SK492009A3

SK492009A3 - Spôsob získavania vysokočistého beta-1,3/1,6-D-glukánu

Info

Publication number: SK492009A3
Application number: SK49-2009A
Authority: SK
Inventors: Vendelín Macho; Dušan Bakoš; Tibor Doboly; Miroslav Fabíni; Juraj Jakubík
Original assignee: Tibor Doboly; Vendelín Macho
Priority date: 2009-07-13
Filing date: 2009-07-13
Publication date: 2011-02-04
Also published as: SK288404B6

Description

Vynález sa týka spôsobu získavania vysokočistého beta-1,3/1,6-D-glukánu (ďalej β-Dglukán) hlavne z Hlivy ustricovej (Pleurotus ostreatus), Húževnatca jedlého (Lentinula edodes) a ostatných drevokazných húb, výhodne z jej hlúbikov, dezintegráciou, defibráciou, extrakciou a účinným bielením technicky dobre dostupnými bieliacimi činidlami, sa dosahuje vysoká účinnosť deštrukcie chitín-glukánových komplexov, proteínov a vysoká čistota získaného produktu.

Doterajší stav techniky β-D-Glukán, je v podstate homopolymérom glukózy s lineárnou molekulou, resp. makromolekulou, obsahujúcou (l,3)^-D-glukozidové väzby, prípadne s vetvenou molekulou, obsahujúcou navyše ešte postranný reťazec, viazaný (l,6)^-D-glukozidovými väzbami. A hoci ide chemicky o dosť heterogénnu skupinu, aj tak sa zvyčajne tieto polysacharidy označujú spoločným názvom glukány. β-Glukány vzbudzujú značnú pozornosť, lebo patria do skupiny fyziologicky účinných látok, ktoré sa súborne označujú ako modifikátory biologickej odpovede. Tak modifikátorom biologickej odpovede môže byť v podstate každá látka [Palisa V., Holan Z.: Prakt. Lék. 69, 770 (1989); Novák M.: Chem. Listy 101, 872-880 (2007)], ktorá stimuluje zvýšenie počtu efektorových buniek imunitného systému. Je známy väčší počet polysacharidov s imunomodulačným účinkom, medzi nimi k dostupným a bohatším zdrojom patrí najmä hliva ustricová (Pleurotus ostreatus) a rad ďalších, ako Laminaria sp., Poria cocos, Grifola frondosa, Sacharomyces cerevisiae a Lentinus edodes a ďalšie [Black W.A. P. et al: J. Appl. Chem. 1951, 505; Harada T et al: Árch. Biochem. Biophys. 124, 292 (1968); Bartnicki-Garcia S.: Ann. Rev. Microbiol. 22, 87(1968); Bohn J.A., Bemiller J.N.: Carbohydr. Polymér 28, 3 (1995); Chichara G. et al: Náture 222, 687 (1969) a Cancer Res. 30, 2776 (1981); US 3 943 247],

Tak imunofarmakologicky účinné látky, teda aj β-D-glukány pôsobiace na základné obranné systémy “hostiteľa”, podstatne zvýšujú jeho odolnosť voči chorobám, k potlačeniu účinkov stresu a alergií, urýchleniu hojenia a zvýšeniu rezistencie voči nebezpečným baktériám a vírusom, ako aj v liečení nádorových ochorení, inhibícii vzniku a rozvoju metastáz [Patchen M.: Suv. Immunal. Res. 2, 237 (1983); Pospíšil et al: Experiencia 38, 1232 (1982)]. V kombinácii s inými doplnkami výživy je účinný pri znižovaní cholesterolu a triglyceridov, zvýšení odolnosti pri ošetrovaní kože proti kožným onemocneniam, pričom pri terapii nádorových ochorení dávkovaním β-D-glukánu je dávkovanie minimálne 1 mg/kg živej hmotnosti denne (CS 243 173).

Známy je kvasničný β-D-glukán, izolovaný z bunkových stien pekárenských kvasme viacstupňovou technológiou a s veľmi nízkymi výťažkami. Podobne je to aj v prípade izolácie β-D-glukánu z obilnín (US 6 323 338; US 6 749 885) a navyše, technológia získavania a rafinácie je technicky náročná a dosahované výťažky sú nízke. Podobná je situácia získavania β-D-glukánu z ďalších surovín (napr. US 6 444 448, US 6 485 945, US 6 197 952), pričom sa pre významné aplikácie vyžaduje podstatne vyššia čistota, hlavne podstatne nižší obsah zvyškov proteínov, chitín-glukánových komplexov zvlášť [Speváček J., Synytsa A., Bras J., Ederová J., Čopíková J.: Osobné oznámenia].

