterológny gén vloží priamo) na miesto zmeny genetického základu vírusu, č‘o znamená, že re-kombináciou medzi geneticky zmeneným vírusoma superinfekčným divým typom vírusu vo väčšine prípadov nevznikne vírus s funkciou vírusu divého typu/a s vloženým heterológnym génomT^Eo tohto vynálezu tiež spadá inzercia heterologneho génu na miesto susediace s mies- : tom zmeny genetického základu vírusu, takže segregácia heterológného génu a zmeneného genetického základu ša vyskytne u menej ako 10 % z celkového množstva vírusových potomkov. Obmedzenie šírenia geneticky manipulovaného vírusu sa preto zachot·' J .·!· ' ,
..vá v ^obidvoch prípadoch. j ·,. ú.
Takými toxínmi sú napríklad pre hmyz špecifický toxín ςΡ ; '-.i. 1 ’ 7 , ž · „
AalT ťzo škorpióna Androctonus' australis /Zlotkin, E., a další, Toxicon, 9, 1-3 /1971/7» toxín z roztoča druhu Pyemotes tritici /Tomalski, ý. D., a Miller, L··' K·, Náture,.. 352, 82-35:.' /1991/7, toxín z Bacillus thurineiensis subsp:. .aizawai /BTK/ í
$· , i i
i>·' “y ) I- ‘
i
/. 7 ' ·23 ” ,; : · ' , 1. . ' ’ i ' / ‘ ‘ :Ί ' ' /Martens, J. ’ľ. Μ· , a další , Αρρ.& Snvir. ľ.iičrobiology5é, 2764-2770 /1990//, toxín izolovaný z pavúčieňo jedu /jackson, J· P.· H., a Parks, T- N·, US/patent č. 4 925/664/ s toxín ž Sacillus thuringiensis CrylVD /BTI/./Federici, B·. A. , In Viťro, 28,. 50A /1992//· Medzi príklady takých ŕieuropéptidov alebo hormónov, ktoré mdžu byt vhodné.;pre tento postup sa račí hormón eklosion /Eldridge, H., -a další, Insect Biochem., 21, 34ir-351,/1992//, protoracikotrópny hormón /PTTH/, adipokinetický hormón, diuretický hormón a proktolín ./Menn, J. J., a Borkovec, A· B·, J. Agric. Food chem., 37, 271-278 /1989//.:Príkladom takých enzýmov je juvenilná.hormonesteráza /JHE/ /Hammock,b· D·., a další, Náture, 344, 458-461 /1990//·
Napríklad vytvorením ŕekombinäčného baculovírusu, ktorý ma defektný alebo deletováný p74. gén a .obä'ahuje tiež heterológny gén kódujúci toxín vložený na miesto zmeny' p74 génu, * 4 ·.
vznikne vírus |so': zvýšenou-účinnostou proti cielovému hmyzu, ale neschpný lahko sa prenášat z jedného jedinca hmyzu na druhého! v životnom prostredí. ' ‘ Izoluje sa AcMNPV vírus, ako je popísané dalej v texte v príkladoch 11 a 12, pričom na miesto delécie v Δρ74 vírusu A4000,.ροφ kontrolou vírusového TA26. promótora, sa vloží gén pre toxín ’AalT zo škorpióna špecifický pre hmyz. Vzorky takto vytvoreného vírusu, označeného A4001, boli uložené .7· apríla 1993/ v Americkej: zbierke tyoov kultúr a dostali' ATCC prírastkové číslo VH'2405· Výsledkom pestovania tohto vírusu v bun'1. .
kách Sf9,idivého typu je produkcia, orálne neinfekčných PI3 /po,dla očakávania/. Ked sa tento vírus pestuje v bunkovej línii typu helper Šf° /28«3/ CL-2 pooísané vyššie v texte, vý-. sledné ΡΪ3 sú orálne infekčné a infikovaný hmyz vykazuje oríznaky kontrakčnej paralýzy, ktorá je charakteristická pre Aal AaiT toxín /vid príklad 12 dalej v texte/.
’.ľ 2 / A' ľ : ,/ 2 ' ' ' .' '
- Pestovanie tohto vírusu v bunkovej línii alebo transg.énnôm hmyze, ktoré dodajú produkt funkčného p74 génu, umožní tomuto vírusu infikoval hmyz tráviacou sústavou. Pretože tu nenastane ďalšia komplementácia, prirodzené populácie hmyzu i· produkujú iba vírus defektnýjz hľadiska orálnej infekčnosti. Preto v nepritomnosti koinfikujúceho vírusu divého typu životný cyklus rekombinačného vírusu končí po tejto jedinej infekcii. To je rozdiel oproti publikovaným postupom použitia baculovírusu /Tomalakŕ, M. D., a'Miller, L. K·, Náture, 352, 82-85 /1991//, kde po zániku napadnutého hmyzu sa do prostre- dia uj.blnia OB; tieto CB sú strávené iným hmyzom a životný < cyklus vírusu sa opakuje, čiže prenos z hostiteľa na hostite,·>?. .··..· .. 4 - -ť>· ; . ·, · la sa tú vyskytuje. ' · i · J / , £ · f Snáď najdôležitejšou vecou v tomto vynáleze je umiest- , nenie heterológneho génu pre toxín, neuropeptid alebo hormón * · ’ V; ' .
alebó enzým priamo na miesto zmeny;vírusového {genetického zá-,. kladú alebo do jeho blízkosti, čo znamená, že· akákoľvek hómologiéká rekombinácia medzi- týmto geneticky manipulovaným vírusoÄ divého typu iba obnoví pôvodné rodičovské genotypy.
i Napríklad inzerciou·génu pre toxín do .deletovane j oblasti génu p74 sa vytvorí vírus s fenotypom tpxín+/tvorba infekčných CB-·,Rekombináciou s vírusom divého typu /s fenoty' 'ľ pom toxín-/tvorba infekčných CB+/ sa získa iba potomstvo s fenotypmi toxín+ /tvorba infekčných 0B- a toxín-/tvorba infekčnýcH 0B+· Rekombinačnému prípadu spôsobenému; homológnou rékombináciouj ktorý by viedol k získaniu potomstva s fenotypom toxíri+/tvorba infekčných 0B+, sa zabráni tým, že delécia a inzercia génov sä odohráva na rovnakom mieste a nie ďaleko od seba na rôznych lokuso'ch vírusového genómu. Preto sa gén pre toxín nachádza len vo vírusoch, ktoré sú geneticky defektné4 pre produkciu infekčných CB·'Toto zamedzenietšírenia he.terológného génu pre toxín sa zachová a infekčný vírus zmizne z
„ľ ' . s a?·
·. ' . . ’ ; f *í ' ' .. - ' t,' F.
; í : · J . | . · , \ 1 · ' b .
ekosýstému rýchlejšie ako vírus divého typu, vzhladom k jeho 'zníženej schopnosti vytvárať potomstvo. \ j / Pre lepšie pochopenie tohto vynálezu sú dalej uýedené nasledujúce príklady. Tieto príklady sú uvedené iba na ilustráciu a nie preto, aby obmedzovali rozsah tohto vynálezu.
«'· · .
príklady predvedenia vynálezu
V príkladoch sa používajú štandardné techniky molekulovej biológie podlá postupov, ktoré popi sali- Sambrook á další /*Sambrook, ,J., a další, Molekulové klonovanie: laboratórna príručka /Molécular cloning:,A Laboratory Manual/, 2. vydanie, ; ';old?spring Harbor Laboratory Press, Cold Spŕing Harbor, N.Ϊ. /1989/7’ Ďalej sa používajú štandardné techniky pre rast a ; produkciu, baculovírusov podlá postupov, ktoré popísali Summersf a :Smith /summers, M· D., a Smith, G· E·^ Príručka spôsobov prípravy baculovírusových vektorov a kultivácie hmyzových , buniek /A Manual of Methods for Saculovírus and Insect Celí Culture procedures/, Dept. of Entomology, Texas Agricúltural Experiment Station and Texas A&M University, college Station, Texas 77843-2475, Texas Agricultural Experiment Station Sulletin no. 1555 /1987/7· Všetky odkazy na pomenované reštrikčné fragmenty vírusu AcMNPV vychádzajú z fyzických máp E2 kmeňa vírusu AcMNPV, ktoré publikovali Summers a Smith vo vyššie uvedenej Príručke spôsobov prípravy ba-Gulovírusóvých vektorov a kultivácie buniek hmyzu.