Zaujímavý je účinný postup izolácie β-D-glukánu extrakciou z huby Lentinus edodes [Yap,

Nog. Int. J. Med. Mushrooms 3, 6-19 (2001)] cez vyzrážanie v etanole a vymrazovaním v kvapalnom dusíku, čo je pravdepodobne ešte účinnejší spôsob, ako boli predtým známe postupy [Chichara et al: Cancer Res. 30, 2776-81 (1970); Mizumo: Int. J. Med. Mushrooms 1, 9-29 (1999)].

Predsa sa však ukázala ako vhodná surovina v našich podmienkach na získanie β-Dglukánu hlavne Hliva ustricová (Pleurotus ostreatus), z ktorej sa dosahuje vysoký výťažok na sušinu (Kuniak Ľ. et al: CS 274 918, CS 276 192), čo v princípe, pravda s technickými rozdielmi preukazujú aj ďalšie patenty (napr. Gabrižová L.: SK 282 870, Doboly T., Dobolyová L: SK 285 062). Ide aj o technicky zaujímavé postupy izolácie β-D-glukánu, dobré výťažky, ale žiada sa ešte vyššia čistota produktu, bez podstatne vyšších nárokov na potrebný čas na purifikáciu β-Dglukánu. Síce je známa purifikácia účinkom vodno-peroxidového, resp. vodno-peroxidoalkalického vodného roztoku, dokonca aj spôsob purfikácie kvasinkového β-D-glukánu (Masler

L. et al: CS 274 030) od nežiadúceho α-D-glukánu enzýmami s amylázovou aktivitou, ale tento spôsob nie je výhodný na účinnejšiu purifikáciu β-D-glukánu, izolovaného z hlivy ustricovej.

Uvedené publikácie a patenty len sčasti vystihujú spôsob získavania β-D-glukánu, ako aj ďalších 109 citovaných prác a publikácií [Novák M.: Chem. Listy 101, 1872-1880 (2007)., Rastal R.A., Martin V.: Biotetchnology 13, 490 - 496 ( 2002 ); Gibson R.A.: Probit Nutr. Res. Rev. 17, 259 - 275 ( 2004 ); Synytsya A., Mičková K., Synytsya A., Jablonsky I., Spéváček J., Erban V., Kováriková E., Čopíková J.: osobné oznámenia] poskytujú aj technicky cenné informácie, avšak ešte nástojčivo ostáva problém získavania vysokočistého β-D-glukánu. A tak známe vedecké i technické informácie využíva a ešte pretrvávajúce problémy rieši spôsob podľa tohto vynálezu.

Podstata vynálezu

Podstatou tohto vynálezu je spôsob získavania vysokočistého beta-1,3/1,6-D-glukánu z Hlivy ustricovej (Pleurotus ostreatus) a ostatných drevokazných húb, výhodne po premytí čistou vodou a z jej hlúbikov, po premytí vodou, dezintegráciou, konjugovaňou s defibráciou vo vodnom prostredí, obsahujúcom 0,10 až 0,60 % hmotn. najmenej jedného činidla, vybraného spomedzi uhličitanov alkalických kovov, oxalanu amónneho a fortifikujúcej prímesi, pričom pH vodného roztoku suspenzie je 7,9 až 8,2 a po separácii suspenzie sa ešte vykonáva jej extrakcia vodným roztokom hydroxidu sodného a/alebo draselného o koncentrácii 0,05 až 0,5 % hmotn. a po premytí, s odstránením vodorozpustných komponentov, sa suspenzia hlavne beta-1,3/1,6-Dglukánu obsahujúca hydroxid sodný o koncentrácii 0,05 až 0,2 % hmotn. a po separácii suspenzie a premytí s odstránením vodorozpustných komponentov, sa suspenzia hlavne beta1,3/1,6-D-glukánu separuje a po premytí so zriedeným vodným roztokom karboxylovej kyseliny na pH 4,8 až 5,2 a premytí čistou vodou, sa nerozpustný produkt “surového” beta-1,3/1,6-Dglukánu bieli peroxidom vodíka a najmenej jedným ďalším oxidantom, pri teplote 6 až 36 °C, počas 3 až 26 h v prostredí hydroxidov a/alebo uhličitanov alkalických kovov, s následnou dehydratáciou organickým vodorozpustným atoxickým rozpúšťadlom alebo lyofilizáciou, so zbavením vody až dosušením a finálnou úpravou, pričom defibrácia nerozpustného beta-1,3/1,6D-glukánu sa uskutočňuje prevažne v suspenzii vodného roztoku najmenej jedného hydroxidu a/alebo uhličitanu až hydrouhličitanu alkalického kovu, navyše obsahujúceho 0,03 až 0,15 % hmotn. oxalanu amonného, a fortifikujúcej prímesi, tvorenej alkalickou soľou kyseliny peroxymravčej a/alebo peroxyoctovej v množstve 0,1 až 0,45 % hmotn., po čom sa následne premyje vodou a vymyjú sa vodorozpustné komponenty, pričom sa aglomerovaná suspenzia, hlavne beta-1,3/1,6-D-glukánu následne bieli pri teplote 6 až 36 °C, počas 3 až 26 h pôsobením vodných roztokov najmenej dvoch bieliacich činidiel, vybraných spomedzi oxidu chloričitého, hexahydrátu oxidu chloričitého v množstve 1,5 až 12 % hmotn., peroxidu vodíka, peroxidu alkalického kovu, kyseliny peroxymravčej a jej alkalickej soli, kyseliny peroxyoctovej a jej alkalickej soli, v množstve 2 až 35 % hmotn., počítané na sušinu suspenzie a následne získaný beta-1,3/1,6-D-glukán sa premyje vodou, okyslenou kyselinou octovou a/alebo kyselinou peroxyoctovou na obsah pod 0,25 % hmotn. a napokon premyje demineralizovanou alebo destilovanou vodou a dosuší pri teplote pod 65 °C.

Výhodou spôsobu podľa tohto vynálezu sú predovšetkým dosahované vysoké výťažky beta-l,3/l,6-D-glukánu, najmä jeho vysoká čistota, technická dostupnosť účinných oxidantov a ďalších komponentov potrebných pre účinnú izoláciu a purifikáciu. Oxidanty sa využívajú nielen na purifikáciu-bielenie, ale aj na účinný rozklad nežiadúcich komplexov beta-1,3/1,6-D-glukánu s chitínom a proteínmi vôbec. V neposlednom rade, je výhodou aj strojno-technologická dostupnosť, nízka energetická náročnosť, pričom aj pre väčší počet pripravených reakčných roztokov, prania “koláčov” suspenzie, hlavne β-D-glukánu možno vystačiť s demineralizovanou alebo dokonca z hygienického hľadiska dostupnou pitnou vodou. Len finálne premývanie je nutné viesť demineralizovanou až destilovanou vodou.

Ďalšou výhodou spôsobu podľa tohto vynálezu je možnosť získavať vysokočistý beta1,3/1,6-D-glukán nielen z Hlivy ustricovitej, ale aj z ďalších drevokazných húb, ako napr. z Húževnatca jedlého (Lentinula edodes), Lesklokôrovky obyčajnej (Ganoderma lucidum), Trsovnice lupeňovitej (Grifola frondosa) a ďalších drevokazných húb najmä obsahujúcich 1,3 a/alebo 1,6-D-glukán.

Fortifikujúcu prímes pri defibrizácii vo vodnom prostredí tvorí 0,05 až 0,25 % hmotn. alkalickej soli kyseliny peroxymravčej a/alebo peroxyoctovej.

Bielenie suspenzie beta-1,3/1,6-D-glukánu sa uskutočňuje oxidom chloričitým, výhodne vo forme hexahydrátu oxidu chloričitého, v množstve 2 až 8 % hmotn., počítané na hmotnosť sušiny suspenzie beta-1,3/1,6-D-glukánu. Pritom jej spolubielenie sa uskutočňuje peroxidom vodíka a/alebo jeho alkalickou soľou, vybranou spomedzi peroxidu sodíka a peroxidu draslíka vo forme vodného roztoku o koncentrácii 2 až 25 % hmotn. a v množstve 10 až 35 % hmotn., počítané na hmotnosť sušiny.

Ďalšie spolu bieliace činidlo môže byť vybrané spomedzi kyseliny peroxymravčej a peroxyoctovej a/alebo ich alkalických solí, v množstve 3 až 15 % hmotn., počítané na hmotnosť sušiny suspenzie.

Beta-1,3/1,6-D-glukán pred finálnym premytím demineralizovanou alebo destilovanou vodou sa premyje kyselinou octovou a/alebo kyselinou peroxyoctovou, o koncentrácii 0,2 až 0,5 % hmotn., pričom je pripravená použitím demineralizovanej alebo destilovanej vody.