- - 26 - ' ;S . -. -1, .. . .,/
V' ' 1 · , ,
•..'V '· , . ' F r í k 1 a d 1 . ·./ , / Konštrukcia prenosového vektora Ap74“l a rekombinačného vírusu A4000 «» x · ·’· X'·· / ϊ
Prenosový vektor ΔΡ74-1 sa skonštruuje za účelom deletovania P74 génu z E2 kmeňa vírusu Autographa califorňica NPV, ktoré sa deje približne v mieste jednotky 90 na mape vírusového genómu /vid obr. 1/. Bst Eli fragment E, ktorý obsahuje DNA kódujúci gén p74> .sa vyčistí z E2 kmeňa vírusovej DNA. Tento fragment sa klonuje na Bst Eli miestopSE280 plazmidovéhc vektora /výrobca invitrogén, San Diego, CA/· Tento kloň s'a nazýva LBlO.,2· Fragment kódujúci 5 oblasť génu p74 a/?'lemujúce sekvencie sa izoluje z klonu LBlO,2 štepením enzýmom Nco 1. Ďalej sa na tomto Nco I mieste pripraví tupý koniec T4 DNA polymerázou, ten s'á štiepi enzýmom Xho I a výsledný fraginent sa čistí v géle. Tento fragment , v ktorom miesto nco I s,tupým koncom boío štiepené Xho I enzýmom, sa klonuje medzi Κρη I miesto s tupým', koncom a, Xho I, mie.sto plazmidu;LB9 ·6 . Plazmič I.B9.6 je derivátom Bluescript.SK plazmidu ývýrobca Stratagene, La jolla, GA/> do ktorého sa na Hinc II miesto vloží polyliriker. Tento linker obsahuje dalšie miesta'pre jednotlivé reštrikčné enzýmy, ktoré sú užitočné pre inzerciu heterológnych ígénov do deletovanej oblasti génu p74 /V-id dalej v texte/. yýsledný plazmid obsahujúci 5'lemujúce sekvencie a 5'sekvencie génu p74, popísané vyššie v texte, sa nazýva LB 11.12. Ďalej sa izoluje fragment génu p74 kódujúci 3;' tretinu tohto génu a 3'lemujúce sekvencie, ktorý jgohraničený na .jednej strane Hpa.I miestom a na druhej Bam Hl miestom. Tento fragmentysa klonuje medzi Eco RV miesto plazmidu LB 11.12· Výsledný kloň je prenosovým vektorom áp?4l /vid obr. 2/. Tento prenosový vektor kóduje 4750 párov báz /bp/ 5 lemujúcich sekvencií, sekvencie génu p74 od bp 1 do bp 69» 64 bp plazmi.·/ i ·
i ' ι ' -. ... 1 - 27 -. * ' ti . / . .. . γ dového polylinkera, popísaného vyššie v textef sekvencie' génu P74 od bp 1237 k terminačnému kodónu na mieste 1937 a 1796 bp 3 lemujúcich sekvencii /fcuzio, J. a áalší, yirology, 173 » 759-763. /1989/ 7· Obr. 3 ukazuje v 074 kódujúcej oblasti podrobnejšie. Tento prenosový vektor sa dalej použije na konštrukciu A4OQO kmeňa uvedeného vírusu štandardnými postupmi kotransfekcie /webb, N. R·, a Summers, M. D., J. Methods Celí g Molec. Biol.,2, 173-188 /1990//. Množstvo í r * f x 10 Sf9buniek sa zaočkuje na misku pre tkanivové kultúry s priemerom 60 mm. pri prilnutí buniek sa očkovacie médium odstráni z buniek a nahradí sä 0,75 ml média podľa Grace, ktoré obehu je 10 % fetálneho teľacieho séra /FCS/ s antibiotikami. Do.0»75 ml transfekčného pufru /zloženier 25 mM HEPES, pH 7,1, 140 mM roztok NaCl, 125 mM roztok CaClj/.sa pridá 1 jxg DNA z vírusu AcMNPV a 2 pg DNA z vektora ^p74rl. Tento pufer obsahujúci DNA sa po kvapkách pridá k bunkám. :a bunky sa 4 hodinyinkubujú pri teplote 27°C· Po 4 hodinách ha médium odstráni a bunky sa opatrne premyjú čerstvým roztokom.· TNMFT~, obsahujúcim 1C % FCS a antibiotiká. Po 4 až 5 dňoch?sä oj3stránia|ECV vírusy a jednotlivé plaky sa izolujú pomocou stanovenia plakov kov, ktoré popísali Summers a Smith /Summers, M. D., a.Smith,
G· E.·, Príručk8 spôsobov prípravy baculovírusových vektorov a kultivácia buniek hmyzu /A Manual of Methods for Baculovírus Vekto.rs and .In se ó t Celí Culture Frocedures/, Dept. of Entomol°gy,: Texas Agricultural Experiment Station and Texas A& M · University, College station, Texas 77343-2475) Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 /1.987//· '· .' .·. Λ Λ />·, t >’* ,
Jednotlivé plaky 3a potom použijú na infikovanie jednotlivých jamiek na platni pre tkanivové kultúry/obsahujúcej 48 jamiek, pričom do každej jamky sa vopred zaočkuje množstvo
7,5 x 10^ Sf9 buniek v. ,0,5 ml čerstvého TNMFH·média. Po 5 dňoch sa z každej jamky buč v rade alebo stĺpci odoberie do zásoby 10 μΐ supernatantu obsahujúceho pučiaci vírus. Zaháji sä pfc.R reakcia, pričom sa použijú. 4 /j-1 zásobného supernatantu : ' '·:1 ' · .. ' . > . ' a oligompry A a C ukázané na obr; 3. Pretože :oligomér C je špecifický pre deletovaný gén p74, amplifíkuje sa fragment iba v ťýcjp^re'akč^ch zmesiach, ktoré obsahujú rekombinačný vírus... PÔŔ’reakcia aa spustí násleh.u júcim ^spôsobom: 4 jjuL 1 f zásobného, supe^rnátantu sa najprv štiepia hodinu pri teplote 55 ^0 nešpecifickou proteázou /s koncentráciou 200 p,g/ml/ zo ;Streptomyces griseus /výrobca poehringer%Mannheim, Indianopolis, IN/ v 25 )xl(reakčnej zmesi obsahujúcej IX pufer A /so zložením: 10 mM Tris /PH 0,3/, 50 mM roztok.KOI, želatínu s ((líončentrácibu 0,4 £g/ml'G, 45 %' Nbnidet P40 (/výrobca Shell Oi. Oil Gó./ a 0,45 % Tween 20 /výrobca ICI Americas, Inc.//. Ne- < špecifická proteáza ,sa potom inaktivuje zahrievaním počas 12 minút pri teplote 95 °G. PCR amplifikácia sooúíva v zmiešaní vírusu ošetreného nroteázou, s množstvom 50 pinol ksžďéb.o zo špecifických oligonukleotidových prímerov v 50 jH reakčnej . zmesi Λ ktorá obsahuje 200 pAí štyroch dNTP /’d.ATP, dGTP, dCT? á dTTP/, *1,5 mM MgCÍ„ , lx'pufer -A ;a , AmpliTaq .ONA polymerázu s koncentráciou 1,25 jednotky /výrobca Ferkin-Slmer/Ge-tus, Norwalk, CT/. Vzorka sa podrobí 230 amplifikačným cyklob, z kto-, rých sa každý skladá z troch krokov: 1 minúta pri teplote 94 °G /denaturačný krok/,; 1,5 minút^r pri teplote, 55 °C /ochlä-, - < dzovací krok/ a 2,5 minúty pri teplote 72 °C ./predlžovací krok/·. Po 25 cykloch nasleduje predlžovací kroka dĺžkou 7 minút pri teplote 72 °G· 20 jxl reakčnej zmesi sa nodrobí elektroforéze v agarózovom géle s koncentráciou 1,2 aby sa ootvrdila prítomnosť rekombinačného vírusu. Pretože vzorky sú organizované podlá radov a stĺpcov, rekombiriačný vírus sa . identifikuje podlá jamky, ktorá je spoločná pozitívnemu radu i pozitívnemu stĺpcu.
·<
. P r í k lad 2 .
Demonštrácia fenotypu vírusu A4000 pri·skúške na terčíkoch listov s druhom Heliothis virescens ;
1 . . 'V<
. ' · <
Štandardná skúška na terčíkoch listov sa vykonáva na larvách a Heliothis virescens v štádiu tretieho instaŕu, aby sa testovala infekčnosť vírusového kmeňa A4000. K lístku bavlníka'tvaru terčíka s priemerom 5 mm, ktorý je umiestnený v jamke obsahujúcej vopred navlhčený terčík z filtračného papiera /terčík má asi 4 mm v priemere a je navlhčený 30 j^l vody/, sa pridá kvapôčka s objemom 1 μ.1 obsahujúca vírus /s definovanou dávkou PIB/, v TET pufri /zloženie: 50 mM T.ris-HCl, pH 7,5/lC nmM EDTA/0,1 % Triton X-1CC /výrobca Rohm anc Haas, Philadelphia, . PÁ/· Po vyschnutí, kvapky sa do jamky umiestni- jedna larva a jamka sa uzavrie. Larvy sa nechajú cez noc žiViť. Ďalší deň ráno sa. larvy, ktoré skomnzumovali celý listový terčík, prenesú do jednotlivých janiiek obsahujúcich potravu pre hmyz, Úmrtnosť lariev sa sleduje pokial sa larvy, ktoré prežili, nezakuklia. Tento.postup sa opakuje s vírusovým kmeňom AcMHPV di.vého typu E2. označeným AlOCO, ktorý sa použije ako kontrola. .Ďalej sú uvedené výsledky dvoch oddelených testov:
? Íí?
r.
vírus Dávka (PIB) Počet uhynutých lariev
Test 1
| A4000 | 2,5 X 105 | 1/31 |
| (Δρ74). | 5 X 104 | 0/32 |
| 5 X 103 | 0/31 | |
| 5 x 102 | 0/32 |
A1000 5 x Ϊ02 ( divý typ ) 5 , x 101
16/Ϊ8
14/31
B á
t ^•Λύί-
| . i *··: Ú '< ; | 30 . :!. íé.. ' | í/ | ||
| Test 2 J· -i | • | , . . ‘j·. . | ||
| A4000 * | 5 | X | 106 | 0/20 |
| (ΔΡ74) Ť | 5 | x | ίο5 Ϊ | 0/21 |
| 5 | x | 104 | ' 0/24 | |
| 5... | x | lo3 | 0/20 | |
| A1000 v | 5 | x | 102 | 22/32 |
| ( divý typ ) | 5 | x | 101 | 5/32 |
.Tieto výsledky -ukazujú, že vírus obsahujúci deléciu vd74 géne nie je ifekčný ani v dávkach 10 OCO krát vyšších než infekčný vírus, obsahujúci intaktný p74 gén. Nepredpokladá sa, že úhyn jednej larvy pri použití kmeňa A400C bol spôsobený • normálnym infikovaním. ...
príklad 3 . ¥ ’ ; . ..