Vysušený beta-1,3/1,6-D-glukán sa ešte upravuje na aplikovateľnú formu, ako domieľaním, mikronizáciou, gélovatením a prípadne formuláciou s ďalšími látkami na produkty s nutričným a terapeutickým, hlavne imunostimulačným účinkom, v humánnej výžive i vo výžive zvierat.

Ďalšie konkrétne údaje, ako aj ďalšie prednosti spôsobu podľa tohto vynálezu sú zrejmé z príkladov.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

V laboratórnom dezintegrátore - mixéri, sa 12 h po zbere defibruje 5 kg hlúbikov Hlivy ustricovej (Pleuroťus ostreatus) n prostredí 8 kg vodného roztoku uhličitanu sodného o koncentrácii 0,15 % hmotn. počas 3,5 min, čím vznikne pomerne homogénna suspenzia vo vode, pričom pH prostredia dosahuje 7,9 až 8,1. Po defíbrácii sa reakčná zmes prefiltruje na filtri ešte dokonale premyje pitnou vodou a ďalej sa odstredí, čím sa odstránia vo vode vodorozpustné komponety, ako sacharidy, proteíny, enzýmy, popoloviny, ako aj vodorozpustný glukán. Takto získaný nerozpustný podiel glukánu sa celkom zbaví kvapalnej fázy a dá sa do reaktora o objeme 15 dm³ a zaleje sa 60 g vodného roztoku hydroxidu sodného o koncentrácii 29 % hmotn. a 1 % hmotn. uhličitanu sodného. Vytvorená zmes sa intenzívne mieša a postupne sa do nej pridá na bielenie 430 g peroxidu vodíka o koncentrácii 30 % hmont. a nato sa nechá bieliť pri teplote 20 až 25 °C počas 16 h. Po vybielení sa získaný glukán dokonale premýva pitnou vodou až do zmiznutia fialovočerveného sfarbenia fenolftaleínového indikátora. Nato sa k získanému filtračnému koláču pridá 1 kg mierne okyslenej pitnej vody, s obsahom 0,005 % hmotn. kyseliny octovej a potom po dôslednom premiešam sa filtračný koláč opäť premyje 2,5 kg demineralizovanej vody. Získaný mokrý glukán sa potom účinne lisuje a tak odlisovaný koláč v reaktore 4 kg koncentrovaného etanolu a nechá sa počas 1 h odstáť. Nato sa suspenzia opätovne dá do lisu a potom sa vylisuje. Takáto dehydratácia koláča etanolom sa ešte opakuje dvakrát, načo sa získaný glukán vysuší pri teplote 50 až 55 °C za mierne zníženého tlaku.

Výťažok získaného glukánu na hmotnosť sušiny hlúbikov hlivy ustricovej dosahuje 71 %, pričom je nerozpustný nielen vo vode, ale aj v zriedených kyselinách a organických rozpúšťadlách, obsahuje 0,72 % hmotn. chitínového dusíka, 1,57 % hmotn. popola, pričom ľahko sa melie na zrnenie 0,2 až 0,5 mm.

Príklad 2

Postupuje sa podobne ako v príklade 1, len s tým rozdielom, že najprv sa hlúbiky opláchnu pitnou vodou, potom v autoklave v prostredí fyziologického roztoku o koncentrácií 8,5 % hmotn. NaCl, nato sa ešte opláchnu demineralizovanou vodou pri teplote 30 - 38 °C a až potom nasleduje dezintegrácia a defibrácia 5 kg hlúbikov hlivy ustricovej v prostredí 8 kg vodného roztoku uhličitanu sodného o koncentrácii 0,15 % hmotn. sa navyše fortifikuje prímesou 0,28 % hmotn. peroxymravčanu draselného.

Do 15 dm³ reaktora sa postupne na bielenie okrem 430 kg peroxidu vodíka o koncentrácii 30 % hmotn. pridá 50 g hexahydrátu oxidu chloričitého.

Výťažok získaného glukánu na hmotnosť sušiny hlúbikov hliby ustricovej dosahuje 73,5 %, pričom obsahuje len 0,38 % hmotn. chitínového dusíka a 1,17 % hmotn. popola, pričom sa takisto ľahko melie na zrnenie 0,15 až 0,4 mm a je vhodný na prípravu gélov.

Príklad 3

Postupuje sa podobne ako v príklade 2, len pri defibrácii sa navyše použije ako fortifikačná prímes zmes 0,2 % hmotn. sodnej soli kyseliny peroxyoctovej a 0,1 % hmotn. draselnej soli kyseliny peroxymravčej.

Výťažok β-D-glukánu dosahuje 74,2 %, pričom obsahuje 0,21 % hmotn.chitínového dusíka a 0,97 % hmota, popola. Vysokou čistotou je vhodný na formuláciu gélov s terapeutickým účinkom aj na pokožku.

Príklad 4

Postupuje sa podobne ako v príklade 2, pričom pri defibrácii sa ako fortifikujúca prímes pridá 0,2 % hmota, sodnej soli kyseliny peroxymravčej, len 8 kg vodného roztoku uhličitanu sodného o koncentrácii 0,15 % hmota, sa ako spolubielidlo namiesto 0,08 % hmota, hexahydrátu oxidu chloričitého s 0,14% hmota, a navyše sa do roztoku privedie ešte na 0,05 % hmota, suchého oxidu chloričitého.

Dosušenie sa robí za zníženého tlaku (0,5 kPa) pri teplote 50 °C a po domletí sa získa zrnenie 0,12 až 0,20 mm.

Výťažok β-D-glukánu je podobný ako v príklade 2, ale obsah chitínového dusíka je 0,15 % hmota., popola 0,74 % hmota.

Príklad 5

Postupuje sa podobne ako v príkladoch 2 a 3, ale k získanému filtračnému koláču sa pridá 1 kg okyslenej pitnej vody, ktorá obsahuje 0,011 % hmota, kyseliny mravčej a 0,15 % hmota, kyseliny peroxymravčej a ešte 0,07 % hmota, kyseliny peroxyoctovej.

Výťažok je podobne vysoký, pričom obsah chitínového dusíka ďalej poklesol na 0,11 % hmota, a popola na 0,51 % hmota. Dehydratácia sa robí lyofilizáciou, získa sa zrnenie častíc 0,04 až 0,011 mm.

Príklad 6

Postupuje sa podobne ako v príklade 2, len namiesto uhličitanu sodného sa použije mólo vo rovnaké množstvo uhličitanu draselného a namiesto hydroxidu sodného sa použuje mólo vo len polovičné množstvo hydroxidu sodného a druhú polovicu tvorí mólovo rovnaké množstvo hydroxidu draselného.

Výťažok získaného glukánu dosahuje 72,9 %, pričom obsahuje 0,26 % hmota, chitínového dusíka a 1,01 % hmotn. popola, pričom sa takisto dobre melie na zrnenie 0,1 až 0,3 mm.

Príklad 7

Postupuje sa podobne ako v príkladoch 2 a 3, ale pri defibrácii a extrakcií sa použije navyše vodný roztok oxalánu amónného o koncentrácií 0,25 % hmota, a mokrý glukán sa dehydrataje koncentrovaným etanolom, pričom výťažok a čistota sú podobné (výťažok 72,1 % a obsah chitínového dusíka je 0,31 % hmota.) zrnenie prášku je ešte jemnejšie a dosahuje 0,04 až 0,16 mm.

Ak sa postupuje lyofilizáciou ako v príklade 3, zrnenie β-D-glukánu je 0,02 až 0,11 mm, obsah chitínového dusíka 0,24 % hmota. Podobné výsledky sa dosahujú aj pri použití zmesi koncentrovaného etanolu s obsahom do 48 % hmotn. acetónu a metyletylketónu.

Príklad 8

V laboratórnom mixéri sa 18 h po zbere defibruje 5 kg hlúbikov hlivy ustricovej v 10 kg demimeralizovanej vody a potom sa disperzia odfiltruje a zvyšok (koláč) sa zaleje 10 kg vodného roztoku uhličitanu sodného a 0,2 % hmotn. šťavelanu amónneho. Extrakcia sa uskutočňuje pri teplote 80 + 5 °C počas 2 h. Zvyšok po tejto extrakcii sa premyje demineralizovaňou vodou a hydrolyzuje sa vo vodnom roztoku v množstve 10 kg, obsahujúcom 0,4 % hmotn. uhličitanu sodného a 0,4 % hmotn. hydroxidu sodného, pri teplote 88 + 3 °C počas 3,5 h. Tým sa v podstate odstránia zo substrátu komponenty a nerozpustný β-1,3/1,6(1,4)-glukán. Ten sa dôkladne premyje demineralizovanou vodou a okyslí sa čistou kyselinou octovou na pH 5. Nerozpustný produkt sa za občasného premiešavania bieli počas 12 h vodným roztokom peroxidu vodíka o koncentrácii 21 % hmotn. a dehydratuje sa koncentrovaným etanolom, pričom etanol sa odstraňuje za zníženého tlaku ( 0,5 kPa ) pri teplote 36 + 2 °C. Získa sa po dezintegrácii a mikronizácii 232 g suchého práškového P-l,3/l,6(l,4)-glukánu s obsahom chitínového dusíka 0,34 % hmotn. a popola 1,13 % hmotn.a zmenia 0,03 až 0,09 mm.