Príprava neinfekčnej formy vírusu komplementáciou kmeňa . A4000 pri raste v bunkovej línii, obsahujúcej nestabilne in- .
tegrovanú kópiu Hind in fragmentu;P vírusu AcMNPV
Sf 9 bunky sa kotransfekujú podlá postupov popísaných v príklade L. Pri transfekciách sa použije 1 ^g genómovej vírusovej DMA vírusu A4000 a desaťnásobný mólový.prebytok olazini, dove j· DNA ;z ( plazmidu ACOO28/.3· Plazmid AC0028.3 sa skladá z Hind -III fragmentu P vírusu Acmnpv, vloženého ňa Hind III miesto plazmidu Bluescript KS II /výrobca Štratagene, La Jolla, CA/· Hind III fragment'P’’ je vyznačený v hornej časti ' obr. 2 ako časť Bst Eli fragmentu E vírusu; AcMŇPV. Tento fragment obsahuje kódujúcu sekvenciu celého génu p74 s množstvom 22i bp 5'lemujúcich sekvencií a 56 bp 3 lemujúcich sekvencií. Po. 48 hodinách sa pólyédre získajú z infikovaných buniek odstreôovaním pri nízkej rýchlosti a následným resuspent
Λ**»**·
31.-·, dovaním v TET pufri. K resuspendovanému vírusu sa pridá roztok SDS tak, aby jeho výsledná koncentrácia bola 1 %. Bunková DNA V sa naruší strižnými silami pri intenzívnom miešaní a pipetovaní vzorky. Na odstránenie bunkovej DNA sa uskutočňuje rad následných premývaní PIB častíc v TET pufri bez SDS, po ktorých nasleduje odstreďovanie pri nízkej rýchlosti·. Nakoniec sa PIB častice resuspendujú v TET pufri a za účelom stanovenia sa .spočítajú na hempcytom?tre. Biostanovenie sa .uskutoční podlá postupu popísaného v príklade 2· Pri dávke 1 x 10^ PIB nespôsobia samotné polyédre z Sf9 buniek transfekovaných DNA z vírusu A4000 úhyn lariev, častice PIB z Sf9 buniek kotransfeko-. vaných 7NA z vírusu A4C0C a DNA z plazmidu AČOČ28.3 spôsobia úhyn lariev vzhladom na to, že sú infekčné. Rast vírusu v bunkách .poskytujúcich funkčný p74 protein /vzhladom na prítomnosť ACCÔ2S.3 plazmidu/ teda spôsobí tvorbu Α4000 vírusu,, ktorý je infekčný pre hmyz. Tento vírus je schopný spôsobil produktívnu infekciu v larvách. Tento výsledok sa potvrdí zberom častíc PIB!z mŕtvych lariev. Častice PIB sa získajú umiestnením mŕ~ tvých lariev do pohárika s odstráneným dnom^ ktoré je nahradené Nytexom ^/výrobná; značka'; firmy Tetko, Briar-cliff Manor, . . ;
N.Y./· Mŕtve larvy sa potom prelejú TET pufrom /množstvo 1 uil/ ./larva/ a zhromaždia sa tie,časti výtoku, ktoré obsahujú PIB častice. Tieto PIB častice sa resuspendujú v TET pufri obsahujúcom 1 % roztok SDS· Suspenzia sa premieša 'a odstredí Dri nízkej rýchlosti., PIB častice sa ďalej niekoľkokrát premyjú TET;. pufrom (bez iSDS · ; DNA z týchto PIB sa získa} postupom'popísaným'v príklade 6, podlá Summersa á Smitha /Su'mmers, M · D., :a Smiťh, C·· E·, Príručka spôsobov, prípravy bäc.uíovírusových vek-i torova kultivácia búniek hmyzu /A Manual of Wetnods for Bácu-, lovíŕus Veôtors and' Insect Celí Culture Prôcedures/, Dept. of Entomology, Texas Agricultural Experiment Station and Texas A
MHJniveräity, Čollege Station, Texas 77843“i.2475, Texas Agric oultural Experiment Station Bulletin wo. 1555 /1987//· Pritomt
-:3 hosť dp?4-vírusu v-týchto mŕtvych larvách saj potvrdí PCR amplifikäciou, pri ktorej sa'použijú oligoméry popísané, v príklade 1. -ί..· .·-· · · . ti ' r
Príklad 4
Konštrukcia expresných vektorov obsahujúcich heterôlógny promótor ' 'H· ; ·- J .. . ;í 1 ; ' 5 použitie hieterolognych· promótorov na riadenie exoresie p74 génu môže zvýšiť účinnosť komplementácie p74 vírusu. Ex Expresné vektory vhodné na toto použitie sa skladajú z nasledujúcich modulov; /1/ heterologny promótorový;modul, ktorý sa požíva na reguláciu transkripcie; /2/ polylinkerový modul, ktorý ulahôuje inzerciu PMA sekvencií, ktorých expresia sa požaduje, a /3/ modul, obsahujúci 3 UTP oblasť,/ktorá poskytuje miesto spracovania primárneho transkriptu a p'blyadenyláciu . /vid obr. 4/. Taký expresný vektor, ktorý obsahuje ĽA26 génový ''promótor vírusu AcMNPV, polylinker a 3 UTR oblast pre základný prote.ín 6,9 K z vírusu' ACMNPV, sa pazýva ptôEVli vzorky E. coli kmeňa ΡΗ9 nesúceho špecifický pMEVl izolát, označené ACCO64·!, boli uložené 7. apríla 1993 v Americkej zbierke typov kultúr a bolo im pridelené ATCC prírastkové číslo 69 275·
Ďalšie vektory sa môžu lahko pripraviť' náhradou oromótora, obsahujúceho rst I/Xba I fragment pMEVl,' fragmentárni štie.penými Fst. I/Xba I,. ktoré obsahujú oblasť; kódu júcu 6,9 K oblasť vírusového promótora vírusu AcMNPV /vektor pMEV2/· Miesto oblasti 1 kódujúcej 6,9 K oblasť promótora vírusu AcMNPV môže byť vo fragmentoch, štepených pst I/Xba I, promótorova oblast kódujúca polyhedrin /vektor alebo 39 K oblasť vírusového promótora /vektor pMEV4/· ? ; Fromótoroyé fragmenty použité pri konštrukcii týchto f
-f.{_ , - - - 33 - < h; ' vektorov sa, vytvoria PCR amplifikácio^ klonov^nej vírusovej DNÁ s použitím promótor-špecif ických párov oli'gonukleotiďový’ch prímerov., Prímery sa vytvoria tak, že amplifikované promótorové segmenty majú nasledujúcu všeobecnú štruktúru obssahu júcu:5 · /1/ .heteropolymérnu syntetickú sekvenciu utvorenú z 22 5 koncových párov báz s rekongičnými miestami pre reštrikčné endohukleázy Sst I, Sse 83871 a Stu I /v tomto poradí/; /2/ seg•ment vírusovéj DNA,«ktorý začína od pozície umietnenej 100-350 bp proti „smeru transkripcie od hlavného štartovacieho miesta transkripcie daného géhu a pokračuje k 3'koncu 5'UTR oblasti /t.j. k pozícii -1, označenej s ohladom na thanslačný iniciač-/ ný kodón/, a /3/ heterópolymérnu oblasť utvorenú z 23 3'koncových bp s rekogoičnými miestami pre reštrikčné endonukleázy t'Esp 31 a Xba I /v tomto poradí/. Poloha a orientácia Esp I a rekogničného miesta lokalizuje miesta štepenia medzi oozície -5 a -4 v /+/vlíákne!i;á 'medzi pozície -1 > a +1 v /-/vlákne.
Templátom použitým na prípravu 35 K. promótorov je Hind III jfragment K vírusu AcMNFV. Sekvencia;prímeru /+/vlákna obsahuje heteropolymérnu sekvenciu s veľkosťou 22 bo s miestami pre reštrikčné enzýmy Sst I, Sse 33871 a Stu I á 35 H sekvenciu 5'konca siahajúcu od pozície -399· do.pozície .-382. Primer /-/vlákna obsahuje 35 K sekvenciu 5 konca od ?2l,do -1, nasledovanú heteropolymérnou oblasťou s veľkosťou 23 bo s miestami pre reštrikčné enzýmy Esp 31 a Xba.I, Pre každú amolifikačnú reakciu sa 50 pmol vhodného páru Pŕímerov zmieša s .250 pg templátu DNA v 50 jxl reakčnej zmesi obsahujúcej 10 11M Tris-HCl /PH 8,3/> 50 mM KCl, í,5 mM MgCl^, 200 jiM báz dWTP,
ICO /tg/ml želatíny a 2,5 jednotky AmpliTag DNA DO.lymerázy /výrobca Perkln-Elmer/Cetus, Norwalk, CT/· Vzorka sa amplifikuje pri 25 cykloch skladajúcich1 sa z 3 krokov: lmin pri teplote ,94 % /denáturačhý krok/, 1,5 min pri teplote' 55 °C /ochladzovací krok/'a 3 min pri teplote.72 °0 /predlžovací krok/. Ako .1
i ó ' . “ 34 - ' ,· O ' .
t O j. .'U - r 7 7 í \ .-P. · ' · λ '·. ·· ' 1 · . T , · , . ; · /·. í . / · (j·, - - · / . ·, - : ' ' ;‘ 7 '' ,, ’
i. , / . 7 pri plných reakciách ;k času posledného reakčného kroku sa pridá 7 minút. . / , . . , -ý1 . t
Každá reakcia sa ukončí prídavkom EDTA',na koncentráciu 10 mM v reakčnej zmesi a Sarkosylu /N-lauroylsarkosin sodný/ na koncentráciu 2 g/1. Produkty sa potom extrahujú raz chloro', .4. -? . 7formpm a raz zmesou fenol:chloroform a vyzrážajú sa etanolom. ; ' Vzorky DNA ša znovu rozpustia vo vhodnom pufri a potom sa štepia pat I /tento enzým rozpoznáva šesť centrálnych párov báz [CTGCÁ G] miesta p.re Sse.83871/ a Xba I. Každý‘predpokladaný promotorový fragment sa ďalej čistí gélovou elektrpforézou v 1,2 % agarózovom géle s nízkou teplotou topenia a liguje sa do : j . .Pst Ι/Xba I vektorového fragmentu s velkosťou; 3,2 kb, pripraveného z pMEVl. Tento fragment obsahuje polylinkerový modul, .· 3%UTS modul .a SK+ základ plazmidu Bluescript z pMEVl. Žiadané rekombinanty sa identifikujú analýzou reštrikčnými enzýmami a určením sekvencie DNA. Odborníci v obore m'ôžu: podlá tohto postupu pripraviť akúkolvek promótorovú oblasť,· ktorej sekvencia je dostupná, ako je napríklad 6,9 promótor vírusu AcMNPV, po- . lyhedrínový promótor alebo bunkové promótory,' napríklad hsD 70 promótor z Prosophila melanogaster. ·' ' .