Príklad 9

Postupuje sa podobne ako v príklade 8, len namiesto 10 kg vodného roztoku o koncentrácii 0,4 % hmotn. uhličitanu sodného a 0,4 % hmotn. hydroxidu sodného obsahuje navyše 0,25 % hmotn. hexahydrátu oxidu chloričitého a pri defibrácii sa do vodného roztoku pridá ešte 0,5 % hmotn. sodnej soli kyseliny peroxymravčej s 0,1 % hmotn. draselnej soli kyseliny octovej. Nerozpustný produkt sa však bieli najskôr počas 5 h vodným roztokom peroxidu sodíka o koncentrácii 15 % hmotn., nato sa dôkladne premyje demineralizovanou vodou do neutrálne reakcie a čiastočne sa okyslí zriedenou kyselinou octovou takisto na pH=5 a potom sa ešte dobieluje vodným roztokom peroxidu vodíka o koncentrácii 21 % hmotn. počas 12 h a dehydratuje sa etanolom, pričom etanol sa oddestiluje za zníženého tlaku pri teplote 36 + 2 °C.

Získa sa po rozomletí 233 g suchého práškového P-l,3/l,6(l,4)-glukánu s obsahom chitínového dusíka 0,71 % hmotn. a popola 0,91 % hmotn.

Príklad 10

Postupuje sa podobne ako v príkladoch 2 a 3, len bielenie β-D-glukánu sa vykonáva 200 g peroxidu vodíka takisto o koncentrácii 30 % hmotn. namiesto 50 g hexahydrátu oxidu chloričitého sa aplikuje 70 g a navyše sa privedie 10 g samotného oxidu chloričitého a 15 g peroxymravčanu sodného s 5 g peroxymravčanu draselného, pričom bielenie sa uskutočňuje pri teplote 14 + 2 °C, počas 16 h.

Výťažok β-D-glukánu dosahuje 74,1 %, pričom obsahuje 0,18 % hmotn. chitínového dusíka a 0,61 % hmotn. popola, pričom zrnenie častíc β-D-glukánu dosahuje 0,06 až 0,22 mm.

Príklad 11

Postupuje sa podobne ako v príklade 2, len na bielenie sa aplikuje 150 g peroxidu vodíka o koncentrácii 33 % hmotn., 50 g hexahydrátu oxidu chloričitého, 15 g čistého oxidu chloričitého a 50 g kyseliny peroxymravčej, 70 g peroxymravčanu draselného a 100 g peroxyoctanu sodného.

Výťažok β-D-glukán dosahuje 72 až 72,9 %, pričom obsahuje 0,11 % hmotn. chitínového dusíka a 0,61 % hmotn. popola.

Príklad 12

Postupuje sa podobne ako v príkladoch 2 a 3, len sa mení teplota a čas bielenia surového β-D-glukánu, bieliace činidlá, fortifikačná prímes pri defibrácii a finálna úprava nerozpustného β-D-glukánu po premytí destilovanou vodou a vysušení, výťažky finálneho β-D-glukánu a jeho čistota, ako aj ďalšie údaje sú v tab.l

Príklad 13

Postupuje sa podobne ako v príkladoch 2 a 3, len ako zdroj beta-D-glukánu sa namiesto Hlivy ustricovitej (Pleurotus ostreatus) využíva Húževnatec jedlý (Lentinula edodes) ako drevokazná huba, ktorá tiež obsahuje beta-l,3/l,6-D-glukán, pričom surová zmes sa „rafinuje“ bielením s peroxidom vodíka (160g) okoncetrácií 33% hmotn.,, 65g hexahydrátu oxidu chloričitého , 50g kyseliny peroxymravčej, 30g kyseliny peroxyoctovej, 70g peroxymravčanu sodného a lOOg peroxyoctanu sodného.

Výťažok beta-1,3/1,6-D-glukánu dosahuje 71,9% až 72,4%, pričom obsahuje 0,061% hmotn. chitínového dusíka a 0,67% hmotn. popola.

Podobné výsledky, hlavne čistota, sa dosahujú aj s ďalšími drevokaznými hubami, obsahujúcimi hlavne beta-1,3 ako aj beta-1,6 glukány, alebo aspoň jeden z týchto dvoch.