Príklad .5 .
i '.': ' \ > \ ' . . t \ ' '< t
Príprava heterológnych konštruktov obsahujúcich promo- . tor-p74 kódujúcu oblasť í . ’ * . ' V ' ' · '<
, Froteín kódujúci oblasť génu p74 sa izoluje PCR.ampliv fikáciou vhodnej oblasti ÁCOO28«3, aby sa mohla vložiť do ex presných vektorov obsahujúcich heterológne promotory /ako je .. popísané v príklade 4/.- V PCR reakcii sa použije prímer /+/ •vlákna ís velkosťou 24 bp, ktorého s'koniec je na ATG translač, nom štartovacom mieste. p74 génu. prímer /-/vlákna s velkosťou
' '4' - ; / ./ u; - 35 - bp sa skladá z 20 bp 3 sekvencie génu p74 končiacej TAA translačným stop kodonom, za 'ktorou je umiesťhené áalšia sekvenčia s. velkďstou 9 bp'obsahujúcou Bam Hl miesto. Pri PCŔ-reakcii sa 250 pmol ACCO28«3 zmieša s 50 pmol každého.zo špecifikovaných .oligonukleotidových prímenov v 50 >>1 reakčnej zmesi, obsahujúcej 2C0 jiM každého dNTP /dATP, dQTPj duTP a dTTP/,
1,5 mM Mgd^, 1 X pufer A a 1,25 jednotky AmpliTaq DNA polymerázy|/výrobca perkin-Elmer/CetUs, |N,orwalk, CT/. Vzorka äa podrobí 5 cyklom amplifik'Áciej pričom každý cykľús sa skladá z 1 min pri teplote 94 °Č /dena’turačný krok/, 1,5; min pri' 45 °& ;
1 O '1 x /ochladzovací krok/ a 3 .min pri 72 C /predlžovací krok/. Dar· lej 25 ampíifikačných cyklov, ktoré sa skladajú' z 1 min pri 94 °c /denaturačný krok/, 1,5 min pri 55 °C /ochladzovací krok/ a 2,5 min pri. 72 °C /predlžovací krok/.tPCR reakcia sa ukončí zdržaním . 7 min pri 72 °C· / po čistení sa reakčné produkty ošetria Klenowovým fragmentom DNA polymérázy I /Sambrook, J.., a čalší, Molekulové klonovanie: laboratórna príručka /Molecular Cloning: A Laboratory!Manual/, 2· vydanie, ,'Jold Spring Harbor Laboratory Press, Cold.Spring Harbor, N.v. /1989/7 v prítomnosti všetkých štyroch dNTP, aby sa zaistilo, že PCP produkty budú mat tupé konce. 3'koniec p74 kódujúcej oblasti sa potom štepí Bam Hl a výsledný fragment sa čistí elektroforézou v 1$/agaróžovom géle s nízkou teplotou topenia. Tento fragment sa potom klonuje do akéhokolvek vektora z niekolkých expresných^vektorov pooísaných v príklade 4· Pri tvorbe expresných vektorov· pre inzerciu 074 génu sa každý, vektor štepí Esp 31 a výsledné prečnievajúce 5'konce sa' doplnia pôsobením DNA polyme.rázy i z E. coli /Klenowov fragment/ v prítomnosti všetkých štyroch dNTP. Každý vektor sa potom štepí Bam Hl. Vektor sa oddelí od uvolneného = polylinkerového fragmentu elektroforézou v 1% agaróžovom géle ; s nífzkou teplotou topenia. Potom sa pri oddelených reakciách •Á- ; ‘· <ľ· · ' tentjo vektor ligu je s fragmentom obsahu júcim/p74 gén.
ť ' : ' , - 36 - . / . . ť ·' ··'' ., · ' ..· - :, . > '' . ... . .$ : ; . a. ' ’ ' ' 7f • . V’· ; . Príklad 6 -//7 ' ;; , < 7 \ · f ' , -'t·?· Izolácia stabilných Jf9 bunkových línií obsahujúcich funkčnú kópiu p74 génu integrovanú do bunkového genómu ’ ·ν· ' ' , '.
' ; ·' >.·* ’ '. .
V tomto príklade sa izolujú deriváty Sf9 .buniek, ktoré obsahujú, konštrukty s génom p74, pričom tieto konštrukty sú integrované dp bunkového genómu. Postup izolácie popísali Jarvis a ďalší /Jarvis, D. L., a ďalší, Biotechnology, 8, 95 950-955 /1990//. V tomto príklade sa používa; plazmid označe-. ný AC0028.3 /ATCC 68.987/· Tento plazmid obsahuje Hind III ; fragment P vírusu AcMNPV, ktorý zahŕňa p74 gén a malé množstvo pôvodných, lemujúcich sekvnecií. Najprv sa Sf9 bunky ko * · í ’ , 'T? · transŕekujú zmesou 2 pg DN A AC0028.3 plazmidu a 1 DNA plazmidu IE-1 Neo /Jarvis/ D. L., a ďalší , Biotechnology, 8, 950-955 /1990//.; Po transfekcii sa,bunky 2 hodiny, inkubujú pri teplote 28 °0. Po;premytí buniek kompletným TNMFH médiom /Sambrook, J., a ďalší, Molekulové klonovanie; laboratórna príručka /Molecular Cloning: A Laboratory Mänual/, 2· vydanie nie, Cold Bpring Härbor Laboratory Press, Cold Bpring Harbor, N.Y. /1989// sa bunky opäí dajú do živného média-a inkubujú sa 22 hodín pri teplote 28 °C. Bunky sa potom naočkujú v nízkej koncentrácii na misky tak, aby vzniknutá kultúra bola riedka a dodá sa kompletné TNMFH médium s 0,5 mg/mlvanalógu neomycínu G4l 8 /výrobca GIBCO-BRL, Grand Island, N.Y./ /uvedená koncentrácia analógu G4Í8 je uvedená pre aktívnu bázu tejto látky/. Bunky sa potom inkubujú týždeň pri teplote 28 °C. Na konci týždňa sa médium vymení a použije sa kompletné médium bez G418. Nasledujúci postup sa použije pre každú z troch oddelených misiek. Prežívajúce bunky sa po zberajú a pomnožia.;. Tri pomnožené sady buniek sú stabilnými bunkovými líniami, označenými Sf9/28.3/CL-Í, of9/28.3/CL-2 /ATCC· CRL 11,322/ a of9/28·3/CL-3· Tieto zmiešané populácie sa napestujú a potom sa kontrolujú na prítomnosť p74 génu za použitia PCR reakcie, a ·'. ': · · - 7,. . ' A .
f
- 37 > akoíje popísané v príklade 1. Pri tejto PCR reakcii sa použi , je oligomér špecifický pre /+/v.lákno génu p7£ /oligomér A/ a oligomér špecifický pre oblasť chýbajúcu v p/4 géne vírusu i ' J . .
A4000 /oligomér B/. Oligomery sú znázornené na obr. 3.
? ·? f '·;·' Ί P r í k 1 a d 7 '('<·'
Produkcia A4000 vírusu infekčného pre hmyz pestovaním ! v hore uvedených binkových líniách a demonštrácia jeho fenotypu
Každá z uvedených troch bunkových línií, izolovaných spôsobom popísaným v príklade ó, sa infikuje^ pri hodnote MOI väčšej než 1 vírusom A4000. Produkcia vírusu.nastáva pri hod; notách MOI v rozmedzí asi od 0,01 do 20. Častice PIB sa získajú z infikovaných buniek spôsobom popísaným v príklade 3.
Uskutoční sa štandardná skúška na terčíkoch listov /vid prí> . s > · £· ' \ . < t · : £ klad 2/. Ďalej sú uvédené výsledky troch- oddelených testov.
Vírus A1000 je E2 kinéň divého typu vírusu AclíNPV:
' ' ' ; ; . -f · .i... . < .
VÍrus/Bunková Dávka (PIB) Počet uhynutých/ % línia Počet testovaných úmrtnosti (Pasáž číslo)
| Test 1 A4000/Sf9 | 1 | x | 105 | 0/16 | 0 |
| A4000/CL-1(P3) | 1 | x | 105 | 7/16 / | 44 |
| A40Ó0/CL-2(P2) | i 1 | x | 105 | 9/15 / | 60 |
| A4000/CL-3(P2) | 1 | x | 105 | 6/16 | 38 |
| A1000/Sf9 , ý | 1 | x | 10 3 | 30/3 2 | 94 |
| kontrola ··«· Š' | 0 | 'r | 0/30 . ' í ; | 0 |
| .> : - J8 - . ·. ~ ; í- ··> . · t . : · · . > · · , . . ; : ·· · ··..! . | ||||||
| Test 2 n ·’ í | ||||||
| A4000/SÍ9 | 1 | x | 105 4 | 0/15 | í»·. ; | 0 |
| A4000/CL-1(P3) | 1 | x | 105 | 1/15 | ŕ | 6 |
| A4Ó00/CL-2(P2) | 1 | x | 105 | 4/16 | 25 | |
| A4000/CL-3(P2) | ; 1 | x | 105 | 6/16 | „’i- | V38 |
| AlOOO/Sf9 | j 1 | x | 103> | 21/28 | 75 | |
| kontrola | 0 | • 0/32 | t | 0 / | ||
| Test 3 | ’ | ·. ·* | 'k ís v- ' | |||
| t. | ||||||
| A4000/Sf9 | 1 | x | 105 | 0/16 | TÍ. · | 0 |
| A4000/CL-1(P7) | 1 | x | 105 | 5/16 | *·' | 31 |
| A4000/CL-2(P6) | 1 | x | 105 | 5/16 | 31 | |
| A4000/CL-3(P6) | 1 | x | 105 | 0/16 | f'· | o |
| A4Ó00/CL-3(P2) | í 1 | x | 105 | 3/15 . | 20 | |
| A1000/Sf9 | 1 | x | 103 | 17/31 | .55 | |
| kontrola 1 | í 0 | 0/15 | •v | o | ||
| Λ Ž týchto | údajov | je zrejmé, | že ked sa | -í ; Sf9 | bunky * s tá bil |
• ne transformované plazmidom ÁCOO28.3 infikujú vírusom A4000, tak výsledné PIB častice sú orálne infekčné.vNáopak PIB; čas1 tice z rodičovských netransformovaných Sf9 buniek infikovaných vírusom A4000 nespôsobujú úhyn lariev. To znamená, že pestovanie vírusu A4000 v bunkách poskytujúcich funkčný p74 ; iproteín,/čo je-spôsobené stabilnou integráciou konštruktu p74 génom, ako je popísané v príklade 6/ má za následok produkciu ; vírusu A4000, ktorý je infekčný pre hmyz. príčina neuskutočnenia komplementácie v pasáži číslo 6 bunkovej línie Sf9/28. •3/CL-3 nie je známa; í ' DNA sa dalej pripraví /ako je popísané v príkladoch 3 a 6 podlá óummersa a omitha /oummers, M. D. , a óuiith, 3. E., ‘' Príručka spôsobov prípravy baculovírúsových vektorov a kulti' vácia buniek hmyzu /A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Celí Culture Procedures/, De-pt. of Entoinology, Texas Agricultural Experiment Station and Texas A &. M \ · . . ' r.; . 'U. ’ Γ ; M; , . f r , / ... ' . , / ' f , . , ' . : :
: 1 i '· ,·.Ι - . ...