Pri substitúcií hexahydrátu oxidu chloričitého, na dosiahnutie podobne vysokej rafinačnej účinnosti je potrebný dvojnásobok kyseliny peroxymravčej a/alebo kyseliny peroxyoctovej.

Priemyselná využiteľnosť

Vynález je využiteľný pri získavaní vysokočistého beta-1,3/1,6-D-glukánu ako imunomodulačného doplnku potravín v humánnej výžive, ale aj vo fortifikácii krmovín, imunostimulantov pri formulácii liečiv, pre prevenciu nielen proti vírusovým a bakteriálnym ochoreniam, ale aj proti nežiaducim dôsledkom chemoterapie a rádioterapie pri nádorových ochoreniach. V neposlednom rade, ako účinný doplnok komponentov zvyšujúcich telesnú odolnosť a výkonnosť, ako v možnostiach efektívneho pestovania a využitia Hlivy ustricovej a ostatných drevokazných húb.

Tabulka 1

Obsah nečistôt (% hmotn.)	E	0,46	0,44	0,38	0,16	0,16	0,35	0,13	0,3
c CL O CL	CM	O	-	o\ o	tí- os o	O	CM OS O	en Os O
Výťažok glukánu	tí^ cí r-	oľ so	ογ o? MS	en r-	n f— r-	<z? o r-	tí^ r-	en^ <o
Činidlo neutrál. Glukánu (%hmotn.)	E m o o	E m O CN O S¹E U	E m O u m E O + E CN O u m E O	E O ^r O E ►4? ° E O	E m o m· O E E° O	E CM ó 00 O E ď° O	E m O CN O E ď® O	E CM O tíO E HH O E O
dehydratácia/ postup	Ô § Μ-» o	-S <tí .s ttí o	etanol+aceton	3 s M—» O	o S	o g M-> O	.2 ’o ^tí n S o	.2 ’S ^tí .S S
Bieliace činidlo	_o E i? o S 4=	cT	+ 00	O	o	o	O	tí*	CM + so
Λ 2 T3	o ď x CN O G	CM o Ô + E m O	o CM E Ό X CM O G	o CM E x CM O G	o CM E 'S CM O G	o CM E X CM O G	O ffi* SO x CM O G	CM o u + o E* Ό X CM O G
tí -s® θ s 43	CM en	IZ?	00 + tr>	tí* + oo	tí^- áó	tí^- + OO	CN + + m	oo + *0 Ό +
43 tí Ui Ό	cm O ď	CM O tí z	CM O CM !E + CM O CM E	CM Ϊ ? CM O E*	CM S 5 CM O CM E	CM O CM tí ? CM O CM E	CM 5 CM s ¥ CM O CM E	CM O E¹ t, O tí* ? CM O CM
Teplota a čas bielenia		CM	so	tí^- CM	O CM	O CM	so CM	O CM	OO
O o	CM	CM en	O	on CM	LZS CM	OO	O en	tí* en
Fortifikujúca prímes pri defíbrácii	%hmotn./ roztok	T—H CM O	«Z? o	l> o + 00_Λ θ'	00 O_r o	1	CM O o	tí“ r““l O	CM <n o
43 S tí	tí % o o 5? O	!E m O o E	m /ζ o o F Ji U e a u +	tí E m O o E	1	te ± Z E r? rn O 8£ E g	>4 m O o m E o	!x! m O o m E O