ŕ ; ... · P ; Ί ' \ - 39 - 7 . I
Univeršity, college ótation, Texas 77843-2475, Texas Agricul·.. tural Experiment Station Bulletin No. 1555 /3*987// z častíc PIB Jednotlivo pozbeŕanyclí z dvadsiatich lariev, ktoré boliusmrtené komplementovaným vírusom pre teste 1 vyššie v texte. Pre skúšanie prítomnosti Δρ74 vírusu sa uskutoční PCR-ampli! fikácia s použitím primerov A a C a pre skúšänie prítomnosti t divého'stypu vírusu s použitím A a B /všetky prímerý, vid obr. j : 3/. Postup pri PCR.'amplifikácii je popísaný ý príklade 1. Vý, sledky ukazujú, že;všetkých dvadsať lariev bolo infikovaných Άρ.74 vírusom i Okrem pozitívneho signálu pre lp74 vírus vykazuje päť z dvadsiatich lariev silný PCR pás špecifický pre : ' r ’ í· ' ' ’ ·- --.¾ . V .
prítomnosť intaktného p74génu. o PIB časticami izolovanými z 18 z dvadsiatich lariev z testu l^aa vykoná-skúška na terčíkoch listov /vid príklad 2/. Pre každú vzorku sa použije , dávka 1 x 10^ PIB/larva a 32 testovacích lariev. Úmrtnosť nad w ' ' . · íl ’ ' úroveň kontroly vykazujú len častice PIB, izolované zo šty- , x , ·. „ roch skúmaných lariev s pozitívnym signálom na prítomnosť m · - r ' taktného p74 génu. Častice PÍB zo žiadnej zc]14 skúmaných lariev, u ktorých bol· pozitívny test iba na prítomnosť deleto• vaného p74 génu/ nespôsobili’ úmrthosť lariev^nad úroveň kon; troly. ' · , ·. Ký ·; , // ' 1 · i. . . : . .. ‘í; · • Tieto výsledky by mali byť pravdepodobne spôsobené jednou z dvoch nasledujúcich príčin. Príčinou by mohol byť fakt, že vzorky komplementovaného vírusu sú kontaminované ví- rusom divého typu ä že niektoré larvy' z pôvodného testu /t estu. 1/ nesú vírUs divého typu. Kebyj sa tieto larvy dalej infikovali Ap74 vírpšom, mohli by byť v PIB prípravkoch z týchto lariev prítomné PIB častice vírusu divého typu, aj PIB časti ' , ’ ··' - r ce Δρ74 vírusu. Alternatívnym vysvetlením by ,;mo hlo byt, ze sa počas pestovania Δρ74 vírusu v komplementujúcej bunkovej lís nii vyskytne homológna rekombinácia medzi tjmto vírusom a p74, sekvenciami, integrovanými do bunkového genómu· Ak sa rekombinácia vyskytne v malej; miere, potom len niektoré larvy, ŕ · .
Ľ í· X , . / ? s . . j·5.',. ··,£-. / ' ' . /. - 40 - J/ : ,7 .
ktoré zahynú pôsobením kompíemen to vaného vírú.su, by tiež ób/ ‘ sahbvaľi vírus divého typu. Tento vírus divého typu by bol v druhom cykle stanovenia orálne infekčný. V. prítomných konštruktoch existuje homológia s velkoslou ^84 -;bp medzi 4p74 ; vírusom na; 5 konci delecie a sekvenciami génu p74, integrovanými do bunkového génu a homológia s velkostou 713 bp ns /3'konci delécie. Ak je toto alternatívne vysvetleníé správne, potom sa tomuto výsledku môže zabránit anižením velkosti, alebo ak je to nutné, vylúčením tejto homolognej sekvencie vyskytujúcej s$ medzi vírusom a bunkovou líniou.
? V/ < ' · ’ -é · ,· ' ' ' ' . - ' ; - . ·. ' f ·' ť ; í P r í, k laď 8. . . ’ í '
Ή . ' T. ’ l. ' Λ ; 7. J .. ' ;
Konštrukcia transgénnych druftbV hmyzu; ktoré obsahujú . funkčnú kópiu p?4 génu stabilne integrovanú do genómu hmyzu
V tomto príklade sa na konštrukciu tránsgénnych kmeňov hmyzu použije balistické zavedenie DNA pomocou wolŕrámových častíc;/*BaldarélliH. M., a Lengyel, J. A., f-Nucléič Acids Res., 18, 59O3-59C4 /1991//· Pre jeden z p74;;konštruktov, popísaných v príklade 5, sa vyzráža 20 až 100 yg DNA v injekčnom pufri;.-.pre embryá -/0,1. M fosforečnan sodáý, pH 6,8, 5 niM KCl/. na povrchu premytých wolfrámových častíc s.polomerom 1,2 mm /výrobca Bio-Rad, Richmond, CA/· uelkový |bjem zrážacej reakčnej zmesi je 65 pl. Po zrážaní sa odstráni 50 pl súper' ·· .· ..'··· . 7 ' ‘ natantu. Tesne pred vnesením 8 ul do makroprôjektilu sa peleta a 12 až 15 pl supernatantu intenzívne premieša. Na bombardovanie embryí Trichoplusia ni s odstránenou vonkajšou blanou, v štádiu vývoja pred vytvorením blastodérmu, sa použije balistický systém pre dopravu biočastic /A biolistics bioparticle delivery. systém /výrobca Dupont, Wilmington, DE//· Počas tohto postupu sú embryá zachytené pa filtračnom papieri. Embryá sa potom umiestnia pod jeries 700 halocarboň oil /vý ' ! ' . ), . '77 <
robca Halocarbon Products Corp., Hackensack,:N.J./, dokiaľ sa nevyliahnu'. Po vyliahnutí hmyzu, ktorý prežil, sa do schrá-·'· niek dohromady umiestni vždy/·; skupina 25 týchto jedincov hmyzu. Vajíčka ztýchto schránok sa zhromaždia á.z embryí aa pripraví DNA spôsobom, ktorý popísal.áôberts^/Roberts, D. tí.,, ed., Drosoph.ila: praktický prístup /Drosophila.: A Practical Approach/, str. 276, IRL Press, Oxford, Engländ /1936//. Aby, sa určila schránka, v ktorej vajíčka obsahujú p74 gén, uskutoční sa reakcia /viď príklad 1/ s použitím oligomérov A a B, zobrazených na obr. 3· Keó sa identifikujú pozitívne skupiny ..;· < · · ·· ' hmyzu, vajíčka z týchto skupín sa vyživujú ajnéchajú sa vyvíjať až.V-do dospelosti. Jednotlivé páry dospelýth jedincov sa” spária a DNA izolovaná z ich vajíčok sa opäť/ítestuje PCR reakciou ná prítomnosť p74 génu.. Tento proces pokračuje, dokiaľ sa nevytvorí línia mór,' ktoré sú pre p74 génjhomozygótne, . . '
Pri k 1 a d
Produkcia A40CC vírusu infekčného pre 'hmyz pestovaním í'. í | h- ľ·.·: ' i f 'V' ' '· ' ΐ :
v hore uvedených tŕahägénnych druhoch hmyzu a demonštrácia jeho - fenotypu j.; h / . -· - ' '-'y.· - ; ' ' / ·' . , . .
Najprv sa malému počtu /10 až 20/ transgénnych lariev druhu Triehoplus'ia ni vo štvrtom instarštádiú podá injekčné íďo hemolymfy 5 jtl tkanivového kultivačného média s;, množstvom í x 10* Častíc napúčáného vírusu Á4000· Po 4 až 5 dňoch, kedy -sa zaznamená úhyn väčšiny lariev spôsobený vírusom A4000, sa pozberajú PIB častice spôsobom popísaným v nríklade j. Tieto FIB častice sa potom použijú na ďalšie pomnoženie. Transgénne larvy Trichoplusia ni v treťom instarštádiú,/ktoré obsahujú jeden z p74 konštruktov popísaných v príklade 5, sa na obdĺžnikoch- s rozmermi 2,54 x 3,Si cm kŕmia potravou povrchovo kontaminovanou 0,4 juul média s koncentráciou L, x 10 , PIB častíc
1,
- 42:-. .
• , ’ · ΐ
- ' · ··..' >' - ' V - , ; Α4Ρ0Ό vírusu v 1 ml. po '5 až 6 dňoch, kedy sa ú väčšiny lariev zaznamená smrl spôsobený vírusom A4000, sa PIB,· častice pozbe. rajú spôsobom .popísaným výšši.e v texte. Vzorka, týchto PIB čas tíc sa uchováva v TET pufri j ako, zásoba. Biologické účinky vírúsu sa ďalej stanovia štandardnou skúškou naťerčíkoch listov | • s larvami Trichoplusia ni divého typu v druhom.instarštádiu.
? v 4 :(výsladký ukazujú, žé pestovanie vírusu A4000 vi transgénnych druhoch hmyzu, obsahujúcich funkčný p74 gén, obnoví infekčhosl vírusu voči hmyzu na približne normálnu úroveň;. Avšak vírus pozbieraný z týchto lariev divého typu, ktoré boli usmrtené tým : týmto komplementovaným vírusom, má zníženú schbpnosl infikoval hmyz orálne. 3 ľ..
•Vy. j? ; ýjr. ' Ý - '-V·. · · '. ' ň .' '· ý - .
l '. '· ' v ' 1 ’· F r í k 1 a d 10 · . .J' Λ , - í 7
ý. · * ' ' V ' t . < · , Λ. Á ·.
'inzercia génu kódujúceho toxín ďo p74-l'transferového , vektora a izolácia rekombinačného vírusu A4TxP^-I í ý < *. 4-r- ·. ' f- .· ? ' ' ' ·. . ' ' .!