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Spôsob získavania vysokočistého beta-1,3/1,6-D-glukánu z Hlivy ustricovej (Pleurotus ostreatus) a ostatných drevokazných húb, výhodne po premytí čistou vodou a z jej hlúbikov, po premytí vodou, dezintegráciou, konjugovanou s defibráciou vo vodnom prostredí obsahujúcom 0,10 až 0,60 % hmotn. najmenej jedného činidla, vybraného spomedzi uhličitanov alkalických kovov, oxalanu amónneho a fortifikujúcej prímesi, pričom pH vodného roztoku suspenzie je 7,9 až 8,2 a po separácii suspenzie sa ešte vykonáva jej extrakcia vodným roztokom hydroxidu sodného a/alebo draselného o koncentrácii 0,05 až 0,5 % hmotn. a po premytí, s odstránením vodorozpustných komponentov, sa vodná suspenzia hlavne beta-1,3/1,6-D-glukánu, obsahujúca hydroxid sodný o koncentrácii 0,05 až 0,2 % hmotn. a po separácii suspenzie a premytí odstránením vodorozpustných komponentov, sa suspenzia hlavne beta-l,3/l,6-D-glukánu separuje a po premytí so zriedeným vodným roztokom karboxylovej kyseliny na pH 4,8 až 5,2 a premytí čistou vodou, sa nerozpustný produkt “surového” beta-1,3/1,6-D-glukánu bieli peroxidom vodíka a najmenej jedným ďalším oxidantom, pri teplote 6 až 36 °C, počas 3 až 26 h v prostredí hydroxidov a/alebo uhličitanov alkalických kovov, s následnou dehydratáciou organickým vodorozpustným atoxickým rozpúšťadlom alebo lyofílizáciou, so zbavením vody až dosušením a finálnou úpravou, vyznačujúci sa tým, že defibrácia nerozpustného beta1,3/1,6-D-glukánu sa uskutočňuje prevažne v suspenzii vodného roztoku najmenej jedného hydroxidu a/alebo uhličitanu až hydrouhličitanu alkalického kovu, navyše obsahujúceho 0,03 až 0,15 % hmotn. oxalanu amónneho, a fortifikujúcej prímesi, tvorenej alkalickou soľou kyseliny peroxymravčej a/alebo peroxyoctovej v množstve 0,1 až 0,45 % hmotn., po čom sa následne premyje vodou a vymyjú sa vodorozpustné komponenty, pričom sa aglomerovaná suspenzia, hlavne beta-l,3/l,6-D-glukánu následne bieli pri teplote 6 až 36 °C, počas 3 až 26 h pôsobením vodných roztokov najmenej dvoch bieliacich činidiel, vybraných spomedzi oxidu chloričitého, hexahydrátu oxidu chloričitého v množstve 1,5 až 12 % hmotn., peroxidu vodíka, peroxidu alkalického kovu, kyseliny peroxymravčej a jej alkalickej soli, kyseliny peroxyoctovej a jej alkalickej soli, v množstve 2 až 35 % hmotn., počítané na sušinu suspenzie a následne získaný beta-l,3/l,6-D-glukán sa premyje vodou, okyslenou kyselinou octovou a/alebo kyselinou peroxyoctovou na obsah pod 0,25 % hmotn. a napokon premyje demineralizovaňou alebo destilovanou vodou a dosuší pri teplote pod 65 °C.

2. Spôsob získavania vysokočistého beta-l,3/l,6-D-glukánu podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že fortifikujúcu prímes tvorí alkalická soľ kyseliny peroxymravčej a/alebo peroxyoctovej v množstve 0,05 až 0,25 % hmotn.

3. Spôsob získavania vysokočistého beta-l,3/l,6-D-glukánu podľa nároku 1 a 2, vyznačujúci sa tým, že bielenie suspenzie beta-1,3/1,6-D-glukánu sa uskutočňuje oxidom chloričitým, výhodne vo forme hexahydrátu, v množstve 2 až 8 % hmotn., počítané na hmotnosť sušiny suspenzie.

4. Spôsob získavania vysokočistého beta-1,3/1,6-D-glukánu podľa nárokov 1 až 3, vyznačujúci sa tým, že spolu bielenie suspenzie beta-1,3/1,6-D-glukánu sa uskutočňuje peroxidom vodíka a/alebo jeho alkalickou soľou, vybranou spomedzi peroxidu sodíka a peroxidu draslíka, v množstve 2 až 25 % hmotn., počítané na hmotnosť sušiny suspenzie.

5. Spôsob získavania vysokočistého beta-1,3/1,6-D-glukánu podľa nárokov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že spolu bielenie suspenzie beta-1,3/1,6-D-glukánu sa uskutočňuje najmenej jednou kyselinou vybranou spomedzi kyseliny peroxymravčej a kyseliny peroxyoctovej a/alebo ich alkalických solí, v množstve 3 až 15 % hmotn., počítané na hmotnosť suspenzie..

6. Spôsob získavania vysokočistého beta-1,3/1,6-D-glukánu podľa nárokov 1 až 5, vyznačujúci sa tým, že čistá okyslená voda kyselinou octovou a/alebo kyselinou peroxyoctovou s obsahom po 0,25 % hmotn. je vytvorená z pitnej alebo destilovanej vody.

7. Spôsob získavania vysokočistého beta-1,3/1,6-D-glukánu podľa nárokov 1 až 6, vyznačujúci sa tým, že vysušený beta-1,3/1,6-D-glukán sa upravuje na aplikovateľnú formu, ako domieľaním, mikronizáciou, gelovatením a formuláciou s ďalšími látkami na produkty s nutričným a terapeutickým, hlavne imunostimulačným účinkom, v humánnej výžive i vo výžive zvierat.