Fragment PNA, kódujúci toxín z roztoča ^yemotes tritici /ŤxP-I/ špecifický pre hmyz, sa izoluje z cDNA klonu Tox34 . /Tomalski, m. Ď., a Miller, L·. K., Náture, 352i 82-85, /1991/7 ; · Eco Hl fragment, obsahujúci celú proteín-kodujúcu oblast génu • s nejakými neprelomenými oblasťami-na*ý a 3 konci, sa klonuje. y ;; do AcMNPV· p’VÍ 1393: vektora /súprava iňviťrogén;. San Diego, ý , CA/·; Fragment s tupými koncami., siahajúci od Eco RV miesta k
ý. Hind III' miestu, vytvorený z tohto konštruktu sa vloží do transferového vektora Δρ74-1 na Afl II. miesto, ktoré Je vnút«„ r. », · ·, «, ?·;- 1 Λ .·„ i. ·.·. · v; 'í ,< -r··, < . : · ·.·; 1. , ·'. ‘ ri danej delécie /viď obr. 2/· Výsledkom spoločnej transfekcie tohto plazmidu označeného LBl5«9, s genómovou RNA vírusu A4000
I í, > ý doí sf9 buniek,, je $ekombinačný; vírus, ktorý kóduje TxP-I gén a ktorý nemôže' orálne infikoval larvy, injekčné voravenie na. púčanej formy tohto vírusu do hemolymfy larievjHeliothis virescens vo štvrtom instarštádiu však spôsobí charakteristickú paralýzu, vzniknutú expŕesiou génu TxÚ-I. Okrem toho sa pestovaním totito vírusu spôsobmi popísanými :v. prik?_adoch 3, 7, a 9 docieli produkcia A4TxP-I vírusu infekčného pre hmyz J Tentoŕ · ·'*'· '-· infekčný Ä4TXP-I vírus môže orálne infikovať larvy a vyvolať paralýzu. Avšak vírus vytvorený týmito infikovanýÄ&larvami si nezachová- svoju infekčnost pre hmyz. ···:
J . > ,ι V . ti . 1. ’ λ ’ .
..Príklad 11 .
' t. Konštrukcia expresného vektora obsahujúceho kódonovo optimalizovaný AalT gén *
Tpxín AalT špecifický pre hmyz sa nachádza y jede severoafrického škorpióna Androctonus australis Hector. Skonštruuje sa transferový vektor pre inzerciu AalT génu do génovej oblasti vírusu AcMNPV kódujúcej polyhedrín. Tento vektor označený ACCO55.,! obsahuje AalT gén vložený na BamHI miesto plazmidu pVL 985 /Poberts, D. B·, ed., Drosophila: praktický prístup ./Drosophila: A Practical Approach/, str,. 276, IPL.Press, Oxford, England /1986/7 a pozostáva z kódonovo optimalizovanéj ’nukletidov.e j sekvencie pre zrelý AalT toxín, spojenej so sekvenciou Dre signálny peptid kutikulového génu z Drosophila meílanogaster. Vzorky E. coli kmeňa HBlOl nesúceho teň^o transferový vektor ACOO55·1 boli uložené 17. decembra' 1992 v Americkej zbierke typov kultúr a dostali ATCC prírastkové číslo 69
166. L' :
Pre následné vloženie do expresných vektorov podlá príkladu 4 sa ťoxín-kódujúci segment tohto transferového vektora získa POP reakciou, prímerom /+/vlákna použitým v tejto reakcii je oligonukleotid s velkostou 27 báz, ktorého 5.'koniec 3a zhoduje s ATG iniciačným kodónom pre tra.nsláciu AalT génu, ktorý je kodónovo optimalizovaný a ktorý sa má' amplifikovať /AalT gén je obsiahnutý v ACOO5.1 vektore/.
'f . · · Y .
,-44-.- - . . ' ό
Frímer /-/vlákna hybridizuje a miestom, ktoré leží vo vektore ΑΟΟθ55·1 vzdialené asi 35 až 40 bp od'3'konca AalT génu v smere prepisu.^Podmienky pre POP reakciu sú v zásade Dopísané v príklade 1 ·. Po purifikácii sa reakčné produkty čistia spôsobom popísaným v príklade 5» s'výnimkou toho, že fragment sa čistí elektroforézoú v 1,8% agaro'zovom géle s nízkou teplotou topenia. 7
Pre prípravu expresných vektorov pre inzerciu toxínového génu sa každý vektor štepí enzýmom Esp JI a vzniknuté r ' . 5? prečnievajúce konce sa doDlnia pôsobením DNA*· polymerázy í /Klenowovho fragmentu/ z E Coli za prítomnosti všetkých štyroch dNTP báz. Každý preparát sa ďalej štepí BamHI. Vektor sa oddelí od uvoľneného polýlinkerového fragmentu elektroforézoú , v 1% agarózovom géle.; s nízkou teplotou toDeni.a a potom sa ligu je v oddelených reakciách s génovým fragmentom kódujúcim AalT toxín.
Príklad 12
Izolácia rekombinačného. A4001 vírusu kódujúceho AalT toxín
Aby sa pripravila DNA vírusu A40CQ pre .inzerciu génu, linearizuje sa táto DNA postupným štepením enzýmami Sse 83871 a Bsu 3βΙ· V typickom usporiadaní sa 40 ^g DNA vírusu A4000 štepí 2 hodiny pri teplote 37 °C enzýmom Sse 8371 v množstve ICO jednotiek /výrobca Takara Biochemical, Inc., Berkeley,
CA/ v 250 1 reakčnej zmesi, obsahujúcej 10 mM nufér Tris-HCl, pH 7>5>.10 mM MgCl·^, 1 mM ditibtreitolu /DTT/, 50 mM NaCl a 0,01 % 3SA. Reakčná.zmes sa potom upraví ICO mM NaCl a 50 mM pufru Tris-HCl, pH 7,9 a DNA sa štepí 2 hodiny pri teplote. 37 °C enzýmom Bsu 361 v množstve 100 jednotiek /výrobca New'fEngland Biolabs, Beverly, MA/· Potom sa reakcia ukončí ' ' I ľ. .... · - : · · ' i
- '45 -1 pridaním SDS na výslednú koncentráciu 10 g/1, wadľna výslednú koncentráciu 0,3 M a EDTA na koncentráciu 10-mM· Ďalej sa DNA chromatograficky čistí v poly-prep kolóne /výrobca BiôRad La Laboratories, Richmond, CA/, obsahujúcej 2 ml Sephacryl-300 /výrobca Pharmacia, Piscataway, N.J./, uvedenej do rovnováhy 10 mM pufrom Tris-HCl /pH 8,0/, 1 mM roztokom-EDTA, 0,1% rozítokom. SDS «.a 0,3 M roztokom NaCl.. Zachytí sa 12 frakcií s objemom 15c p.l. 10 μ-l každej frakcie sa analyzuje:gélovou elektroforézou, aby sa identifikovali frakcie obsahujúce vírusovú DNA. Tieto frakcie sa spoja, extrahujú sa jednou zmesou fenol: •.chloroform a vírusová DNA sa potom vyzráža etanolom. DNA sa resuspenduje v . TE pufri /zloženie 10 mM Tris-HCl s pH 8,0, mM EDTA/ tak, aby koncentrácia DNA bola 0,2 až 1 mg/ml a J .. suspenzia sa skladuje pri teplote 4 °C· Pre stanovenie, či bola vírusová DNA kompletne linearizovaná, sa alikvotná čast DNA štepí Eco RI a analyzuje sa gélovou elektrofoŕézou. Vírusová ĎNA vykazujúca Eco ri fragment s velkosťou 7 kb nebola štepená 3su 361 a Sse 83871 úplne a nepoužije sa..
Expresný vektor obsahujúci AalT gén, pppísaný v príklade 11, sa štepí 3su 36I á Sse 83871· 12 ng fragmentu kódujúcetv> ·; · ho toxín sa liguje s množstvom 0,5 H-g Bs'u 361/Sse 3783'1-li'ne- . arizovanej a vyčistenej DNA vírusu AcMNPV A4CČC v 5 gl reakčnej zmesi, obsahujúcej 25 Tris-HCl /pH 7,6/, 5 mM MgCli,, mM ATP, 1 mM DTT, 50 g/1 polyetylénglykolu-8000 a C,5 jednotky T4 DNA ligázy /výrobca Gibco-DRL, Gaithersburg, MD/. Po inkubácii prebiehajúcej cez noc pri teplote 16 °C sa celá ligačná zmes použije na transfekciu Sf9 buniek, ako je popísané v príklade 1.
päť dní po transfekcii sa.z transfekovaných Sf? buniek odstráni médium. Pripravia sa desaťnásobné sériové zriedenia z
tránsfekčného supernatantu. Dva alikvotné podiely s objemom 1 ml zo zriedení IC 3, 10 a 10sa použijú na infekciu buniek f
/množstvo 1,5 x 1C^/ v kultivačnej miske s priemerom 6 cín. Za hodinu po pridaní; vírusu sa vírusové inokulum: odstráni a bunky sa prelejú médiom obsahujúcim agarozu, ako je popísané v predchádzajúcom príklade. Ked sa plaky úplne vyvinú, použijú sa na inokuláciu jednotlivých jamiek platne so 48 jamkami. Výsledná dalšia generácia vírusu sa analyzuje PCR reakciou s použitím prímeru A /na obr. 3/ ako prímeru /+/vlákna a kutikulového-AalT prímeru /-/vlákna, pooísaného v príklade 11.
Po jednom alebo dvoch dalších kolách purifikácie plakov ' sa pripravia PI zásoby /Summers, M. D., a Smith, G. E., Príručka spôsobov prípravy baculovírusových vektoroví a kultivácia buniek hmyzu /A Manual of Methods for Baculovírus Vectors ánd í Insect Celí Cultúre Procedúres/, Dept. of Entomology, Texas . Agricuitural Experiment Station and Texas A & M University, .
Colíege Station, 'Texas 77843-2475> Texas Agricuitural Experiment Station Bulletin No. 1555 /1987//· Rekombinačný vírus ob Í-.
sahujúci AalT sa označí A4001. Biologická aktivita tohto vírusu sa testuje injekčnou skúškou na stanovenie ECV. ECV forma vírusu sa injekčné vpraví do lariev Heliothis; virescens, ktoré ; * · sú uprostred štvrtého instärštádia. Vírus sa titruje plakovou skúškou /vid Summers, M. D., a Smith, G.E·, Príručka spôsobov prípravy baculovírusových vektorov a kultivácia buniek hmyzu/ ; a potom sa zriedi na 2 x 10?, 2 xí 10^ a 2 x 10^ REV /plak tvoriacich jednotiek/ na ml v TNM-7H médiu obohatenom 0,5 % .
f /obj./ červene číslo 5. Každá larva sa znecitlivie pôsobením oxidu uhličitého počas 2 až 5 minút a potom sa do nej injekciou vpraví 0,5 H-1 zriedeného vírusu, pričom -sä použije Hamil- ; tonová injekčná striekačka vybavená ciachovanou ihlou č. 26. Ihla sa vpichne pozdĺžne medzi posledné dve panôžky a potom sa posunie ventrálne o dva až tri telové články preč vpich. Po injekcii sa každá larva prezrie, či neuniká zafarbená hemolymfa. Ak je podozrenie na stratu vzorky alebo ák je jej strata e
' - 47 zrejmá, larva sa odstráni. Larvy sa potom umiestnia do zakrytých stravovacích.buniek s plochou.4 cm2 /1 larva na bunku/ a nechajú sa pri teplote 27 C. Raz denne sa larvy vizuálne kontrolujú, aby sa zistila ich môrbidita alebo mortalita. Larva . sa považuje za hynúcu /pozitívna odpoveď/, ak nie je schooná, sa vrátiť po obrátení na chrbát počas 0,5 až 2 minút do správnej polohy. i .
Ked sa do lariev II. virescens injekčné vpraví množstvo 6 x 1(? - 1 x 10^ PFU vírusu, larvy odpovedajúce na infekciu vírusom A4001 vykazujú kontraktilnú paralýzu a čas potrebný na odpoveď sa zníži, ak sa,porovná charakteristická doba na odpoveď po infikovaní vírusom AcMNPV divého typu s rekombinačným vírusom tvoriacim AalT toxín. Konktrétne priemerná doba od.po. vede na rekombinačný vírus /RT^q/ je 50 % /s odchýlkou 4 %/ tejto hodnoty pre vírus divého typu v jednej skúške biologickej aktivity. V druhej skúške je RT^^ rekombinačného vírusu 52 % /s odchýlkou 5 %/ tejto hodnoty pre vírus divého typu. Tento výsledok ukazuje, že inzercia AalT génu a kutikulovej signálnej sekvencie do vírusu AcMNPV /A4001/ urýchľuje rýchlosť usmrtenia pomocou'expresie biologicky aktívneho toxínu.
Pri štandardnej skúške na terčíkoch listov, popísanej v príklade 2, vykazujú kontraktilnú paralýzu charakteristickú pre AalT toxín len larvy kŕmené A4001 vírusom, pestovaným v
| záchrannej bunečnej línii Sf9/28-3/CL-2· A4001 vírusom v SF9 bunkách divého typu, tilnú paralýzu. | Naopak larvy kŕmené nevykazujú kontrak- | ||
| Príklad 13 • / ‘ | .1 k.'· ··;·.* .. | ||
| A4UAS | Konštrukcia ťransferového vektora | UAS-..-D74 a vírusu UAL· ‘ | .. - .1 s |
| í : k | ŕ |
V tomto príklade sa na pozíciu -1 bp /proti smeru pre- .
pisu/ do p74 kódujúcej oblasti vírusu vloží špecifická kvasin’ ková a^tiyačná DNA sekvencia UASqAL, ktorá leží pred regulovaným génom, dohromady s hsp 70 promótorom z Drosophila melano,gaster s minimálnou velkostou -43 až -1 bp. GAL4 štruktúrny gén sa izoluje z pLA plazmidu /Johnston, S. A., a další, Proc.
Natl. Acad. sci., 83, 6553.-6557 /1986//v podobe fragmentu, ohraničeného tíamHI a Hind III miestom, s velkostou 2,9 kb.
i
Tento GAL4 fragment sa vloží do jedného z vektorov obsahujúcich heterológny promótor tak, ako je popísané v príklade 5. Stabilné sf9 bunky, ktoré obsahujú funkčné kópie heterológnych promótor-GAL4 konštruktov sa izolujú spôsobom ponísaným v príklade 6. Pre vytvorenie UAS„AT-p74 rekombinačného vírusu sa skonštruuje UASg^^-p74 transferový vektor. Ako substrát pre PGR reakciu, pri ktorej vznikne fragment s velkosťou 175 bp, sa použije 17-hsp 70/lacZ konštrukt/Fischer, J. A., a äalší, Náture, 332, 853-856 /1988/7· Vytvorený fragment sa skladá zo štyroch kópií repetície s velkosťou 29 pb a obsahuje 17mér.
GAL4 rekogničné miesto s vysokou afinitou spojené s hsp 70 promótorom z Drosophila melanogaster s minimálnou velkostou
-43 až -1 bp. Fo pridaní reštrikčného miesta Sma I na 5'koniec a reštrikčných miest Esp 31 a Nde I na 3 'koniec tohto fragmentu sa použijú špecifické prímery. Uvedené reštrikčné miesta sú potrebné pre následné klonovacie kroky. Tento fragment sa vloží do ΔΡ74-1 transferového vektora /vid obr. 4/ medzi 5'koniec, na ktorom je väčšinou Hind III miesto tupo ukončené a Nde I miesto p74 génu. Tento plazmidový kloň sa označí LB 17·8·. Fragment s p74 kódujúcou oblasťou sa vytvorí PCR amplifikačnou reakciou, pri ktorej sa použije p74~špecifický prímer pre /+/vlákno, popísaný v prikladá 5, a Bluescript, špecifický prímer T3 /výrobca Stratagene, La Jolla, uA/ pre /-/vlákno. Na tento p74 fragment sa pôsobí Klenowovým fragmentom DNA polymerázy I tak, ako už bolo skôr v texte popísané. Po čistení sa fragment štepí enzýmom Bcl I, ktorý pôsobí v,blízkosti 3'konv ca p74 génu. Plazmid LB 17*8 sa; pripraví podobne:štepením enzýmom Esp 31 a následným vytvorením tupých koncov pôsobením / Klenowovho fragmentu. po čistení; sa tento vektor tiež štepí Bcl I. Pripravený vektor a p74 gánjový fragment sa potom za , štandardných podmienok ligujú dohromady. Tento kloň, označený t ; pUASGA1|-p74) obsahuje kompletný p74 gén riadený hsp promótorom, pričom tento promotor závisí od prítomnosti C-AL4 proteínu. Hekombinačný vírus nazvaný A4UAS sa vytvorí spôsobom popísaným v príklade 1. Komplementovaný vírus sa oripraví pestovaním tohto ŕekombinäčného vírusu v bunkových líniách, popísaných v príklade 6. Výsledky štandardného biostanovenia, pooísaného v príklade 2, ukazujú, že vírus obsahujúci i UAS,-,. τ-p74 je je neinfekčný voči hmyzu, ak je podávaný orálne. Ked sa · však tento vírus pestuje v GAL4 komplementačnej bunkovej línii ,nii, je pri orálnom podávaní infekčný. >
P r í k 1 a d 14' ý . . ' J ' • · * t
Izolácia funkčného analogu AcMNPV p74 génu z genómu |· „ ; granulózneho vírusu 2 : . Izolácia génu zodpovedného za orálnu infekČnost granu. lózneho vírusu sa vhodne uskutoční využitím techniky marker i . ' ' í ' i rescue /Passarelli, A. L., a Miller, L. K., J. Virology, 67,' ‘ 2I49-2I58 /I993//· Najprv sa z vírusovej DNA TrichoDlusia ni ' granulózneho vírusu ,/TnGV/ pripraví čiastočným štepením Sal I fragment Sal I TnGV DNA· Tento fragment sa l.iguje do kozmidového vektora pVKlO2 /knauf, V. C·, a Nester, E. W·, Plasmid, 8 8, 45-54 /1982//, a tým sa vytvorí genómová knižnica prekrývajúcich sa kozmidových klonov. Alikvotná čast jedného z' CpGV kozmidových klonov /s hmotnosťou 1 /*g/ sa dohromady s 1 jxg * ; ’iAcMNFV Ä4OOÓ vírusovej DNÁ transfekuje do buniek spôsosbom ^popísaným v príklade 1. po 5 dňoch sa vykoná štandardná plaková ú
skúška, po úplnom vyvinutí sa jednotlivé plaky použijú na infikovanie jednotlivých jamiek tkanivovej kultivačnej platne so 48 jamkami, ako je popísané v príklade;l. Vypestovaný vírus z ., týchto jamiek sa. .zhromaždí do skupín po dvadsať. Tento vírus sa podáva s potravou larvám Trichoplusia ni v treťom ihstarštá.ďiu pri stanovení na terčíkoch listov, popísanom v príklade 2- Ák kozmidový kloň obsahuje funkčný analóg génu p74, orálna infekčnosť vírusu A4C00 zostane zachovaná. Špecifický gén zodpovedaný za zachovanie infekčnosti sa identifikuje Opakovaním kotransfekcie a testovacieho postupu s plazmidóvými subklonmi pozitívneho kozmidu.
i.
v A : /)// /32 -51-.
Claims (14)
- PATENTOVÉ NÁROKY;1. Rekombinačný hmyzí vírus s obmedzenou schopnos-: lou šíriť sa v životnom prostredí z hostitela na hostitela, ktorý sa stáva neinfekčným voči hmyzu zmenou- svojho genetického základu a ktorého infekčnost je obnovená komplementáciou s produktom alebo funkciou, ktorá v tomto zmenenom víruse chýba alebo je defekťná.w í , ....} : x .. á . .-W '
- 2· Vírus podía nároku 1, zvolený zo skupiny’;sklaďa, · t - I , ;júcej sa z DNA a RNA vírusov. k i ;
- 3. Vírus podlá nároku 2, zvolený zo súboru DNA vírusov zahŕňajúceho vírusy Eubaculovirinae, Nudibaculovirinae, Entomopoxvirinae, Ichnovirus, aracovirus, Iridoviridae a Parvoviridae.
- 4. Vírus podlá nároku 3» z čelade Eubaculovirinae, je vybratý zo skupiny zahŕňajúcej jadrové polýedrické vírusy a granulózne vírusy.i..···' ‘ · ' ' . · ’
- 5. Vírus podlá nároku 1, v ktorom zmena genetického /základu spočíva buď v odstránení funkcie génu alebo v interferencii s vírusovou funkciou.t , ?. í
- 6. Vírus podía nároku 1, ktorého ipfekčnosl sa obnoví produkciou vírusu:j r j. í ; i a/ v hmyzích bunkách, transfekovaných; fragmentom DNA, ktorý poskytuje produkt alebo funkciu, ktoré chýbajú alebo sú defektné v zmenenom víruse; = b/ v bunkových líniách, ktoré boli stabilne transformované fragmentom DNA, ktorý poskytuje produkt alebo funkciu, ktoré chýbajú alebo sú defektné v zmenenom víruse;ž · c/ v transgénnych jedincoch hmyzu, ktoré obsahujú . fragment DNA poskytujúci produkt al’ebo funkciu, ktoré chýbajú alebo sú defektné v zmenenom víruse.
- 7· Vírus.podlá nároku 6, v ktorom sä na riadenie expresie daného,fragméntu DNA použije heterologny.promótor. · , ľ'* .· i , í ' \ ' ý
- 8· Vŕrus oodla nároku 1, ktorý ďalej obsahuje heterológny gén kódujúcu látku š potláčajúcimi alebo modifikačnými. účinkami na hmyz, pričom tento gén je.vložený do .vírusového genómu. ’ ; .« · · ·
- 9,. Vírus podlá.nároku 8, v ktorom je látka s potláčajúcimi alebomodifikačnými účinkami pre hmyz .zvolená zo sku-' , 't pmy zahŕňajúcej toxíny, neuropeptidy a hormcny a enzymy.
- 10· Vírus podlá nároku 8., pričom heterologny gén sa vloží: ;a/ priamo na miesto zmeny genetického základu vírusu· alebo ' . - b/ na miesto, priliehajúce k miestu.-zmeny genetického základu vírusu takým spôsobom, že segregäciä hetérológneho génu,a zmeneného genetického základu sa vyskytuje u vírusového potomstva v menej než 10 % prípadov.Vq
- 11. Spôsob výroby vírusu hmyzu so zníženou schopnosťou šíriť sa v životnom prostredí z hostitela na hostitela, v y z n a č u j ú c i sa t ý m , že zahŕňa tieto kroky:a/ výrobu vírusu neinfekčného ore hmyz zmenou genetického základu vírusu; a ie-53 -..b/ obnovenie infekčnosti vírusu komplementáciou s i·· ' . '4 5 ‘ produktom alebo funkciou, ktoré v zmenenom víruse chýbajú alebo sú defektne.
- 12. Spôsob podlá nároku 11, vyznačujúci sa t ý m , že zmena genetického základu vírusu sa spôsobí buď odstránením funkcie génu, alebo interferenciou s vírusovou funkciou. i:-II f . At , . · ‘ - *
- 13. Spôsob podlá nároku 11, v y z n a č u j ú c. i ' t ý m ,že infekčnost vírusu sa obnoví produkciou vírusu:a/ v bunkách hmyzu transfekovaných fragmentom DNA, ktorý poskytuje produkt alebo funkciu, ktoré chýbajú alebo sú deféktné v zmenenom víruse; b/ v bunkových líniách, ktoré boli stabilné transformované fragmentom DNA, ktorý Doskytuje orodukts.alebo funkciu, ktoré chýbajú alebo sú defektne v zmenenom víruse;c/ v transgénnych jedincoch hmyzu, ktoré obsahujú fragment DNA poskytujúci produkt alebo funkciu, ktoré chýbajú alebo sú defektné v'zmenenom víruse.s. a .!ra.**·*··^'
- 14. Spôsob pódia nároku 11, vy z n a č u j ú c i tým , že ďalej zahŕňa použitie heterôlógneho promóto15. Spôsoto poďia nároku 11, vyznačujúci sa tým, že ďalej zahŕňa Doužitie heterôlógneho génu, ktorý sa vloží do vírusového genómu a ktorý kóduje látku s potláčajúcimi alebo modifikačnými účinkami na hmyz.MF-899-93“Če
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US89159892A | 1992-06-01 | 1992-06-01 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK55293A3 true SK55293A3 (en) | 1994-01-12 |
| SK282444B6 SK282444B6 (sk) | 2002-02-05 |
Family
ID=25398502
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK552-93A SK282444B6 (sk) | 1992-06-01 | 1993-05-31 | Hmyzí vírus so zníženou schopnosťou šíriť sa v životnom prostredí z hostiteľa na hostiteľa a spôsob jeho výroby |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0572978B1 (sk) |
| JP (1) | JPH0646843A (sk) |
| KR (1) | KR100341542B1 (sk) |
| AR (1) | AR248427A1 (sk) |
| AT (1) | ATE239795T1 (sk) |
| AU (1) | AU675939B2 (sk) |
| CA (1) | CA2097389A1 (sk) |
| CZ (1) | CZ103093A3 (sk) |
| DE (1) | DE69332941D1 (sk) |
| FI (1) | FI932479A (sk) |
| HU (1) | HU218849B (sk) |
| IL (1) | IL105849A0 (sk) |
| MX (1) | MX9303261A (sk) |
| NO (1) | NO931988L (sk) |
| NZ (1) | NZ247737A (sk) |
| PL (1) | PL171938B1 (sk) |
| SK (1) | SK282444B6 (sk) |
| UA (1) | UA42671C2 (sk) |
| ZA (1) | ZA933829B (sk) |
| ZW (1) | ZW6993A1 (sk) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9106185D0 (en) * | 1991-03-22 | 1991-05-08 | Wellcome Found | Biological control agents |
| ATE324435T1 (de) | 1995-02-21 | 2006-05-15 | Cantab Pharmaceuticals Res Ltd | Virale zubereitungen, vektoren, immunogene und impfstoffe |
| US6355240B1 (en) * | 1995-07-26 | 2002-03-12 | Basf Aktiengellschaft | Enhanced insecticidal insect virus through the expression of heterologous proteins with early promoters |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2008204A6 (es) * | 1986-09-09 | 1989-07-16 | Genetics Inst | Metodos para producir cuerpos de inclusion polihedrica de composicion mezclada (pib),para coinfectar insectos huespedes y para producir proteinas heterologas en insectos. |
-
1993
- 1993-05-28 HU HU9301581A patent/HU218849B/hu not_active IP Right Cessation
- 1993-05-31 AU AU39919/93A patent/AU675939B2/en not_active Ceased
- 1993-05-31 AR AR93325054A patent/AR248427A1/es active
- 1993-05-31 PL PL93299145A patent/PL171938B1/pl unknown
- 1993-05-31 CZ CZ931030A patent/CZ103093A3/cs unknown
- 1993-05-31 JP JP5152986A patent/JPH0646843A/ja active Pending
- 1993-05-31 NZ NZ247737A patent/NZ247737A/en unknown
- 1993-05-31 FI FI932479A patent/FI932479A/fi unknown
- 1993-05-31 CA CA002097389A patent/CA2097389A1/en not_active Abandoned
- 1993-05-31 IL IL105849A patent/IL105849A0/xx unknown
- 1993-05-31 SK SK552-93A patent/SK282444B6/sk unknown
- 1993-06-01 ZW ZW69/93A patent/ZW6993A1/xx unknown
- 1993-06-01 AT AT93108801T patent/ATE239795T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-06-01 NO NO931988A patent/NO931988L/no unknown
- 1993-06-01 EP EP93108801A patent/EP0572978B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-06-01 KR KR1019930009818A patent/KR100341542B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1993-06-01 DE DE69332941T patent/DE69332941D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-06-01 ZA ZA933829A patent/ZA933829B/xx unknown
- 1993-06-01 MX MX9303261A patent/MX9303261A/es unknown
- 1993-06-18 UA UA93003071A patent/UA42671C2/uk unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0572978A1 (en) | 1993-12-08 |
| AU675939B2 (en) | 1997-02-27 |
| JPH0646843A (ja) | 1994-02-22 |
| FI932479A0 (fi) | 1993-05-31 |
| PL299145A1 (en) | 1994-02-07 |
| AU3991993A (en) | 1993-12-02 |
| IL105849A0 (en) | 1993-09-22 |
| HU9301581D0 (en) | 1993-10-28 |
| PL171938B1 (pl) | 1997-07-31 |
| AR248427A1 (es) | 1995-08-18 |
| NO931988L (no) | 1993-12-02 |
| DE69332941D1 (de) | 2003-06-12 |
| ATE239795T1 (de) | 2003-05-15 |
| UA42671C2 (uk) | 2001-11-15 |
| KR100341542B1 (ko) | 2002-11-18 |
| KR940000580A (ko) | 1994-01-03 |
| HU218849B (hu) | 2000-12-28 |
| NZ247737A (en) | 1995-10-26 |
| SK282444B6 (sk) | 2002-02-05 |
| NO931988D0 (no) | 1993-06-01 |
| HUT66586A (en) | 1994-12-28 |
| EP0572978B1 (en) | 2003-05-07 |
| FI932479A (fi) | 1993-12-02 |
| CA2097389A1 (en) | 1993-12-02 |
| MX9303261A (es) | 1994-01-31 |
| CZ103093A3 (en) | 1994-01-19 |
| ZA933829B (en) | 1993-12-27 |
| ZW6993A1 (en) | 1993-12-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6326193B1 (en) | Insect control agent | |
| US5266317A (en) | Insect-specific paralytic neurotoxin genes for use in biological insect control: methods and compositions | |
| US5858353A (en) | Insect viruses, sequences, insecticidal compositions and methods | |
| US5547871A (en) | Heterologous signal sequences for secretion of insect controlling proteins | |
| JP2001501824A (ja) | 昆虫特異的ダニ毒素遺伝子を発現する生物学的昆虫防除剤、方法および組成物 | |
| AU753930B2 (en) | Recombinant baculovirus-based insecticides | |
| Haase et al. | Genetic engineering of baculoviruses | |
| SK55293A3 (en) | Recombinant insect virus and method to produce this virus | |
| AU743526B2 (en) | Transgenic virus | |
| US6130074A (en) | Recombinant insect virus with reduced capacity for host-to-host transmission in the environment and methods to produce said virus | |
| JP2000507089A (ja) | 組換えバキュロウイルスの生産 | |
| JPH09510871A (ja) | 生物学的昆虫制御剤 | |
| CA2141206A1 (en) | Gene insertion by direct ligation in vitro | |
| Possee et al. | Genetically engineered viral insecticides: New insecticides with improved phenotypes | |
| US6355240B1 (en) | Enhanced insecticidal insect virus through the expression of heterologous proteins with early promoters | |
| CZ20004156A3 (cs) | Insekticidy na bázi rekombinantního bakuloviru | |
| MXPA00010981A (es) | Insecticidas con base en basculovirus recombinantes | |
| Xinwen | Genomics and Genetic Engineering of Helicoverpa Armigera Nucleopolyhedrovirus |